JPH06193B2 - 高水性容積多重ラメラ小胞の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 リポソーム或は脂質小胞は少なくとも１９６５年以来知
られている。リポソームには３つの一般的なタイプがあ
る：脂質二重層に水性層をさし入れて形成した直径約
０．１〜４μｍの範囲の一連の実質的に球形のシェルを
有するオニオン様構造の多重ラメラ（multilamellar）
小胞（ＭＬＶ）；大きな未構造化水性相を囲む脂質二重
層を有する大きな（直径１μｍより大きい）単ラメラ小
胞（ＬＵＶ）；直径が０．２μｍより小さい他は構造が
ＬＵＶと同様の小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）。ＭＬＶ
は、ＭＬＶの脂質二重層内の脂質の量が比較的に大いこ
とから、親油性物質を包被或は輸送するのに最良と考え
られるのに対し、ＬＵＶは、水性／脂質容積比が大きい
ことから、親水性分子、特に高分子を包被するのに最良
と考えれる。ＳＵＶは寸法が小さいことにより、組織の
細胞に比較的容易に接近し得る利点を有するが、容積が
小さいことにより親水性物質の送達を極少量に限る。
が、ＳＵＶは親油性物質を輸送するのに有用になり得
る。

初期のリポソーム研究は全てリン脂質を二重層用の脂質
源として使用した。これを選択する理由は、リン脂質が
天然膜の主要な構造成分であるということであつた。し
かし、リン脂質をリポソームタイプの構造用に用いるに
は多くの問題がある。第一に、分離したリン脂質は広範
囲の酵素により分解を受ける。第二に、最も容易に入手
可能なリン脂質は天然源からのもの、例えば卵黄レシチ
ンであり、自触媒過酸化を受けるポリ不飽和アシル鎖を
含有する。リポソーム構造は、過酸化が起きると、崩壊
し、被包物質の早期放出及び毒性過酸化副生物の形成を
引き起こす。この問題は水素化することによつて回避す
ることができるが、水素化は費用のかかるプロセスであ
り、それで出発原料の値段を上げる。値段はリン脂質を
大規模に使用することに付随する第三の問題である。リ
ポソームを生産するのに十分純粋な卵黄レシチン１キロ
グラムは、現在、４０，０００ドル以上かかる。これ
は、ほとんどの用途について出発原料としてあまりに高
過ぎる値段である。

リン脂質を用いる際に値段が高くかつ追加の問題がある
ことから、多数のグループが脂質小胞を作るのに合成両
親媒質（amphiphile）を用いようと試みてきた。例え
ば、ロレアル（L'Oreal）に勤めるファンレルベルゲ（V
anlerberghe）等は一連の合成ポリマー、主にポリグリ
セロール誘導体をリン脂質の代わりとして用いてきた。
同様に、ケリー（Kelly）及びサンドズ（Sandoz）イン
コーポレイテッドは脂肪族脂質を試みてきた。

最近になつて、特にロレアルグループから、市販されて
いる界面活性剤を使用してリポソーム様多重ラメラ脂質
小胞において脂質二重層を形成使用とするある微候が表
われてきた。界面活性剤及びリン脂質は、共に両親媒質
であり、少なくとも１つの親油性アシル或はアルキル基
を親水性ヘツド基に結合させている。

試みられてきた界面活性剤中の親水性ヘツド基はポリオ
キシエチレン或はポリグリセロール誘導体を含む。ヘツ
ド基をエステル或はエーテル結合によつて１つ或はそれ
以上の親油性鎖に結合させる。市販されている界面活性
剤はポリオキシエチレン脂肪族エーテルのＢＲＩＪ系
統、ＳＰＡＮソルビタンアルキルエステル、ＴＷＥＥＮ
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含み、
これらは全てデラウエア、ウィルミントン、ＩＣＩアメ
リカズ、インコーポレーテッドから入手し得る。

ＭＬＶを形成するのにどんな出発原料を用いるにして
も、文献に報告されている小胞製造方法の実質的に全て
は、バンガム（Bangham）等、J.Mol.Biol.,１３、２３
８〜２５２頁（１９６５年）に記載されている原バンガ
ム法か或はそのある変法のいずれかを用いている。たど
る基本のアプローチは、脂質を、コレステロールを含む
他の親油性物質と共に有機溶媒に溶解することから始ま
る。有機溶媒は、熱を用いて蒸発することにより或は不
活性ガス（例えば、窒素）流を溶解した脂質上に通して
溶媒を除くことによつて取り去る。次いで、残分を、通
常電解質及び親水性の生物学的に活性な物質を含有する
水性相でゆっくり水和して大きな多重ラメラ膜構造を形
成する。種々のタイプの粒状物質或は構造を、蒸発させ
る間、用いて脂質残分の形成を助成してきた変法がいく
つかある。これらの実験についてのベーシスは、膜質残
分の物理的構造を変えることによつて、水和して一層良
好な小胞が生成し得るということである。２つの最近の
リビュー刊行物、ゾウカ（Szoka）及びパパージョポウ
ロス（Papahdjopoulous）、Anu.Rev.Biophys.Bioeng.
９：４６７−５０８頁（１９８０年）及びデューセ（Do
usset）及びデュースターブラシー（Douste-Blazy）
（テクニークエドキュマンタシオン、ラボアジエ、パ
リ、プュイジウー及びテュラトル編集、Les Liposome
s、４１−７３頁（１９８５年）において）はＭＬＶを
作製するのに用いられてきた方法をまとめている。

