JPH06197762A

JPH06197762A - タマネギのｄｎａ抽出法

Info

Publication number: JPH06197762A
Application number: JP34791592A
Authority: JP
Inventors: Fumiyuki Goto; 文之後藤; Tamayo Konishi; 珠世小西; Yoichi Ido; 洋一井戸; Haruki Otsuki; 晴樹大月; Koichi Katsuyama; 浩一勝山
Original assignee: Iseki and Co Ltd; Iseki Agricultural Machinery Mfg Co Ltd
Current assignee: Iseki and Co Ltd; Iseki Agricultural Machinery Mfg Co Ltd
Priority date: 1992-12-28
Filing date: 1992-12-28
Publication date: 1994-07-19

Abstract

(57)【要約】【目的】従来技術の持つ課題を解決し、純度の高いタ
マネギのＤＮＡの抽出率を高める方法を確立すること【構成】タマネギの母球の鱗葉をスライスしたものを
凍結乾燥した後、ＤＮＡ抽出液を添加する前段におい
て、核を破壊しない組成の溶液を加え、核のみを集め、
その後微粉末にした上で界面活性剤を含む抽出液でＤＮ
Ａ抽出を開始するタマネギのＤＮＡ抽出方法である。Ｄ
ＮＡ抽出液を添加する前に核を破壊しない溶液を加える
ことにより、核を集めることが可能となり、細胞中のオ
ルガネラや多糖類を除去できるので、より精製度の高い
ＤＮＡを得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はタマネギの品種改良をア
シストするＲＦＬＰマップや、組み替えＤＮＡ技術の開
発に利用するためのＤＮＡの抽出方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】タマネギのＤＮＡの抽出に成功すると、
このＤＮＡを用いて遺伝子工学的手法により、既知の遺
伝子をプローブとして、新しい遺伝子をクローニングす
ることができる。そしてこのクローニング遺伝子を改変
するか、あるいは他の生物の遺伝子をゲノムへ導入する
ことにより、新品種を育成することができる。また、タ
マネギのＤＮＡの抽出により、ＲＦＬＰ地図を作り、育
種年限の短縮が可能となる。このようにタマネギのＤＮ
Ａの抽出に成功すると、タマネギの品種の改良技術の開
発に測り知れない利点がある。しかも、より純粋なＤＮ
Ａが得られると、より少量の制限酵素、リガーゼ等とこ
のＤＮＡを反応させることができ、遺伝子工学を利用し
た育種改良研究において、ＤＮＡ量の見積りが正確に行
え、実験精度が向上し、また、その結果蓄積された技術
を用いる育種コストが低減できる。しかし、タマネギＤ
ＮＡの抽出方法については現在まで知られていない。

【０００３】日本生化学会編、「生化学実験講座２、核
酸の化学I」７６頁、（株）東京化学同人、１９７５年
５月発行によるとＤＮＡ抽出のための核の分離方法とし
て肝臓にショ糖−ＣａＣｌ₂水溶液を用いて核を分離す
る方法が記載されている。しかし、この方法は動物生細
胞を材料としているものであり、細胞壁を破壊して、同
時に無傷の核を分離する必要性のため、そのまま植物に
適用することは難しい。また、高濃度のショ糖を使用す
るので操作しにくい欠点がある。

【０００４】また、本発明者らは先にタマネギの母球の
鱗葉をスライスしたものを凍結乾燥した後、微粉末にし
た上で界面活性剤を含む抽出液でＤＮＡ抽出を開始する
タマネギのＤＮＡ抽出方法について発明した（特願平４
−１２９４７３号）。しかし、この方法では細胞から核
を分離せず直接ＤＮＡ抽出を行うので多糖類の混入が多
く、後の研究に障害となることが多かった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】より純粋なＤＮＡが得
られると、より少量の制限酵素、リガーゼ等とこのＤＮ
Ａを反応させることができ、遺伝子工学を利用した育種
改良研究において、ＤＮＡ量の見積りが正確に行え、実
験精度が向上し、また、その結果蓄積された技術を用い
る育種コストが低減できる。そこで、本発明の目的は前
記従来技術の持つ課題を解決し、純度の高いタマネギの
ＤＮＡの抽出率を高める方法を確立することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的はタマ
ネギの母球の鱗葉をスライスしたものを凍結乾燥した
後、ＤＮＡ抽出液を添加する前段において、核を破壊し
ない組成の溶液を加え、核のみを集め、その後界面活性
剤を含む抽出液でＤＮＡ抽出を開始するタマネギのＤＮ
Ａ抽出方法によって達成される。

