JPH06197792A - バイオリアクター及びそれを用いた微量成分の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 高感度かつ再現性良く体液試料等の検体を定
量することができるバイオリアクターと方法。 【構成】 酸化酵素とペルオキシダーゼを含む固定化酵
素リアクターであって、リアクターの入口側に主として
酸化酵素が、出口側に主としてペルオキシダーゼが配置
されているバイオリアクター。検体中の微量成分を検出
する際に上記バイオリアクターを用いる微量成分の検出
方法。 【効果】 検体中の微量成分を高感度かつ再現性よく定
量することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は固定化酵素を含むリアク
ター及びこれを利用する、検体中の微量成分の検出方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】測定対象物を酸化酵素を用いて測定する
方法においては、酸化反応により発生した過酸化水素
を、ペルオキシダーゼを用いて、比色法、ケイ光法、化
学発光法により検出することが多いが、測定対象物が高
濃度に存在する場合、従来は、各酵素を溶液状態で反応
させており、特に、比色的に検出する生化学検査用の自
動分析装置を用いて測定することが多い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】酸化酵素とペルオキシ
ダーゼの固定化酵素を用いて測定対象物を測定する系に
おいては、測定対象物が高濃度に存在する場合、各酵素
を溶液状態で反応する場合と同様の精度での測定が可能
であることが知られている。しかし、測定対象物の濃度
が低い場合、酸化酵素により発生する過酸化水素も微量
であるため、効率的なペルオキシダーゼの反応が行なえ
ず、測定対象物の精度のよい測定が困難であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を加え、酸化酵素とペルオキシ
ダーゼの固定化酵素の配置及び両固定化酵素のリアクタ
ーへの充填方法を工夫することによって高感度かつ再現
性良く体液試料等の検体を定量できることがわかり、本
発明を完成した。

【０００５】本発明は、２種の固定化酵素を用い、酵素
反応が効率よく行われるように、それらの充填方法、配
置方法を工夫したものである。

【０００６】即ち、本発明は、（１） 酸化酵素とペル
オキシダーゼを含む固定化酵素リアクターであって、リ
アクターの入口側に主として酸化酵素が、出口側に主と
してペルオキシダーゼが配置されているバイオリアクタ
ー，（２） 入口側に酸化酵素のみが、出口側にペルオ
キシダーゼのみが配置されている上記（１）のバイオリ
アクター，（３） 入口側から出口側に向かって酸化酵
素の濃度が減少し、ペルオキシダーゼ濃度が増加するよ
うに酸化酵素とペルオキシダーゼが配置されている上記
（１）のバイオリアクター，（４） 酸化酵素が配置さ
れた固定化酵素リアクターとペルオキシダーゼが配置さ
れた固定化酵素リアクターが、直接または近接して接続
したバイオリアクター，（５） 酸化酵素とペルオキシ
ダーゼが粒子状担体に担持されている上記（１），
（２），（３）または（４）のバイオリアクター，
（６） 検体中の微量成分を検出する際に上記（１），
（２），（３），（４）又は（５）のバイオリアクター
を用いる微量成分の検出方法，（７） 微量成分が１，
５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（以下１，５−ＡＧ
と略す）である上記（６）の検出方法，に関するもので
ある。

【０００７】本発明のバイオリアクターを用いれば、体
液等の検体中の１，５−ＡＧ等の微量成分を定量する
際、酸化酵素が該微量成分（基質）を酸化するときに生
成する過酸化水素を、効率良く定量することが可能であ
る。即ち、体液等の検体中の微量成分を高感度かつ再現
性良く定量することができる。

【０００８】本発明において、酸化酵素とは酸素の存在
下、基質を酸化して過酸化水素を発生する酵素であり、
例えば、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．
４）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．
６）、ピラノースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１
０）、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．
１１）、ウリカーゼ（ＥＣ１．７．３．３）、プトレシ
ンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１０）等が挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではない。