一旦ＭＬＶを作ると、プロセスの有効性を求めることが
必要である。生物学的物質をリポソーム或は脂質小胞に
包被する有効性を求めるのに一般的に用いられる２つの
測定は単位質量の脂質当り包被される物質の質量（「包
被質量」）及び捕獲容積である。

捕獲容積は小胞内に捕捉される溶媒量である。捕捉容積
とは、小胞内の水性フラクシヨンの濃度を小胞内の脂質
の濃度で割つたものであり、すなわちｍ／ｇ脂質で表
わされる。

従来の方法を用いて作つた多重ラメラ脂質小胞は親水性
物質について低い、通常５〜１５％程度の包被質量を有
する。加えて、溶媒の捕獲容積は通常２〜４ｍ／ｇ脂
質程度であるが、親油性物質についての包被質量は多重
ラメラリポソームにおいてずっと良好である。従って、
従来の手順を用いて作った多重ラメラリポソームは親油
性（疎水性）物質を包被するのに良好であると考えられ
るが、親水性物質を包被するのに良好であるとは考えら
れない。

小さな単ラメラリポソームは、直径が２０〜５０ｎｍの
範囲であり、極めて小さい捕獲容積（およそ０．５ｍ
／ｇ）、かつまた親水性物質について極めて小さい包被
質量（０．５〜１％）を有する。しかし、脂質二重層は
全容積の５０〜８７％を構成するので、これらのＳＵＶ
は親油性物質を少量輸送するのに優れている。また、こ
れらのＳＵＶを使用してＭＬＶ或はＬＵＶが到達するこ
とのできない組織に極めて少量の親水性物質を輸送する
ことができる。

大きい容積を包被し及び親水性物質について高い包被質
量を得る際の問題により、ＬＵＶが研究されてきた。Ｌ
ＵＶは大きい捕獲容積（およそ３５ｍ／ｇ脂質）及び
親水性物質について高い包被質量（４０−５０％）を有
するが、疎水性或は親油性物質を包被するには極めて劣
つている。ＬＵＶは、これらの特性から、高分子を含む
親水性物質を包被するのに最もよく適しているが、ＬＵ
Ｖを使用する場合の問題がある。大きな水性中心を囲む
脂質二重層は単一だけであるので、ＬＵＶは他のリポソ
ーム程には適せず、一層容易に崩壊を受ける傾向にあ
る。更に、脂質／水性容積比が小さいことにより、親油
性物質を輸送するのにＬＵＶを用いることは困難であ
る。

多重ラメラ脂質小胞を作るための源としてリン脂質より
もむしろ合成界面活性剤を用いた実験がいくつか文献に
報告されてきたが、これらの材料を用いて小さいか或は
大きな親水性分子を包被する能力が向上することを示す
報告はない。加えて、これらの材料で作つた脂質小胞の
安定性が増大することの報告はない。よって、文献は、
これらの合成材料で作ったリポソームがリポソーム分野
で求められている親水性及び高分子送達の目的を達成す
るのに有用になることを示していない。

標準の方法を用いて作った多重ラメラ脂質小胞（通常多
重ラメラ小法を音波処理して作る小さな単ラメラ小胞を
含む）に伴うそれ以上の問題は、これらの現行のプロセ
スがおそくかつ物質に関して比較的非効率であるという
ことである。例えば、多重ラメラ脂質小胞を作る標準の
時間は２−２０時間程である。ＳＵＶを必要とする場合
には、多重ラメラ小脂質構造を破壊してＳＵＶにする音
波処理するのに更に時間がかかる。このように処理加工
がおそいことは、脂質小胞を大規模に用いるためには、
扱いにくくかつ費用がかかる。

よって、発明の目的は迅速かつ効率的な多重ラメラ小胞
の生成方法を提供するにある。

発明のそれ以上目的は親水性物質について高い包被質量
及び高い捕獲容積を有する多重ラメラ胞を開発するにあ
る。

発明の別の目的は、有機溶媒或は洗浄剤を用いないで脂
質膜構造を形成するにある。

発明のなおそれ以上の目的は、比較的安価な、容易に入
手し得る表面活性剤で作った小胞に生物学的に活性な高
分子を迅速、効率的に包被する方法を提供するにある。

発明のこれらや他の目的及び特徴は詳細な説明及び請求
の範囲の記載から明らかになるものと思う。

発明の要約 本発明は迅速、効率的な多重ラメラ脂質小胞の製造方法
を提供し、かつ親水性物質について高い被包質量及び高
い捕獲容積を有する小胞を製造する。発明は、また、親
油性或は親水性物質を高水性容積多重ラメラ小胞に高い
効率で包被する方法も提供する。

