JPH06197764A

JPH06197764A - 超転位性を付与するｄｎａ配列とそれを用いて構築されるベクター

Info

Publication number: JPH06197764A
Application number: JP5249147A
Authority: JP
Inventors: Richard H Baltz; リチャード・ヘンリー・バルツ; Patricia Jean Solenberg; パトリシア・ジーン・ソレンバーグ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1992-10-08
Filing date: 1993-10-05
Publication date: 1994-07-19
Also published as: MX9306163A; EP0629698A1; CA2107505A1; IL107179A0

Abstract

(57)【要約】【構成】Ｔｎ５０９９-７における自発的な突然変異
によって生成した５７塩基対配列のＩＲ-Ｌ５０９９-１
０およびその機能的断片。【効果】ＩＲ-Ｌ５０９９-１０はＩＲ-Ｌ５０９９-１
０を含む転位因子に超転位活性を付与する。ＩＲ-Ｌ５
０９９-１０を含むベクターはストレプトミセス、チャ
イニア、サッカロポリスポラ、ストレプトベルチシリウ
ムおよびマイコバクテリウムなどの様々な細菌で有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】トランスポゾン、挿入配列および転位性バ
クテリオファージなどの転位因子は原核細胞と真核細胞
の両方で発見されている。これらの因子は、ゲノムに沿
うわずかな部位または多数の異なる部位で挿入を起こす
ことができる。ＤＮＡの相同性がなくても転位および挿
入するというこの能力は、転位因子を強力な遺伝子手段
として活用することを可能にしている。このような因子
のいくつかの使用例には、遺伝子マッピング、プロモー
タープローブとしての使用、挿入突然変異体の構築、遺
伝子間組換えの媒介、受容株のゲノムへの遺伝子情報の
挿入、および特定の遺伝子の遺伝子タッギング(標識化)
が含まれる。

【０００２】ストレプトミセスとそれに関連する属にお
ける組換えＤＮＡ技術の開発と活用は、これらの細胞の
ゲノム中に外来のＤＮＡまたは複数コピーの天然のＤＮ
Ａを導入するための遺伝子手段が利用可能であるかどう
かに依存する。この開発は、ストレプトミセスとそれに
関連する属(ストレプトベルチシリウム(Streptovertici
llium)、サッカロポリスポラ(Saccharopolyspora)、チ
ャイニア(Chainia)およびマイコバクテリアなど)で現在
利用できる転位因子の数が極めて少ないという事実によ
って遅れている。

【０００３】ストレプトミセスでの使用が可能な転位因
子には、ＩＳ１１０(Bruton,C.およびK.Chater,1987,Nu
cleic Acids Res.,15:7053-7065)、ＩＳ２８１(Sladkov
a,A.1986,Mol.Biol.,20:878-881)、Ｔｎ４５５６(Chun
g,S.,1987,J.Bacteriol.,169:4436-4441)、ストレプト
ミセス・コエリコラー(Streptomyces coelicolor)に由
来する２.６キロ塩基の小環状体(Lydiate,D.ら,1986,Mo
l.Gen.Genet.,203:79-88)およびＩＳ４９３とそれから
誘導されるトランスポゾンが含まれる。

【０００４】挿入配列ＩＳ４９３は、トランスポゾント
ラップを用いてストレプトミセス・リビダンス(Strepto
myces lividans)から単離された。Solenberg,P.および
S.Burgett,1989,J.Bacteriol.,171:4807-4813。ＩＳ４
９３を使用して様々なトランスポゾンが開発されてい
る。Solenberg,P.およびS.Burgett,1989,J.Bacteriol.,
171:4807-4813、McHenney,M.およびR.Baltz,1991,J.Bac
teriol.,173:5578-5581、Hahn,Dら,1991,J.Bacteriol.,
173:5573-5577およびSolenberg,P.およびR.Baltz,1991,
J.Bacteriol.,173:1096-1104を参照のこと。上記のトラ
ンスポゾンは様々なアクチノミセス目の遺伝子操作に有
用であることが立証されている。ＩＳ４９３から誘導さ
れたトランスポゾンは約１０^-6の転位頻度を示す。

【０００５】Hahnら(上記)によって記述されたｘｙｌＥ
プロモータープローブトランスポゾンであるトランスポ
ゾンＴｎ５０９９を、ｘｙｌＥの構成的生産を駆動する
プロモーターを含むように改変した。トランスポゾンＴ
ｎ５０９９-７は、構成的に発現されるｘｙｌＥ遺伝子
を含有するＴｎ５０９９誘導体の名称である。ｘｙｌＥ
の構成的発現はｘｙｌＥ生産に対する選択圧をもたら
し、最終的にはｘｙｌＥプロモーターとコード配列の領
域での欠失を導いた。この欠失にはＴｎ５０９９- ７の
５'逆方向反復の一部が含まれ、５０〜５７塩基領域に
おける変化を伴う改変された逆方向反復が生成した(セ
ンス鎖から左から右へ解読)。この改変された５'逆方向
反復をＩＲ-Ｌ５０９９-１０と命名する。これはＩＲ-
Ｌ５０９９-１０を含むトランスポゾンと他の因子に超
転位性を付与する。

【０００６】Ｔｎ５０９９-７中の自発的な欠失によっ
て生成した逆方向反復であるＩＲ-Ｌ５０９９-１０は、
それを用いて構築される転位因子に超転位活性を付与す
る。

【０００７】本明細書で使用する用語を下記の如く定義
する。Ａｍ^R：アプラマイシン(apramycin)耐性表現型またはそ
れを付与する遺伝子。Ａｍ^R遺伝子はａａｃ(３)ＩＶと
も呼ばれる。Ａｐ^R：アンピシリン耐性表現型またはそれを付与する
遺伝子。遺伝子：プロモーター機能、リボソーム結合部位および
翻訳可能な遺伝子生成物をコード化するＤＮＡセグメン
ト。Ｈｍ^R：ハイグロマイシン耐性表現型またはそれを付与
する遺伝子。超転位：１０^-5またはそれ以上の頻度の転位因子による
転位。挿入配列：挿入機能に無関係な既知の遺伝子をコード化
しない小さい(一般的には２０００ｂｐ未満)因子。逆方向反復：挿入配列またはトランスポゾンの宿主細胞
ＤＮＡへの挿入を容易にする、挿入配列およびトランス
ポゾンの末端にあるＤＮＡ配列。逆方向反復はＩＲと略
記され、場合によって、それらが挿入配列またはトラン
スポゾンのどちらの末端を定義するかを示すためにＩＲ
-ＬおよびＩＲ-Ｒと記される。ここにＩＲ-Ｌは左(５')
反復であり、ＩＲ-Ｒは右(３')反復である。Ｏｒｉ：複製起点。複製起点：特定の宿主細胞中で染色体外因子の複製を可
能にするＤＮＡ配列。組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー：自律的に複製することができるあらゆる物質であっ
て、プラスミドやファージを包含するが、これらに限定
されず、１またはそれ以上の追加のＤＮＡセグメントを
付加することができるＤＮＡ分子からなるか、もしくは
１またはそれ以上の追加のＤＮＡセグメントが既に付加
されているＤＮＡ分子からなる。選択可能標識：既知の機能を有する遺伝子または遺伝子
の組み合わせであって、その発現を容易に決定すること
ができるもの。形質転換：受容宿主細胞中へのＤＮＡの導入。転位因子：トランスポゾン、挿入配列、あるいはゲノム
中のわずかな部位または多数の部位で挿入することがで
きる二本鎖ＤＮＡの独立した切片。トランスポゾン：一般に２ｋｂより大きい転位因子であ
って、挿入機能には無関係な追加の決定因子(抗生物質
耐性や重金属耐性を付与する遺伝子または生合成遺伝子
など)を含有してもよい。

【０００８】本発明は超転位特性を付与する新規な配列
を提供し、その配列をＩＲ-Ｌ５０９９-１０と命名す
る。Ｔｎ５０９９-１０はＩＲ-Ｌ５０９９-１０を含
む。Ｔｎ５０９９-１０は、本発明のＩＲ-Ｌ５０９９-
１０超転位性配列を用いて構築することができるトラン
スポゾンの具体例である。Ｔｎ５０９９-１０と本発明
の超転位性配列を含有する他のベクターは、染色体遺伝
子を挿入的に不活化する際や何らかの種類の外来ＤＮＡ
をストレプトミセスのゲノム中に挿入する際に有用であ
ると共に、遺伝子マッピング、プロモータープローブの
構築、挿入突然変異体の構築などにも有用である。本発
明のもう１つの側面は、他の新規なトランスポゾンを作
成するためにこの転位因子を使用することである。した
がって本発明は、ストレプトミセス中で使用するために
長年にわたって必要とされてきた上述のような独立し明
確に定義された因子を実現する助けとなり、それによっ
て染色体外因子や相同的組込みに依存することから当業
者を解放するものである。驚くべきことにＩＲ-Ｌ５０
９９-１０因子は、ＩＳ４９３から誘導された他のトラ
ンスポゾン(Ｔｎ５０９６およびＴｎ５０９９を含む)よ
り約１０³倍高い転位頻度をもたらし、それゆえに、宿
主生物中への興味ある遺伝子のより高い転位頻度を容易
に達成する手段を提供する。

【０００９】Youngman,Philip,「Plasmids：A Practica
l Approach」(K.Hardy編,ＩＲＬプレス,インコーポレイ
テッド，英国オクスフォード，７９〜１０３頁)に記述
されている手法にストレプトミセス中での成長のための
改良を加えて、Ｔｎ５０９９-１０の定常状態転位頻度
を決定した。温度感受性デリバリーベクターを用いる３
複製実験を行った。等価な実験条件下におけるＴｎ５０
９６およびＴｎ５０９９との比較によって、Ｔｎ５０９
９-１０の超転位活性を立証した。その結果を表１に要
約する。

【表１】トランスポゾン転位頻度Ｔｎ５０９６４.３×１０^-6 Ｔｎ５０９９１０^-6未満Ｔｎ５０９９-１０２.５×１０^-3

【００１０】上に要約した実験は、ＩＲ-Ｌ５０９９-１
０がＩＳ４９３に基づく従来のベクターより約１０００
倍高い転位頻度を付与することを明らかにしている。こ
の１０００倍高い転位頻度が、ある細胞内で遺伝子添加
量(ある与えられた遺伝子のコピー数)を増大させるため
の容易な手段を与え、それゆえに、代謝産物の生合成経
路の律速酵素の遺伝子添加量を増大させることによって
抗生物質や免疫抑制薬などの代謝産物の生産収率を改善
する上で莫大な利益をもたらし得ることは、当業者に理
解されるであろう。

