JPH06197799A - 宿主細胞シャット・オフの分析 - Google Patents

宿主細胞シャット・オフの分析

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JPH06197799A
JPH06197799A JP4306093A JP4306093A JPH06197799A JP H06197799 A JPH06197799 A JP H06197799A JP 4306093 A JP4306093 A JP 4306093A JP 4306093 A JP4306093 A JP 4306093A JP H06197799 A JPH06197799 A JP H06197799A
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ゾンマーグルーベル ヴォルフガンク
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アウエル ヘルベルト
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ブラース ディーター
Lela Frasel
フラーゼル レーラ
Klaus Dr Hartmuth
ハルトムート クラウス
Ernst Kuechler
キュッヒェラー エルンスト
Heinrich Kowalski
コヴァルスキー ハインリッヒ
Hans-Dieter Dr Liebig
ディーター リービッヒ ハンス
Timothy Skern
スケルン ティモシー
Elisabeth Ziegler
ツィーグラー エリザベス
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ピコルナ・ウイルスに寄因する宿主細胞シャ
ット・オフの分子メカニズムのインビトロ分析法を提供
する。 【構成】 ピコルナウイルスによって引き起こされる宿
主細胞シャット・オフの分析方法であって、（ａ）少な
くとも１つの内部翻訳開始部位を有する遺伝子由来のＲ
ＮＡにＣａｐ構造を与え、（ｂ）これをピコルナウイル
ス・プロテアーゼとプレ・インキュベーションした翻訳
混合物中でインビトロで翻訳し、そして、（ｃ）該翻訳
生産物を分析することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用】本発明は、ピコルナ・ウイルスに寄因
する宿主細胞シャット・オフの分子メカニズムのインビ
トロ分析法に関する。さらに、本発明は、この分析法に
必要なピコルナウイルス・プロテアーゼの調製法および
その精製法に関する。また、本発明は、ＨＲＶ２Ａプロ
テアーゼの阻害を目的とした上述のインヒビターを含む
医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】大部分のピコルナ・ウイルスによる感染
は、本来の内在性メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が
存在するにもかかわらず、細胞性タンパク質の生合成の
急速で劇的な減少をもたらす。この“宿主細胞シャット
・オフ”として知られている現象は、ウイルスが効率よ
くゲノムＲＮＡおよびウイルス・タンパク質を合成する
のを可能にしている〔リュウカート（Ｒｕｅｃｋｅｒ
ｔ，Ｒ．Ｒ．）（１９９０）“ピコルナウイルスとその
複製”フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．（編）：
“ヴィロロジー”、第２編、１−２巻、５０７−５４
８〕。宿主細胞シャット・オフを誘導する分子メカニズ
ムは、未だ十分に分かっていない。感染の経過におい
て、Ｃａｐ依存開始複合体の形成に必要と考えられてい
る真核性開始因子ｅＩＦ−４Ｆの構成要素であるタンパ
ク質ｐ２２０の分解が観察される（ソネンバーグ（Ｓｏ
ｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．）（１９８７）Ａｄｖ．Ｖｉｒｕ
ｓ Ｒｅｓ．３３，１７５−２０４）。細胞性ｍＲＮＡ
は特徴的なＣａｐ構造を有しているので、この現象がそ
の翻訳を妨害する。一方、ピコルナ・ウイルスはＣａｐ
を含んでいないが、５’非翻訳領域にＣａｐ非依存的翻
訳を可能にする機能的に保存された領域を有している
〔ペレチア（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．）およびソネン
バーグ（Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．）（１９８８），Ｎ
ａｔｕｒｅ３３４，３２０−３２５；カーン（Ｋｕｈ
ｎ）ら、（１９９０），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４，４６２
５−４６３１〕。
【０００３】おそらく、ｐ２２０の切断は、エンテロウ
イルスおよびライノウイルスの場合はウイルス・プロテ
アーゼ２Ａにより、またアフトウイルスの場合はリーダ
ー・プロテアーゼ・ペアＬ／Ｌ’により間接的に誘導さ
れている〔クロスリッヒ（Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ，Ｈ．
−Ｇ．），ニクリン（Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．
Ｈ．），トヨダ（Ｔｏｙｏｄａ，Ｈ．），エッチンソン
（Ｅｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｅ．）およびウィマー（Ｗｉｍ
ｍｅｒ，Ｅ．）（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，２
７１１−２７１８；ロイド（Ｌｌｏｙｄ，Ｒ．Ｅ．），
トヨダ，エッチンソン（Ｅｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｅ．），
ウィマー（Ｗｉｍｍｅｒ，Ｅ．）およびアーレンフェル
ド（Ｅｈｅｒｎｆｅｌｄ Ｅ．）（１９８６）Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ １５０，２９９−３０３；ベルシャム（Ｂｅ
ｌｓｈａｍ Ｇ．Ｊ．）およびブラングウィン（Ｂｒａ
ｎｇｗｙｎ，Ｊ．Ｋ．）（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６４，５３８９−５３９５；デバニー（Ｄｅｖａｎｅ
ｙ）ら，（１９９０），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，４４０
７−４４０９〕。多くの実験は、これらの極端に特異的
なウイルスプロテアーゼが感染細胞中で潜伏しており、
かつ、ｐ２２０の切断をもたらす内在性プロテアーゼを
タンパク質分解的に活性化することを示している〔クロ
スリッヒらの上記文献；ロイドらの上記文献；ヘレン
（Hellen, C.V.T.）、クロスリッヒ及びウィマー，（１
９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８，９８８１−９８９
０〕。
【０００４】しかし、今日まで、その細胞性プロテアー
ゼを同定できないので、この活性化は未だ証明されてい
ない。一方、真核性開始因子ｅＩＦ−３は、このｐ２２
０切断活性の必須要素であることが示されている〔ウィ
コフ（Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｅ．），ハーシェイ（Ｈｅｒｓ
ｈｅｙ，Ｊ．Ｗ．Ｂ．）およびアーレンフェルド（Ｅｈ
ｒｅｎｆｅｌｄ，Ｅ．）（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，９５２
９−９５２３〕。また、他の研究グループの観察は、ｐ
２２０の切断および宿主シャット・オフの発生との間に
何の時間的関連を示しておらず、この事は、この現象の
原因としての適切性には議論の余地があることを意味し
ている〔ウルザインキ（Ｕｒｚａｉｎｑｕｉ）およびカ
ラスコ（Ｃａｒｒａｓｃｏ）（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６３，４７２９−４７３５〕。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ピコルナ・
ウイルスに寄因する宿主細胞シャット・オフの分子メカ
ニズムのインビトロ分析法を提供する。さらに、本発明
は、この分析法に必要なピコルナウイルス・プロテアー
ゼの調製法およびその精製法を提供する。また、本発明
は、ＨＲＶ２Ａプロテアーゼの阻害を目的とした上述の
インヒビターを含む医薬組成物を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、少なく
とも１つの内部翻訳開始部位を有する遺伝子由来のＲＮ
ＡにＣａｐ構造を提供することを特徴とする。このＲＮ
Ａを、予めピコルナ・ウイルス・プロテアーゼとインキ
ュベートした翻訳混合物によりインビトロで翻訳する。
このタンパク質パターンを、Ｃａｐ構造無しの対応する
ＲＮＡ、および／またはピコルナ・ウイルス・プロテア
ーゼと翻訳混合物とのプレ・インキュベーション無しの
翻訳生産物の対応するタンパク質パターンと比較するこ
とにより、宿主シャット・オフを分析することが出来
る。さらに、本発明は、この分析法に必要なピコルナウ
イルス・プロテアーゼの調製法およびその精製法に関す
