JPH0619347B2 - 遊離リガンド測定 - Google Patents

遊離リガンド測定

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JPH0619347B2
JPH0619347B2 JP59502539A JP50253984A JPH0619347B2 JP H0619347 B2 JPH0619347 B2 JP H0619347B2 JP 59502539 A JP59502539 A JP 59502539A JP 50253984 A JP50253984 A JP 50253984A JP H0619347 B2 JPH0619347 B2 JP H0619347B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、遊離リガンドと内因性結合剤に結合したリ
ガンドとを含有する生物学的流体中の遊離リガンドの濃
度の測定方法に関する。
背景技術 近年、血清中の遊離ホルモン、並びに結合蛋白質のごと
き内因性結合剤に結合したリガンドと平衡にある遊離リ
ガンドを含有する他の生物学的流体の他のリガンドの濃
度を測定するために、イムノアッセイ技法が開発され
た。これらは、特異的結合剤の量が十分に少なく、遊離
リガンドと内因性結合リガンドとの間の平衡が有意に影
響を受けなければ（すなわち、遊離リガンドの測定にお
ける求められている分析精度に悪影響を与えるほどに平
衡が影響を受けなければ）、リガンドに対する特異的結
合剤、通常は抗体、が試験されるべきサンプルと接触し
た場合、リガンドによる特異的結合剤の結合部位の支配
の程度が遊離リガンドの濃度の測定値であるという原理
に基いている。未知サンプルについて支配の程度を測定
し、そして既知濃度の遊離リガンドを含有する標準サン
プルを用いて前記の測定値を換算することにより、未知
サンプル中の遊離リガンド濃度を測定することが可能で
ある。
まず、結合したリガンドを含有する特異的結合剤をサン
プルから取り出し、そして支配されていない部位に結合
する適切にラベルされた物質（例えば放射性ラベル物
質）を用いて逆検定（back-titration）することにより
支配されていない部位の比率を決定することにより、結
合部位の支配の程度を測定した。従ってこの方法は効果
的に２段階法であった。
次に、サンプルから特異的結合剤を取り出すことなく
「逆検定」を行い、こうして２段階法を１段階法に転換
することが提案された。これは、ラベルされた物質とし
てリガンドのラベルされた類似体を使用することによ
り、又はラベルされた物質として特異的結合剤を用いる
ことにより行うことができる。
すなわち、公表されたヨーロッパ特許出願第0,026,103
号に、ａ）液体のサンプルをリガンドのラベルされた誘
導体及びリガンドに対する特異的結合剤と混合し、ｂ）
遊離リガンド、ラベルされた誘導体及び特異的結合剤の
間の反応を行い、ｃ）必要であれば特異的結合剤に結合
したリガンド及びラベルされた誘導体の部分を結合して
いないその部分から分離し、ｄ）特異的結合剤に結合し
ているか又は結合していないラベルされた誘導体の量を
測定し、そしてｅ）その測定値を用いて生物学的流体中
の遊離リガンドの濃度を測定することから成るラジオイ
ムノアッセイ法により、前記生物学的流体中の遊離リガ
ンドの濃度を測定することが提案されている。ここに開
示された方法に従えば、リガンドのラベルされた誘導体
は、加えられた特異的結合剤に強く結合するが、内因性
結合剤には全く結合せず、又はリガンドが結合するのよ
り非常に弱く結合するように選択される。
他の方法においては、遊離リガンドの測定法は、流体の
サンプルをラベルされた特異的結合剤及びリガンドのラ
ベルされていない類似体と混合し、得られた混合物をイ
ンキュベートしてラベルされた特異的結合剤に対する遊
離リガンドとラベルされていない類似体との競争を許容
し、リガンドに又はラベルされていないリガンド類似体
に結合したラベルされた特異的結合剤の量を測定し、そ
して結合したラベルされた特異的結合剤の量とサンプル
中に存在する遊離リガンドの量とを関連ずけることを含
んで成るイムノラジオメトリー法を用いる。
しかしながら、ヨーロッパ特許出願第0,026,103号の原
理を具体化する実際の測定キットを用いて、例えばある
種の非甲状腺疾患を有する患者又は遊離甲状腺ホルモン
と関連しない血清蛋白質の異状を有する患者から採取し
たサンプル中の遊離甲状腺ホルモンを測定した場合、こ