【０００９】本発明において、過酸化水素の定量のため
に用いられるペルオキシダーゼとしてはその起源、由来
に特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキ
シダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）又はペルオキシダー
ゼ様物質等が挙げられ、これらは一種若しくは要すれば
二種以上組み合わせて用いられる。

【００１０】酸化酵素及びペルオキシダーゼは、水に不
溶性の担体に固定化し、固定化酵素として使用される。
酵素を固定化する水に不溶性の担体としては種々のもの
が使用でき、特に限定されない。例えば、担体の材質と
しては、ガラス、天然高分子、合成ポリマー、プラスチ
ック、金属等いずれでもよく、又、担体の形状として
は、粒子状、ビーズ状、繊維状、フィルム状、板状、管
状等いずれでもよく、目的に応じて、適当な材質及び形
状のものを選択して用いる。

【００１１】酵素の担体への固定化は常法によって行な
うことができ、その方法は特に限定されるものではな
い。例えば、吸着法、包括法、架橋法、共有結合法が一
般的に用いられているが、吸着法、包括法、架橋法では
酵素反応中に酵素の離脱が起こり易く、徐々に活性の低
下が起こる可能性があり、共有結合法が特に好ましい。
共有結合法としては種々の方法が適用されるが、たとえ
ば、アミノ化多孔質ガラスとグルタルアルデヒドを用い
る方法、カルボキシル化多孔質ガラスを活性エステルに
した後結合する方法、エポキシ基、ホルミル基、トレシ
ル基等の官能基を有する担体に結合させる方法などが適
用できる。また、ガラスチューブ等を用いる場合、アミ
ノプロピルトリエトキシシラン等のシランカップリング
剤を用いて、アミノプロピル基を導入し、グルタルアル
デヒドを用いて固定化することができる。

【００１２】酸化酵素とペルオキシダーゼは、両方とも
同一の担体に固定化してもよく、あるいは酸化酵素の固
定化担体とペルオキシダーゼの固定化担体を別々に用意
して使用してもよい。

【００１３】特に好ましい固定化酵素としては、粒子状
の担体に酸化酵素又はペルオキシダーゼを固定化したも
のが挙げられ、粒子の粒径は０．１μｍ〜３ｍｍの範囲
が好ましい。

【００１４】リアクターの容器としては、固定化酵素を
用いた酵素反応を行なう際に使用される通常のカラムや
チューブが使用できる。カラムやチューブの内壁を酵素
固定化用の担体として用いた場合、酵素を固定化したカ
ラム又はチューブ自体がリアクター（バイオリアクタ
ー）となり、又、カラムやチューブの内壁を酵素固定化
用の担体としない場合は、担体に酵素を固定化した固定
化酵素をカラムやチューブに充填することにより、リア
クター（バイオリアクター）が得られる。この場合、一
つのカラム又はチューブに酸化酵素とペルオキシダーゼ
を配置してもよく（カラム又はチューブの内壁に各酵素
を固定化するか、又は、各酵素を固定化した担体をカラ
ム又はチューブに充填することにより）、あるいは、酸
化酵素が配置されたカラム又はチューブ（カラム又はチ
ューブの内壁に酸化酵素を固定化したもの、又は、酸化
酵素を固定化した担体をカラム又はチューブに充填した
もの）とペルオキシダーゼが配置されたカラム又はチュ
ーブを直接又は近接して接続してバイオリアクターとす
ることもできる。

【００１５】酸化酵素が配置されたカラム又はチューブ
（酸化酵素の固定化酵素リアクター）とペルオキシダー
ゼが配置されたカラム又はチューブ（ペルオキシダーゼ
の固定化酵素リアクター）を近接して接続してバイオリ
アクターとする場合、両リアクター間の配管の長さは１
０ｃｍ以内とするのが好ましく、５ｃｍ以内であること
が特に好ましい。この配管は内径０．０５ｍｍ〜１ｍｍ
であることが好ましい。