【００１１】Ｔｎ５０９９-１０は、科学的文献に記述
されているＴｎ５０９９に類似している。Hahn,R.ら,19
91,J.Bact.,173:5573-5577を参照のこと。Ｔｎ５０９９
は、ＩＳ４９３にｘｙｌＥコード配列、ハイグロマイシ
ン耐性遺伝子およびマルチクローニング部位を付加する
ことによって構築された。また大腸菌中でハイグロマイ
シン耐性遺伝子産物の転写を達成し、それによって大腸
菌形質転換体の簡便な同定を可能にするために、Ｔｎ５
０９９は、ハイグロマイシン耐性遺伝子配列の５'側に
位置するファージラムダｐＬプロモーターをも含有して
いる。ＩＳ４９３のヌクレオチド配列はSolenberg,P.お
よびBurgett,S.J.,1991,Bact.171:4807-4813に教示され
ている。

【００１２】Ｔｎ５０９９-１０の制限部位と機能地図
を図３に示す。Ｔｎ５０９９-１０の末端に位置する逆
方向反復は、図３の矢印で示されるように逆向きであ
る。ラムダｐＬプロモーターはハイグロマイシン耐性遺
伝子の５'側に位置する。ハイグロマイシン耐性遺伝子
はその同種プロモーターを含有しており、これはアクチ
ノミセス類中で機能することができる。大腸菌形質転換
体の選択のためにファージラムダプロモーターを付加し
た。２つの読み取り枠(ＯｒｆＡとＯｒｆＢ)はSolenber
gおよびBurgettの上記文献に記述されている。ＯｒｆＢ
の翻訳産物はトランスポザーゼであると考えられる。Ｏ
ｒｆＡの機能はまだ解明されていない。ＯｒｆＡの機能
性はＩＳ４９３に基づくトランスポゾンの転位にとって
必須でない。

【００１３】Ｔｎ５０９９-１０のヌクレオチド配列を
配列番号１として次に記載する。

【００１４】 GAGCGTTTTT CAACCTCAGG CTGACGGGGT CAGGGGTCAG AGGCGAGGTA ACCATCTGCG GTGATAAATT ATCTCTGGCG GTGTTGACAT AAATACCACT GGCGGTGATA CTGAGCACAT CAGATCGGTC GTCGAGGTCC ACAGGCCCTC GGCGACGTTC CGCCGGGCCT CGGCGACCGC CGCGTCGAGG CGCCGGTCGA AGGGGCAGTC CTCCACGGGC AGCTCGTGGA GGGCGCGGGC CAGCTCCGCC ATCGCCTCGA CCACGGCGAA CCGCTGGTGC TCGGGCCACT CCTCGGCCGC CGCGACGCCG GGGACGGCCT CCGTGACGAG CCACGCGGCG GTGTCGTCGG CACCGCGCTC GACGACGCGG GGGACGGGGA TCGGCGGGGC CTGGCGGCGC CTCGCCGTCG CAGAACCAGG CGGTGGCGTA CACCGTCGCC TCGGTCGGCC CGTAGAGATT GGCGATCCCG ACCGCAGCAC CACCGAGAAC GTCCCCGACG TGGCCGACCA GCCCGTCATC GTCAACGCCT GACCGCGGTG CGGACAGGCC GTGTCGCGAC CGGCCGTGCG GAATTAAGCC GGCCCGTACC CTGTGAATAG AGGTCCGCT GTG ACA CAA GAA TCC CTG TTA CTT CTC GAC CGT ATT GAT TCG GAT GAT TCC TAC GCG AGC CTG CGG AAC GAC CAG GAA TTC TGG GAG CCG CTG GCC CGC CGA GCC CTG GAG GAG CTC GGG CTG CCG GTG CCG CCG GTG CTG CGG GTG CCC GGC GAG AGC ACC AAC CCC GTA CTG GTC GGC GAG CCC GAC CCG GTG ATC AAG CTG TTC GGC GAG CAC TGG TGC GGT CCG GAG AGC CTC GCG TCG GAG TCG GAG GCG TAC GCG GTC CTG GCG GAC GCC CCG GTG CCG GTG CCC CGC CTC CTC GGC CGC GGC GAG CTG CGG CCC GGC ACC GGA GCC TGG CCG TGG CCC TAC CTG GTG ATG AGC CGG ATG ACC GGC ACC ACC TGG CGG TCC GCG ATG GAC GGC ACG ACC GAC CGG AAC GCG CTG CTC GCC CTG GCC CGC GAA CTC GGC CGG GTG CTC GGC CGG CTG CAC AGG GTG CCG CTG ACC GGG AAC ACC GTG CTC ACC CCC CAT TCC GAG GTC TTC CCG GAA CTG CTG CGG GAA CGC CGC GCG GCG ACC GTC GAG GAC CAC CGC GGG TGG GGC TAC CTC TCG CCC CGG CTG CTG GAC CGC CTG GAG GAC TGG CTG CCG GAC GTG GAC ACG CTG CTG GCC GGC CGC GAA CCC CGG TTC GGC CAC GGC GAC CTG CAC GGG ACC AAC ATC TTC GTG GAC CTG GCC GCG ACC GAG GTC ACC GGG ATC GTC GAC TTC ACC GAC GTC TAT GCG GGA GAC TCC CGC TAC AGC CTG GTG CAA CTG CAT CTC AAC GCC TTC CGG GGC GAC CGC GAG ATC CTG GCC GCG CTG CTC GAC GGG GCG CAG TGG AAG CGG ACC GAG GAC TTC GCC CGC GAA CTG CTC GCC TTC ACC TTC CTG CAC GAC TTC GAG GTG TTC GAG GAG ACC CCG CTG GAT CTC TCC GGC TTC ACC GAT CCG GAG GAA CTG GCG CAG TTC CTC TGG GGG CCG CCG GAC ACC GCC CCC GGC GCC TGA CGC CCC GGG TGA AGA GCC CCGTCGGGCG GTGCCTGACG GGGCTTCTCA GTTAACCTAG GATCCATGGC GGCCGCAATA TTAATCAGGC TGACGGGGTC AGGGGTCAGA GGCGGGGTCT GGATCAGCGC GAGCGGTCGT GAGGTAGTAC CGGTTGCGCT CGAAGCTCAC TGCCGTCTAG GACAGAAGCT GACCCTAGCT CACGCCTACC GTCGCTGCTG GCAAGCAACA TCAGCGAAAG GACCGCG ATG CCC CAG CAG ACC AGC CCC GAG CCG GAG GGC TAC ACC ACC GTT GCG CCC TGG GTC GTC ACC GAC GAC ACG GGG GCT TTC CTC GAC TTC GTC ACC CAG GCA TTC GGG GGC GAG GAA CTC GGG CGG GTG TCG ACC GAG GAG GGC TTG ATC GGT CAC GCT GAG ATC CGA GTC GGC GAC ACC GTC GTG TTG GCC TTC GAC CGA CAC ACG GAC TGG CCC GCC ATG CCG AGC CTG CTG CGC GTA TTT GTC GCC GAT GCG GAC GAG GCG TTT TCC CAG GCC GTC GCA GCT GGC GGC TAT GTC GTC ACT TCC CTG GCC GAC GAC GCC TTC GGA CAG CGC GGA GGG CGC ATC AAG GAC CCC TTC GGC AAT ATC TGG TGG GTG GTC AGC TGC GTT GAG GAC GTC TCT GAG GGC GAG ATG TGG AAG CGG CTG CAG GAC CCC GTA TAC GCC GAG GCC ATG CGC GTG GCT CAG GAG ACA CTC GAC GCC GAG CTC AGC GGT CGA CGC CAC GGG CGC AGC AGC GCA CCC GTC AGG ACA ACC AGC TAG ACCCACGACG TCGGGGTTCG CATGCGCCAG ACCGGTAGCC AAGGAGCGTC TTCATTCTGC TTCGGCAGCT TGCGGGTTGG CCTGACACAG GGGTGAAGCC CCTGGTAGAT GGGTTTTCGA CCAAGAAATC CGTCTCTACT AGAGGCTTCAC GTG CTT GTT TAC CCC TCC GGG CTG GAC GTG TCC AGT TCT GCC CTC CGC TTC CTC TCC GCC CGT CTG CGG GAA CAC CGC CGT GGT CTC GGC ACC CGG TGG CGG CGC CTG AGC GCA GGT CGG CAG GCT CTG CTC GCC CTC GCC CAT CTC CGC AAC GGT CAT CCG TAT GTG CAG CTC GCG GCC GGG TTC GGC GTG GGC ACC ACC ACT GCC TAC CGC TAC GTC ACC GAG GCA GCT GAG GTT CTG GCC GCC CTT GCC CCG ACG CTC GCC GAG GCG GTC CGG GCG GCG TCG ATG AAG GCG TTC GTC CTG CTG GAC GGG ACG CTG CTG CCG ATC GAC CGA ATC GCC GCC GAC CGG CCT TTC TAC TCG GGC AAG CAC AAG AAA CAC GGG ATG AAC GTA CAG GTG ATC GCA GAT CCT TCC GGC CGC CTG CTG TGG GCC TCG CCG GCC CTG CCC GGA GCC GTC CAC GAC GTC CGT GCG GCC CGC GAG CAC GGC ATC ATC GAC ACG CTT GCC ACA GCC GAC GTC AAC TGC TGG GCA GAC AAG GGC TAC CAG GGC GCC GGA GGC ACG GTC CGT GTT CCC TAC CGC GGC CGG TGG GAG ACG CTC TCT GCA GGG CAG CAG GCC GTC AAT CGA TCC CAC GCG AAG ATC CGG GCG CTC GTC GAG CAA GCC GTC GCG ACC CTC AAG TCC TGG CGA CTC CTT CGC AGG CTC CGT TGC TCG ACC ACC CGC GTC ACG GTC CTC GTC CAG GCC GTC CTC TGC CTG CAT CAG GCC AGC TCA GCT TGA GGATGGAAAACGCTC

【００１５】配列番号１のヌクレオチド配列は、図３に
記載するＴｎ５０９９-１０の制限部位および機能地図
との関連で読むべきである。

【００１６】Ｔｎ５０９９-１０の超転位活性は５'挿入
配列の最初の５７ヌクレオチドに極在化されていた。配
列番号１のこれら最初の５７ヌクレオチドをＩＲ-Ｌ５
０９９-１０と命名する。超転位活性を付与する配列番
号１の領域(ＩＲ-Ｌ５０９９-１０)には、Ｔｎ５０９９
-７からｘｙｌＥ遺伝子が自発的に欠失してＴｎ５０９
９-１０を生成するときに生成した、図３でＩＳ４９３-
１０スプライス部位と同定する配列を包含する。ＩＲ-
Ｌ５０９９-１０の配列を配列番号５として次に記載す
る。