る。本発明の方法は、宿主シャット・オフに関する物質
の解析に加えて、宿主シャット・オフのインヒビターの
同定に使用しうる。
【０００７】以下に、本発明を説明する。意外にも、イ
ンビトロ翻訳混合物に関するピコルナウイルス２Ａプロ
テアーゼは、Ｃａｐ構造を有するＲＮＡ分子の内部開始
コドン（ＡＵＧ）における翻訳開始を増加する効果を持
つことが分かった。従って、本発明の特徴の１つは、以
下のステップ： (a) 少なくとも１つの内部翻訳開始部位を有する遺伝子
由来のＣａｐ構造を有するＲＮＡのインビトロ調製； (b) 宿主細胞シャット・オフを開始させるピコルナウイ
ルス・プロテアーゼ、特にライノウイルス２Ａプロテア
ーゼとインビトロ翻訳混合物とのインキュベーション； (c) (a) で調製したＲＮＡと、(b) で調製した翻訳混合
物とのインキュベーション； (d) 翻訳生産物の分析；を含む宿主細胞シャット・オフ
の分析法である。
【０００８】本発明の方法に使用するＲＮＡは、開始お
よび停止コドンと共にリーディング・フレームを有する
遺伝子であって、さらに、そのＲＮＡが少なくとも１つ
の内部翻訳開始コドン（ＡＵＧ）を含む遺伝子を用いた
インビトロ転写により調製しうる。“遺伝子”という言
葉は、１つのタンパク質を合成する為の情報を含む、ま
たは１つのタンパク質をコードするＤＮＡのフラグメン
トを意味する。便宜上、一つ以上の付加的翻訳開始部位
が配置されており、その結果、最初の開始コドンおよび
全ての付加的開始コドンは、例えば、個々の分子量の違
いにより検出しうるタンパク質またはペプチドを生成す
る。実施例１では、ピコルナウイスル２Ｃ遺伝子（ＨＲ
Ｖ２ ２Ｃ遺伝子）を用いた適当な遺伝子の構築を説明
する。ピコルナウイルス遺伝子の配列およびその調製方
法は知られており、例えば、ヒト・ライノウイルスＨＲ
Ｖ１４に関してはスタンウェイ（Ｓｔａｎｗａｙ）ら、
（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，７
８５９−７８７５、また、ヒト・ライノウイルスＨＲＶ
２に関してはスカーン（Ｓｋｅｒｎ）ら、（１９８５）
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３，２１１１−２１
２６に報告されている。これらの遺伝子を単離するのに
使用する原料としてのウイルスは、例えば、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メ
リーランド、ＵＳＡ）から入手しうる。もちろん、必要
とされる遺伝子断片も既知配列に基づいて合成的に調製
しうる〔例えば、エッジ（Ｅｄｇｅ）ら、（１９８１）
２９２，７５６−７６２の方法による〕。
【０００９】開始コドンおよび停止コドンおよび内部翻
訳開始の挿入等、適当な遺伝子の構築に必要な全ての操
作は当業者に周知のことであり、例えば、サムブルーク
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らの上記文献に報告されている。
最初の開始ＡＵＧの前の配列は、出来るかぎりコザック
（Ｋｏｚａｋ）のコンセンサス配列に一致するよう選択
する方が有利である〔コザック，（１９８９）Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８，２２９−２４１〕。実施例１
で使用する２Ｃ遺伝子には、開始および停止コドンが提
供されなければならない。スカーンら（１９８５、上記
文献）の方法で単離しうるＨＲＶ２２Ｃ遺伝子には、既
に内部翻訳開始部位が存在する。インビトロ転写、即ち
対応するＲＮＡの調製には、上記のように調製した遺伝
子を転写ベクターにクローン化する。ここでは、該遺伝
子はＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターのコントロール
下に置かれる。インビトロ転写後、対応するＲＮＡはマ
イクログラム・オーダーで得られる。ベクターシステム
はＳＰ６、Ｔ３およびＴ７プロモーターで機能すること
が望ましい。例えば、プラスミドｐＧＥＭ２（プロメガ
製）を使用しうる。
【００１０】対応するＤＮＡのインビトロ転写は、例え
ば、ダチラー（Ｄｕｅｃｈｌｅｒ）ら、（１９８９）Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ，１６８，１５９−１６１、サムブルー
クら、（１９８９）上記文献、クリーグ（Ｋｒｉｅｇ，
Ｐ．Ａ．）およびメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．）
（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５，３
９７〜４１５またはブヤード（Bujard,H）ら、（1987）
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５，４１６−４３３
等の標準的方法で行う。インビトロ転写混合物には、例
えば、２０mM リン酸ナトリウム（ｐＨ７．７）；８mM
ＭｇＣｌ2、１０mM ＤＴＴ、４mM スペルミジン−
ＨＣｌ、５０mMＮａＣｌおよび０．４−１mM ＡＴＰ、
ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰが含まれる。テンプレート
ＤＮＡ（２０μg/ml）を適当な制限酵素で線状化し、つ
づいてフェノール抽出およびエタノール沈殿する。この
反応は対応するＲＮＡポリメラーゼを添加することによ
り開始する。この反応物を３７℃で３０分間インキュベ
ートする。
【００１１】転写反応後、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮＡｓｅフ
リー、ベーリンガー・マンハイム製）を添加することに
よりＤＮＡを消化し、フェノール抽出およびエタノール
沈殿によりＲＮＡを精製する。もしもＲＮＡに次のイン
ビトロ転写に必要なＣａｐ構造をとらせるなら、この転
写反応に7ｍＧｐｐｐＧおよびＧＴＰを添加することが
出来る。例えば、ダチラーら（１９８９）、上記文献の
方法では、反応混合物に１mM 7ｍＧｐｐｐＧおよび２
５０μＭのＧＴＰが含められている。インビトロ翻訳に
は、市販されているか若しくは標準法で調製しうるタン
パク質抽出物を用いる。例えば、ウサギの網状赤血球溶
解産物またはＨｅＬａ細胞抽出物を使用しうる。さら
に、翻訳混合物は、翻訳反応に関する個々のタンパク質
またはタンパク質混合物の活性を調べるために従来法に
より分画できる〔サムブルーク，フリッツ（Ｆｒｉｔｓ
ｃｈ，Ｅ．Ｆ．），マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．）（１９８９）：“モレキュラー・クローニング：
ラボラトリー・マニュアル”、コールドスプリングハー
バー・プレス；実施例１）。
【００１２】実施例１に示されているように、各反応混
合物には１μgのＲＮＡを使用する。また、反応混合物
には、２０μｌの９０ｍＭＫＣｌ、0.３ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、１０ｍＭクレアチンホスフェート、２μｌの35Ｓ
−トランス・ラベル（ＩＣＮ；１０μCi／μｌ、１００
０Ci／mmol）および１1.５μｌのマイクロコッカス・ヌ
クレアーゼ（シグマ製）で処理したウサギ網状赤血球溶
解産物が含まれる。このウサギ網状赤血球溶解産物は、
例えば、マイクロコッカス・ヌクレアーゼによる処理に
よるジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ）およびハント
（Ｈｕｎｔ，Ｔ．）の方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．（１９８３），９６，５０−７４）を用いて調製す
る。３０℃で１時間後、１μｌの２００ｍＭメチオニン
を添加して反応を停止し、その一部（１μｌ）をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルに流す。泳動後、ゲルのフル
オログラフを作製する。実施例４では、インビトロ翻訳
にＨｅＬａ細胞抽出物を使用している。翻訳生産物のラ
ベル化には多くの方法を使用しうるが、その全ては、例
えば放射性アミノ酸の取り込み、電気泳動分離およびフ
ルオログラフィー、または従来法（サムブルークら、
（１９８９）上記文献）により調製しうる対応するタン
パク質、または、その断片に対するモノクローナル抗体
またはポリクローナル抗体による該タンパク質または該
断片の検出等の免疫学的方法による分離した翻訳生産物
の検出等、従来から知られている方法である。
【００１３】本発明に従い、翻訳混合物を宿主細胞シャ
ット・オフを開始する試薬、即ち、対応するピコルナウ
イルス・プロテアーゼとプレ・インキュベートする。こ
の目的のためには、該プロテアーゼを精製物、または部
分精製物、または粗抽出物の形で翻訳混合物に添加しう
る。ピコルナウイルス・プロテアーゼ、特にライノウイ
ルス２Ａプロテアーゼの調製法は知られている。例え
ば、ＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼのためには、発現ベク
ターｐＥｘ２Ａ〔スカーンら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，１８１，４６−５４〕およびｐＰＲＯＫ−２Ａ
〔ソマーグラバー（Sommergruber）ら、（１９９２）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２６３９−２２６