【００１６】カラム又はチューブ等のバイオリアクター
の容器の容量は特に制限はないが、通常５ｍｌ以下であ
り、好ましくは２ｍｌ以下であり、又、内径に対して長
さは２倍以上であることが好ましい。

【００１７】酸化酵素は、固定化酵素の形でバイオリア
クターの入口側に配置されるが、配置する酸化酵素の量
は、体液等の検体中の測定すべき微量成分の全量を酸化
するのに必要な量以上の量（即ち、定量的に酸化するの
に必要な量以上の量）であることが好ましい。

【００１８】ペルオキシダーゼは、固定化酵素の形でバ
イオリアクターの出口側に配置されるが、配置するペル
オキシダーゼの量は、酸化酵素の作用により発生する過
酸化水素の全量がペルオキシダーゼの基質と反応するの
に必要な量以上の量であることが好ましい。

【００１９】従って、これら酵素の使用量は、検体中の
測定すべき微量成分の種類、量、酵素の種類、測定条件
等に応じて適宜決定される。

【００２０】以下に、バイオリアクターの製法について
一例を挙げて説明する。

【００２１】例えば、酸化酵素を粒子状担体に固定化し
た固定化酸化酵素とペルオキシダーゼを粒子状担体に固
定化した固定化ペルオキシダーゼを用いる場合、（ａ）
バイオリアクターとなるカラム又はチューブの出口側に
固定化ペルオキシダーゼを充填しその後に入口側に固定
化酸化酵素を充填しバイオリアクターとする方法、
（ｂ）カラム又はチューブの出口側に固定化ペルオキシ
ダーゼを充填しフィルターを挟み更に固定化酸化酵素を
充填しバイオリアクターとする方法、（ｃ）二本のカラ
ム又はチューブに別々に固定化ペルオキシダーゼ及び固
定化酸化酵素を充填し直接ジョイントにて接続してバイ
オリアクターとする方法、（ｄ）二本のカラム又はチュ
ーブに別々に固定化ペルオキシダーゼ及び固定化酸化酵
素を充填し、これらを内径１ｍｍ以下、長さ１０ｃｍ以
下の配管にて接続しバイオリアクターとする方法等が挙
げられる。又、酸化酵素を内壁に固定化したガラスチュ
ーブ等とペルオキシダーゼを内壁に固定化したガラスチ
ューブ等を直接に又は内径１ｍｍ以下、長さ１０ｃｍ以
下の配管で接続することによりバイオリアクターとする
こともできる。

【００２２】又、前述のとおり、酵素の使用量は、検体
中の測定すべき微量成分の種類、量、酵素の種類、測定
条件等により異なり、一概には言えないが、血液中の
１，５−ＡＧを測定するためのバイオリアクターの場合
において、酸化酵素としてピラノースオキシダーゼを、
ペルオキシダーゼとしてＨＲＰ（ホースラディッシュペ
ルオキシダーゼ）を用いる場合は、通常、バイオリアク
ター中にピラノースオキシダーゼを１〜１００００ユニ
ット／リアクター、ＨＲＰを０．１〜１００００ユニッ
ト／リアクター配置させる。

【００２３】次に、本発明の検出方法について説明す
る。

【００２４】検体としては血液、血清、血漿、膵液、唾
液、尿、胸水、腹水、髄液等の種々の体液等が使用でき
る。

【００２５】体液中の測定する微量成分としては、１，
５−ＡＧ、尿酸、グルコース、ポリアミン、ピルビン
酸、コレステロール等が挙げられ、これらは体液中に通
常１００μｇ／ｍｌ以下存在する。

【００２６】本発明の検出方法は、特に、血液、血清又
は血漿中の１，５−ＡＧの定量に特に優れている。

【００２７】本発明の検出方法は、本発明のバイオリア
クターを用い、公知の方法に準じて行なうことができ、
例えば、フローインジェクション分析法（ＦＩＡ法）に
より行なうことができる。