【００１７】 GAGCGTTTTT CAACCTCAGG CTGACGGGGT CAGGGGTCAG AGGCGAGGTA ACCATCT

【００１８】配列番号１、配列番号５および図３の教示
を組み合わせると、ＩＲ-Ｌ５０９９-１０(配列番号５)
の超転位機能を使用する無数の様々なベクターの構築が
可能になる。図３は制限エンドヌクレアーゼ部位を示し
ているので、ＩＳ４９３の(図３で見て)左端にある逆方
向反復を単にＩＲ-Ｌ５０９９-１０配列で置換するだけ
で、ＩＳ４９３ベクターからＩＲ-Ｌ５０９９-１０ベク
ターを容易に構築することができる。配列番号１は図３
で見て左から右に、配列番号５である逆方向反復(ＩＲ-
Ｌ５０９９-１０)、ファージラムダの左側プロモータ
ー、ハイグロマイシン耐性遺伝子、マルチクローニング
部位、ＯｒＦＡ、ＯｒＦＢおよびＩＳ４９３の元来のＩ
Ｒ-ＲからなるＴｎ５０９９-１０のヌクレオチド配列を
表している。図３の制限部位と機能地図には制限エンド
ヌクレアーゼ部位に対応するオリゴヌクレオチド番号
(左から右に読む)が提示されているので、配列番号５を
含むベクターを作成するために配列番号１の成分を利用
することは慣用の手法になる。実施例１Ｃは、プラスミ
ドｐＣＺＡ１４１(ＮＲＲＬＢ１８４１７)の唯一のＳ
ａｕＩ部位中に容易に挿入されてｐＣＺＡ１４１-１０
をもたらすリンカーの合成を教示している。当業者がＩ
Ｓ４９３挿入配列とそれから誘導されるトランスポゾン
に関する追加の情報を得たい場合には、Hahnら(上記)、
SolenbergおよびBaltz(上記)、McHenneyおよびBaltz(上
記)並びにSolenbergおよびBurgett(上記)の教示を参照
すればよく、これらの教示はすべて参考文献として本明
細書の一部を構成するものとする。

【００１９】実施例１はＩＳ４９３配列から誘導される
トランスポゾンの構築を教示する。かなり高い頻度で転
位するベクターは、単にＩＳ４９３を含むベクター中の
対応する部分を配列番号５のＩＲ-Ｌ５０９９-１０で置
換するだけで容易に調製される。Ｔｎ５０９６とＴｎ５
０９９について記述している文献については上記の項で
言及した。当業者は上述の関連するトランスポゾンをＩ
Ｒ-Ｌ５０９９-１０ベクターに変換することの容易さを
理解するであろう。

【００２０】ＩＳ４９３転位因子は、ＮＲＲＬに寄託さ
れその永久保存培養コレクションの一部を形成している
株、大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／ｐＣＺＡ１４１から従
来法で単離することができるプラスミドｐＣＺＡ１４１
から得ることができる。大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／ｐ
ＣＺＡ１４１の培養物は受託番号ＮＲＲＬＢ１８４１
７の下にＮＲＲＬから入手することができる。プラスミ
ドｐＣＺＡ１４１の制限部位と機能地図を添付の図面の
図１に示す。

【００２１】ＩＳ４９３因子は２つの独立した読み取り
枠を含む。ＯｒｆＡと命名されている第１の読み取り枠
は１７７アミノ酸をコード化しており、唯一のＳａｕＩ
部位と唯一のＳｐｈＩ部位の間に認められる。ＯｒｆＢ
と命名されている第２の読み取り枠は２３３アミノ酸を
コード化しており、ＯｒｆＡから見てＩＳ４９３因子の
反対の末端に位置する。この部位中に連結されるアプラ
マイシン耐性付与遺伝子(ａａｃ(３)ＩＶ)はどちらの方
向を向くこともできる。プラスミドｐＣＺＡ１５６中に
認められるＴｎ５０９６は、ＯｒｆＡおよびＯｒｆＢの
反対の配向にあるａａｃ(３)ＩＶ遺伝子を含有する。プ
ラスミドｐＣＺＡ１５７中に認められるＴｎ５０９７は
ＯｒｆＡおよびＯｒｆＢと同じ配向にあるａａｃ(３)Ｉ
Ｖ遺伝子を含有する。Ｔｎ５０９６とＴｎ５０９７は共
に、この外来遺伝子をアクチノミセス目のゲノム中に組
込む際に有用である。ＩＳ４９３またはＩＲ-Ｌ５０９
９-１０に基づくベクター中に何らかの興味ある外来遺
伝子を連結することによって、その他多数の新規トラン
スポゾンを作成することができる。Ｔｎ５０９６とＴｎ
５０９７の制限部位と機能地図を添付の図面の図２に示
す。

【００２２】ＩＳ４９３ベクターまたは対応するＩＲ-
Ｌ５０９９-１０ベクターによって行われ得るような転
位事象は、ゲノムの様々な位置で転位が起こり得、組込
みのためにＤＮＡ相同性を必要としないので、極めて有
用である。さらに、転位機構によるＤＮＡの組込みは、
機能的な相同組換え系を持っている生物に制限されな
い。

【００２３】多くの異なる技術とクローニングベクター
を用いて宿主細胞中に転位因子を導入することができる
ので、ＩＲ-Ｌ５０９９-１０超転位性配列は決して本明
細書に記述するプラスミドでの使用に限定されるもので
はない。さらに、ＩＲ-Ｌ５０９９-１０因子を用いる転
位によって染色体中に組込まれる遺伝子の種類も基本的
に無制限である。具体例として挙げたプラスミドの抗生
物質耐性付与遺伝子を数多くの異なる抗生物質耐性付与
遺伝子で置換することができ、また、重金属耐性付与遺
伝子、二次代謝産物生合成遺伝子、それらの組み合わせ
で抗生物質耐性付与遺伝子を置換することもできる。宿
主細胞の染色体への二次代謝産物生合成遺伝子の安定な
組込みは所望の遺伝子産物の生産の増大をもたらすか、
あるいは新しい雑種遺伝子産物の生産をもたらすことが
できる。当業者は、基本的にどのような機能をコード化
するどのような遺伝子でも、本明細書に開示するＩＲ-
Ｌ５０９９-１０因子を用いて宿主染色体中に転位させ
得ることを理解するであろう。したがって、ＩＲ-Ｌ５
０９９-１０因子のパラメーター内のどのような外来Ｄ
ＮＡの付加も、本発明の範囲に包含されるであろう。

【００２４】この例示的なＤＮＡ配列には数多くの改変
と変種が考え得る。そのような改変はＩＲ-Ｌ５０９９-
１０ベクター中に新しい制限部位を導入することがで
き、その因子の有用性を著しく増大させる得るであろ
う。実際に、いくつかの改変はＩＳ４９３誘導体によっ
て制御される転位の頻度を潜在的に変化させ得る。これ
らの改変されたＩＲ-Ｌ５０９９-１０因子は、Ｔｎ５０
９９-１０を生成させたＩＲ-Ｌ５０９９-１０などのよ
うに自然に起こり得るし、あるいは、基本的にはItakur
aら,1977,Science,198:1056およびCreaら,1979,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,75:5765の手法に従って合成法によっ
て作成することができる。さらにシステック(Systec)１
４５０ＡＤＮＡ合成装置(システック,インコーポレイ
テッド，ミネソタ州ミネアポリス、チャンドラー・ドラ
イブ３８１６番)またはＡＢＳ３８０ＡＤＮＡ合成装置
(アプライド・バイオシステムズ,インコーポレイテッ
ド，カリフォルニア州９４４００４フォスター・シティ
ー、リンカーン・センター・ドライブ８５０番)を用い
ることによって、合成成分やリンカーを合成することが
できる。その他の多くのＤＮＡ合成装置が当該技術分野
では知られており、合成ＤＮＡ断片を作成するためにそ
れらを使用することができる。したがって本発明は、決
して具体的に例示するＤＮＡ配列やプラスミドに制限さ
れるものではない。

【００２５】Ｔｎ５０９９-１０は、Ｔｎ５０９９-７と
命名されたトランスポゾンからのｘｙｌＥコード領域と
その構成的プロモーターの自発的な欠失によってもたら
された。この欠失は５０〜５７塩基領域の配列を削除し
た。図３と配列番号５を参照のこと。この領域における
さらなる欠失が、挿入配列およびトランスポゾンに同様
の超転位活性を付与するＩＲを導くであろうことは当業
者の理解するところである。上述の利用可能性および数
多くの他のＤＮＡ合成装置と共に、特注のＤＮＡ合成を
行う商業的な実験室数の増大やＤＮＡ配列の末端を「チ
ュウバック(chew-back)」するエキソヌクレアーゼが、
配列番号５のＩＲ-Ｌ５０９９-１０より小さいＩＲ-Ｌ
５０９９-１０様配列の調製を容易にする。したがって
本発明は配列番号５の機能的な副断片を包含する

【００２６】プラスミドｐＣＺＡ１４１-１０は、本発
明のＩＲ-Ｌ５０９９-１０を使用して構築することがで
きるベクターの具体例である。プラスミドｐＣＺＡ１４
１-１０は、ＩＲ-Ｌ５０９９-１０をＩＲ-Ｌとし、ＩＳ
４９３をＩＲ-Ｒとして保持するＴｎ５０９９-１０を含
有する。当業者は、さらなる超転位トランスポゾンを作
成するためにＴｎ５０９９ -１０のＩＲ-ＲをＩＲ-Ｌ５
０９９-１０で容易に置換できることを理解するであろ
う。また当業者は、プラスミドｐＣＺＡ１４１-１０の
非Ｔｎ５０９９-１０成分を、同じ機能を与える他のベ
クターの成分と容易に交換できることを理解するであろ
う。プラスミドｐＣＺＡ１４１-１０の非Ｔｎ５０９９-
１０成分は市販のベクターｐＵＣ１９に由来する。ｐＵ
Ｃ１９と機能的に等価な数多くのベクターがＡＴＣＣや
ＮＲＲＬなどの受託機関から入手できると共に、ニュー
・イングランド・バイオラブス、ファルマシア、ベーリ
ンガー・マンハイムなど数多くの商業的企業から入手す
ることができる。したがってこのベクター骨格(非Ｔｎ
５０９９-１０)は、本発明のＩＲ-Ｌ５０９９-１０転位
因子を宿主細胞中に導入するために使用できるベクター
に対する制限ではない。