小胞を作るためには、界面活性剤とステロール及び電荷
発生両親媒質とを、相の温度を界面活性剤の融点よりも
高く保ちながらブレンドして親油性相を形成する。次い
で、多重ラメラ小胞を形成するために、親油性相を過剰
の水性相と高剪断条件及び高温下で組合わせる。温度は
全ての生成工程について一定に保つ必要はないが、全て
の場合において、温度は界面活性剤の融点よりも高くし
なければならない。

これらの小胞を形成する方法において有用な界面活性剤
はポリオキシエチレン脂肪族エーテルを含み、好ましく
は下記の構造を有する： R₁-O-(CH₂-CH₂-O-)m-H ここで、Ｒ_１はCH₃-(CH₂)_nであり、ｎは１１〜１５の範
囲であり、ｍは２〜４である。他のポリオキシエチレン
エーテルを使用することができるが、最も好ましい物質
はポリオキシエチレン(2)セチルエーテル及びポリオキ
シエチレン(4)ラウリルエーテルである。

また、発明において有用な代りの脂質群はポリグリセロ
ール脂肪族エーテルであり、好ましくは下記の構造を有
する： ここで、Ｒ_３はCH₃-(CH₂)_yであり、ｙは１１〜１５の範
囲であり、ｘは１〜３の範囲である。

小胞中のステロールの目的は最適な寸法を確実にし、脂
質の転移温度近くでの安定性を含む高い安定性をもたら
す膜層の熱互変性相転移を緩衝することである。最も好
ましいステロールはコレステロールであるが、同様の性
質を有する任意のステロールが同様の結果をもたらす。

電荷発生物質なしで作った小胞は高容積吸収（uptake）
及び親水性分子及び高分子を高率的に加入する能力を欠
き、また、凝集或は凝結する傾向を有し、ほとんどの用
途について使用できないものにさせる。このため、発明
の方法では電荷発生物質を用いて、正か或は負のいずれ
かの実効（net）電荷を形成される小胞に付与する。好
ましい負電荷発生物質はジセチルホスフェート、セチル
スルフェート、所定の長鎖脂肪酸、レチン酸、ホスファ
チジン酸、ホスファチジルセリン及びこれらの混合物か
らなる群より選ぶ。

実効正電荷を小胞に付与するために、長鎖アミン、長鎖
ピリジニウム化合物（例えば、セチルピリジニウムクロ
リド）、第四アンモニウム化合物或はこれらの混合物を
用いることができる。正の電荷を引き起こす好ましい物
質はヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、効
力のある消毒剤である。この消毒剤を小胞内で正電荷発
生物質として用いることにより、小胞が劣化するにつれ
て第二の利点をもたらし、長期放出殺菌剤キャリヤーと
して作用する。

小胞は、また、小胞中に包被した物質を特定の生物位置
で放出することを可能にするために、小胞を特定の標的
に向けるのに使用することができる親水性か或は両親媒
性のいずれかのターゲッティング分子を含んでもよい。
親水性ターゲッティング分子を使用する場合、該分子を
界面活性剤のポリオキシエチレン或はポリグリセロール
部分のＯＨ残基に直接に或はスペーサーを経て結合させ
ることができ、或は技術の現状の手順を用いてパルミチ
ン酸或はホスファチジルエタノールアミンのような分子
に結合させることができる。スペーサーを使用する場
合、ターゲッティング分子は二重層膜の親水性コアーと
これらの化合物のアシル鎖を経て互いに組み合うことが
できる。好ましい親水性ターゲッティング分子はモノク
ローナル抗体、レクチン、ペプチドホルモンを含む。

親水性ターゲッティング分子に加えて、また両親媒性タ
ーゲッテイング分子を使用することが可能である。両親
媒性ターゲッティング分子は通常界面活性剤分子に化学
的に結合されずにむしろ脂質小胞の二重層ラメラを構成
する分子の親油性或は疎水性部分と相互作用する。好ま
しい両親媒姓ターゲッティング分子は中性糖脂質、ガラ
クトセレブロサイド（例えば、肝臓ガラクトシルレセプ
ター）、或は荷電した糖脂質、例えばガングリオシドで
ある。

本発明の方法を用いて作った小胞は診断試験、例えば免
疫学的系の凝集反応試験において用いることができる。
小胞はまた可視用、例えば放射線透過写真用マーカー或
は標識として使用することもできる。

発明は、別の態様では、親水性或は親油姓物質を包被す
る方法を提供する。親油性物質を小胞内に包被するため
には、親油姓物質を界面活性剤と、ステロールと、電荷
発生物質とで生成した親油姓相に界面活性剤の融点を越
える温度でブレンドする。さもなければ、小胞の生成を
前述した通りにして行う。

親水性物質を被包するためには、親油性相を前に記載し
た通りにして作り、包被する親水性物質を水性相に加え
る。包被することができる親水性物質は下記を含む：高
分子、ウイルス、免疫学的補助剤、例えばムラミルジペ
プチド、ペプチドホルモン、例えばインスリン、グルカ
ゴン、下垂体ホルモン、成長因子、例えば脈管形成性、
上皮及び表皮成長因子、リンホカイン、例えばインター
ロイキン−２、インターフェロン、血液タンパク質、例
えばヘモグロビン、水溶性植物ホルモン、殺虫剤、放射
性ヌクレオチド、放射線医学診断用対比染料。包被する
ことができる親油性物質の例はステロイドホルモン、有
機殺虫剤、殺カビ剤、除虫剤、親油性ビタミン及び誘導
体を含む。脂質小胞において用いることができる材料の
タイプの一層完全なリスチングは、グレゴリアジス（Gr
egoriadis）、ニューイングランド、J.Med.２９５：７
０４−７１１頁（１９７６年）に載っている。