４４〕が報告されている。ｐＥｘ２Ａによる発現後、大
部分のプロテアーゼが不溶性物質として得られる。ｐＰ
ＲＯＫ−２Ａによる発現は成熟タンパク質を生成しない
が、このタンパク質は１つの付加的Ｎ末端メチオニンだ
け長くなっている。特に、大量の可溶性ピコルナウイル
ス・プロテアーゼの調製には、実施例３および４で説明
している調製法が有利である。ここでは、可溶性の成熟
ライノウイルス・プロテアーゼを調製するために、ＶＰ
１タンパク質のＣ末端部分の遺伝子フラグメントおよび
２Ａプロテアーゼの完全な遺伝子をベクターｐＥＴ８ｃ
（ノバジェン、マジソン、ＵＳＡ）またはｐＥＴ３ｂ
（ノバジェン、マジソン、ＵＳＡ）にクローン化し、大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳまたはＬｙｓＥ株（ノ
バジェン、マジソン、ＵＳＡ）で発現させる。
【００１４】ＶＰ１部分が３−４０個のＣ末端アミノ酸
を含み、その結果、発現後、ピコルナウイルス２Ａプロ
テアーゼ部分の自己分解活性により可溶性成熟タンパク
質を放出する可溶性融合タンパク質が得られることが望
ましい。特に、融合タンパク質の生成には、２８個のＣ
末端ＶＰ１アミノ酸が適している。例として、実施例２
および３において、プラスミドｐＥＴ／２ＡおよびｐＥ
Ｔ８ｃ／２Ａを用いた可溶性成熟ＨＲＶ２ ２Ａプロテ
アーゼを調製するための発現を説明している。ＶＰ１タ
ンパク質のＣ末端部分および２Ａタンパク質のｃＤＮＡ
配列は既知であり、スタンウェイらの上記文献およびス
カーンらの上記文献により報告されている。これらはウ
イルスから直接単離できるし、または合成的にも調製し
うる（エッジらの上記文献）。対応するウイルスは、例
えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ロックビル、メリーランド、ＵＳＡ）から入手しう
る。
【００１５】従って、本発明のもう１つの特徴は、ピコ
ルナウィルスＶＰ１タンパク質のＣ末端部分、次いで完
全なピコルナウィルス２Ａタンパク質を上記ベクターに
クローニングすることを特徴とする、可溶性成熟ピコル
スウイルス２Ａプロテアーゼ、好ましくは、ライノウィ
ルス２Ａプロテアーゼの組み換え調製法である。発現
後、細胞は実施例３で説明するように処理しうる。例え
ば、細胞を超音波で分解し、プロテアーゼは遠心後に得
られる細胞上清から分画硫安沈殿により濃縮できる。さ
らに、プロテアーゼは、イオン交換およびゲルクロマト
グラフィーで精製しうる（実施例３）。また、２Ａプロ
テアーゼは分画硫安沈殿後、直接使用しうる（実施例
２）。翻訳混合物と対応するプロテアーゼとのプレ・イ
ンキュベート後、インビトロ翻訳は、マーキング試薬、
例えば35Ｓ−メチオニン等の放射性ラベル化アミノ酸の
添加で開始する。翻訳後、得られたタンパク質は従来法
で検出しうる〔サムブルークら（１９８９）上記文
献〕。以下に、本方法をライノウイルス２Ｃ遺伝子の翻
訳で説明する。
【００１６】実施例１に従って調製したプラスミドｐＬ
ｉｎｋ−２Ｃ中のＨＲＶ２ ２Ｃ遺伝子を（スカーンら
の上記文献）（図６および図７）ＢａｍＨＩで線状化
し、インビトロで転写する。このＲＮＡは、転写開始コ
ドンからＡＵＧコドンまでの４６ヌクレオチドと、これ
に続くＨＲＶ２配列の３８７２乃至５２１９のヌクレオ
チドを含む。プラスミドｐＬｉｎｋ−ＢＣ（図６および
図７、実施例１）をコントロールとして使用し、これに
よってＢａｍＨＩにより線状化およびインビトロ転写
後、ＨＲＶ２配列の転写開始から翻訳開始までの４８ヌ
クレオチドと、これに続くＨＲＶ２配列の３５８７乃至
５２１９のヌクレオチドを含むＲＮＡが生産される。さ
らに、比較として２Ｃ遺伝子をＨＲＶ２の５’ＵＴＲの
後、およびウサギ・グロビン遺伝子の５’ＵＴＲ領域の
後にクローン化する。このことで、プラスミドｐＨＲＶ
２／５’ＵＴＲ−２Ｃおよびｐβ−２Ｃが生成する（図
７、実施例１）。図９のＡは、プラスミドｐＨＲＶ２／
５’ＵＴＲ−２Ｃ、ｐβ−２Ｃ、ｐＬｉｎｋ−２Ｃおよ
びｐＬｉｎｋ−２ＢＣのインビトロ転写後に得られるＲ
ＮＡの翻訳生産物を示している。意外にも、多くのタン
パク質が各ＲＮＡから翻訳されている。
【００１７】プラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｃおよびｐβ−
２ＣのＲＮＡの生産物の中に３７kDのバンドがある。こ
のバンドは成熟２Ｃタンパク質のサイズに対応してい
る。明らかに、この生産物は２つの構築物の最初のＡＵ
Ｇにおける開始から生成したものである（図７中、黒矢
印で示した）。他のバンド３３ｋＤ、２８ｋＤ及び２０
ｋＤは、図７に白矢印でしめしたＡＵＧから開始した生
産物である。意外にも、構築物ｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ
−２ＣのＲＮＡの翻訳では３７kDのバンドは出現しなか
った。従って、この事はＡＵＧ６１１での開始が無かっ
たことを示している。３７kDのバンドが成熟２Ｃタンパ
ク質であるという事実は、これがプラスミドｐＬｉｎｋ
−２ＢＣのＲＮＡの翻訳生産物に存在しないことからも
確認される。３３kD、２８kDおよび２０kDのバンドに加
えて、ここには４７kDおよび４２kDの二本の別のバンド
が存在する。これは、２Ｃ遺伝子の前に合成的に誘導さ
れたＡＵＧに由来するので３７kDのバンドを欠いてい
る。２ＢＣ遺伝子の最初のＡＵＧ（図７中、黒で示され
ている）での開始による４７kDのバンドおよび４２kDの
バンドは、２ＢＣ遺伝子中のＡＵＧの開始に対応してい
る。図２１は内部開始を担っているＡＵＧ領域の配列を
示している。
【００１８】また、この予期せぬ内部開始の現象を５’
Ｃａｐ構造を有し、従って感染宿主細胞の細胞性ＲＮＡ
の構造に対応する転写物を用いて調べた。図９のＢで
は、電気泳動後のプラスミドｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−
２Ｃ、ｐＬｉｎｋ−２ＣおよびｐＬｉｎｋ−２ＢＣによ
り転写されたＣａｐ構造を有するＲＮＡの翻訳生産物を
示している。プラスミドｐＬｉｎｋ−２ＣおよびｐＬｉ
ｎｋ−２ＢＣのＲＮＡでの開始は、殆ど専ら図７で黒矢
印で示したＡＵＧから起こっていた。実際に、３７kDお
よび４７kDのバンドのみが確認しえた。このように、Ｃ
ａｐ構造の存在が内部開始の抑制を起こしている。Ｃａ
ｐ構造を提供された構築物ｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲのＲ
ＮＡの翻訳生産物は、非Ｃａｐ化ＲＮＡのものと殆ど差
がない。３７kDおよび４７kDの所の弱いバンドは、ＡＵ
Ｇコドン４４９および６１１での開始を示している。従
って、キャップされた時でさえ、ＨＲＶ２の５’ＵＴＲ
領域は、内部翻訳を開始する２Ｃ ＲＮＡの能力を抑制
しえない。宿主細胞シャット・オフを解析するために、
翻訳混合物を宿主細胞シャット・オフを開始するピコル
ナウイルス・プロテアーゼとプレ・インキュベートす
る。意外にも、例えば、ＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼと
の翻訳生産物のプレ・インキュベート後、Ｃａｐ構造を
持つｐＬｉｎｋ−２Ｃ転写物の翻訳は、Ｃａｐ構造を持
たない対応する転写物と同じタンパク質パターンを生じ
た。図９のＢのトレース７は、得られた翻訳生産物を示
している。Ｃａｐ構造を持つＲＮＡを使用したにもかか
わらず、Ｃａｐ構造無しのＲＮＡの翻訳パターンが得ら
れた。明らかに２Ａの存在がウサギ・網状赤血球溶解産
物の性質を変化させている。
【００１９】２Ａプロテアーゼがこの変化を担っている
という仮説は、図９のＢのトレース８の結果によっても
確認される。この実験では（実施例３）、先ず２Ａプロ
テアーゼをエラスタチナル（２Ａ活性のインヒビター）
と混合した。この場合、Ｃａｐ構造無しのＲＮＡの翻訳
はウサギ・網状赤血球で正常に進行する。即ち、２Ａの
阻害が翻訳の性質の変化を妨げている。Ｃａｐ構造およ
びウイルスプロテアーゼの添加に依存して異なるタンパ
ク質パターンが出現するという意外な現象は、ピコルナ
ウイルスによって起こる宿主細胞シャット・オフを解析
する簡単な方法を提供する。この方法は、特に宿主細胞
シャット・オフに関連する物質の分析および単離に使用
しうる。宿主細胞シャット・オフに関係するウイルス性
並びに細胞性物質を研究しうる。この目的のためには、
例えば、分画した形の翻訳混合物を使用しうる。また、
この方法を用いて宿主細胞シャット・オフのインヒビタ
ーを見つけることもできる。実施例２は、翻訳混合物へ
のエラスタチナルの添加が、添加したＨＲＶ２プロテア
ーゼの活性を特異的に阻害することを示している。この
阻害は、翻訳パターンから明確に読み取ることが出来
る。
【００２０】ウサギ・網状赤血球溶解産物に加えて、他
の翻訳システム、例えば、ＨｅＬａ細胞抽出物を使用し
うることは明白である。実施例４は、ＨｅＬａ細胞抽出
物中でＣａｐを提供されたＲＮＡの翻訳に関するピコル
ナウイルス・プロテアーゼの影響を検出するためのイン
ビトロシステムを説明している。この翻訳システムは、
取り分けよく知られている〔ローソン（Ｌａｗｓｏｎ，
Ｍ．Ａ．），およびセムラー（Ｓｅｍｌｅｒ，Ｂ．
Ｌ．）（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ 、８８，９９１９−９９２３およびモ
ラ（Ｍｏｌｌａ，Ａ．），ポール（Ｐａｕｌ，Ａ．