【００２７】ＩＲ-Ｌ５０９９-１０配列を用いて構築さ
れる転位因子はストレプトミセス、チャイニア、サッカ
ロポリスポラ、ストレプトベルチシリウムおよびマイコ
バクテリウムの数多くの種および株で有用である。上述
の細菌中にベクターを導入する際に必要な形質転換およ
びトランスフェクション法は当該技術分野でよく知られ
ているので、本明細書では取り立てて言及しないことに
する。

【００２８】本発明をさらに例示するために以下に実施
例を記載するが、これらの実施例が本発明の範囲を制限
すると解釈してはならない。当業者が本発明を実施する
には本発明の実施例と詳細な説明の項の記載で充分であ
ろうが、さらに「MolecularCloning A Laboratory Manu
al」(第２版,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiati
s,T.,コールド・スプリング・ハーバー・プレス,１９８９)
および「Current Protocols In Molecular Biology」(A
usbel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidm
an,J.G.,Smith,J.A.およびStruhl,K.編,グリーン・パブ
リッシング・アソシエーツ・アンド・ウィリー-インターサ
イエンス,１９８９)を参照することができる。上述の情
報源は遺伝子工学のあらゆる論文にとって優れた技術的
補遺である。ストレプトミセスとそれに関連する属(サ
ッカロポリスポラ、ストレプトベルチシリウムおよびチ
ャイニアなど)は、主として大腸菌とそれに関連するグ
ラム陰性バチルスに向けられているSambrook(上記)とMo
lecular Cloningに記載の技術の適合を必要とする。「G
enetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory M
anual」(Hopwood,D.A.ら編,エフ・クロウ・アンド・サン
ズ,リミテッド,英国ノルウィック)は、ストレプトミセ
スの遺伝子操作で使用される分子生物学的手法に取り組
む「方法書」を提供するので、優れた補遺である。

【００２９】実施例１：プラスミドｐＣＺＡ１４１-１０の構築Ａ．プラスミドｐＣＺＡ１４１の単離約２.１ｋｂのＨｉｎｄIII制限断片上にＩＳ４９３を含
有するプラスミドｐＣＺＡ１４１を、ノーザン・リジョ
ナル・リサーチ・センター(ＮＲＲＬ)から受託番号ＮＲ
ＲＬＢ-１８４１７の下で大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／
ｐＣＺＡ１４１として入手する。プラスミドｐＣＺＡ１
４１の制限部位と機能地図を添付の図面の図１に記載す
る。

【００３０】２５μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ-寒
天プレート(１リットルあたりバクト-トリプトン１０
ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、バクト-酵母抽出物５ｇおよび寒
天１５ｇ)上にＫ１２ＪＭ１０９／ｐＣＺＡ１４１の凍
結乾燥物を接種することにより、該株の単一コロニー単
離物を得る。このコロニーを用いて、２５μｇ／ｍｌア
ンピシリンを含むＬブロス(１％(ｗ／ｖ)バクト・トリ
プトン、０.５％(ｗ／ｖ)酵母抽出物、０.５％ＮａＣｌ
および０.１％(ｗ／ｖ)デキストロース、ｐＨ７)約５０
０ｍｌに植菌し、得られた培養物を通気下３７℃で細胞
が定常状態に達するまでインキュベートする。

【００３１】Maniatisら,1982,「Molecular Cloning」
(コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー)から適
合させた下記の手法に従って細胞からプラスミドＤＮＡ
を得る。大腸菌形質転換体を同定するために用いるプラ
スミドＤＮＡを調製する際には、これと同じ手法である
が小規模であって、超遠心段階をフェノール抽出とそれ
に続くクロロホルム抽出で置き換えた方法を使用する。

【００３２】定常期の大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９／ｐＣ
ＺＡ１４１細胞約５００ｍｌを４０００×ｇで４℃で１
０分間の遠心分離によって収集し、その上清を捨てる。
細胞ペレットを氷冷ＳＴＥ緩衝液(０.１ＮＮａＣｌ、
１０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ７.８)および１ｍＭＥ
ＤＴＡ)１００ｍｌで洗浄する。細胞ペレットを洗浄し
た後、そのペレットを５ｍｇ／ｍｌリゾチームの入った
溶液１(５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣ
ｌ(ｐＨ８.０)および１０ｍＭＥＤＴＡ)１０ｍｌに再
懸濁し、室温で１０分間放置する。次に溶液２(０.２Ｎ
ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳ)２０ｍｌをリゾチーム処理
した細胞に加え、容器の反転によってその溶液を穏やか
に混合する。その混合物を氷上で１０分間インキュベー
トする。

【００３３】溶解した細胞混合物に氷冷した３Ｍ酢酸ナ
トリウム(ｐＨ４.８)１５ｍｌを加え、容器の反転によ
ってその溶液を混合する。その溶液を氷上で６０分間イ
ンキュベートする。上記の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液は等
量の３Ｍ酢酸と３Ｍ酢酸ナトリウムを混合することによ
って調製する。

【００３４】溶解した細胞混合物をベックマンＳＷ２７
ローター(またはその等価物)中２００００ｒｐｍで４℃
で２０分間遠心分離する。上清約３６ｍｌを回収し、
２.５体積のエタノールを加え、混合し、得られた溶液
を氷上に１５分間放置する。１２０００×ｇで室温で３
０分間の遠心分離によってプラスミドＤＮＡを集める。
上清を捨て、７０％エタノールを用いてＤＮＡペレット
を室温で洗浄する。エタノール洗浄液をデカントし、ペ
レットを真空デシケーター中で乾燥する。次いでそのペ
レットをＴＥ緩衝液８ｍｌに再懸濁する。

【００３５】上記のＤＮＡ溶液にＣｓＣｌ８ｇを加え
る。ＣｓＣｌ-ＤＮＡ溶液各１０ｍｌにつき１０ｍｇ／
ｍｌの臭化エチジウム水溶液約０.８ｍｌを加える。こ
の溶液の最終密度は約１.５５ｇ／ｍｌであり、臭化エ
チジウム濃度は約８００μｇ／ｍｌである。この溶液を
ベックマン・タイプ５０遠心管に移し、その上部を１.
５５ｇ／ｍｌＣｓＣｌの入ったＴＥ緩衝液で満たし、
密封し、４５０００ｒｐｍで２０℃で２４時間遠心分離
する。遠心分離後、通常の光下で２つのＤＮＡバンドが
見え、ＵＶ光下ではそれらがより顕著になる。遠心管か
ら蓋をはずし、＃２１皮下針の付いた注射器を用いて、
それを遠心管の側部に挿入することによって、下側のＤ
ＮＡバンドを回収する。

【００３６】水で飽和した１-ブタノールで数回抽出す
ることによってプラスミドＤＮＡの溶液から臭化エチジ
ウムを除去し、ＴＥ緩衝液に対して透析することによっ
てＣｓＣｌを除去する。緩衝化フェノールで抽出し、次
いでクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡを沈殿させ、７
０％エタノールで洗浄し、乾燥する。この操作によって
約０.５ｍｇのプラスミドｐＣＺＡ１４１ＤＮＡを得る
ことができる。

【００３７】Ｂ．ＳａｕＩによるプラスミドｐＣＺＡ１４１の消化プラスミドｐＣＺＡ１４１約５μｇをＳａｕＩで消化す
る。消化緩衝液の組成と制限エンドヌクレアーゼ切断の
ための反応条件はニュー・イングランド・バイオラブス
・カタログと製品説明書に記載されていると共に、Samb
rookら(上記)と「Molecular Cloning」(上記)の文献に
も記載されているので、ここではそれを再記しない。プ
ラスミドｐＣＺＡ１４１は単一のＳａｕＩ部位を含有し
ており、それはＩＳ４９３の５'末端近くであって、Ｉ
Ｓ４９３のＩＲ-Ｌ内に存在する。プラスミドｐＣＺＡ
１４１の消化はこのベクターを直線化して、ＩＳ４９３
をＴｎ５０９９-１０に変換するＤＮＡリンカーを適合
させる。ＳａｕＩによる消化の後、直線状のｐＣＺＡ１
４１を従来法で精製した。