【００２８】即ち、ペルオキシダーゼの基質を含む緩衝
液を、本発明のバイオリアクターに通液し、次いでバイ
オリアクターからの流出液は検出器に通液する。この緩
衝液の通液は連続的に行なう。体液等の検体は、バイオ
リアクターに通液する前にペルオキシダーゼの基質を含
む緩衝液の流路中に注入する。

【００２９】検体中の測定すべき微量成分に対して特異
性の高い酸化酵素を用いる場合は分離カラムを使用する
必要はないが、測定すべき微量成分に対して特異性の低
い酸化酵素を用いる場合であって、検体中の測定すべき
微量成分を検体中の他の成分と分離する必要がある場合
は、分離カラムを用いるのが好ましい。分離カラムは、
公知のものを使用することができる。この場合、分離カ
ラムに溶離液を通液し、分離カラムからの溶出液は次い
で、ペルオキシダーゼの基質を含む緩衝液と合流させた
後バイオリアクターに通液する。これらの通液は連続的
に行なう。検体は、分離カラムに通液する前の溶離液の
流れ中に注入する。

【００３０】ここで溶離液としては、公知のものが使用
できる。但し、溶離液に要求される条件として、(1) 体
液等の検体中の測定すべき微量成分が、図２の様なシス
テムの分離カラムで分離された後、バイオリアクターで
単一のピークとして検出されること、(2) 分離カラムか
らの溶出液とペルオキシダーゼの基質を含む緩衝液の混
合液がバイオリアクターを通過する際に、固定化酵素の
活性を阻害せず、活性を低下させず、また、ペルオキシ
ダーゼにより生成した発色物質又は蛍光物質が、検出系
に達する時間内まで安定であることが必要になる。これ
らの条件を満たすものであれば、通常ＨＰＬＣで使用さ
れる塩類、酸類、塩基類、緩衝液、有機溶媒、界面活性
剤、等を含む水溶液が使用できる。

【００３１】検体中に含まれる測定すべき微量成分は、
バイオリアクターの入口側に配置された酸化酵素により
酸化され、その際過酸化水素が発生する。次いで発生し
た過酸化水素は、バイオリアクターの出口側に配置され
たペルオキシダーゼの作用により、ペルオキシダーゼの
基質と反応し、該基質が過酸化水素で酸化され、その結
果生じた発色色素又は蛍光物質を検出器において吸光度
測定又は蛍光測定し、検体中に含まれる微量成分を定量
する。

【００３２】緩衝液としては、種々のものが使用でき、
例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液、クエン酸緩衝液、グッド緩衝液、イミダゾール緩
衝液等が挙げられる。

【００３３】ペルオキシダーゼの基質としては、種々の
発色基質、蛍光基質が挙げられ特に限定されない。例え
ば、発色基質とは過酸化水素と反応し可視あるいは紫外
領域に吸光度をもつ物質を生成する化合物であり、２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テト
ラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、Ｎ−（カルボキシメ
チルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルア
ミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６
４）、１０（カルボキシメチルアミノカルボニル）−
３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナト
リウム塩（ＤＡ−６７）、４−アミノアンチピリンとフ
ェノール類やＮ置換芳香族アミン誘導体の組合せなどの
トリンダー系の発色基質等が挙げられ、又、蛍光基質と
は過酸化水素と反応し蛍光を発する化合物であり、ヒド
ロキシフェニルプロピオン酸（ＨＰＰＡ）、パラヒドロ
キシ安息香酸等が挙げられる。

【００３４】ペルオキシダーゼの基質は、緩衝液中に
０．１μＭ〜１ｍＭ存在させるのが好ましい。

【００３５】ペルオキシダーゼの基質を含む緩衝液又は
これと溶出液の混合物のバイオリアクターへの通液量
は、測定すべき微量成分や酵素の種類等により変わる
が、通常は０．００１〜２０ｍｌ／分程度である。