の測定結果は、正しい状態に反して、変則的な甲状腺ホ
ルモン濃度を示すようである。これらのキット中の抗体
（特異的結合剤として機能する）の濃度は、今まで提案
されたこの技法の単純化された理論的説明において予想
されるものより１００倍まで大きくてよい。
これらのキットの操作への前記以外の研究は、リガンド
類似体が内因性結合剤と全く結合せず又はわずかに結合
するのみであるどころか、このものは非常に実質的な量
で、少なくとも９０％そしておそらく９９％という高い
程度に、サンプル中に存在するアルブミンにのみならず
他の結合蛋白質TBG及びTBPAとも結合することを示し
た。
従って、この発明の目的は、先行技術における本質的な
欠点を有しない遊離リガンドを測定するための前記の方
法に代る改良された技法を案出することである。
発明の開示 ラベルされた類似体を用いるイムノアッセイ技法のため
に、サンプル中の特異的結合剤及びその他の結合剤に結
合するリガンド類似体の全量に対する、特異的結合剤に
結合するリガンド類似体の量の割合ｂは次の等式により
表わされることが見出された（特異的結合剤の濃度が十
分に低く、サンプル中の遊離リガンドと結合リガンドと
の間の平衡が有意に撹乱されないものとする）。
ここで、 ＫHはリガンド／特異的結合剤反応の平衡定数であり； は類似体／特異的結合剤反応の平衡定数であり； 〔fH〕は遊離リガンドの濃度であり； 〔An〕は類似体の濃度であり； 〔Ab〕は特異的結合剤の濃度であり； ΣＫp〔Ｐ〕は であり； 〔Ｐ1〕，〔Ｒ2〕、…（Pn〕はサンプル中のAb以外の種
種の（内因性の又は添加された）結合剤の濃度であり；
そして、 はリガンド類似体と種々の（内因性の又は添加された）
結合剤との間の反応の対応する平衡定数である。
ラベルされた結合剤が使用されるイムノメトリー測定技
法のためには、１＋ΣＫP〔Ｐ〕…以後Ｓと称する…が
現われる同様の等式を立てることができる。
この理論的等式を基礎にして改良されたアッセイ技法を
設計することができる。
まず、リガンド類似体が内因性結合剤と結合し、そして
この結合の程度が、内因性結合剤の濃度及び／又は類似
体／内因性結合剤反応の平衡定数が異るために、生物学
的流体ごとに異る場合、 がＳに有意に寄与し、そして内因性結合剤についての積 からＳへの寄与を比例的に低下せしめるような濃度〔P
x〕及び類似体との反応の平衡定数 を有する追加の結合剤(X)を添加することにより、前記
の相違の寄与の有意性を低下せしめることができる。
第２に、リガンド類似体がサンプル中に存在する内因性
結合剤と全く結合せず又はある十分な程度に結合しない
場合、あるいは内因性結合剤の濃度及び平衡定数がサン
プルにより異ならない場合においてさえ、リガンド類似
体のための追加の結合剤の添加がＳの増加を可能にす
る。等式により強制される制約は次に、この技法の精度
及び応答性を犠牲にすることなく〔Ab〕が増加すること
を可能にし、このことは測定が一層迅速に完了するこ
と、又は一層低い比活性の特異的結合剤を使用すること
が可能であることを意味する。
従ってこの発明に従えば、遊離リガンド及び内因性結合
剤に結合したリガンドを含有する生物学的流体中の遊離
リガンドの濃度を測定するための改良された方法が提供
され、この方法は ａ） 流体のサンプルを、リガンドの類似体、遊離リガ
ンド及びリガンド類似体が結合する特異的結合剤、並び
にリガンド類似体とは結合するがリガンドとは結合しな
い外来性結合剤（ここで、リガンド類似体又は特異的結
合剤のいずれかがラベルされている）と混合し、 ｂ） 得られた混合物をインキュベートして、特異的結
合剤に対してリガンドとリガンド類似体とを競争せし
め、 ｃ） 特異的結合剤もしくは外来性結合剤と結合したラ
ベルされた類似体の量、又はリガンド類似体に結合し
た、もしくは結合しなかったラベルされた特異的結合剤
の量を決定し、そして ｄ） 決定された量をサンプル中の遊離リガンドの量と
関連ずける、 ことを含んで成る。
外来性結合剤はこの発明の方法においてリガンドのため
の緩衝系として機能し、試験される流体の組成の不適当
な変動を減少し、又は除去する効果を有する。本質的
に、リガンド類似体は２種類の結合剤、すなわちリガン
ドに対する結合剤でもある特異的結合剤（以後Ａと称す
る）、及びリガンドに対する結合剤ではない外来性結合
剤（以後Ｘと称する）との間の競争の対象である。
内因性結合剤からＳへの寄与が０であるか又はすべての
サンプルについて実質上同一である場合、外来性結合剤