【０００７】

【作用】一般に、植物体のＤＮＡを抽出する方法として
液体窒素存在下で植物組織を破砕してＤＮＡを抽出する
方法が行われている。しかし、この方法は、鱗葉のよう
に水分含量が多い組織を液体窒素中で凍結処理すると組
織中の水分が凍結してしまうため、破砕しにくくなると
同時に、液体窒素で破砕すると、材料の一部が溶けた
り、再度氷結したりすることがある。そのため、染色体
に著しい損傷を与える。そこで、タマネギの母球から核
ＤＮＡを抽出する場合には、母球の鱗葉を１〜３ｍｍ幅
にスライスした後、冷却アセトン等で凍結させ、その
後、凍結乾燥処理をすることで、組織中の水分が凍結す
ることがなくなり、以後の組織の微粉末化が容易とな
り、抽出液によるＤＮＡ抽出が可能となる。

【０００８】上記の知見は本発明者らの先の特許出願
（特願平４−１２９４７３号）に開示した通りである
が、本発明では、さらに、ＤＮＡ抽出液を添加する前
に、核を破壊しない溶液を加えることに特徴がある。こ
の、核を破壊しない溶液により核を集めることが可能と
なり、また、細胞中のオルガネラや多糖類を除去できる
ので、より精製度の高いＤＮＡを得ることができる。

【０００９】

【実施例】本発明の一実施例を説明する。以下に、タマ
ネギのＤＮＡの抽出の手順を示す。冷蔵貯蔵していたタマネギ（品種：七宝甘球）母球の
表皮根部を切除し、鱗葉組織１７６ｇをスライスする。で得られた鱗葉組織のスライスを５００ｍｌのナス
型フラスコに入れ、予め、冷却しておいたアセトン中で
凍結させる。その後、凍結乾燥器（東京理化機械（株）
製ＦＤ−１）で４日間処理する。凍結乾燥したサンプルを乳鉢、乳棒で細かく砕く。サンプル１ｇを５０ｍｌファルコンチューブに入れ
て、下記のＡ液２０ｍｌを加え、かきまぜる。この溶液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離処理を
した後、上清液を除き、下記のＢ液１５ｍｌをくわえ
て、沈殿をけん濁させる。

【００１０】次に、溶液を遠心用チューブに移し、２
ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加
え、ゆっくり撹拌する。６０℃で１０分間撹拌した後に、５ｍｌ、５モルの酢
酸カリウムを加え撹拌する。次いで、氷冷１０分後に、１００００ｒｐｍで２０分
間遠心分離処理をした後、上清液を新しいチューブへ移
し、等量のイソプロパノールを加えて、１００００ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離して、ペレットを得る。得られたペレットを７０％エタノールで２回リンスし
た後、真空乾燥し、１ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ
のTris−ＨＣｌ（（ｐＨ８．０））にペレットを溶か
す。

【００１１】Ａ液Ｂ液０.２Ｍショ糖１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）２.５ｍＭＥＤＴＡ５０ｍＭＥＤＴＡ２.５ｍＭＤＴＴ５００ｍＭＮａＣｌ１０ｍＭＮａＣｌ１０ｍＭ２-メルカプトエタノール１０ｍＭＫＣｌ

【００１２】上記プロセスにより得られた本実施例のタ
マネギのＤＮＡの収量は１０３μｇ／生重量１０ｇ（乾
重量１ｇ）であった。このＤＮＡは図１の吸光度による
と２６２ｎｍ付近にピークを示すので、高純度のＤＮＡ
が得られたものと言える。本発明者らの先の発明（特願
平４−１２９４７３号）での収量は３７μｇ／生重量１
ｇであったので本実施例の方法は収量は約１／４である
が、原料のタマネギを多量に用いれば大量のＤＮＡ抽出
が可能であり、収率はさして問題とならない。それより
も、先の発明（特願平４−１２９４７３号）に比べ、本
実施例の方法では多糖類を著しく低減することができる
ということがより重要である。