【００３６】注入する検体（体液）の量は特に限定され
ないが、通常は１回あたり０．１〜１００μｌである。

【００３７】バイオリアクターにおける反応温度は通常
０〜８０℃であり、好ましくは４〜４０℃である。又、
バイオリアクターに通液する液のｐＨは通常は３〜１１
であり、好ましくは５〜９である。又、緩衝液中には、
その他の通常の添加剤例えば、界面活性剤、防腐剤、安
定化剤等を加えることができる。

【００３８】

【実施例】以下、実施例及び比較例を挙げて、本発明を
より具体的に説明する。

【００３９】合成例１ 固定化ピラノースオキシダー
ゼの調製 １ｇのアミノプロピル−ＣＰＧ（ポアーサイズ１４００
オングストローム フナコシ（株）販売）に２．５％グ
ルタルアルデヒド水溶液１０ｍｌを添加し、１時間室温
で反応させた後、十分水洗した。これに７０００ユニッ
トのピラノースオキシダーゼ（ＰＲＯＤ）を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１０ｍｌを加え、室温で
４時間撹拌しながら反応させた。このＰＲＯＤ固定化担
体粒子を上記リン酸緩衝液で洗浄して未反応のＰＲＯＤ
を除去し、ＰＲＯＤ固定化酵素を作製した。

【００４０】合成例２ 固定化ペルオキシダーゼの調
製 合成例１で使用したアミノプロピル−ＣＰＧ１ｇに、過
ヨウ素酸法により活性化した１００００ユニットのホー
スラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む０．
０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１０ｍｌを添加し、４
℃で４時間反応させた。このＨＲＰ固定化担体粒子を
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄して未反応
のＨＲＰを除去し、ＨＲＰ固定化酵素を作製した。

【００４１】実施例１ 内容積３００μｌのカラムの入口側に合成例１で得られ
た固定化ピラノースオキシダーゼを１５０μｌ、出口側
合成例２で得られた固定化ペルオキシダーゼ１５０μｌ
を充填し、バイオリアクター（１）を得た。

【００４２】実施例２ 合成例１で得られた固定化ピラノースオキシダーゼと合
成例２で得られた固定化ペルオキシダーゼを内容積が３
００μｌのカラムに次のように充填した。即ち、カラム
の入口側から出口側に向かって、最も入口側に固定化ピ
ラノースオキシダーゼ７５μｌ、次いで固定化ピラノー
スオキシダーゼと固定化ペルオキシダーゼを３対１の量
比に混合したもの７５μｌ、さらにその量比が１対３で
混合したもの７５μｌ、最も出口側に固定化ペルオキシ
ダーゼ７５μｌを充填し、バイオリアクター（２）を得
た。

【００４３】実施例３ 合成例１で得られた固定化ピラノースオキシダーゼと合
成例２で得られた固定化ペルオキシダーゼを、内容積が
３００μｌのカラムに次のように充填した。即ち、カラ
ムの入口側から出口側に向って、固定化ピラノースオキ
シダーゼと固定化ペルオキシダーゼの混和比が６対１の
混合物７５μｌ、３対１の混合物７５μｌ、１対３の混
合物７５μｌ、１対６の混合物７５μｌを充填し、バイ
オリアクター（３）を得た。

【００４４】実施例４ 内容積が１５０μｌのカラムに合成例１で得られた固定
化ピラノースオキシダーゼ１５０μｌを充填し、又、内
容積が１５０μｌの別のカラムに合成例２で得られた固
定化ペルオキシダーゼを１５０μｌ充填し、これら２つ
のカラムを内径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍのチューブで接
続しバイオリアクター（４）を得た。

【００４５】実施例５ 内容積１５０μｌのカラムに合成例１で得られた固定化
ピラノースオキシダーゼ１５０μｌを充填し、又、内容
積１５０μｌの別のカラムに合成例２で得られた固定化
ペルオキシダーゼを１５０μｌ充填し、これら２つのカ
ラムを、ジョイントを介して直接接続し、バイオリアク
ター（５）を得た。