Ｖ．），およびウィマー，（１９９１），Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２５４，１６４７−１６５１）。実施例５は、構築
物ｐＬｉｎｋ−２ＣおよびＰＢ−２ＣのＲＮＡを使用し
た実施例３で説明したウサギ・網状赤血球溶解産物のお
ける内部開始の意外な現象の究明を示している。対応す
る細胞標的とライノウイルスＨＲＶ２ ２Ａプロテアー
ゼとの相互作用を例として、宿主細胞シャット・オフを
解析する方法を以下に説明する。本発明の方法は、宿主
細胞シャット・オフのインヒビターの活性の研究を可能
にする。
【００２１】プロテアーゼ切断部位付近のアミノ酸は、
一般に以下のように表される：・・・Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２
−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’・・・切断は
Ｐ１とＰ１’の間で起こる。ＨＲＶ２の組み換えプロテ
イナーゼ２Ａ（ＨＲＶ２ ２Ａ）を用いた天然の切断領
域Ｐ８−Ｐ８’（配列番号２３）の研究により、意外に
も部位Ｐ１ではなく、部位Ｐ２がペプチド基質の切断に
重要であることが示された。さらに、Ｃ末端およびＮ末
端短縮ペプチド基質を用いて、Ｐ領域（切断部位の上
流）中の部位およびＰ１’およびＰ２’部位も重要であ
ることが示された（ソマーグラバーら、（１９９２）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２２６３９−２２６
４４）。ＨＲＶ２ ２Ａ（特に、Ｐ１’部位およびＰ８
−Ｐ３領域）の基質特異性または認識配列をより正確に
分析するために、各々部位Ｐ８−Ｐ６’にアミノ酸置換
を有する、実施例７および８に示す１５マーのオリゴペ
プチドを合成しうる。各部位を、各々酸性、塩基性、疎
水性および極性アミノ酸に置換した。部位Ｐ２、Ｐ１お
よびＰ１’の場合、数個のアミノ酸置換を行った。
【００２２】これらのデータ、実施例７のペプチド基質
に対するデータ、およびペプチド基質の欠失実験の結果
（ソマーグラバーらの上記文献）を基に、以下に示すＨ
ＲＶ２ ２Ａに対するペプチド基質中の潜在的認識配列
が得られる： Ｐ７（ＡＲＧ）−Ｐ６（Ｘ）−Ｐ５（Ｘ）−Ｐ４（Ｉｌ
ｅ／Ｌｅｕ）−Ｐ３（Ｘ）−Ｐ２（Ｔｈｒ）−Ｐ１
（Ｘ）＊Ｐ１’（Ｇｌｙ）−Ｐ２’（Ｐｒｏ） この事で、天然の切断配列ＴＲＰＩＩＴＴＡＧＰＳＤＭ
ＹＶＨ（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２３）またはＨＲＶ２ ２
Ａプロテアーゼの細胞標的の切断配列から、アミノ酸置
換によりライノウイルスＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼの
競合的インヒビターを生成する可能性が生じる。この様
にして得られたインヒビターの有効性は、上述の方法を
用いて検定することが出来る。意外にも、アミノ酸モチ
ーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｌ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｇ−Ｐとヒトｐ
２２０タンパク質〔ｅＩＦ−４γ；ヤン（Ｙａｎ）ら、
（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２３２
２６〕のアミノ酸配列の配列比較で、ＨＲＶ２２Ａプロ
テアーゼの競合的インヒビターとして使用しうる２つの
ペプチド配列ｐ２２０−３（配列番号１２４）およびｐ
２２０−４（配列番号１２５）が明らかとなる。
【００２３】この競合活性は、ＨＲＶ２ ２Ａプロテア
ーゼペプチドＰ８−Ｐ８’（配列番号２３）の対応する
天然の認識配列の切断と比較することで測定した。競合
実験に使用した方法は、実施例７で説明する。ペプチド
Ｐ８−Ｐ８’（配列番号２３）、ｐ２２０−３（配列番
号１２４）及びｐ２２０−４（配列番号１２５）は、宿
主細胞シャット・オフを阻害しうる。従って、本発明は
ライノウイルス２Ａプロテアーゼによってもたらされる
宿主細胞シャット・オフのインヒビターを含む。このイ
ンヒビターは、天然の切断配列ＴＲＰＩＩＴＴＡＧＰＳ
ＤＭＹＶＨ（配列番号２３）に由来し、かつ、アミノ酸
モチーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｌ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｇ−Ｐ（Ｘ
は、如何なる誘導アミノ酸をも示し、それによって、酸
残基のないアミノ酸が好ましい）を維持する事を特徴と
する。部位Ｐ１にメチオニンを含むインヒビターが望ま
しい。特に、本発明には、ペプチドＰ８Ｆ（配列番号２
６）、Ｐ８Ｋ（配列番号２８）、Ｐ３Ｋ（配列番号４
８）、Ｐ１Ｃ（配列番号８２）、Ｐ４’Ｋ（配列番号１
１０）、Ｐ４’Ｆ（配列番号１１１）、Ｐ４’Ｔ（配列
番号１１２）、Ｐ５’Ｋ（配列番号１１６）、ＭＭＰ−
１（配列番号１２７）およびＭＭＰ−２（配列番号１２
８）が含まれる。インヒビターには、上述のペプチド、
および、通常、この分子の一部を構成していない付加的
化学官能基を有する物を含む。これらの化学誘導体は、
分子の可溶性、吸収、生物学的半減期等を改良する化学
官能基、または毒性または不都合な副作用を減少しうる
化学官能基が含まれる。このような効果をもたらす化学
官能基は良く知られている〔レミントンズ・ファーマシ
ューティカル・サイエンス（１９８０）〕。
【００２４】システイン基は、通常、クロル酢酸または
クロルアセトアミド等のα−ハロアセテート（および相
当するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカ
ルボキシアミドメチル誘導体を生ずる。また、システイ
ン基は、ブロモトリフルオロアセトン、クロロアセチル
ホスフェート、Ｎ−アルキルマレインイミド、３−ニト
ロ−２−ピリジルスルフィド、メチル−２−ピリジルジ
スルフィド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−
クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ
−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール
と反応しうる。ヒスチジン基は、例えば、ｐＨ５．５−
７．０でジエチルピロカーボネートと反応させて誘導体
を作りうる。リジンおよびアミノ末端基は、コハク酸ま
たは他のカルボン酸無水物と反応する。これらの反応
は、リジン基の電荷の逆転を起こす。α−アミノ基を含
む誘導基に対する他の適当な試薬には、メチルピコリン
イミデート等のイミドエステル類、ピリドキサールホス
フェート類、ピリドキサール、クロロボロハイドライ
ド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチル尿素；
２，４−ペンタンジオンおよびグリオキシレートとのト
ランスアミネース触媒反応が含まれる。
【００２５】アルギニン基は、フェニルグリオキサー
ル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジ
オンおよびニンヒドリン等の従来から使用されている試
薬と反応させることにより修飾する。アルギニン基の誘
導体化は、アルカリ反応条件を前提としている。さら
に、これらの試薬は、リジン基のアミノ基およびアルギ
ニンのδ−アミノ基と反応しうる。チロシン基の特異的
修飾は、詳細に報告されている。特に、芳香族ジアゾニ
ウム基またはテトラニトロメタンとの反応による光学的
に検出可能な官能基の導入は、Ｏ−アセチルチロシル誘
導体または３−ニトロ誘導体を生成する。チロシン基
は、125Ｉまたは131Ｉで沃素化することも出来る。この
ラベル化ペプチドはラジオイムノアッセイに使用しう
る。スパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基
は、例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリ
ニル−（４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミ
ド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）と選択的に反応させるこ
とが出来る。さらに、アスパルチルおよびグルタミル基
は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル
およびグルタミニル基に転換しうる。グルタミニルおよ
びアスパラギニル基は、しばしば、対応するグルタミル
およびアスパルチル基を得るために脱アミド化される。
【００２６】また、本発明には、ＨＲＶ２Ａプロテアー
ゼの阻害を目的とした上述のインヒビターを含む医薬組
成物であって、場合によっては、従来から知られている
賦形剤、および／またはキャリヤー、および／または安
定剤を含む医薬組成物が含まれる。さらに、本発明は、
ＨＲＶ２Ａプロテニナーゼを阻害する医薬組成物の調製
を目的とした上述のインヒビターの使用、および、場合
によっては、従来から良く知られている賦形剤、および
／またはキャリヤーと共に、上述のペプチドの１つを含
む、ＨＲＶ２Ａプロテイナーゼの阻害を目的とした薬剤
に関する。また、本発明は、ＨＲＶ２Ａプロテイナーゼ
の阻害を目的とした上述のペプチドの使用および活性化