【００３８】Ｃ．リンカーの調製プラスミドｐＣＺＡ１４１ＩＳ４９３の唯一のＳａｕ
Ｉ部位に下記のＤＮＡ配列を連結することによって、Ｔ
ｎ５０９９-１０が生成する。

【００３９】 TCAGGCTGAC GGGGTCAGGG GTCAGAGGCG AGGTAACCAT CTGCGGTGAT AAATTATCTC TGGCGGTGTT GACATAAATA CCACTGGCGG TGATACTGAG CACATCAGAT CGGTCGTCGA GGTCCACAGG CCCTCGGCGA CGTTCCGCCG GGCCTCGGCG ACCGCCGCGT CGAGGCGCCG GTCGAAGGGG CAGTCCTCCA CGGGCAGCTC GTGGAGGGCG CGGGCCAGCT CCGCCATCGC CTCGACCACG GCGAACCGCT GGTGCTCGGG CCACTCCTCG GCCGCCGCGA CGCCGGGGAC GGCCTCCGTG ACGAGCCACG CGGCGGTGTC GTCGGCACCG CGCTCGACGA CGCGGGGGAC GGGGATCGGC GGGGCCTGGC GGCGCCTCGC CGTCGCAGAA CCAGGCGGTG GCGTACACCG TCGCCTCGGT CGGCCCGTAG AGATTGGCGA TCCCGACCGC AGCACCACCG AGAACGTCCC CGACGTGGCC GACCAGCCCG TCATCGTCAA CGCCTGACCG CGGTGCGGAC AGGCCGTGTC GCGACCGGCC GTGCGGAATT AAGCCGGCCC GTACCCTGTG AATAGAGGTC CGCT GTG ACA CAA GAA TCC CTG TTA CTT CTC GAC CGT ATT GAT TCG GAT GAT TCC TAC GCG AGC CTG CGG AAC GAC CAG GAA TTC TGG GAG CCG CTG GCC CGC CGA GCC CTG GAG GAG CTC GGG CTG CCG GTG CCG CCG GTG CTG CGG GTG CCC GGC GAG AGC ACC AAC CCC GTA CTG GTC GGC GAG CCC GAC CCG GTG ATC AAG CTG TTC GGC GAG CAC TGG TGC GGT CCG GAG AGC CTC GCG TCG GAG TCG GAG GCG TAC GCG GTC CTG GCG GAC GCC CCG GTG CCG GTG CCC CGC CTC CTC GGC CGC GGC GAG CTG CGG CCC GGC ACC GGA GCC TGG CCG TGG CCC TAC CTG GTG ATG AGC CGG ATG ACC GGC ACC ACC TGG CGG TCC GCG ATG GAC GGC ACG ACC GAC CGG AAC GCG CTG CTC GCC CTG GCC CGC GAA CTC GGC CGG GTG CTC GGC CGG CTG CAC AGG GTG CCG CTG ACC GGG AAC ACC GTG CTC ACC CCC CAT TCC GAG GTC TTC CCG GAA CTG CTG CGG GAA CGC CGC GCG GCG ACC GTC GAG GAC CAC CGC GGG TGG GGC TAC CTC TCG CCC CGG CTG CTG GAC CGC CTG GAG GAC TGG CTG CCG GAC GTG GAC ACG CTG CTG GCC GGC CGC GAA CCC CGG TTC GGC CAC GGC GAC CTG CAC GGG ACC AAC ATC TTC GTG GAC CTG GCC GCG ACC GAG GTC ACC GGG ATC GTC GAC TTC ACC GAC GTC TAT GCG GGA GAC TCC CGC TAC AGC CTG GTG CAA CTG CAT CTC AAC GCC TTC CGG GGC GAC CGC GAG ATC CTG GCC GCG CTG CTC GAC GGG GCG CAG TGG AAG CGG ACC GAG GAC TTC GCC CGC GAA CTG CTC GCC TTC ACC TTC CTG CAC GAC TTC GAG GTG TTC GAG GAG ACC CCG CTG GAT CTC TCC GGC TTC ACC GAT CCG GAG GAA CTG GCG CAG TTC CTC TGG GGG CCG CCG GAC ACC GCC CCC GGC GCC TGACGCCCCG GGTGAAGAGC CCCGTCGGGC GGTGCCTGAC GGGGCTTCTC AGTTAACCTA GGATCCATGG CGGCCGCAAT ATTAA （配列番号６)

【００４０】オリゴヌクレオチド合成は当該技術分野で
よく知られており、ＩＲ-Ｌ５０９９-１０の配列(配列
番号６)は、そのような方法によって容易に合成され
る。SambrookおよびManiatis(上記)および「Current Pr
otocols in Molecular Biology」(上記)を参照のこと。
リンカーの配列は配列番号６に対応する。このリンカー
は、総合的に配列番号６の両鎖を包含する一連のオリゴ
ヌクレオチドとして合成される。適当なオリゴヌクレオ
チドの選択は好みの問題である。本明細書で先に述べた
ようにＴｎ５０９９-１０はＴｎ５０９９-７における自
発的な欠失によってもたらされたので、本発明ではこの
断片を合成しなかった。ここに記載のリンカーは、自ず
から可能にすると思われる、配列番号１(ＩＳ４９３)と
配列番号５(ＩＲ-Ｌ５０９９-１０)の教示の組み合わせ
を補足するために記述するものである。

【００４１】Ｄ．プラスミドｐＣＺＡ１４１-１０を作
成するためのｐＣＺＡ１４１への１６７５ｂｐリンカー
の連結ＳａｕＩ突出部を有する実施例１Ｂの直線化したｐＣＺ
Ａ１４１と、やはりＳａｕＩ突出部を有する実施例１Ｃ
の１６７５ｂｐリンカーを当該技術分野でよく知られて
いる手法に従って連結する。Sambrookら(上記)の１.５
３〜１.７２を参照のこと。

【００４２】Ｅ．実施例１Ｄの連結混合物による大腸菌
ＭＭ２９４の形質転換形質転換能を有する大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４細胞を調
製するために、ＮＲＲＬ(受託番号ＮＲＲＬＢ-１５６
２５)から得た大腸菌Ｋ１２ＭＭ２９４の凍結乾燥物を
再構成することによって、単一コロニー(複数)を得る。
ＭＭ２９４の１つの単一コロニー単離物をブロス５ｍｌ
に植菌し、その培養を通気しながら３７℃で終夜インキ
ュベートする。終夜培養物の５０μｌを用いてブロス５
ｍｌに植菌する。その培養物を通気下３７℃で終夜イン
キュベートする。翌朝、その培養物をブロスで２００ｍ
ｌに希釈する。希釈した培養物を通気下３７℃で、５５
０ｎｍの吸光度(Ａ)が約０.５になるまでインキュベー
トする。その培養物を氷水槽中で１０分間冷却し、次い
で４０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって細
胞を集める。細胞ペレットを冷１０ｍＭＮａＣｌ１０
０ｍｌに再懸濁した後、直ちに遠心分離によって再度ペ
レット化する。その細胞ペレットを３０ｍＭＣａＣｌ
１００ｍｌに再懸濁し、氷上で２０分間インキュベート
する。

【００４３】遠心分離によって細胞を再び集め、３０ｍ
ＭＣａＣｌ１０ｍｌに再懸濁する。その細胞の０.５
ｍｌを上で調製した連結ＤＮＡに加える。この細胞-Ｄ
ＮＡ混合物を氷上で１時間インキュベートし、４２℃で
９０秒間熱ショックを与え、次いで氷上で約２分間冷却
する。この細胞-ＤＮＡ混合物を遠心分離し、細胞ペレ
ットを１.５ｍｌチューブ中のブロス０.５ｍｌに再懸濁
し、３７℃で１時間インキュベートする。

【００４４】形質転換混合物の一部を１００μｇアプラ
マイシン／ｍｌの入ったＬ-寒天プレートに接種する。
そのプレートを３７℃で終夜インキュベートする。数個
のアプラマイシン耐性コロニーを選択し、次いで制限酵
素分析によってそれらをスクリーニングする。プラスミ
ドｐＣＺＡ１４１の制限部位と機能地図を図１に示す。
唯一のＳａｕＩ部位に対する実施例１Ｃの１６７５ｂｐ
リンカーの挿入は２つの異なるプラスミドをもたらし、
それらはリンカーの配向だけが異なっている。正しい配
向で上記リンカーを保持するプラスミドはＴｎ５０９９
-１０を含有する。ＥｃｏＲＩとＳａｕＩによる所望の
プラスミドの消化は、アガロースゲルで分割した時に
３.６ｋｂと２.９ｋｂのＤＮＡ断片をもたらす。正しい
配向で上記リンカーを保持し、それゆえにＴｎ５０９９
-１０(配列番号１)を含有するプラスミドをｐＣＺＡ１
４１-１０と命名する。制限エンドヌクレアーゼ・マッ
ピングについてはSambrookら(上記)の１.８５以降に議
論されている。