Ｘ及びその濃度は、 及びＳの両者が１０以上であるように有利に選択され、
好ましくはＳは５０〜５００である。内因性結合剤から
Ｓへの寄与がサンプルごとに有意に変化しがちである場
合外来性結合剤Ｘ及びその濃度は、 がＳの予想される変化に匹敵するかそれより大であるよ
うに有利に選択され、そして好ましくは少なくともＳの
半分、例えばＳの2/3〜9/10を構成する。
しかしながら、Ｓの部分としての積 の最適利用範囲は遊離リガンドの測定における不正確さ
の臨床的許容性、及び内因性結合剤のみからＳへの寄与
が変化すると考えられる程度に依存してケースごとに異
ることが理解されよう。
外来性結合剤Ｘの量の増加には特異的結合剤Ａの増加が
一般的に伴うこと、及び特異的結合剤Ａの量のあまりに
大きな増加は生物学的流体中の遊離リガンドと結合リガ
ンドとの間の平衡の有意な撹乱をもたらすことにより、
外来性結合剤Ｘの量の実際的な上限がしばしば強制され
るであろう。
競争的平衡反応の関係として表現すれば、この発明の方
法は、添付図面の第１図に示すように描写することがで
きる。平衡は遊離リガンド、内因性結合リガンド、特異
的結合剤Ａに結合したリガンド、遊離のリガンド類似
体、特異的結合剤に結合したリガンド類似体、外来性結
合剤Ｘと結合したリガンド類似体、及び通常の場合内因
性結合リガンド類似体の間に成立する。従って、この発
明は、内因性結合剤と強く結合しそして追加の結合剤Ｘ
の存在により緩衝化され、その結果内因性結合剤との平
衡反応の変動の効果が比例して低下し得るようなリガン
ド類似体を備えることによりヨーロッパ特許出願0,026,
103号に記載された系と異る。
外来性結合剤Ｘはリガンド類似体と結合すべきでありそ
してリガンドとは結合すべきでないことが必須であるか
ら、その選択はリガンド及びリガンド類似体の性質に依
存する。さらに、この結合剤がその本来的性質又はその
濃度により遊離リガンドと内因性結合リガンドとの間の
平衡を撹乱してはならないのみならず、こんどは内因性
結合剤により、又は試験される流体中に存在するかもし
れない薬剤もしくは他のなんらかの成分により影響され
てはならないということは、特異的結合剤Ａの場合と同
様この結合剤についても必須の要件である。外来性結合
剤Ｘは例えば類似体の物理的封入体であってもよい。し
かしながら好ましくは、これは試薬、特にリガンドと類
似体との間の化学的相違に従って後者を結合するが前者
を結合しないように適合せしめられた抗体である。有利
には、結合剤Ｘとして機能する抗体は類似体に対する非
常に高い親和性を有しない（リガンドに対するその親和
性が少なくとも２オーダー低いとして）。従って、この
ような抗体を非常に高濃度で使用して積 の必要な値を得ることができる。イムノアッセイ技法に
とってありふれた技法により困難を伴わないで適切な外
来性結合剤Ｘを設計することができよう。
この発明の方法は、リガンド類似体がラベルされている
（例えば放射性に）イムノアッセイ技法（例えばラジオ
イムノアッセイ）にのみならず、特異的結合剤がラベル
されている（例えば放射性に）イムノメトリーアッセイ
技法（例えばイムノラジオメトリーアッセイ）に適用す
ることができる。
この方法は、生物学的流体中の遊離ホルモン、特に遊離
甲状線ホルモンＴ３及びＴ４の、しかしさらに他のホル
モン、例えばコルチゾル、プロゲステロン、オエストラ
ジオール及びテストステロンの濃度を測定するために使
用することができる。
使用される特異的結合剤Ａは従来のイムノアッセイ技法
においてこの目的のために有用であるとことが知られて
いるものでよく、又は公知の原理に従って調製すること
ができる。ヨーロッパ特許出願第0,026,103号及び第0,0
73,865号に記載されているリガンド類似体を、多くの他
のリガンド類似体と同様に使用することができ、そして
内因性結合剤には結合しないが単に結合剤Ｘ（このもの
はリガンドそれ自体と結合しない）と結合することがで
きるリガンド類似体を設計する試みはもはや必要でない
ことが理解されよう。リガンド類似体は、任意の適当な
方法で、例えばイムノアッセイ技法が使用される場合に
はヨーロッパ特許出願第0,026,103号に記載されている
方法によりラベルすることができる。この方法に代え
て、国際特許出願WO 83/03306に非常の詳細に記載され
ているように、類似体をラベルされていない状態で、ラ
ベルされた特異的結合剤と共に使用することができる。
この発明の方法のために適当な他の操作可能な条件は公
知の又は従来のイムノアッセイ技法において常用されて