下記の記述及び例は発明を一層十分に示す。

記述 本発明は界面活性剤を脂質源として用いて大きい水性容
積を有する新規なタイプの多重ラメラ脂質小胞を精密な
製造方法で作製するプロセス、親水性或は親油性物質を
このタイプの多重ラメラ脂質小胞内に包被する方法及び
高水性容積多重ラメラ脂質小胞自体を特徴とする。包被
質量及び捕獲容積に基づいて、発明の多重ラメラ脂質小
胞は、当分野で知られている多重ラメラ脂質小胞に比べ
て、高分子を含む親水性物質を包被及び送達するのに最
もよく適していることがわかる。更に、最も好ましい材
料を使用して多重ラメラ脂質小胞を形成することによっ
て、これらの小胞は従来のリポソーム或はその他の既知
の多重ラメラ脂質小胞に比べて一層広い範囲のｐＨに耐
え、かつ酸化系、例えばペルオキシダーゼ、食細胞の過
酸化物発生系により作用をそれ程受けない。多重ラメラ
脂質小胞は、また、出発原料の値段が安いことから、作
るのがずっと安い。

本発明の多重ラメラ脂質小胞は、広い関係で、ポリオキ
シエチレン脂肪族エーテル或はポリグリセロール脂肪族
エーテルにすることができる脂質構造物質の温度を液体
になるように融点よりも高い温度に上げて作る。ステロ
ール、好ましくはコレステロールを、電荷発生物質及び
包被する親油性物質と共に液体界面活性剤にブレンドし
て親油性相を形成する。次いで、この親油性相を、高剪
断装置を使用して、過剰の水性相に界面活性剤の融点よ
り高い温度で強制的に入れる。親水性物質を多重ラメラ
脂質小胞内に包被するつもりならば、親水性物質を水性
相にいれる。発明において有用なポリオキシエチレン脂
肪族エーテルは低い融点を有するので、温度に敏感な生
物活性な親水性物質を損傷させずに包被することができ
る。これは、本方法を広い範囲の物質について用いるこ
とを可能にする。

アニオン性或はカチオン性両親媒質を界面活性剤に加入
して実効正或は負電荷を生じる。電荷保持物質を脂質構
造に加入することにより、脂質構造を安定にさせかつ迅
速な分散をもたらす。このような電荷を使用しない場
合、形成した小胞は、極めて低い濃度に保たない場合に
は、凝集することになる。荷電物質は、大きな水性容積
を包被するためにも必要とする。荷電される両親媒質の
量は多くする必要はなく、0.5〜５モル％（界面活性剤
の濃度を基準にして）が適当な電荷を小胞に付与するの
に十分である。

一層良好な安定性をもたらしかつ膜層の熱互変性相転移
を緩衝し、例えば脂質の転移温度に近い温度における膜
構造の安定性をもたらすために、コレステロール或は同
様の化学的性質を有する別のステロールを多重ラメラ小
胞の脂質構造に加入する。コレステロールは、また、完
成小胞の最適な寸法を可能にする。好ましい界面活性剤
／コレステロールモル比は約３〜２０の範囲であり、あ
る程度コレステロールが包被する親油性物質と対抗する
かどうかに依存する。

本明細書中に記載するポリオキシエチレン及びポリグリ
セロール界面活性剤は現時点でわかっている発明の方法
を実施するための最良のものであるが、リン脂質或はそ
の他の界面活性剤を用いて本方法によって小胞を形成す
ることが可能である。しかし、これらのリン脂質及びそ
の他の界面活性剤の内の多くは、これらを用いて温度敏
感性の生物学的に活性な物質を包被することが実施し得
ないような高い融点を有する。更に、不飽和脂質を一層
多く用いる場合は、酸化分解を受け易くなる。

一旦親油性相を形成すると、高剪断技法を用いて水和す
ることが必要である。この高剪断をもたらすことができ
る装置は広範囲に市場で入手可能である。使用すること
ができる装置はバイオテクノロジーディベロップメント
コーポレーション製のマイクロ流動化装置、「フレン
チ」−タイププレス或は高い十分な剪断力及び加熱した
半粘稠性液を扱う能力をもたらすある種の他の装置を含
む。非常に高い剪断の装置を使用する場合、粉末液を加
圧下、通常の融点より低い温度でミクロ乳化して本発明
の多重ラメラ脂質小胞を形成することが可能になり得
る。

一旦、多重ラメラ脂質小胞を形成すると、音波処理或は
機械的剪断によって寸法を変え或は構造を変更すること
ができる。これを実施する装置、並びに全般的な手順は
当業者に知られており、かつリポソーム分野において普
通に用いられる。