【００１３】次に、上記本発明に関連したタマネギＤＮ
Ａ抽出法について述べる。ネギ類は一般に粘質物を含ん
でいるが、その粘質物の構成物質はセルロース、ヘミセ
ルロース、プロトペクチン、水溶性ペクチンなどであ
り、それらの結合様式はα−１，４−グルコシド結合や
β−１，４−またはβ−１，３−グルコシド結合であ
る。ところで、「実験生物学講座１７，植物生理学［Ｉ
ＩＩ］」２７８頁、丸善（株）発行にはＳＤＳを含む含
む抽出液でＤＮＡ粗抽出した後、きょう雑物の除去を目
的として各種酵素を添加する方法でブンドウ（Phaseolu
s aureus）のＤＮＡを抽出する方法が開示されている。
この方法ではαアミラーゼを用いているが、このα−ア
ミラーゼはα−１，４−グルコシド結合を分解するもの
で、ネギ類の粘質物中のセルロースやペクチンなどは分
解できない。

【００１４】そこで、タマネギなどの粘質物を含有する
植物体からＤＮＡを大量抽出するために、次のような手
段でＤＮＡ抽出を試みた。すなわち、ＤＮＡ粗製液へ加
水分解酵素を添加することを特徴とするＤＮＡ抽出法で
ある。上記加水分解酵素はタマネギなどのα−１，４−
グルコシド結合、β−１，４−グルコシド結合およびβ
−１，３−グルコシド結合をランダムに加水分解する酵
素を用いる。その具体例はα−アミラ−ゼ（α−１，４
−結合を切断する）、セルラーゼ（β−１，４−結合を
切断する）、ペクチナーゼ（α−１，４−結合を切断す
る）である。

【００１５】また、用いる酵素の濃度は酵素標品中に含
有されているＤＮａｓｅ活性が通常のＤＮＡ抽出法と同
程度の活性を示す範囲であり、望ましくはα−アミラー
ゼ１００μｇ／ｍｌ、セルラーゼ５０μｇ／ｍｌ、ペク
チナーゼ２００μｇ／ｍｌ以下で使用する。加水分解酵
素を作用させるバッファ液のｐＨは５．５〜６．５、望
ましくは６．０とする。このｐＨの調整は前記実施例の
ステップにおけるｐＨ７〜８のＴＥバッファ液のｐＨ
を途中でｐＨ６に置換することで行う。

【００１６】一般に、ＤＮＡの抽出、精製時によく用い
られる酵素はＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）だが、この
酵素は活性が強く、ｐＨに対する特異性が低い。そのた
め特別なバッファを必要としていないため、ＲＮａｓｅ
を用いるとＤＮＡ抽出バッファのｐＨは前記実施例のス
テップの７〜８で十分であり、バッファの置換は必要
としていない。しかし、上記加水分解酵素を用いると当
該酵素の最適ｐＨで作用させることができ、少量の酵素
で多糖類を除去できる。このように、上記ＤＮＡ粗製液
へ加水分解酵素を添加することを特徴とするＤＮＡ抽出
法により、物理的手法では限界がある多糖類の除去を化
学的手法により効果的に行え、物理的切断力がＤＮＡに
加えられないのでＤＮＡの低分子化がさけられる。

【００１７】具体例で上記ＤＮＡ粗製液へ加水分解酵素
を添加するＤＮＡ抽出法を説明すると、次のような手順
で行う。（１）冷蔵貯蔵していたタマネギ（品種：七宝甘球）母
球の表皮根部を切除し、鱗葉組織をスライスし、３００
ｍｌナスフラスコへ入れる。（２）約５０ｍｌの純水（ｄＤＷ）を加え７日間凍結乾
燥させる。（３）７日経過後乳鉢で破砕し、途中で、０．８４ｍ／
ｍ（メッシュＮｏ．２０）でふるい分けして、メッシュ
を通過したものを５０ｍｌのチューブに移し、−２０℃
で保存し（すぐに次のスフップに移行する場合は、この
低温保存は必要ない）、その中の１ｇを５０ｍｌ遠心チ
ューブに入れる。（４）２５ｍｌの下記のバッファー液であるＣ液を加
え、かくはんした後、１０分間静置し、１５００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離して、上清液を捨てる。（５）前記（４）の操作を繰り返した後、１５ｍｌのバ
ッファー液である下記のＤ液を加えて懸濁させ、さら
に、２１５０μｌの１０％ＳＤＳ加える。