エステルを用いたＦｍｏｃ法、またはＨＯＢｔ／ＤＩＰ
ＣＤＩ活性化およびその類似法による該ペプチドの調製
方法を含む。本発明のポリペプチド、および、その医薬
的に許容しうる酸付加塩は、従来法により不活性で医薬
的に許容可能なキャリヤーまたは溶剤を用い、剥き出し
の、またはコート化した錠剤、丸薬、顆粒、エアロゾ
ル、シロップ、エマルジョン、サスペンジョンおよび溶
液等の簡便な成形物に転換しうる。医薬的に活性な化合
物の割合は、全組成物の0.５〜９０重量％の範囲であっ
て、以後に特定する投与量を達成するのに十分な量が含
まれるべきである。
【００２７】この成形物は、例えば、活性物質を溶剤お
よび／またはキャリヤーと、場合によってはエマルジョ
ン剤および／または分散剤を用いて混合することにより
調合するが、もしも希釈剤として水を使用する場合は、
場合によっては、例えば可溶化剤または補助溶剤として
有機溶剤を使用することもできる。賦形剤には、水、パ
ラフィン、植物油、単または多官能性アルコール等の医
薬的に許容しうる有機溶剤；天然鉱物粉末、合成鉱物粉
末、糖等のキャリヤー；エマルジョン化剤および潤滑剤
が含まれる。この物質は、通常の方法で、望ましくは経
口または非経口的に、より特定すると舌下または静脈経
由で投与される。経口投与の場合は、もちろん、錠剤に
上述のキャリヤーに加えて澱粉、望ましくはポテト澱
粉、ゼラチン等の種々の添加成分と共に、クエン酸ナト
リウム、炭酸カルシウムおよびリン酸二カルシウム等の
添加物を含ませることが出来る。ステアリン酸マグネシ
ウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよび滑石等の潤滑剤も
錠剤の調製に使用しうる。水性サスペンジョンの場合、
活性物質は上述の賦形剤に加えて、種々の芳香剤または
発色剤と混合しうる。
【００２８】また、錠剤は、層状に構成させることもで
きる。同様に、コート化した錠剤は、コロジオンまたは
シェラック、アラビアゴム、滑石、二酸化チタンまたは
糖等の錠剤のコーティングに従来から使用されている薬
剤で錠剤と同様に調製したコアをコーティングすること
により調製しうる。遅延放出または不耐性対策のため
に、そのコアも層状に構成させることもできる。同様
に、先に錠剤の成形に挙げられた賦形剤を用いて錠剤の
コーティングも層状に構成させ、遅延放出を行うことも
できる。本発明の活性物質、または、それらの組み合わ
せ物のシロップも、付加的にサッカリン、グリセリンま
たは糖等の甘味料、並びにバニリンまたはオレンジ抽出
物等の香料を含むことが出来る。また、これらは、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩等のサスペンジョ
ン補薬または増粘剤、脂肪族アルコールとエチレンオキ
シドとの縮合生産物等の保湿剤、またはｐ−ヒドロキシ
ベンゾエート等の保存剤を含むことが出来る。注射可能
な溶液は、例えば、ｐ−ヒドロキシベンゾエート等の保
存剤、またはコンプレキソン等の安定剤を添加し、注射
バイアルまたはアンプルに入れるなど通常の方法で調製
する。活性物質、または活性物質の組み合わせ物を含む
カプセルは、例えば、活性物質をラクトースまたはソル
ビトール等の不活性キャリヤーと混合し、これをゼラチ
ンカプセルに封入することにより調製しうる。
【００２９】非経口投与用の活性物質の溶液は、適当な
液体キャリヤーを用いて調製しうる。経口投与量は、１
〜３００mg、望ましくは５〜１５０mgである。しかし、
これらの量は、体重、投与経路、薬剤に対する応答の個
人差、成形物の種類、または薬剤投与の時間または間隔
に依存して調節する必要がある。従って、ある場合に
は、指定した最小量以下で十分であるかもしれないし、
また、別の場合には、上限を越える必要があることもあ
りうる。大量の薬剤を投与する場合は、これを一日何回
かの投与単位に分割することが賢明かもしれない。さら
に、本発明のポリペプチド、またはその酸付加塩を他の
活性物質と組み合わせることもできる。
【００３０】具体的には、本発明は以下の事項に関す
る。 −ピコルナウイルスによって引き起こされる宿主細胞シ
ャット・オフの分析方法であって、少なくとも１つの内
部翻訳開始部位を有する遺伝子由来のＲＮＡにＣａｐ構
造を与え、これをピコルナウイルス・プロテアーゼとプ
レ・インキュベーションした翻訳混合物中でインビトロ
で翻訳し、そして、該翻訳生産物を分析することを特徴
とする方法。 −インビトロで翻訳したタンパク質をラベル化する。 −得られたタンパク質を、Ｃａｐ構造を持たないＲＮＡ
および／またはピコルナウイルス・プロテアーゼとプレ
・インキュベートしない翻訳混合物によるＲＮＡの翻訳
生産物と比較する。 −ＲＮＡをピコルナウイルス２Ｃ遺伝子、望ましくはラ
イノウイルス２Ｃ遺伝子のインビトロ転写で得る。 −特に、該ＲＮＡはプラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｃのイン
ビトロ転写で得ることが出来る。比較として、プラスミ
ドｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−２Ｃ、ｐβ−２Ｃまたはｐ
Ｌｉｎｋ２ＢＣのＲＮＡを使用しうる。 −プレ・インキュベーションには、可溶性成熟ピコルナ
ウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテ
アーゼ、望ましくはＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼを使用
する。特定のプロテアーゼは濃縮された粗抽出物または
精製物として使用しうる。
【００３１】−翻訳混合物には、網状赤血球溶解産物ま
たはＨｅＬａ細胞抽出物またはこれらの翻訳系の分画成
分が含まれる。 −望ましい態様における本発明の方法は、開始コドンお
よび停止コドンを備えたＨＲＶ２ ２Ｃ遺伝子をインビ
トロで転写し、該転写物にＣａｐ構造を与え、ライノウ
イルス２Ａプロテアーゼとプレ・インキュベートした翻
訳混合物中で翻訳し、そして該翻訳タンパク質を、Ｃａ
ｐ構造を持たないＲＮＡの翻訳生産物およびインヒビタ
ーを添加した翻訳生産物と、放射能ラベル化、電気泳動
およびオートラジオグラフィーによって比較することを
特徴とする。 −本方法は、宿主細胞シャット・オフに関連する細胞性
およびウイルス性タンパク質の検出および単離、および
宿主細胞シャット・オフのインヒビターの単離に使用し
うる。特に、ライノウイルス・プロテアーゼのインヒビ
ターを単離しうる。 −さらに、本発明は、プラスミドｐＨＲＶ２／５’ＵＴ
Ｒ−２Ｃ、ｐＬｉｎｋ−２Ｃ、ｐＬｉｎｋ−２ＢＣ、ｐ
ＳＶＬ−２ＢＣ、ｐＳＶＬ−２Ｃおよびｐβ−２Ｃに関
する。 −また、本発明は、可溶性成熟ピコルナウイルス２Ａプ
ロテアーゼの組み換え調製法であって、ＶＰ１タンパク
質のＣ末端側の遺伝子フラグメント、およびそれに続く
２Ａプロテアーゼの完全な遺伝子を発現ベクターｐＥＴ
８ｃまたはｐＥＴ３ｂにクローン化し、これを発現させ
ることを特徴とする方法に関する。 −２Ａプロテアーゼは融合タンパク質として、特に大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＳまたは−ＬｙｓＥ株で発
現でき、また、成熟２Ａプロテアーゼは自己触媒活性に
より放出しうる。 −ＶＰ１タンパク質のＣ末端および２Ａプロテアーゼの
完全な遺伝子については、以下のアミノ酸配列：
【００３２】 ↓ＶＰＩ Asn Pro Val Glu Asn Tyr Ile Asp Glu Val Leu Asn Glu Val Leu Val 1 5 10 15 Val Pro Asn Ile Asn Ser Ser Asn Pro Thr Thr Ser Asn Ser Ala Pro 20 25 30 Ala Leu Asp Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Ser Val Gln Pro Glu 35 40 45 Asp Val Ile Glu Thr Arg Tyr Val Gln Thr Ser Gln Thr Arg Asp Glu 50 55 60 Met Ser Leu Glu Ser Phe Leu Gly Arg Ser Gly Cys Ile His Glu Ser 65 70 75 80 Lys Leu Glu Val Thr Leu Ala Asn Tyr Asn Lys Glu Asn Phe Thr Val 85 90 95 Trp Ala Ile Asn Leu Gln Glu Met Ala Gln Ile Arg Arg Lys Phe Glu 100 105 110 Leu Phe Thr Tyr Thr Arg Phe Asp Ser Glu Ile Thr Leu Val Pro Cys 115 120 125 Ile Ser Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gly His Ile Thr Met Gln Tyr Met 130 135 140 Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Pro Asn Ser Arg Asp Asp Tyr Ala 145 150 155 160 Trp Gln Ser Gly Thr Asn Ala Ser Val Phe Trp Gln His Gly Gln Ala 165 170 175 Tyr Pro Arg Phe Ser Leu Pro Phe Leu