いる技法と同様であってよい。
この発明、及びその使用によって達成される改良を次の
例により説明する。
例 ヨーロッパ特許出願第0,026,103号に記載されている遊
離チロキシン（fT４）のイムノアッセイのために適当な
チロキシン（Ｔ４）の類似体を、Ｔ４のアミノ酸構造の
化学的変形により調製した。この類似体に対する抗体
(X)を良く知られている免疫学的技法によって調製し
た。このものはＴ４に対する親和性に比べて103の類似
体に対する親和性を有することが示された。この類似体
を良く知られているもの「交換」法により125Ｉで放射
性ラベルした。このものは通常のＴ４結合体蛋白質に対
してＴ４よりも非常に低い親和性定数を有しており、従
ってヨーロッパ特許出願第0,026,103号の要件を満足さ
せることが示された。
変形されたＴ４類似体に対するのと同じ親和性を有す
る、Ｔ４に対する特異抗体を固体担体に連結した。
いずれも４％BSA，PBS，pH7.４中に稀釈された固相抗体
試薬の懸濁液0.５ml（２ｎｍ）及び125ＩＴ４類似体0.
５ml（２ｎＭ）、並びに種々の濃度のfT４を含有する正
常なヒト血清のアリコート100μｌ（公知の方法により
調製したもの）の混合物を調製した。特異的結合試薬へ
の125Ｉ類似体の結合の程度を、第２図(a)に示すように
fT４の濃度と関連ずけた。
同じ濃度の特異的抗原及び類似体を、３mMのオレイン酸
及び種々の濃度のfT４を含有するサンプルの100μｌの
アリコートと共に含有する同様の混合物を調製した。
（オレイン酸は、幾つかの薬剤を投与した後及び非甲状
腺疾患中の血清サンプル中に増加することが知られてい
る非エステル化脂肪酸として知られている化合物の種類
の１つである。） 結合の程度が、第２図(b)に示すようにfT４と関連する
ことが見出された。すなわち、例えば20pMのfT４及び３
mMのオレイン酸を含有するサンプルは、類似体の結合の
程度の増加のために、１0.６pMのfT４、４７％の片より
を含むものと解釈されよう。
この測定のインキュベーション条件における は７０であると予想される。
この発明の方法に従って、すでに記載されているように
して調製された追加の結合剤を、抗体及び抗原の同じ混
合物にΣＫX〔PX〕＝150となるように0.２％の濃度に加
えた。再び、ラベルされた類似体と特異的抗体との結合
の程度を、それぞれ第２図（ｃ及びｄ）に示すように
に、３mMのオレイン酸添加の前後においてfT４濃度と関
連ずけた。
本発明のこの例において、２０pg/mlのfT４及び１mMの
オレイン酸を含有するサンプルは１７pg/mlのfT４を含
有するものと解釈され、マイナスの片よりは１５％に過
ぎなかった。結合剤のこれ以上の添加は、この方法の観
察される片よりの一層の減少を生じさせ、そして結合剤
の必要濃度はは臨床的理由のためのfT４予測において許
容される片よりに依存するであろう。
フロントページの続き (71)出願人 999999999 ジャクソン，トーマス マイケル イギリス，ロンドン ダブリュ １エヌ ８エーエ，モーティマー ストリート（番 地なし），ザ ミドルセックス ホスピタ ル メディカル スクール，デパートメン ト オブ モーレキュラー エンドクリノ ロジー内 (72)発明者 イ−キンズ，ロジヤ− フイリツプ イギリス国，ロンドン ダブリユ １エヌ ８エ−エ−，モ−テイマ− ストリ−ト （番地なし），ザ ミドルセツクス ホス ピタル メデイカル スク−ル，デパ−ト メント オブ モ−レキユラ− エンドク リノロジ−内 (72)発明者 ジヤクソン，トーマス マイケル イギリス国，ロンドン ダブリユ １エヌ ８エ−エ−，モ−テイマ− ストリ−ト （番地なし），ザ ミドルセツクス ホス ピタル メデイカル スク−ル，デパ−ト メント オブ モ−レキユラ− エンドク リノロジ−内 (56)参考文献 特表昭59−500632（ＪＰ，Ａ) 特表昭59−501480（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】遊離リガンドと、内因性結合剤に可逆的に
    結合したリガンドとが平衡状態にある生物学的流体中の
    該遊離リガンドの濃度の測定方法であって、 ａ）生物学的流体のサンプルを、リガンドの類似体、前
    記遊離リガンド及び該リガンド類似体が可逆的に結合す
    る特異的結合剤、並びに該リガンド類似体とは可逆的に
    結合するが前記リガンドとは結合しない外来性結合剤と
    混合し、ここで、リガンド類似体又は特異的結合剤のい