【００４６】実施例６ 合成例１において、ピラノースオキシダーゼの代りにコ
レステロールオキシダーゼを用い、その他は合成例１と
同様にして固定化コレステロールオキシダーゼを作製し
た。この固定化コレステロールオキシダーゼを、実施例
１において固定化ピラノースオキシダーゼの代りにカラ
ムに充填し、バイオリアクター（６）を得た。

【００４７】実施例７ 合成例１において、ピラノースオキシダーゼの代りにウ
リカーゼを用い、その他は合成例１と同様にして固定化
ウリカーゼを作製した。この固定化ウリカーゼを、実施
例１において固定化ピラノースオキシダーゼの代りにカ
ラムに充填し、バイオリアクター（７）を得た。

【００４８】実施例Ａ１ 図１に示したフローインジェクション分析装置を用い
て、１，５−ＡＧの検出を行った。図１に示したとお
り、この分析装置においては、ＨＲＰの基質を含む緩衝
液（Ｘ１）をポンプ（Ｘ２）を用いてバイオリアクター
（Ｘ４）に導通し、バイオリアクター中で反応したＨＲ
Ｐの基質の酸化生成物は、検出器（Ｘ５）で検出され、
ポンプとバイオリアクターの間に設けられているインジ
ェクター（Ｘ３）から測定対象物（検体）を注入し、分
析する。

【００４９】実施例１〜５で得られたバイオリアクター
（１）〜（５）を図１のフローインジェクション分析装
置のバイオリアクター（Ｘ４）として用いた。ＨＲＰの
基質としては、ＤＡ−６４（和光純薬（株）製）を１０
０μＭになるように５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、ポンプでバイオリアクターに２．０ｍｌ
／分の供給速度で室温で通液した。インジェクターから
は、５μｇ／ｍｌの１，５−ＡＧ水溶液１０μｌを注入
し、バイオリアクターにより発色した色素のピーク面積
を吸光度検出器（７２７ｎｍ）で検出した。その結果を
表１に示した。

【００５０】比較例Ａ１ 実施例Ａ１において、次のバイオリアクターを用いた以
外は同様にして分析を行った。結果を表１に示した。

【００５１】バイオリアクター（１１） 合成例１で得られた固定化ピラノースオキシダーゼ１５
０μｌと合成例２で得られた固定化ペルオキシダーゼ１
５０μｌを均一に混合したものを、内容積３００μｌの
カラムに充填したもの。

【００５２】バイオリアクター（１２） 実施例４において、２つのカラムを長さ３０ｃｍのチュ
ーブで接続したもの。

【００５３】

【表１】

【００５４】同一のカラムに２つの固定化酵素を充填す
る場合、バイオリアクター（１）〜（３）を用いた場合
と、バイオリアクター（１１）を用いた場合を比較すれ
ば明らかなように、本発明のバイオリアクターを用いた
場合の方がピーク面積が大きかった。又、リテンション
タイムは、バイオリアクター（１１）を用いた場合の方
が、本発明のバイオリアクター（１）〜（３）を用いた
場合よりも長かった。

【００５５】一方、固定化ピラノースオキシダーゼのカ
ラムと固定化ペルオキシダーゼのカラムを接続する場合
においては、２つのカラムの接続を短くした場合［バイ
オリアクター（４）および（５）］の方が接続の長い場
合［バイオリアクター（１２）］に比較し、ピーク面積
が大きかった。又、リテンションタイムも、バイオリア
クター（１２）の場合の方が長かった。