【００４５】

【配列表】

【００４６】配列番号：１配列の長さ：３３１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic ＤＮＡ配列の特徴存在位置：６１０..１６０５特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１８５４..２３８７特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：２５３９..３３０３特徴を表す記号：ＣＤＳ配列 GAGCGTTTTT CAACCTCAGG CTGACGGGGT CAGGGGTCAG AGGCGAGGTA ACCATCTGCG 60 GTGATAAATT ATCTCTGGCG GTGTTGACAT AAATACCACT GGCGGTGATA CTGAGCACAT 120 CAGATCGGTC GTCGAGGTCC ACAGGCCCTC GGCGACGTTC CGCCGGGCCT CGGCGACCGC 180 CGCGTCGAGG CGCCGGTCGA AGGGGCAGTC CTCCACGGGC AGCTCGTGGA GGGCGCGGGC 240 CAGCTCCGCC ATCGCCTCGA CCACGGCGAA CCGCTGGTGC TCGGGCCACT CCTCGGCCGC 300 CGCGACGCCG GGGACGGCCT CCGTGACGAG CCACGCGGCG GTGTCGTCGG CACCGCGCTC 360 GACGACGCGG GGGACGGGGA TCGGCGGGGC CTGGCGGCGC CTCGCCGTCG CAGAACCAGG 420 CGGTGGCGTA CACCGTCGCC TCGGTCGGCC CGTAGAGATT GGCGATCCCG ACCGCAGCAC 480 CACCGAGAAC GTCCCCGACG TGGCCGACCA GCCCGTCATC GTCAACGCCT GACCGCGGTG 540 CGGACAGGCC GTGTCGCGAC CGGCCGTGCG GAATTAAGCC GGCCCGTACC CTGTGAATAG 600 AGGTCCGCT GTG ACA CAA GAA TCC CTG TTA CTT CTC GAC CGT ATT GAT 648 Val Thr Gln Glu Ser Leu Leu Leu Leu Asp Arg Ile Asp 1 5 10 TCG GAT GAT TCC TAC GCG AGC CTG CGG AAC GAC CAG GAA TTC TGG GAG 696 Ser Asp Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Arg Asn Asp Gln Glu Phe Trp Glu 15 20 25 CCG CTG GCC CGC CGA GCC CTG GAG GAG CTC GGG CTG CCG GTG CCG CCG 744 Pro Leu Ala Arg Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly Leu Pro Val Pro Pro 30 35 40 45 GTG CTG CGG GTG CCC GGC GAG AGC ACC AAC CCC GTA CTG GTC GGC GAG 792 Val Leu Arg Val Pro Gly Glu Ser Thr Asn Pro Val Leu Val Gly Glu 50 55 60 CCC GAC CCG GTG ATC AAG CTG TTC GGC GAG CAC TGG TGC GGT CCG GAG 840 Pro Asp Pro Val Ile Lys Leu Phe Gly Glu His Trp Cys Gly Pro Glu 65 70 75 AGC CTC GCG TCG GAG TCG GAG GCG TAC GCG GTC CTG GCG GAC GCC CCG 888 Ser Leu Ala Ser Glu Ser Glu Ala Tyr Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro 80 85 90 GTG CCG GTG CCC CGC CTC CTC GGC CGC GGC GAG CTG CGG CCC GGC ACC 936 Val Pro Val Pro Arg Leu Leu Gly Arg Gly Glu Leu Arg Pro Gly Thr 95 100 105 GGA GCC TGG CCG TGG CCC TAC CTG GTG ATG AGC CGG ATG ACC GGC ACC 984 Gly Ala Trp Pro Trp Pro Tyr Leu Val Met Ser Arg Met Thr Gly Thr 110 115 120 125 ACC TGG CGG TCC GCG ATG GAC GGC ACG ACC GAC CGG AAC GCG CTG CTC 1032 Thr Trp Arg Ser Ala Met Asp Gly Thr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Leu 130 135 140 GCC CTG GCC CGC GAA CTC GGC CGG GTG CTC GGC CGG CTG CAC AGG GTG 1080 Ala Leu Ala Arg Glu Leu Gly Arg Val Leu Gly Arg Leu His Arg Val 145 150 155 CCG CTG ACC GGG AAC ACC GTG CTC ACC CCC CAT TCC GAG GTC TTC CCG 1128 Pro Leu Thr Gly Asn Thr Val Leu Thr Pro His Ser Glu Val Phe Pro 160 165 170 GAA CTG CTG CGG GAA CGC CGC GCG GCG ACC GTC GAG GAC CAC CGC GGG 1176 Glu Leu Leu Arg Glu Arg Arg Ala Ala Thr Val Glu Asp His Arg Gly 175 180 185 TGG GGC TAC CTC TCG CCC CGG CTG CTG GAC CGC CTG GAG GAC TGG CTG 1224 Trp Gly Tyr Leu Ser Pro Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Asp Trp Leu 190 195 200 205 CCG GAC GTG GAC ACG CTG CTG GCC GGC CGC GAA CCC CGG TTC GGC CAC 1272 Pro Asp Val Asp Thr Leu Leu Ala Gly Arg Glu Pro Arg Phe Gly His 210 215 220 GGC GAC CTG CAC GGG ACC AAC ATC TTC GTG GAC CTG GCC GCG ACC GAG 1320 Gly Asp Leu His Gly Thr Asn Ile Phe Val Asp Leu Ala Ala Thr Glu 225 230 235 GTC ACC GGG ATC GTC GAC TTC ACC GAC GTC TAT GCG GGA GAC TCC CGC 1368 Val Thr Gly Ile Val Asp Phe Thr Asp Val Tyr Ala Gly Asp Ser Arg 240 245 250 TAC AGC CTG GTG CAA CTG CAT CTC AAC GCC TTC CGG GGC GAC CGC GAG 1416 Tyr Ser Leu Val Gln Leu His Leu Asn Ala Phe Arg Gly Asp Arg Glu 255 260 265 ATC CTG GCC GCG CTG CTC GAC GGG GCG CAG TGG AAG CGG ACC GAG GAC 1464 Ile Leu Ala Ala Leu Leu Asp Gly Ala Gln Trp Lys Arg Thr Glu Asp 270 275 280 285 TTC GCC CGC GAA CTG CTC GCC TTC ACC TTC CTG CAC GAC TTC GAG GTG 1512 Phe Ala Arg Glu Leu Leu Ala Phe Thr Phe Leu His Asp Phe Glu Val 290 295 300 TTC GAG GAG ACC CCG CTG GAT CTC TCC GGC TTC ACC GAT CCG GAG GAA 1560 Phe Glu Glu Thr Pro Leu Asp Leu Ser Gly Phe Thr Asp Pro Glu Glu 305 310 315 CTG GCG CAG TTC CTC TGG GGG CCG CCG GAC ACC GCC CCC GGC GCC 1605 Leu Ala Gln Phe Leu Trp Gly Pro Pro Asp Thr Ala Pro Gly Ala 320 325 330 TGACGCCCCG GGTGAAGAGC CCCGTCGGGC GGTGCCTGAC GGGGCTTCTC AGTTAACCTA 1665 GGATCCATGG CGGCCGCAAT ATTAATCAGG CTGACGGGGT CAGGGGTCAG AGGCGGGGTC 1725 TGGATCAGCG CGAGCGGTCG TGAGGTAGTA CCGGTTGCGC TCGAAGCTCA CTGCCGTCTA 1785 GGACAGAAGC TGACCCTAGC TCACGCCTAC CGTCGCTGCT GGCAAGCAAC ATCAGCGAAA 1845 GGACCGCG ATG CCC CAG CAG ACC AGC CCC GAG CCG GAG GGC TAC ACC ACC 1895 Met Pro Gln Gln Thr Ser Pro Glu Pro Glu Gly Tyr Thr Thr 1 5 10 GTT GCG CCC TGG GTC GTC ACC GAC GAC ACG GGG GCT TTC CTC GAC TTC 1943 Val Ala Pro Trp Val Val Thr Asp Asp Thr Gly Ala Phe Leu Asp Phe 15 20 25 30 GTC ACC CAG GCA TTC GGG GGC GAG GAA CTC GGG CGG GTG TCG ACC GAG 1991 Val Thr Gln Ala Phe Gly Gly Glu Glu Leu Gly Arg Val Ser Thr Glu 35 40 45 GAG GGC TTG ATC GGT CAC GCT GAG ATC CGA GTC GGC GAC ACC GTC GTG 2039 Glu Gly Leu Ile Gly His Ala Glu Ile Arg Val Gly Asp Thr Val Val 50 55 60 TTG GCC TTC GAC CGA CAC ACG GAC TGG CCC GCC ATG CCG AGC CTG CTG 2087 Leu Ala Phe Asp Arg His Thr Asp Trp Pro Ala Met Pro Ser Leu Leu 65 70 75 CGC GTA TTT GTC GCC GAT GCG GAC GAG GCG TTT TCC CAG GCC GTC GCA 2135 Arg Val Phe Val Ala Asp Ala Asp Glu Ala Phe Ser Gln Ala Val Ala 80 85 90 GCT GGC GGC TAT GTC GTC ACT TCC CTG GCC GAC GAC GCC TTC GGA CAG 2183 Ala Gly Gly Tyr Val Val Thr Ser Leu Ala Asp Asp Ala Phe Gly Gln 95 100 105 110 CGC GGA GGG CGC ATC AAG GAC CCC TTC GGC AAT ATC TGG TGG GTG GTC 2231 Arg Gly Gly Arg Ile Lys Asp Pro Phe Gly Asn Ile Trp Trp Val Val 115 120 125 AGC TGC GTT GAG GAC GTC TCT GAG GGC GAG ATG TGG AAG CGG CTG CAG 2279 Ser Cys Val Glu Asp Val Ser Glu Gly Glu Met Trp Lys Arg Leu Gln 130 135 140 GAC CCC GTA TAC GCC GAG GCC ATG CGC GTG GCT CAG GAG ACA CTC GAC 2327 Asp Pro Val Tyr Ala Glu Ala Met Arg Val Ala Gln Glu Thr Leu Asp 145 150 155 GCC GAG CTC AGC GGT CGA CGC CAC GGG CGC AGC AGC GCA CCC GTC AGG 2375 Ala Glu Leu Ser Gly Arg Arg His Gly Arg Ser Ser Ala Pro Val Arg 160 165 170 ACA ACC AGC TAGACCCACG ACGTCGGGGT TCGCATGCGC CAGACCGGTA 2424 Thr Thr Ser 175 GCCAAGGAGC GTCTTCATTC TGCTTCGGCA GCTTGCGGGT TGGCCTGACA CAGGGGTGAA 2484 GCCCCTGGTA GATGGGTTTT CGACCAAGAA ATCCGTCTCT ACTAGAGGCT TCAC GTG 2541 Val 1 CTT GTT TAC CCC TCC GGG CTG GAC GTG TCC AGT TCT GCC CTC CGC TTC 2589 Leu Val Tyr Pro Ser Gly Leu Asp Val Ser Ser Ser Ala Leu Arg Phe 5 10 15 CTC TCC GCC CGT CTG CGG GAA CAC CGC CGT GGT CTC GGC ACC CGG TGG 2637 Leu Ser Ala Arg Leu Arg Glu His Arg Arg Gly Leu Gly Thr Arg Trp 20 25 30 CGG CGC CTG AGC GCA GGT CGG CAG GCT CTG CTC GCC CTC GCC CAT CTC 2685 Arg Arg Leu Ser Ala Gly Arg Gln Ala Leu Leu Ala Leu Ala His Leu 35 40 45 CGC AAC GGT CAT CCG TAT GTG CAG CTC GCG GCC GGG TTC GGC GTG GGC 2733 Arg Asn Gly His Pro Tyr Val Gln Leu Ala Ala Gly Phe Gly Val Gly 50 55 60 65 ACC ACC ACT GCC TAC CGC TAC GTC ACC GAG GCA GCT GAG GTT CTG GCC 2781 Thr Thr Thr Ala Tyr Arg Tyr Val Thr Glu Ala Ala Glu Val Leu Ala 70 75 80 GCC CTT GCC CCG ACG CTC GCC GAG GCG GTC CGG GCG GCG TCG ATG AAG 2829 Ala Leu Ala Pro Thr Leu Ala Glu Ala Val Arg Ala Ala Ser Met Lys 85 90 95 GCG TTC GTC CTG CTG GAC GGG ACG CTG CTG CCG ATC GAC CGA ATC GCC 2877 Ala Phe Val Leu Leu Asp Gly Thr Leu Leu Pro Ile Asp Arg Ile Ala 100 105 110 GCC GAC CGG CCT TTC TAC TCG GGC AAG CAC AAG AAA CAC GGG ATG AAC 2925 Ala Asp Arg Pro Phe Tyr Ser Gly Lys His Lys Lys His Gly Met Asn 115 120 125 GTA CAG GTG ATC GCA GAT CCT TCC GGC CGC CTG CTG TGG GCC TCG CCG 2973 Val Gln Val Ile Ala Asp Pro Ser Gly Arg Leu Leu Trp Ala Ser Pro 130 135 140 145 GCC CTG CCC GGA GCC GTC CAC GAC GTC CGT GCG GCC CGC GAG CAC GGC 3021 Ala Leu Pro Gly Ala Val His Asp Val Arg Ala Ala Arg Glu His Gly 150 155 160 ATC ATC GAC ACG CTT GCC ACA GCC GAC GTC AAC TGC TGG GCA GAC AAG 3069 Ile Ile Asp Thr Leu Ala Thr Ala Asp Val Asn Cys Trp Ala Asp Lys 165 170 175 GGC TAC CAG GGC GCC GGA GGC ACG GTC CGT GTT CCC TAC CGC GGC CGG 3117 Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Thr Val Arg Val Pro Tyr Arg Gly Arg 180 185 190 TGG GAG ACG CTC TCT GCA GGG CAG CAG GCC GTC AAT CGA TCC CAC GCG 3165 Trp Glu Thr Leu Ser Ala Gly Gln Gln Ala Val Asn Arg Ser His Ala 195 200 205 AAG ATC CGG GCG CTC GTC GAG CAA GCC GTC GCG ACC CTC AAG TCC TGG 3213 Lys Ile Arg Ala Leu Val Glu Gln Ala Val Ala Thr Leu Lys Ser Trp 210 215 220 225 CGA CTC CTT CGC AGG CTC CGT TGC TCG ACC ACC CGC GTC ACG GTC CTC 3261 Arg Leu Leu Arg Arg Leu Arg Cys Ser Thr Thr Arg Val Thr Val Leu 230 235 240 GTC CAG GCC GTC CTC TGC CTG CAT CAG GCC AGC TCA GCT TGAGGATGGA 3310 Val Gln Ala Val Leu Cys Leu His Gln Ala Ser Ser Ala 245 250 255 AAACGCTC 3318