本発明の多重ラメラ脂質小胞を薬剤送達系として用いる
場合、それらをどのようにして用い得るかに関し特に制
限はない。例えば、小胞を直接懸濁液に、エーロゾルの
形で、局所に、或はゲルで分散させることができる。凝
集反応試験或は他のあるタイプのマーカー用途用に使用
する場合、直接脂質層に吸収される親油性染料を使用す
ることができる。

発明の多重ラメラ脂質小胞は、薬剤或は高分子送達系と
しての用途に加えて、他の用途を相当に有する。例え
ば、小胞は、注入された物質の免疫応答を向上させるた
めに、補助薬として使用することができる。加えて、高
い水性容積により、発明の多重ラメラ脂質小胞をモイス
チャライザー或はスキンクリームとして用いて有利な結
果を得ることができる。高い捕獲（captured）容積／脂
質比は、従来のスキンケアクリームから利用可能なもの
に比べて発明の小胞を使用して水分を一層多く皮膚に与
えるものである。

発明は下記の制限するものでない例から一層明らかにな
るものと思う。

例１ 最も好ましい材料の内の１つであるポリオキシエチレン
（２）セチルエーテルを使用して本例の多重ラメラ脂質
小胞を作製した。本例及び下記の例では、注射器を記載
する通りにして使用して高い剪断を与えたが、任意の高
剪断装置を用いることができる。

表１は本例について多重ラメラ脂質小胞を作るのに用い
た材料及び割合を掲記する。ポリオキシエチレン（２）
セチルエーテルと、コレステロールと、ジセチルホスフ
ェートとを５ml注射器に入れて脂質の融点より高い温度
である４０℃に加熱した。ジセチルホスフェートは最終
の膜構造に実効（ネット）負の電荷をもたらした。親油
性成分を加熱ブレンドして生じた親油性相を三方ストッ
プコックを経て１５０mM NaClを含有する５mMホスフェ
ート緩衝液（pH7.4）１０mlからなる水性相に強制的に
注入した。２５ml注射器に収容したホスフェート緩衝液
もまた４０℃であった。親油性相を水性相に注入するプ
ロセスにかかった時間は５秒よりも短かかった。次い
で、生成した混合物を強制的に直径約１mmのオリフィス
に通して線流速８−１２×１０^２cm秒で第２の２５ml注
射器に入れた。混合物を２つの２５ml注射器の間で連続
して前後におよそ２分間動かして高容積脂質小胞を作る
のに必要な液体剪断を与えた。多重ラメラ脂質小胞を含
有するミルキー懸濁液が生じた。ベックマンインストル
ーメントカンパニーＪ−２１遠心分離機で１０，０００
rpmにおいて１５分間遠心分離して多重ラメラ脂質小胞
を分離して水溶液の上面上に低密度相を形成した。

形成した多重ラメラ脂質小胞は0.8μｍフィルターを通
過しない。ブランソンソニケーターで６分間音波処理し
た際に、脂質膜構造は通常の多重ラメラ小胞の寸法を達
成し、0.45μｍフィルターを通過した。更に６分間超音
波処理した際に、構造の寸法を十分に小さくして、0.2
μｍフィルターを通過した。

例２ 本例では、例１で負の電荷をもたらしたジセチルホスフ
ェートに代えてセチルトリメチルアンモニウムを用いた
他は、例１と同じ手順を使用した。本例で用いた正確な
割合を表２に示す。

生成した陽に荷電した多重ラメラ小胞は0.8μｍフィル
ターを通過できなかったが、６分間超音波処理した際
に、0.45μｍフィルターを邪魔されずに通過した。更に
６分間超音波処理した際に、脂質膜構造は再び0.2μｍ
フィルターを邪魔されずに通過した。

例３ 本例では、例１と同じ材料を用いて一層大きい規模の試
験を行なった。脂質３グラムを用いた。使用した材料の
モル割合、並びに水性相の容積を表３に開示する。

ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルと、コレステ
ーロールと、ジセチルホスフェートとを、脂質合計３ｇ
で２５ml注射器に入れて４０℃に加熱した。次いで、混
合物を強制的に三方ストップコックを経て６０ml注射器
に収容した４０℃のホスフェート緩衝液５０mlに注入し
た。このプロセスにかかった時間は１０秒よりも短かか
った。次いで、生成した混合物を強制的に直径約１mmの
オリフィスに通して流速８−１２×１０^２cm／秒で第２
の６０ml注射器に入れた。生成した混合物を２つの６０
ml注射器の間で連続して前後に約２分間動かしてクリー
ムを生じた。１０，０００rpmで１５分間遠心分離した
際に、脂質膜構造を非加入水性相の上面に層として分離
する。種々の実験において捕獲された水性容積は７〜2
0.8ml／ｇ脂質であり、多重ラメラ脂質膜構造について
通常観測される２〜４ml／ｇ脂質に比べてすっと多い量
であった。小胞を1/100希釈して周囲温度で凝集に対し
て３０日間安定であることがわかった。

例４ 本例では、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルに
代えてポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルを用
いた他は、実質的に例３と同じ方法を使用した。ラウリ
ルエーテルは周囲温度において液体であるので、加熱す
ることを必要としなかった。脂質を合計３グラム使用
し、割合を表４に挙げる。