Ser Val Ala Ser Ala Tyr Tyr 180 185 190 Met Phe Tyr Asp Gly Tyr Asp Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Gly Thr Ala 195 200 205 Asn Thr Asn Asn Met Gly Ser Leu Cys Ser Arg Ile Val Thr Glu Lys 210 215 220 His Ile His Lys Val His Ile Met Thr Arg Ile Tyr His Lys Ala Lys 225 230 235 240 His Val Lys Ala Trp Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Leu Glu Tyr Thr 245 250 255 Arg Ala His Arg Thr Asn Phe Lys Ile Glu Asp Arg Ser Ile Gln Thr 260 265 270 ↓Ｐ２Ａ Ala Ile Val Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met 275 280 285 Tyr Val His Val Gly Asn Leu Ile Tyr Arg Asn Leu His Leu Phe Asn 290 295 300 Ser Glu Met His Glu Ser Ile Leu Val Ser Tyr Ser Ser Asp Leu Ile 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Thr Asn Thr Val Gly Asp Asp Tyr Ile Pro Ser Cys Asp 325 330 335 Cys Thr Gln Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys His Lys Asn Arg Tyr Phe Pro 340 345 350 Ile Thr Val Thr Ser His Asp Trp Tyr Glu Ile Gln Glu Ser Glu Tyr 355 360 365 Tyr Pro Lys His Ile Gln Tyr Asn Leu Leu Ile Gly Glu Gly Pro Cys 370 375 380 Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Lys Leu Leu Cys Lys His Gly Val Ile 385 390 395 400 Gly Ile Val Thr Ala Gly Gly Asp Asn His Val Ala Phe Ile Asp Leu 405 410 415 Arg His Phe His Cys Ala Glu Glu Gln 420 425 をコードするＤＮＡ配列をコードするものを選択しう
る。
【００３３】−さらに、本発明はプラスミドｐＥＴ８ｃ
／２ＡおよびｐＥＴ／２Ａに関する。 −また、本発明は、可溶性成熟ライノウイルス・プロテ
アーゼ２Ａの精製法であって、(a) 該プロテアーゼを異
種宿主中で発現すること、(b) 該プロテアーゼを含む細
胞を分解すること、(c) 該プロテアーゼを分画硫安沈殿
により細胞上清から濃縮すること、及び(d) 該プロテア
ーゼをイオン交換およびゲルクロマトグラフィーで精製
することを特徴とする方法に関する。 −アミノ酸モチーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｌ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−
Ｇ−Ｐ〔Ｘはいずれかの天然のアミノ酸を示す〕を含
み、かつ、少なくとも１０個で１６個以下のアミノ酸を
含む、天然の切断配列ＴＲＰＩＩＴＴＡＧＳＰＳＤＭＹ
ＶＨ（配列番号２３）から誘導されるライノウイルスＨ
ＲＶ２ ２Ａプロテアーゼのインヒビター。望ましいイ
ンヒビターは、部位Ｐ１にメチオニンを含むもの、また
はペプチドＰ８Ｆ（配列番号２６）、Ｐ８Ｋ（配列番号
２８）、Ｐ３Ｋ（配列番号４８）、Ｐ１Ｃ（配列番号８
２）、Ｐ４’Ｋ（配列番号１０６）、Ｐ４’Ｆ（配列番
号１１１）、Ｐ４’Ｔ（配列番号１０８）、Ｐ５’Ｋ
（配列番号１１６）、ＭＭＰ−１（配列番号１２３）ま
たはＭＭＰ−２（配列番号１２８）である。
【００３４】−アミノ酸モチーフＲ−Ｘ−Ｘ−Ｉ／Ｌ−
Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｇ−Ｐ〔Ｘはいずれかの望ましいアミノ酸
を示す〕を含み、および／またはペプチドｐ２２０−３
（配列番号１２０）またはｐ２２０−４（配列番号１２
１）に関連する事を特徴とする、ｐ２２０配列由来のラ
イノウイルスＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼのインヒビタ
ー。 −ＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼの阻害を目的とした医薬
組成物を調製するための上記インヒビターの１つの使
用。 −ＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼの阻害を目的とした、上
記インヒビターの１つを含み、場合によっては賦形剤お
よび／またはキャリヤーおよび／または安定化剤を伴う
薬剤。 −活性化エステルを用いたＦｍｏｃ法、またはＨＯＢＩ
−ＤＩＰＣＤＩ活性化、およびその類似法による該イン
ヒビターの調製方法。 以下に、本発明を実施例により説明する。
【００３５】
【実施例】実施例１ ：2C遺伝子のライノウイルスcDNAフラグメント
由来のRNA のインビトロ翻訳 Ａ）停止コドンの移入 ヌクレオチド2125から7102までのHRV2のcDNA( スカーン
ら、(1985)Nucl.AcidsRes. 13,2111-2126) を含むプラ
スミドp15 （ダチラーら、(1989), 上記文献)をAcc I
で切断し、次いで得られたフラグメントの吊り下がって
いる5'末端を除去するためにリョクトウヌクレアーゼで
処理した。次いでPvu IIで消化を続けた。得られた、2A
配列の一部分（2A' と命名する) 、2B、2C、3A、3Bの全
配列及び3Cの一部分（3C' と命名する) を含む1.7kb フ
ラグメント（ヌクレオチド3522〜5219; 図３）をpUC18
のSma I 部位にクローン化した。得られるプラスミド(p
UC18-2C3A)をSsp I(ヌクレオチド4335中の切断部位) 及
びBamHI(ポリリンカー中の切断部位) で二重消化にかけ
た。ウイルス配列を含む0.89kbフラグメントをブルース
クリプト(+) ベクター（ストラタゲン(Stratagene)) の
EcoRV 及びBamHI 部位にクローン化した。大腸菌 5K の
トランスフェクション後に、ブルー(+)-2C3Aからの一本
鎖DNA をM13 ヘルパーファージ(VCS-M13, ストラタゲ
ン) により単離した。このDNA を使用して、図１及び図
２に示されるように2Cの後に停止コドンを移入した(GGG
-> TAG)。ヌクレオチド5'-ATCAATTGGCTATTGGAATATA-3'
（配列番号２) を、通常の技術（テイラー(Taylor)ら、
1985,Nucl.Acids Res.13,8765-8785) の助けにより使用
した（図４）。
【００３６】組み入れられた開始コドンを有するクロー
ン（ブルー(+)-2X*3A)をトランスフェクション後に分離
し、その正確さを突然変異領域の直接DNA 配列決定によ
りチェックした〔テーバー(Tabor,S) 及びリチャードソ
ン(Richardson,C.C.),1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4,4767-4771〕。突然変異DNA 領域をブルー(+)-2C*3A
から分離し、pUC18-2C3A中の野生型環境にもどした（図
１及び図２）。ブルー(+)-2C*3A をBspMI で部分消化
し、その突然変異体を含む312bp の長いフラグメントを
分離した。pUC18-2C3Aを同酵素で完全に消化し、365bp
の長いフラグメントも単離した。同消化物の一つのアリ
コートをアルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し
た。消化及び脱ホスホリル化されたpUC18-2C3Aによるこ
れらの二つのフラグメントの結さつは、受容能力のある
大腸菌細胞中の形質転換後にpUC18-2C*3A を生じた。Bs
pMI は中断されたパリンドロームを認識するので、重複
末端が常に異なる。その結果、三つのフラグメントをこ
のように調節して互いに結さつすることが可能である。
【００３７】 Ｂ）2BC 遺伝子及び2C遺伝子の前への開始コドンの移入 プラスミドpSVL（ファルマシア；図４）を制限酵素XbaI
及びBamHI で切断し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
で処理した。pUC18-2C*3A(図４）を一方で制限酵素NdeI
及びBamHI で切断し、1.6kb フラグメントをアガロース
ゲルから溶離し、5'ホスホリル化オリゴヌクレオチドEB
I 1102/1094 （配列番号５）（図５）と結さつした。オ
リゴヌクレオチドの対は、2BC 遺伝子の第一コドンと、