【００４７】配列番号：２配列の長さ：３３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列ＶａｌＴｈｒＧｌｎＧｌｕＳｅｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕ
ＡｓｐＡｒｇＩｌｅＡｓｐＳｅｒＡｓｐＡｓｐ１５
１０１５ＳｅｒＴｙｒＡｌａＳｅｒＬｅｕＡｒｇＡｓｎＡｓｐＧｌｎ
ＧｌｕＰｈｅＴｒｐＧｌｕＰｒｏＬｅｕＡｌａ２０２５
３０ＡｒｇＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙＬｅｕ
ＰｒｏＶａｌＰｒｏＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇ３５４０
４５ＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＳｅｒＴｈｒＡｓｎＰｒｏＶａｌ
ＬｅｕＶａｌＧｌｙＧｌｕＰｒｏＡｓｐＰｒｏ５０５５
６０ＶａｌＩｌｅＬｙｓＬｅｕＰｈｅＧｌｙＧｌｕＨｉｓＴｒｐ
ＣｙｓＧｌｙＰｒｏＧｌｕＳｅｒＬｅｕＡｌａ６５７０
７５８０ＳｅｒＧｌｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＴｙｒＡｌａＶａｌＬｅｕ
ＡｌａＡｓｐＡｌａＰｒｏＶａｌＰｒｏＶａｌ８５
９０９５ＰｒｏＡｒｇＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＧｌｙＧｌｕＬｅｕ
ＡｒｇＰｒｏＧｌｙＴｈｒＧｌｙＡｌａＴｒｐ１００１０５
１１０ＰｒｏＴｒｐＰｒｏＴｙｒＬｅｕＶａｌＭｅｔＳｅｒＡｒｇ
ＭｅｔＴｈｒＧｌｙＴｈｒＴｈｒＴｒｐＡｒｇ１１５１２０
１２５ＳｅｒＡｌａＭｅｔＡｓｐＧｌｙＴｈｒＴｈｒＡｓｐＡｒｇ
ＡｓｎＡｌａＬｅｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａ１３０１３５
１４０ＡｒｇＧｌｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＶａｌＬｅｕＧｌｙＡｒｇ
ＬｅｕＨｉｓＡｒｇＶａｌＰｒｏＬｅｕＴｈｒ１４５１５０
１５５１６０ＧｌｙＡｓｎＴｈｒＶａｌＬｅｕＴｈｒＰｒｏＨｉｓＳｅｒ
ＧｌｕＶａｌＰｈｅＰｒｏＧｌｕＬｅｕＬｅｕ１６５
１７０１７５ＡｒｇＧｌｕＡｒｇＡｒｇＡｌａＡｌａＴｈｒＶａｌＧｌｕ
ＡｓｐＨｉｓＡｒｇＧｌｙＴｒｐＧｌｙＴｙｒ１８０１８５
１９０ＬｅｕＳｅｒＰｒｏＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｓｐＡｒｇＬｅｕ
ＧｌｕＡｓｐＴｒｐＬｅｕＰｒｏＡｓｐＶａｌ１９５２００
２０５ＡｓｐＴｈｒＬｅｕＬｅｕＡｌａＧｌｙＡｒｇＧｌｕＰｒｏ
ＡｒｇＰｈｅＧｌｙＨｉｓＧｌｙＡｓｐＬｅｕ２１０２１５
２２０ＨｉｓＧｌｙＴｈｒＡｓｎＩｌｅＰｈｅＶａｌＡｓｐＬｅｕ
ＡｌａＡｌａＴｈｒＧｌｕＶａｌＴｈｒＧｌｙ２２５２３０
２３５２４０ＩｌｅＶａｌＡｓｐＰｈｅＴｈｒＡｓｐＶａｌＴｙｒＡｌａ
ＧｌｙＡｓｐＳｅｒＡｒｇＴｙｒＳｅｒＬｅｕ２４５
２５０２５５ＶａｌＧｌｎＬｅｕＨｉｓＬｅｕＡｓｎＡｌａＰｈｅＡｒｇ
ＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＩｌｅＬｅｕＡｌａ２６０２６５
２７０ＡｌａＬｅｕＬｅｕＡｓｐＧｌｙＡｌａＧｌｎＴｒｐＬｙｓ
ＡｒｇＴｈｒＧｌｕＡｓｐＰｈｅＡｌａＡｒｇ２７５２８０
２８５ＧｌｕＬｅｕＬｅｕＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｈｅＬｅｕＨｉｓ
ＡｓｐＰｈｅＧｌｕＶａｌＰｈｅＧｌｕＧｌｕ２９０２９５
３００ＴｈｒＰｒｏＬｅｕＡｓｐＬｅｕＳｅｒＧｌｙＰｈｅＴｈｒ
ＡｓｐＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＧｌｎ３０５３１０
３１５３２０ＰｈｅＬｅｕＴｒｐＧｌｙＰｒｏＰｒｏＡｓｐＴｈｒＡｌａ
ＰｒｏＧｌｙＡｌａ３２５
３３０

【００４８】配列番号：３配列の長さ：１７７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列ＭｅｔＰｒｏＧｌｎＧｌｎＴｈｒＳｅｒＰｒｏＧｌｕＰｒｏ
ＧｌｕＧｌｙＴｙｒＴｈｒＴｈｒＶａｌＡｌａ１５
１０１５ＰｒｏＴｒｐＶａｌＶａｌＴｈｒＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧｌｙ
ＡｌａＰｈｅＬｅｕＡｓｐＰｈｅＶａｌＴｈｒ２０２５
３０ＧｌｎＡｌａＰｈｅＧｌｙＧｌｙＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｙ
ＡｒｇＶａｌＳｅｒＴｈｒＧｌｕＧｌｕＧｌｙ３５４０
４５ＬｅｕＩｌｅＧｌｙＨｉｓＡｌａＧｌｕＩｌｅＡｒｇＶａｌ
ＧｌｙＡｓｐＴｈｒＶａｌＶａｌＬｅｕＡｌａ５０５５
６０ＰｈｅＡｓｐＡｒｇＨｉｓＴｈｒＡｓｐＴｒｐＰｒｏＡｌａ
ＭｅｔＰｒｏＳｅｒＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌ６５７０
７５８０ＰｈｅＶａｌＡｌａＡｓｐＡｌａＡｓｐＧｌｕＡｌａＰｈｅ
ＳｅｒＧｌｎＡｌａＶａｌＡｌａＡｌａＧｌｙ８５
９０９５ＧｌｙＴｙｒＶａｌＶａｌＴｈｒＳｅｒＬｅｕＡｌａＡｓｐ
ＡｓｐＡｌａＰｈｅＧｌｙＧｌｎＡｒｇＧｌｙ１００１０５
１１０ＧｌｙＡｒｇＩｌｅＬｙｓＡｓｐＰｒｏＰｈｅＧｌｙＡｓｎ
ＩｌｅＴｒｐＴｒｐＶａｌＶａｌＳｅｒＣｙｓ１１５１２０
１２５ＶａｌＧｌｕＡｓｐＶａｌＳｅｒＧｌｕＧｌｙＧｌｕＭｅｔ
ＴｒｐＬｙｓＡｒｇＬｅｕＧｌｎＡｓｐＰｒｏ１３０１３５
１４０ＶａｌＴｙｒＡｌａＧｌｕＡｌａＭｅｔＡｒｇＶａｌＡｌａ
ＧｌｎＧｌｕＴｈｒＬｅｕＡｓｐＡｌａＧｌｕ１４５１５０
１５５１６０ＬｅｕＳｅｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＨｉｓＧｌｙＡｒｇＳｅｒ
ＳｅｒＡｌａＰｒｏＶａｌＡｒｇＴｈｒＴｈｒ１６５
１７０１７５Ｓｅｒ

【００４９】配列番号：４配列の長さ：２５４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Val Leu Val Tyr Pro Ser Gly Leu Asp Val Ser Ser Ser Ala Leu Arg 1 5 10 15 Phe Leu Ser Ala Arg Leu Arg Glu His Arg Arg Gly Leu Gly Thr Arg 20 25 30 Trp Arg Arg Leu Ser Ala Gly Arg Gln Ala Leu Leu Ala Leu Ala His 35 40 45 Leu Arg Asn Gly His Pro Tyr Val Gln Leu Ala Ala Gly Phe Gly Val 50 55 60 Gly Thr Thr Thr Ala Tyr Arg Tyr Val Thr Glu Ala Ala Glu Val Leu 65 70 75 80 Ala Ala Leu Ala Pro Thr Leu Ala Glu Ala Val Arg Ala Ala Ser Met 85 90 95 Lys Ala Phe Val Leu Leu Asp Gly Thr Leu Leu Pro Ile Asp Arg Ile 100 105 110 Ala Ala Asp Arg Pro Phe Tyr Ser Gly Lys His Lys Lys His Gly Met 115 120 125 Asn Val Gln Val Ile Ala Asp Pro Ser Gly Arg Leu Leu Trp Ala Ser 130 135 140 Pro Ala Leu Pro Gly Ala Val His Asp Val Arg Ala Ala Arg Glu His 145 150 155 160 Gly Ile Ile Asp Thr Leu Ala Thr Ala Asp Val Asn Cys Trp Ala Asp 165 170 175 Lys Gly Tyr Gln Gly Ala Gly Gly Thr Val Arg Val Pro Tyr Arg Gly 180 185 190 Arg Trp Glu Thr Leu Ser Ala Gly Gln Gln Ala Val Asn Arg Ser His 195 200 205 Ala Lys Ile Arg Ala Leu Val Glu Gln Ala Val Ala Thr Leu Lys Ser 210 215 220 Trp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Arg Cys Ser Thr Thr Arg Val Thr Val 225 230 235 240 Leu Val Gln Ala Val Leu Cys Leu His Gln Ala Ser Ser Ala 245 250

【００５０】配列番号：５配列の長さ：５７配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic ＤＮＡ配列 GAGCGTTTTT CAACCTCAGG CTGACGGGGT CAGGGGTCAG AGGCGAGGTA ACCATCT 57