多重ラメラ脂質小胞を形成して遠心分離によって分離し
た後に、捕獲された容積を測定して８ml／ｇ脂質であっ
た。この実験で形成した多重ラメラ脂質小胞は超音波処
理しないで0.2μｍフィルターを邪魔されずに通過した
ことから、これは全く驚くべきことである。ラウリル小
胞は、この小さい寸法の故に、ＳＵＶが有するのと同様
の器官への接近性を有し得、同時にやはり高い捕獲容積
及び被包効率を有する。

例５ 本例では、高分子、特にヘモグロビンを使用して発明の
多重ラメラ脂質小胞についての被包効率を示した。ポリ
オキシエチレン（２）セチルエーテルを使用して脂質膜
構造を作った。表５は濃度を掲記する。

赤血球溶血物は、フレッシュな洗浄したヒト赤血球を低
張性ホスフェート緩衝液に溶解してヘモグロビン濃度１
０mg／mlとして形成した。脂質と、コレステロールと、
ジセチルホスフェートとを１０ml注射器に入れて４０℃
に加熱した。次いで、混合物を強制的に三方ストップコ
ックを経て６０ml注射器に収容した赤血球溶血物５０ml
に射出した。こ注入にかかった時間は５秒よりも短かか
った。次いで、生成した混合物を強制的に直径約１mmの
オリフィスに通して流速８−１２×１０^２cm／秒で第２
の６０ml注射器に入れた。生成した混合物を２つの注射
器の間で連続して前後におよそ２分間動かして暗ピンク
色クリームを生じた。

生成したクリーム７mlをフィコールパック密度バリヤー
（ファーマシア）３mlと混合し、１０，０００rpmで１
５分間遠心分離した。末加入のヘモグロビンは全てフイ
コール−パック密度バリヤー中にとどまるのに対し、脂
質小胞に付随するヘモグロビンは親油性相と共に水性相
の上面に浮き上がる。親油性の小胞含有相はピンク色
で、密度バリヤーの上面と分離された。２つのフラクシ
ョン（脂質相及び密度バリヤー相）の１mlアリコートを
Soluene（パッカード製のトルエン中0.5Ｎ水酸化第四ア
ンモニウム）４mlに溶解し、ヘモグロビン含量をソーレ
ー帯（４２０nm）の吸光度を測定して求めた。フィコー
ル−パックは0.42 O.D.を有し、脂質膜構造は1.46 O.D.
を有しており、脂質１グラム当りヘモグロビン約２２mg
が脂質構造に付随されることを示した。相当する水性容
積吸収はおよそ８ml／ｇであった。

湿り窒素によるガス処理は脂質膜構造に伴うヘモグロビ
ンの固有のスペクトル変化を引き起こし、オキシヘモグ
ロビンからデオキシヘモグロビンへの変換を示した。周
囲酸素に再び暴露した後に、スペクトル変化が起こり、
オキシヘモグロビンに戻る変換を示した。このことは、
ヘモグロビンが被包プロセスによってそこなわれないこ
とを示す。

ヘモグロビン含有構造を４０℃の緩衝液中に１１日間保
ち、次いでフィコール−パック密度バリヤーで再精製し
た。封入されたヘモグロビンの７０％が依然脂質相中に
存在することがわかった。ヘモグロビン含有脂質膜構造
は依然脱酸素化−再酸素化反応を示した。１７日に同様
に実験して、初めに加入されたヘモグロビンの６２％が
依然保留されることを示しかつ依然正常な脱酸素化−再
酸素化を示した。

濃度を３倍増大し、ヘモグロビン３０mg／mlを用いて同
様の実験を行なった。ヘモグロビン被包の予期した増
大、５８mg／ｇ脂質を観測した。

例６ 本例では、被包される質量及び捕獲される容積を求める
ために、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテルと
ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルとを比較し
た。使用した材料の割合は表１に示すものと同じであっ
た。表６はこの実験の結果を挙げる。

ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルの場合、溶媒
７〜９ml／ｇ脂質が水性容積中に吸収され、ヘモグロビ
ンの被包された質量は２０〜６０mg／ｇ脂質であった。
対照として、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテ
ルを用いて、溶媒２〜３ml／ｇ脂質のみが吸収され、封
入された質量は３mg／ｇ脂質より少なかった。ポリオキ
シエチレン（１０）セチルエーテルについての値は従来
の封入方法及びホスホリピッドを用い、ホスホリピッド
及びＭＬＶを形成する従来の封入方法を用いて文献中に
示されている値と実質的に同じである。これは、発明の
方法が種々の材料について作用するが、ポリオキシエチ
レン（２）セチルエーテルが明瞭な利点を生じることを
示す。

例７ 本例では、親油性分子、特にレチン酸を使用して本発明
の多重ラメラ小胞が親油性分子を被包する能力を立証す
る。ポリオキシエチレン（２）セチルエーテルを小胞の
脂質構造材料として用いた。レチン酸を脂質膜構造の親
油性相に加入する。合計2.5グラムの脂質を表７に挙げ
る割合で使用し、用いた方法は例３の方法であった。