【００５６】実施例Ａ２ 実施例６で得たバイオリアクター（６）を、図１のフロ
ーインジェクション分析装置のバイオリアクター（Ｘ
４）として用いた。ＨＲＰの基質としては、ＤＡ−６４
を１００μＭになるように１００ｍＭのＭＥＳ（２−モ
ルホリノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．１）に溶
解し、ポンプでバイオリアクターに２．０ｍｌ／分の供
給速度で室温で通液した。インジェクターから、５０μ
ｇ／ｍｌ濃度のコレステロール溶液１０μｌを注入し、
バイオリアクターを通過して発色したＤＡ−６４のピー
ク面積を吸光度検出器（７２７ｎｍ）で検出した。その
結果を表２に示した。

【００５７】比較例Ａ２ 実施例Ａ２において、次のバイオリアクターを用いた以
外は同様にして分析を行い、結果を表２に示した。

【００５８】バイオリアクター（１３） 実施例６で得た固定化コレステロールオキシダーゼ１５
０μｌと合成例２で得られた固定化ペルオキシダーゼ１
５０μｌを均一に混合したものを、内容積３００μｌの
カラムに充填したもの。

【００５９】

【表２】

【００６０】本発明のバイオリアクター（６）を用いた
方が、ピーク面積が大きかった。

【００６１】実施例Ａ３ 実施例７で得たバイオリアクター（７）を、図１のフロ
ーインジェクション分析装置のバイオリアクター（Ｘ
４）として用いた。ＨＲＰの基質としては、ＤＡ−６４
を１００μＭになるように５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．４）に溶解し、ポンプでバイオリアクターに２．
０ｍｌ／分の供給速度で室温で通液した。インジェクタ
ーから、５μｇ／ｍｌ濃度の尿酸溶液１０μｌを注入
し、バイオリアクターを通過して発色したＤＡ−６４の
ピーク面積を吸光度検出器（７２７ｎｍ）で検出した。
その結果を表３に示した。

【００６２】比較例Ａ３ 実施例Ａ３において、次のバイオリアクターを用いた以
外は同様にして分析を行い、結果を表３に示した。

【００６３】バイオリアクター（１４） 実施例７で得た固定化ウリカーゼ１５０μｌと合成例２
で得られた固定化ペルオキシダーゼ１５０μｌを均一に
混合したものを、内容積３００μｌのカラムに充填した
もの。

【００６４】

【表３】

【００６５】本発明のバイオリアクター（７）を用いた
方が、ピーク面積が大きかった。

【００６６】比較例Ａ４ 図２に示したクロマト分析装置を用いて、１，５−ＡＧ
の検出を行った。ここで用いた分析装置においては、溶
離液（Ｙ１）を、ポンプ（Ｙ３）で分離カラム（Ｙ６）
に送液し、次に、分離して来た測定対象物の酸化酵素の
リアクター（Ｙ８−２）に導通する。リアクター中で生
成した過酸化水素は、ポンプ（Ｙ４）で送液されるＨＲ
Ｐの基質を含む緩衝液（Ｙ２）と、ミキシングポート
（Ｙ７）で混合され、ペルオキシダーゼのリアクター
（Ｙ９）に導通される。リアクター（Ｙ８−１）は用い
ない。リアクター（Ｙ９）で反応したＨＲＰの基質の酸
化生成物は、検出器（Ｙ１０）で検出される。

【００６７】ポンプ（Ｙ３）と分離カラム（Ｙ６）の間
に設けられているインジェクター（Ｙ５）から検体を注
入し、測定対象物を分析する。

【００６８】内容積が１５０μｌのカラムに合成例１で
得られた固定化ピラノースオキシダーゼ１５０μｌを充
填したリアクターを、図２のリアクター（Ｙ８−２）と
して用い、内容積が１５０μｌのカラムに合成例２で得
られた固定化ペルオキシダーゼ１５０μｌを充填したリ
アクターを、図２のリアクター（Ｙ９）として用い、リ
アクター（Ｙ８−２）とリアクター（Ｙ９）間の配管
（チューブ）は内径０．５ｍｍ、長さ５５ｃｍとした。
又、分離カラム（Ｙ６）として、１，５−ＡＧ分析用の
対イオンをホウ酸型にしたＱＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
樹脂を内径４．６ｍｍ、長さ７５ｍｍのカラムに充填し
た分離カラムを用いた。