【００１８】（６）この液をゆっくり撹拌して、６０℃
で１０分間静置させ、５．４ｍｌの５モルの酢酸カリウ
ムを加え、ゆっくり撹拌する。（７）次いで、氷中に１０分間静置させ、途中、ゆっく
り撹拌する。（８）１０分経過後に１００００ｒｐｍで２０分間、４
℃で遠心分離する。（９）上清液をミラクロス２枚でろ過し、５０ｍｌチュ
ーブへ移す。（１０）同容量のイソプロパノールを加えてゆっくり撹
拌し３０分間静置する。（１１）２５００ｒｐｍで２０分間、１５℃で遠心す
る。沈殿物を冷７０％エタノールで２回洗い、その後、
風乾を４０分間行い、真空乾燥を５分間行う。（１２）この乾燥したペレットに５ｍｌのバッファー液
である下記のＦ液を加え、４℃で一昼夜静置後、溶液を
１５ｍｌのチューブへ移す。（１３）１０５μｌの１ｍｇ／ｍｌＲＮａｓｅ、２５μ
ｌの２０ｍｇ／ｍｌのα−アミラーゼ、２５μｌの下記
の酵素液を加え、３７℃で９０分間置く。

【００１９】（１４）次いで、１５０μｌの１０％ＳＤ
Ｓ、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え
て、３７℃に９０分間置く。（１５）その後、同容量のフェノール−クロロホルムを
加えて、２０分間ゆっくりと撹拌し、次いで、２８００
ｒｐｍで１５分間遠心分離する。（１６）得られた水相を新しいチューブに移し、同容量
のクロロホルムを加えて、２０分間撹拌する。（１７）次いで、２８００ｒｐｍで２０分間遠心分離処
理をした後、水相を新しいチューブへ移す。（１８）１／１０容量の３モルの酢酸ナトリウムを加
え、さらに、同容量のイソプロパノールを加えて、てい
ねいに撹拌し、その後、３０分間静置しておき、２８０
０ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する。得られる沈
殿物を７０％の冷エタノールで２回洗い、風乾３０分間
の後、デシケーターに５分間置いた後、１ｍｌのＴＥバ
ッファー液を加えて４℃で保存する。

【００２０】Ｄバッファー液Ｅバッファー液０.２Ｍショ糖１００ｍＭ Tris-ＨＣｌ(ｐＨ８) １.０ｍＭＥＤＴＡ５０ｍＭＥＤＴＡ２.５ｍＭＤＴＴ５００ｍＭＮａＣｌ１０ｍＭｐＨ緩衝剤ＭＥＳ１０ｍＭ２-メルカプトエタノール１０ｍＭＮａＣｌ (ｐＨ６) １０ｍＭＫＣｌ(ｐＨ６)

【００２１】Ｆバッファー液酵素液１ｍＭＥＤＴＡ１％セルラーゼオノズカＲＳ１０ｍＭＭＥＳ(ｐＨ６) ０.５％マセロザイムＲ-１００.２％ペクトリアーゼＹ-２３１０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６）３７℃、１ｈｒ．のインキュベーションなお、Tris-ＨＣｌとはトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンを水溶液として、ＨＣｌでｐＨを調節したも
のである。

【００２２】こうして上記加水分解酵素を用いると当該
酵素の最適ｐＨで作用させることができ、少量の酵素で
多糖類を除去できる。また、上記ＤＮＡ粗製液へ加水分
解酵素を添加することを特徴とするＤＮＡ抽出法によ
り、物理的手法では限界がある多糖類の除去を化学的手
法により効果的に行え、物理的切断力がＤＮＡに加えら
れないのでＤＮＡの低分子化がさけられる。

【００２３】

【発明の効果】液体窒素による凍結が不要であり、繁雑
な操作を必要としない。また、核を集めることにより細
胞中のオルガネラや多糖類を除去できるのでより精製度
の高いＤＮＡを得ることができる。プロトプラストから
でも核を集められるが大量の核を得るためには高価な酵
素が必要となるが本方法ではそのようなものは必要とし
ない。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例で得られたタマネギＤＮＡ溶
液の吸光度分布。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大月晴樹茨城県稲敷郡阿見町大字阿見4818 井関農機株式会社筑波研究所内 (72)発明者勝山浩一茨城県稲敷郡阿見町大字阿見4818 井関農機株式会社筑波研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タマネギの母球の鱗葉をスライスしたも
のを凍結乾燥した後、ＤＮＡ抽出液を添加する前段にお
いて、核を破壊しない組成の溶液を加え、核のみを集
め、その後界面活性剤を含む抽出液でＤＮＡ抽出を開始
することを特徴とするタマネギのＤＮＡ抽出方法。