本発明の方法に従って、ポリオキシエチレン（２）セチ
ルエーテルと、コレステロールと、ジセチルホスフェー
トと、レチン酸を１０ml注射器中４０℃でブレンドし、
次いで、混合物を６０ml注射器中の同様に４０℃の４０
ml５mMホスフェート、１５０mM NaCl、pH7.4に強制的に
注入した。次いて、混合物に、１mmオリフィスを通して
別の６０ml注射器に入れる２分の混合によって高流動剪
断を受けさせて、黄色クリームを生じた。

１５，０００rpmで１５分間遠心分離した際に、脂質小
胞が加入されない水性相の上面に黄色層として分離し
た。分離した脂質小胞を希釈してそれ以上の容積吸収が
なく、安定、均一な懸濁液を形成することができた。水
性相の脂質膜構造への測定した加入は１８ml／ｇであっ
た。採用した条件下でのこの非常に高い値はレチン酸が
寄与する付加実効負電荷によるのであろう。レチン酸の
被包は８mg／ｇ脂質（＞９９％）であった。

例８ 本例では、ポリオキシエチレン（２）セチル及びコレス
テロールで作る脂質小胞に負電荷を付与するのにジセチ
ルホスフェートに代えてレチン酸を用いた。脂質混合物
2.5を表８のモル割合で使用した。用いた方法は例３の
方法と同じであった。

多重ラメラ小胞を形成し、遠心分離して分離した後に、
吸収された水性容積を測定して１２ml／ｇ脂質であっ
た。被包されたレチン酸は17.5mg／ｇであった。

例９ 本例は、本発明の方法によってポリオキシエチレン
（２）セチルエーテルから形成した脂質小胞を用いて異
る親油性材料である防虫剤性Ｎ，Ｎ−ジエチルメタ−ト
ルアミドを加入し得ることを立証する。脂質2.5グラム
を表９に挙げる割合で使用した。Ｎ，Ｎ−ジエチルメタ
−トルアミドがレチン酸に置き代って用いて方法は例７
と同じであった。

１５０，０００rpmで１５分間遠心分離した際に、脂質
膜構造が加入されない水性相の上面上に白色層として分
離した。これを容易に再分散及び希釈して均一な分散液
にすることができ、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタ−トルアミド
の低密度相を分離しなかった。容積吸収は１０ml／ｇ脂
質であり、Ｎ，Ｎ−ジエチルメタ−トルアミドの＞９９
％が脂質膜小胞によって保留された。別の実験では、コ
レステロールを系から除くと、リポソームが急速にＮ，
Ｎ−ジエチルメタ−トルアミドを失うことを示した。

例１０ 本例は、本発明の方法によって形成した脂質小胞が超高
分子構造、特に鳥類脳炎（ＡＥ）ウィルス、１７nmビリ
オンを封入することができることを立証する。用いた割
合及び方法は、赤血球溶解質をＡＥウィルスの溶液に代
えた他は例５と同様であった。結果を表１０に示す。

表１０の結果から明らかな通りに、ＡＥの少なくとも７
５％が本発明の多重ラメラ小胞に吸収され、それらがウ
イルス及びプラスミドを移送するのに潜在的に有用なこ
とを示す。

例１１ 本例では、発明の多重ラメラ小胞について、水性ベー
スの溶液の吸収％を求めた。小胞は、脂質2.5グラムを
使用して親油性相を形成し、0.25Ｎソルビトール溶液を
種々の量で水性相として供した他は、例１に開示する通
りにして作った。次いで、脂質を密度勾配遠心分離によ
って分離して容積を測定した。表１１はml／ｇ脂質で表
わす捕獲容積を示す。