【００６９】図２の（Ｙ１）から１０ｍＭのホウ酸溶液
を供給速度１．０ｍｌ／分で分離カラムに流し、インジ
ェクターから１０μｌの血清を注入した。分離カラムか
ら溶出して来た１，５−ＡＧを含む液をリアクター（Ｙ
８−２）に、次いでリアクター（Ｙ９）に常温で通液し
た。又、途中の（Ｙ７）からＨＲＰの基質ＤＡ−６４を
１００μＭ含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（Ｙ
２）を供給速度２．０ｍｌ／分で供給した。酵素反応に
より生じた色素を吸光度検出器（７２７ｎｍ）で検出し
た。結果を表４に示した。

【００７０】実施例Ａ４ 図２に示した分析装置において、内容積が１５０μｌの
カラムに合成例１で得られた固定化ピラノースオキシダ
ーゼ１５０μｌを充填したリアクターを、図２のリアク
ター（Ｙ８−２）の位置からリアクター（Ｙ８−１）の
位置に変更し、リアクター（Ｙ８−１）とリアクター
（Ｙ９）間の配管（チューブ）は内径０．５ｍｍ、長さ
５ｃｍとした。その他は比較例Ａ４と同様にして同一の
血清を用いて実験を行ない、結果を表４に示した。

【００７１】実施例Ａ５ 実施例Ａ４において、長さ５ｃｍのチューブで連結した
リアクター（Ｙ８−１）とリアクター（Ｙ９）からなる
バイオリアクターを、実施例５のバイオリアクター
（５）に置き換え、その他は実施例Ａ４と同様にして同
一の血清を用いて実験を行なった。結果を表４に示し
た。

【００７２】

【表４】

【００７３】表４から明らかなように、本発明のバイオ
リアクターを用いた方がピーク面積が大きかった。

【００７４】

【発明の効果】本発明によれば、検体中の微量成分を高
感度かつ再現性よく定量することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例Ａ１〜Ａ３で使用したフローインジェク
ション分析装置。

【図２】実施例Ａ４〜Ａ５で使用したフローインジェク
ション分析装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田島 茂 群馬県藤岡市藤岡675−11 (72)発明者 梅香家 佳彦 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−205 (72)発明者 古屋敷 佳久 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−304 (72)発明者 北村 隆司 山口県熊毛郡熊毛町西勝間原1100−179

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酸化酵素とペルオキシダーゼを含む固定
   化酵素リアクターであって、リアクターの入口側に主と
   して酸化酵素が、出口側に主としてペルオキシダーゼが
   配置されているバイオリアクター。
2. 【請求項２】 入口側に酸化酵素のみが、出口側にペル
   オキシダーゼのみが配置されている請求項１のバイオリ
   アクター。
3. 【請求項３】 入口側から出口側に向かって酸化酵素の
   濃度が減少し、ペルオキシダーゼ濃度が増加するように
   酸化酵素とペルオキシダーゼが配置されている請求項１
   のバイオリアクター。
4. 【請求項４】 酸化酵素が配置された固定化酵素リアク
   ターとペルオキシダーゼが配置された固定化酵素リアク
   ターが、直接または近接して接続したバイオリアクタ
   ー。
5. 【請求項５】 酸化酵素とペルオキシダーゼが粒子状担
   体に担持されている請求項１、２、３または４のバイオ
   リアクター。
6. 【請求項６】 検体中の微量成分を検出する際に請求項
   １、２、３、４又は５のバイオリアクターを用いる微量
   成分の検出方法。
7. 【請求項７】 微量成分が１，５−アンヒドロ−Ｄ−グ
   ルシトールである請求項６の検出方法。