NdeI切断部位まで補充されるべきコドンの前にAUG コド
ンを含んでいた。AUG の前の配列を、コザックのコンセ
ンサス配列（コザックの上記文献；図２１) にできるだ
け多く一致するように選んだ。得られたプラスミドをpS
VL-2BCと命名した。2BC 遺伝子の5'末端の配列の完全性
をDNA 配列決定により実証した。
【００３８】下記の操作を使用してプラスミドpSVL-2C
を構築した。プラスミドpSVL（ファルマシア製；図４）
を制限酵素XbaI及びBamHI で切断し、ウシ腸アルカリ性
ホスファターゼで処理した。pUC18-2C*3A(図４）を一方
で制限酵素SphI及びBamHI で切断し、1.3kb フラグメン
トをアガロースゲルから溶離し、5'ホスホリル化オリゴ
ヌクレオチドEBI 1099/1092 （配列番号６）（図５）と
結さつした。オリゴヌクレオチドの対は、2C遺伝子の第
一コドンと、SphI切断部位までの失われたコドンの前に
AUG コドンを含んでいた。AUG コドンの前の配列を、コ
ザックのコンセンサス配列（コザックの上記文献) にで
きるかぎり一致するように選んだ。プラスミドを得、こ
れをpSVL-2C と命名した。2C遺伝子の5'末端の配列の完
全性をDNA 配列決定により確認した。
【００３９】T7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写
を可能にするために、pSVL-2C のXbaI/BamHIフラグメン
トをpGEM2 と結さつした。これはXbaI及びBamHI で切断
し、アルカリ性ホスファターゼで処理したものである。
受容能力のある大腸菌細胞への形質転換後に、プラスミ
ド(pLink-2C)を分離し、その構造を図６及び図７に示
す。制限酵素BamHI による線状化後に、T7 RNAポリメラ
ーゼでのインビトロ転写中に、転写部位からAUG コドン
までの46のヌクレオチド、HRV2 配列の開始、続いてHR
V2 配列のヌクレオチド3872〜5219を含むRNA を生成し
た。
【００４０】同様にして、pSVL-2BCのXbaI/BamHIフラグ
メントを、XbaI及びBamHI で切断しアルカリ性ホスファ
ターゼで処理したp ブルースクリプト（ストラタゲン）
中に結さつした。受容能力のある大腸菌細胞への形質転
換後に、pLink-2BC として知られているプラスミドを得
た。その構造を図６に示す。制限酵素BamHI での線状化
後に、T7 RNAポリメラーゼでのインビトロ転写は、転写
部位からAUG コドンまでの48のヌクレオチド、HRV2 配
列の開始、続いてHRV2 配列のヌクレオチド3587〜5219
を含むRNA を生産する。
【００４１】2C遺伝子をHRV2の5'UTR の後に位置させる
ために、プラスミドpHRV2/5'UTR-2C（図７）を以下のよ
うにして調製した。プラスミドGR6(実施例６）を制限酵
素NcoI及びBamHI で切断し、ウシ腸アルカリ性ホスファ
ターゼで脱ホスホリル化した。プラスミドpLink-2Cを制
限酵素SphI及びBamHI で切断した。1.3kb フラグメント
をアガロースゲルから溶離し、NcoI及びBamHI で切断さ
れたGR6 DNA 試料と結さつし、そして5'ホスホリル化さ
れたオリゴヌクレオチドEBI 1631及び1634（配列番号
７) （図８) と結さつした。オリゴヌクレオチドを一緒
に素早く65℃にし、次いで徐々に４℃に冷却した。これ
らのオリゴヌクレオチドは、pLink-2CのAUG コドンとSp
hI切断部位の間に配置されるアミノ酸をコードする。受
容能力のある大腸菌細胞への形質転換後に、プラスミド
(pHRV2/5'UTR-2C)を分離した。その構造を図７に示す。
制限酵素BamHI による線状化後に、T7 RNAポリメラーゼ
でのインビトロ転写は、転写部位からEcoRV 部位までの
19のヌクレオチド、HRV2配列の開始、続いてHRV2配列の
ヌクレオチド19〜613 及び3872〜5219を含むRNA を生産
する。
【００４２】2C遺伝子をウサギβ−グロビン遺伝子の5'
UTR の後に位置させるために、プラスミドp β-2C(図
７）を以下のようにして調製した；プラスミドGR6(実施
例６）を制限酵素EcoRV 及びBamHI で切断し、その3.0k
b フラグメントをアガロースゲルから単離し、ウシ腸ア
ルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化した。プラス
ミドpLink-2Cを制限酵素SphI及びBamHI で切断した。1.
3kb フラグメントをアガロースゲルから溶離し、GR6 DN
A 試料（NcoI及びBamHI で切断されたもの）と結さつ
し、そして5'ホスホリル化されたオリゴヌクレオチド対
EBI 1264/1250 （配列番号７）及びEBI 1631/1634(SEQ
ID No.8)（図７) と結さつした。オリゴヌクレオチドを
一緒に素早く65℃にし、次いで徐々に４℃に冷却した。
オリゴヌクレオチド対EBI 1264/1250 はウサギβ−グロ
ビン遺伝子の5'UTR をコードし、そしてオリゴヌクレオ
チド対EBI 1631/1634 はpLink-2CのAUG コドンとSphI切
断部位の間に配置されるアミノ酸をコードする。受容能
力のある大腸菌細胞への形質転換後に、プラスミド(pβ
-2C)を単離した。その構造を図７に示す。制限酵素BamH
I による線状化後に、T7 RNAポリメラーゼによるインビ
トロ転写は、転写部位からEcoRV 部位までの19のヌクレ
オチド、β−グロビン5'UTR の開始、続いて52のヌクレ
オチド、全β−グロビン5'UTR 及びHRV2配列のヌクレオ
チド3872〜5219を含むRNA を生産する。
【００４３】Ｃ）インビトロ転写及び翻訳 T7 RNAポリメラーゼを使用する、BamHI での線状化後の
これらプラスミドのインビトロ転写をダチラーらの(198
9)上記文献に記載されたようにして行った。Ｃａｐ構造
を有するRNA を合成するために、7 mGpppG及びGTP を転
写混合物に添加した。例えば、ダチラーらの(1989)上記
文献に記載された反応混合物は１ｍＭの7MeGppG 及び25
0 μm のGTP を含んでいてもよい。反応時間の終了時
に、DNA をＤＮアーゼＩ（ＲＮアーゼ・フリー、ベーリ
ンガー・マンハイム製）の添加により消化し、タンパク
質をフェノール抽出により除去し、8Mの酢酸アンモニウ
ムの容積の1/3 の添加後にエタノールでRNA を沈殿させ
た。もう一度エタノールで沈殿させた後、次いでRNA を
水に吸収させ、一つのアリコートをアガロースゲル電気
泳動により品質について調べた。溶離緩衝液は１％のSD
S を含む。これらのRNA 1 μg をインビトロ翻訳に使用
した。
【００４４】その反応は、20μl の90ｍＭのKCl 、0.3
ｍＭのMgCl2 、10ｍＭのクレアチンホスフェート、2 μ
l の35S-トランス- ラベル(ICN;10 μCi/ μl,1000Ci/
mmol）及びミクロコッカスヌクレアーゼ（シグマ製）で
処理した11.5μl のウサギ網状赤血球溶解産物を含んで
いた。ウサギ網状赤血球溶解産物を、ジャクソン(Jacks
on,R.)及びフント(Hunt,T)の方法(Meth.Enzymol.,(198
3),96,50-74) を使用して、ミクロコッカスヌクレアー
ゼで処理することにより調製した。30℃で１時間後に、
その反応を１μl の200 ｍＭのメチオニンの添加により
停止し、一つのアリコート（１μl ）をSDS-ポリアクリ
ルアミドゲル〔ラエムリ（Laemmli,U.K.)(1970)Nature
291, 547-553）に適用した。溶離の終了時に、ゲルをフ
ルオログラフィーにかけた。
【００４５】図９のＡは電気泳動分離後にプラスミドpH
RV2/5'UTR-2C、p β-2C 、pLink-2C及びpLink-2BC によ
り転写されたRNA の翻訳生産物を示す。意外にも、幾つ
かのタンパク質が各RNA により翻訳された。内部開始の
予期できない現象を更に調べるために、5'Ｃａｐ構造の
存在をもたらす条件下でRNA をプラスミドにより転写し
た。それ故、反応混合物が１ｍＭの 7 mGpppG及び250 μ
M のGTP を含む以外は上記のようにして転写を行った。
翻訳を上記のようにして行った。
【００４６】図９のＢはＣａｐ構造を有するRNA の翻訳
生産物を示す。これらはプラスミドpHRV2/5'UTR-2C、pL
ink-2C及びpLink-2BC により転写されたものである。プ
ラスミドpLink-2C及びpLink-2BC のRNA について、開始
は殆ど専ら図７中に黒い矢印によりマークされたそれら
ＡＵＧで行われた。殆ど専ら、37kD及び47kDのバンドを
認識することができる。Ｃａｐ構造の存在は内部開始の
抑制をもたらした。Ｃａｐ構造を有する構築物pHRV2/5'
UTR のRNA の翻訳生産物は、キャップされていないRNA
の翻訳生産物と殆ど異ならない。37kD及び43kDの弱いバ
ンドはAUG コドン449 及び611 に於ける開始を示す。従
って、キャップされた場合でさえも、5'UTR HRV2は内部
で開始する2C RNAの能力を抑制することができない。
【００４７】実施例２：ウサギ網状赤血球溶解産物中の
キャップされたRNA の翻訳に関するピコルナウイルスプ
ロテアーゼの影響を検出するためのインビトロシステム Ａ）HRV2 2A プロテアーゼの発現 大腸菌中で2Aタンパク質を調製するために、プラスミド
pET3B(スチューディアー(Studier,F.)ら、(1990),Meth.