表１１に示す結果から明らかな通りに、本発明の多重ラ
メラ小胞は従来の多重ラメラ小胞に比べてすっと大きい
捕獲容積を有する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/76 7431−4Ｃ // Ａ６１Ｋ 37/02 8314−4Ｃ 37/24 8314−4Ｃ 37/66 Ｚ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 7/04 7236−4Ｂ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】本質的に下記工程： Ａ．下記の構造、 Ｒ₁−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）ｍ−Ｈ （式中、Ｒ_１はＣＨ_３−（ＣＨ_２）ｎであり、ｎは１１
   〜１５の範囲であり、ｍは２〜４である）を有するポリ
   オキシエチレン脂肪族エーテル界面活性剤とステロール
   及び電荷発生両親媒質とをブレンドして無溶媒非水性親
   油性相を供し、その間該親油性相の温度を該界面活性剤
   の融点より高く保ち、 Ｂ．水性溶媒及び被包する水性可溶性物質で形成した水
   性相を供し、 Ｃ．該非水性親油性相と実質的に過剰の該水性相とを、
   その間混合物の温度を該界面活性剤の融点より高く保っ
   て単一工程で高剪断条件下で組合せる、 からなり、それにより分離し得る水和ラメラ相を形成す
   ることなく高水性容積の多重ラメラ脂質小胞を２分より
   短い時間で形成する該高水性容積多重ラメラ脂質小胞の
   製造方法。
2. 【請求項２】前記ステロールがコレステロール或はその
   誘導体を含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】前記電荷発生両親媒質がジセチルホスフェ
   ート、セチルスルフェート、長鎖脂肪酸、レチン酸、ホ
   スファチジン酸、ホスファチジルセリン、長鎖アミン、
   長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物及び
   これらの混合物からなる群より選ぶ電荷発生物質である
   請求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】更に、モノクローナル抗体、レクチン及び
   ペプチドホルモンからなる群より選ぶ親水性ターゲッテ
   ィング分子を前記界面活性剤に結合させることを含む請
   求の範囲第２項記載の方法。
5. 【請求項５】前記ポリオキシエチレン脂肪族エーテルが
   ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル或はポリオキ
   シエチレン（４）ラウリルエーテルを含む請求の範囲第
   ２項記載の方法。
6. 【請求項６】前記電荷発生分子がレチン酸を含む請求の
   範囲第２項記載の方法。
7. 【請求項７】両親媒性物質を多重ラメラ脂質小胞内に被
   包する方法であって、本質的に下記工程： Ａ．下記の構造、 Ｒ₁−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）ｍ−Ｈ （式中、Ｒ_１はＣＨ_３−（ＣＨ_２）ｎであり、ｎは１１
   〜１５の範囲であり、ｍは２〜４である）を有するポリ
   オキシエチレン脂肪族エーテル界面活性剤とステロール
   及び電荷発生両親媒質とをブレンドして無溶媒非水性親
   油性相を供し、その間該親油性相の温度を該界面活性剤
   の融点より高く保ち、被包する両親媒性物質を該親油性
   相にブレンドし、 Ｂ．水性溶媒及び被包する水性可溶性物質で形成した水
   性相を供し、 Ｃ．該非水性親油性相と実質的に過剰の該水性相とを、
   その間混合物の温度を該界面活性剤の融点より高く保っ
   て単一工程で高剪断条件下で組合せる、 からなり、それにより分離し得る水和ラメラ相を形成す
   ることなく多重ラメラ脂質小胞を形成しかつ両親媒性物
   質を２分より短い時間で被包する該両親媒性物質を多重
   ラメラ脂質小胞内に被包する方法。
8. 【請求項８】前記ステロールがコレステロール或はその
   誘導体を含む請求の範囲第７項記載の方法。
9. 【請求項９】前記電荷発生両親媒質がジセチルホスフェ
   ート、セチルスルフェート、長鎖脂肪酸、レチン酸、ホ
   スファチジン酸、ホスファチジルセリン、長鎖アミン、
   長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物及び
   これらの混合物からなる群より選ぶ電荷発生物質である
   請求の範囲第８項記載の方法。
10. 【請求項１０】前記ポリオキシエチレン脂肪族エーテル
    がポリオキシエチレン（２）セチルエーテル或はポリオ
    キシエチレン（４）ラウリルエーテルを含む請求の範囲
    第８項記載の方法。
11. 【請求項１１】親水性物質を高水性容積多重ラメラ脂質
    小胞内に被包する方法であって、本質的に下記工程： Ａ．下記の構造、 Ｒ₁−Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−）ｍ−Ｈ （式中、Ｒ_１はＣＨ_３−（ＣＨ_２）ｎであり、ｎは１１
    〜１５の範囲であり、ｍは２〜４である）を有するポリ
    オキシエチレン脂肪族エーテル界面活性剤とステロール
    及び電荷発生両親媒質とをブレンドして無溶媒非水性親
    油性を供し、その間該親油性相の温度を該界面活性剤の
    融点より高く保ち、 Ｂ．封入する親水性物質を水性溶媒にブレンドして水性
    相を供し、 Ｃ．該非水性親油性相と実質的に過剰の該水性相とを、
    その間混合物の温度を該界面活性剤の融点よりも高く保
    って単一工程で高剪断条件下で組合せる、 からなり、それにより分離し得る水和ラメラ相を形成す
    ることなく高水性容積の多重ラメラ脂質小胞を形成しか
    つ該親水性物質を２分より短い時間で被包する該親水性
    物質を高水性容積多重ラメラ脂質小胞内に被包する方
    法。
12. 【請求項１２】前記ステロールがコレステロール或はそ
    の誘導体を含む請求の範囲第１１項記載の方法。
13. 【請求項１３】前記電荷発生両親媒質がジセチルホスフ
    ェート、セチルスルフェート、長鎖脂肪酸、レチン酸、
    ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、長鎖アミ
    ン、長鎖ピリジニウム化合物、第四アンモニウム化合物
    及びこれらの混合物からなる群より選ぶ電荷発生物質で
    ある請求の範囲第１１項記載の方法。
14. 【請求項１４】前記ポリオキシエチレン脂肪族エーテル
    がポリオキシエチレン（２）セチルエーテル或はポリオ
    キシエチレン（４）ラウリルエーテルを含む請求の範囲
    第１２記載の方法。
15. 【請求項１５】前記親水性物質を高分子、ヘモグロビ
    ン、ペプチドホルモン、生長因子、リンホカイン、イン
    ターロイキン、インターフェロン及びウイルスからなる
    群より選ぶ請求の範囲第１１項記載の方法。
16. 【請求項１６】請求の範囲第２項記載の方法によって作
    られる多重ラメラ脂質小胞。