【００５１】配列番号：６配列の長さ：１６７５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：genomic ＤＮＡハイポセティカル配列：ＮＯアンチセンス：ＮＯフラグメント型：中間部フラグメント配列の特徴存在位置：５９５..１５９０特徴を表す記号：ＣＤＳ配列： TCAGGCTGAC GGGGTCAGGG GTCAGAGGCG AGGTAACCAT CTGCGGTGAT AAATTATCTC 60 TGGCGGTGTT GACATAAATA CCACTGGCGG TGATACTGAG CACATCAGAT CGGTCGTCGA 120 GGTCCACAGG CCCTCGGCGA CGTTCCGCCG GGCCTCGGCG ACCGCCGCGT CGAGGCGCCG 180 GTCGAAGGGG CAGTCCTCCA CGGGCAGCTC GTGGAGGGCG CGGGCCAGCT CCGCCATCGC 240 CTCGACCACG GCGAACCGCT GGTGCTCGGG CCACTCCTCG GCCGCCGCGA CGCCGGGGAC 300 GGCCTCCGTG ACGAGCCACG CGGCGGTGTC GTCGGCACCG CGCTCGACGA CGCGGGGGAC 360 GGGGATCGGC GGGGCCTGGC GGCGCCTCGC CGTCGCAGAA CCAGGCGGTG GCGTACACCG 420 TCGCCTCGGT CGGCCCGTAG AGATTGGCGA TCCCGACCGC AGCACCACCG AGAACGTCCC 480 CGACGTGGCC GACCAGCCCG TCATCGTCAA CGCCTGACCG CGGTGCGGAC AGGCCGTGTC 540 GCGACCGGCC GTGCGGAATT AAGCCGGCCC GTACCCTGTG AATAGAGGTC CGCT GTG 597 Val 1 ACA CAA GAA TCC CTG TTA CTT CTC GAC CGT ATT GAT TCG GAT GAT TCC 645 Thr Gln Glu Ser Leu Leu Leu Leu Asp Arg Ile Asp Ser Asp Asp Ser 5 10 15 TAC GCG AGC CTG CGG AAC GAC CAG GAA TTC TGG GAG CCG CTG GCC CGC 693 Tyr Ala Ser Leu Arg Asn Asp Gln Glu Phe Trp Glu Pro Leu Ala Arg 20 25 30 CGA GCC CTG GAG GAG CTC GGG CTG CCG GTG CCG CCG GTG CTG CGG GTG 741 Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly Leu Pro Val Pro Pro Val Leu Arg Val 35 40 45 CCC GGC GAG AGC ACC AAC CCC GTA CTG GTC GGC GAG CCC GAC CCG GTG 789 Pro Gly Glu Ser Thr Asn Pro Val Leu Val Gly Glu Pro Asp Pro Val 50 55 60 65 ATC AAG CTG TTC GGC GAG CAC TGG TGC GGT CCG GAG AGC CTC GCG TCG 837 Ile Lys Leu Phe Gly Glu His Trp Cys Gly Pro Glu Ser Leu Ala Ser 70 75 80 GAG TCG GAG GCG TAC GCG GTC CTG GCG GAC GCC CCG GTG CCG GTG CCC 885 Glu Ser Glu Ala Tyr Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro Val Pro Val Pro 85 90 95 CGC CTC CTC GGC CGC GGC GAG CTG CGG CCC GGC ACC GGA GCC TGG CCG 933 Arg Leu Leu Gly Arg Gly Glu Leu Arg Pro Gly Thr Gly Ala Trp Pro 100 105 110 TGG CCC TAC CTG GTG ATG AGC CGG ATG ACC GGC ACC ACC TGG CGG TCC 981 Trp Pro Tyr Leu Val Met Ser Arg Met Thr Gly Thr Thr Trp Arg Ser 115 120 125 GCG ATG GAC GGC ACG ACC GAC CGG AAC GCG CTG CTC GCC CTG GCC CGC 1029 Ala Met Asp Gly Thr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Leu Ala Arg 130 135 140 145 GAA CTC GGC CGG GTG CTC GGC CGG CTG CAC AGG GTG CCG CTG ACC GGG 1077 Glu Leu Gly Arg Val Leu Gly Arg Leu His Arg Val Pro Leu Thr Gly 150 155 160 AAC ACC GTG CTC ACC CCC CAT TCC GAG GTC TTC CCG GAA CTG CTG CGG 1125 Asn Thr Val Leu Thr Pro His Ser Glu Val Phe Pro Glu Leu Leu Arg 165 170 175 GAA CGC CGC GCG GCG ACC GTC GAG GAC CAC CGC GGG TGG GGC TAC CTC 1173 Glu Arg Arg Ala Ala Thr Val Glu Asp His Arg Gly Trp Gly Tyr Leu 180 185 190 TCG CCC CGG CTG CTG GAC CGC CTG GAG GAC TGG CTG CCG GAC GTG GAC 1221 Ser Pro Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Asp Trp Leu Pro Asp Val Asp 195 200 205 ACG CTG CTG GCC GGC CGC GAA CCC CGG TTC GGC CAC GGC GAC CTG CAC 1269 Thr Leu Leu Ala Gly Arg Glu Pro Arg Phe Gly His Gly Asp Leu His 210 215 220 225 GGG ACC AAC ATC TTC GTG GAC CTG GCC GCG ACC GAG GTC ACC GGG ATC 1317 Gly Thr Asn Ile Phe Val Asp Leu Ala Ala Thr Glu Val Thr Gly Ile 230 235 240 GTC GAC TTC ACC GAC GTC TAT GCG GGA GAC TCC CGC TAC AGC CTG GTG 1365 Val Asp Phe Thr Asp Val Tyr Ala Gly Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Val 245 250 255 CAA CTG CAT CTC AAC GCC TTC CGG GGC GAC CGC GAG ATC CTG GCC GCG 1413 Gln Leu His Leu Asn Ala Phe Arg Gly Asp Arg Glu Ile Leu Ala Ala 260 265 270 CTG CTC GAC GGG GCG CAG TGG AAG CGG ACC GAG GAC TTC GCC CGC GAA 1461 Leu Leu Asp Gly Ala Gln Trp Lys Arg Thr Glu Asp Phe Ala Arg Glu 275 280 285 CTG CTC GCC TTC ACC TTC CTG CAC GAC TTC GAG GTG TTC GAG GAG ACC 1509 Leu Leu Ala Phe Thr Phe Leu His Asp Phe Glu Val Phe Glu Glu Thr 290 295 300 305 CCG CTG GAT CTC TCC GGC TTC ACC GAT CCG GAG GAA CTG GCG CAG TTC 1557 Pro Leu Asp Leu Ser Gly Phe Thr Asp Pro Glu Glu Leu Ala Gln Phe 310 315 320 CTC TGG GGG CCG CCG GAC ACC GCC CCC GGC GCC TGACGCCCCG GGTGAAGAGC 1610 Leu Trp Gly Pro Pro Asp Thr Ala Pro Gly Ala 325 330 CCCGTCGGGC GGTGCCTGAC GGGGCTTCTC AGTTAACCTA GGATCCATGG CGGCCGCAAT 1670 ATTAA 1675

【００５２】配列番号：７配列の長さ：３３２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列 Val Thr Gln Glu Ser Leu Leu Leu Leu Asp Arg Ile Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Ala Ser Leu Arg Asn Asp Gln Glu Phe Trp Glu Pro Leu Ala 20 25 30 Arg Arg Ala Leu Glu Glu Leu Gly Leu Pro Val Pro Pro Val Leu Arg 35 40 45 Val Pro Gly Glu Ser Thr Asn Pro Val Leu Val Gly Glu Pro Asp Pro 50 55 60 Val Ile Lys Leu Phe Gly Glu His Trp Cys Gly Pro Glu Ser Leu Ala 65 70 75 80 Ser Glu Ser Glu Ala Tyr Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro Val Pro Val 85 90 95 Pro Arg Leu Leu Gly Arg Gly Glu Leu Arg Pro Gly Thr Gly Ala Trp 100 105 110 Pro Trp Pro Tyr Leu Val Met Ser Arg Met Thr Gly Thr Thr Trp Arg 115 120 125 Ser Ala Met Asp Gly Thr Thr Asp Arg Asn Ala Leu Leu Ala Leu Ala 130 135 140 Arg Glu Leu Gly Arg Val Leu Gly Arg Leu His Arg Val Pro Leu Thr 145 150 155 160 Gly Asn Thr Val Leu Thr Pro His Ser Glu Val Phe Pro Glu Leu Leu 165 170 175 Arg Glu Arg Arg Ala Ala Thr Val Glu Asp His Arg Gly Trp Gly Tyr 180 185 190 Leu Ser Pro Arg Leu Leu Asp Arg Leu Glu Asp Trp Leu Pro Asp Val 195 200 205 Asp Thr Leu Leu Ala Gly Arg Glu Pro Arg Phe Gly His Gly Asp Leu 210 215 220 His Gly Thr Asn Ile Phe Val Asp Leu Ala Ala Thr Glu Val Thr Gly 225 230 235 240 Ile Val Asp Phe Thr Asp Val Tyr Ala Gly Asp Ser Arg Tyr Ser Leu 245 250 255 Val Gln Leu His Leu Asn Ala Phe Arg Gly Asp Arg Glu Ile Leu Ala 260 265 270 Ala Leu Leu Asp Gly Ala Gln Trp Lys Arg Thr Glu Asp Phe Ala Arg 275 280 285 Glu Leu Leu Ala Phe Thr Phe Leu His Asp Phe Glu Val Phe Glu Glu 290 295 300 Thr Pro Leu Asp Leu Ser Gly Phe Thr Asp Pro Glu Glu Leu Ala Gln 305 310 315 320 Phe Leu Trp Gly Pro Pro Asp Thr Ala Pro Gly Ala 325 330

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＣＺＡ１４１の制限部位と機能
地図を表す模式図である(ただし正確な縮尺で描かれた
ものではない)。

【図２】Ｔｎ５０９６とＴｎ５０９７の制限部位と機
能地図を表す模式図である(ただし正確な縮尺で描かれ
たものではない)。

【図３】Ｔｎ５０９９-１０の制限部位と機能地図を
表す模式図である(ただし正確な縮尺で描かれたもので
はない)。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者パトリシア・ジーン・ソレンバーグアメリカ合衆国46256インディアナ州インディアナポリス、シーブリーズ・ウェイ 10116番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号５の超転位性ＤＮＡ配列または
その機能的断片。
【請求項２】ＩＲ-Ｌ５０９９-１０である請求項１の
ＤＮＡ配列。