    ずれかがラベルされており、 ｂ）得られた混合物をインキュベートして、前記特異的
    結合剤に対してリガンドとリガンド類似体とを競争せし
    め、 ｃ）ラベルされたリガンド類似体が使用される場合には
    前記特異的結合剤もしくは外来性結合剤と結合したラベ
    ルされた類似体の量、又はラベルされた特異的結合剤が
    使用される場合にはリガンド類似体に結合したもしくは
    結合しなかったラベルされた特異的結合剤の量を決定
    し、そして ｄ）決定された量をサンプル中の遊離リガンドの量と関
    連ずける、 ことを含んで成り、前記外来性結合剤が、サンプル中の
    他の成分によりリガンド類似体に対する結合剤として悪
    影響を受けず、且つリガンドと内因性結合剤に結合した
    リガンドとの間の平衡を混乱させないものであることを
    特徴とする方法。
  2. 【請求項２】Ｓ値（ここでＳは１＋ΣＫp・〔Ｐ〕とし
    て定義され、〔Ｐ〕はサンプル中の特異的結合剤以外の
    結合剤の濃度を示し、ＫPは該特異的結合剤以外の結合
    剤とリガンド類似体との結合平衡定数を示す）への内因
    性結合剤の寄与が０であるか、又はすべてのサンプルに
    ついて実質上同一であり、そして外来性結合剤及びその
    濃度が、Ｓに対するその寄与が１０以上であり、Ｓが５
    ００以下であるように選択される請求の範囲第１項記載
    の方法。
  3. 【請求項３】請求の範囲第２項において定義したＳへ内
    因性結合剤の寄与がサンプルごとに有意に異り、そして
    外来性結合剤及びその濃度が、Ｓへのその寄与がいずれ
    のサンプルにおいてもＳの半分以上でありそしてサンプ
    ル間のＳの変動に匹敵し又はそれより大であるように選
    択される請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記外来性結合剤が、リガンド類似体と結
    合するがリガンドとは有意な程度に結合しない化学試薬
    である請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】前記外来性結合剤が、リガンドに対するそ
    の親和性よりも２オーダー以上高いリガンド類似体に対
    する親和性を有する抗体である特許請求の範囲第４項記
    載の方法。
  6. 【請求項６】前記リガンド類似体がラベルされており、
    そしてイムノアッセイ技法が使用される請求の範囲第１
    項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記特異的結合剤がラベルされており、そ
    してイムノメトリ−アッセイ技法が使用される請求の範
    囲第１項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記ラベルが放射性ラベルである請求の範
    囲第１項記載の方法。
  9. 【請求項９】前記遊離リガンドが遊離ホルモンである請
    求の範囲第１項記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記遊離リガンドが遊離甲状腺ホルモン
    である請求の範囲第１項記載の方法。
JP59502539A 1983-06-23 1984-06-22 遊離リガンド測定 Expired - Lifetime JPH0619347B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8317124 1983-06-23
GB838317124A GB8317124D0 (en) 1983-06-23 1983-06-23 Free ligand assay
PCT/GB1984/000220 WO1985000226A1 (en) 1983-06-23 1984-06-22 Free ligand assay

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS60501674A JPS60501674A (ja) 1985-10-03
JPH0619347B2 true JPH0619347B2 (ja) 1994-03-16

Family

ID=10544696

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