Enzymol.185, 60-89;Novagen,Madison,USA) をBamHI で
切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。M13 フ
ァージM13/2Aの二本鎖DNA 〔リービッグ(Liebig)ら、(1
991),Proc.Natl.Acad.Sci., 88,5979-5983〕をMluI及び
HindIII で切断し、その448bp フラグメント(HRV2 ヌク
レオチド3138〜3586) をアガロースゲルから分離し、Ba
mHI 切断pET3b 試料と結さつした。受容能力のある大腸
菌細胞中への形質転換後に、プラスミド(pET/2A)を単離
した。その構造を図１０に示す。このプラスミドは、T7
RNAポリメラーゼのプロモーター、翻訳信号及びHRV2の
キャプシドタンパク質VP1 の最後の７のアミノ酸、HRV2
の2Aプロテアーゼの全ての142 のアミノ酸及び２の停止
コドンが続くT7ファージの遺伝子10タンパク質の最初の
14のアミノ酸を有する。ヒトライノウイルス血清型２の
完全VP1-及びP2A-アミノ酸配列を図２５〜２８に示す。
大腸菌株BL21(DE3)LysS(Novagen,Madison,USA)中へのこ
のプラスミドの形質転換及びIPTG（イソプロピルチオガ
ラクトシド）の添加後に、この発現カセットを発現す
る。何となれば、この株はlac オペレーター／プロモー
ターの制御のもとに染色体上にT7RNAポリメラーゼの遺
伝子を有するからである。2Aプロテアーゼを成長ポリペ
プチド鎖から開裂することができる。従って、分子量15
kDの成熟した活性2A分子が得られる。
【００４８】この目的のために、大腸菌 BL21(DE3)LysS
の培養液(50 ml) をプラスミドpET/2Aで0.6 のOD590 ま
で増殖させる。その発現ブロックを0.2 ｍＭのIPTGで誘
導し、培養液を37℃で更に２時間インキュベートする。
次いで細菌を遠心分離することにより除去し、0.7ml の
音波処理用緩衝液(150ｍＭのNaCl、50ｍＭのトリス-HC
l、pH8.0 、５ｍＭのDTT 及び１ｍＭのEDTA) 中に吸収
させ、ソマーグラバーら(1989,Virology, 169, 68-77)
により記載されたようにして超音波で分解する。細胞デ
ブリを遠心分離することにより除去する。上澄み中のタ
ンパク質を30％の硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分
離する。30％の硫酸アンモニウム沈殿を音波処理用緩衝
液250 μl 中に吸収させ、４℃で貯蔵する。
【００４９】 Ｂ）HRV2 2A プロテアーゼの添加による翻訳 図９のＢは、プラスミドpLink-2CのキャップされたRNA
の翻訳に関する2A試料の添加の効果を示す。この種の抽
出物３μl を、RNA の添加の前にウサギ網状赤血球抽出
物に添加し、30℃で10分間インキュベートした。図９の
Ｂのトレース７は前処理したウサギ網状赤血球溶解産物
を含む翻訳生産物を示す。キャップされたRNA を使用し
たが、キャップされていないRNA の翻訳パターンが観察
される。2Aの存在は明らかにウサギ網状赤血球溶解産物
の性質を変える。
【００５０】Ｃ）HRV2 2A プロテアーゼの抑制 2Aプロテアーゼがこの変化の原因であるという事実が図
９のＢのトレース８中の結果により確認される。この実
験では、2A試料を最初に0.5 ｍＭのエラスタチナルと混
合した。エラスタチナルは0.05ｍＭの2Aに関するIC50を
有し〔ソマーグラバー、アホーン(Ahorn,H.)、ゼッフェ
ル(Zophel,A.) 、マウレル−フォギィ(Maurer-Fogy,
I.)、フェッスル(Fessl,F.)、シュノーレンベルグ(Schn
orrenberg,G) 、リービッグ(Liebig,H.-D.)、ブラース
(Blaas,D.)、キュヒラー(Kuchler,E.)及びスカーン（19
92） J.Biol.Chem. 81,22639-22644〕、それ故、2A活性
の非常に良好なインヒビターであることが実証された。
キャップされたRNA の翻訳は通常ウサギ網状赤血球中で
進行する。2Aの抑制は翻訳特性のいかなる変化も防止す
る。
【００５１】実施例３：2Aプロテアーゼの精製法 精製を簡単にするために、発現ベクターpET/2A（実施例
２、図１０）と異なり、VP1 の７のアミノ酸長の前駆体
に代えて、28のアミノ酸長の前駆体を有する発現ベクタ
ーを開発した。この変更は処理された融合タンパク質と
未処理の融合タンパク質の間の分子量の差を更に大きく
し、この差が精製を更に容易にする。
【００５２】そのベクターを以下のようにして調製し
た。プラスミドpET8c(スチューディアー,F. ら、1990,M
eth.Enzymol., 185, 60-89;Novagen,Madison,USA) をBa
mHI で切断し、重複末端を、大腸菌 DNAポリメラーゼＩ
のクレノーフラグメントを使用して充填し、アルカリ性
ホスファターゼで処理した。M13 ファージM13/2AΔ3Gly
（リービッグら、1991,Proc.Nat.Acad.Sci.,88,5979-59
83;WO 92/03559) の二本鎖DNA をSalI及びHindIII で切
断し、524bp フラグメント（HRV2ヌクレオチド3085〜35
86を含む）をアガロースゲルから単離し、線状化したpE
T8c と結さつした。大腸菌 HMS 174(Novagen,Madison,U
SA) 中での形質転換後に、プラスミド(pET8c/2A Δ3Gl
y) を単離した。その構造を図１１に示す。このプラス
ミドはT7 RNAポリメラーゼプロモーター、翻訳開始及び
T7ファージの遺伝子10タンパク質の最初の13のアミノ
酸、続いてα- フラグメントの三つのアミノ酸、HRV2の
キャプシドタンパク質VP1 の最後の28のアミノ酸、HRV2
の酵素的に不活性な2Aプロテアーゼの139 アミノ酸及び
２つの停止コドンを有する。
【００５３】続いてpET8c/2AΔ3Gly中の2AΔ3Gly遺伝子
を野生型遺伝子により置換した。プラスミドpET8c/2AΔ
3Glyを制限酵素PstI及びApaIで切断し、3.5kb フラグメ
ントをアガロースゲルから単離した。また、プラスミド
pET/2AをPstI及びApaIで切断し、1.0kb フラグメントを
アガロースゲルから単離した。これらの二つのセグメン
トの結さつ及び大腸菌 HMS 174中での形質転換後に、プ
ラスミド(pET8c/2A)を単離した。その構造を図１２に示
す。このプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼのプロモー
ター、翻訳開始及びT7ファージの遺伝子10タンパク質の
最初の13のアミノ酸、続いてα- フラグメントの三つの
アミノ酸、HRV2のキャプシドタンパク質VP1 の最後の28
のアミノ酸、HRV2の活性2Aプロテアーゼの142 のアミノ
酸及び２つの停止コドンを含む。大腸菌 BL21(DE3)LysS
またはLysE中の形質転換及びIPTGの添加後に、この発現
ブロックを発現する。何となれば、染色体上の細菌株BL
21(DE3)LysS または-LysE はlac プロモーター／オペレ
ーターの制御のもとにT7 RNAポリメラーゼの遺伝子を有
するからである。2Aプロテアーゼを成長ポリペプチド鎖
から開裂することができる。従って、15kDの分子量を有
する成熟した活性2A分子が得られる。
【００５４】培養 予備培養のために、２３０ｍｌのＬＢ−培地（３０ｍｇ
／ｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／ｌのア
ンピシリンを含む）に、ｐＥＴ８ｃ／２Ａプラスミドを
含有する、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＬｙｓＥを接種
し、３４℃で一夜インキュベートした。次いで、ＬＢ培
地（上記した）の１リットルの３ロットを７５ｍｌの予
備培養液に接種し、３４℃で２．５時間、１３０ｒｐｍ
でインキュベートした。ＩＰＴＧ（最終濃度：０．３ｍ
Ｍ）で誘起後、バクテリア懸濁液をさらに３４℃で４時
間、１３０ｒｐｍでインキュベートした。光学濃度は、
誘起前でＯＤ５９５＝０．５５であり、誘起後４時間で
ＯＤ５９５＝１．３４であった。次いで、バクテリアを
沈降させ（６０００ｒｐｍ，１０分間，４℃）、２００
ｍｌの洗浄緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄
した。さらにもう一度遠心分離した後、バクテリアを３
０ｍｌの緩衝液Ａ（洗浄緩衝液と５ｍＭ ＤＴＴおよび
５％グリセリン）に再懸濁し、超音波処理でそれぞれ５
〜１０秒間、３回溶解した。細胞破片を除去するため
に、溶解したバクテリアを遠心分離（３０分間，１６０
００ｒｐｍ）し、上澄液を２０％硫酸アンモニウムに入
れ、７℃で一夜放置した。析出物を遠心分離（３０分
間，１６０００ｒｐｍ）し、上澄液を４０％硫酸アンモ
ニウムに入れた。７℃で３時間放置した後、溶液を遠心
分離（３０分間，１００００ｒｐｍ）し、析出物を３０
ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁した。
【００５５】モノＱでのカラムクロマトグラフィ 緩衝液Ａに再懸濁した１０ｍｌの沈降物を、Ｍｏｎｏ
Ｑ ＨＲ５／５カラムに加え、カラムを５ｍｌの緩衝液
Ａで洗浄した。２Ａプロテアーゼを含む、Ｍｏｎｏ−Ｑ
カラムに結合したタンパク質を、次いで、緩衝液Ｂ（緩
衝液Ｂは緩衝液Ａにおいて、１５０ｍＭ ＮａＣｌの代
わりに１Ｍ ＮａＣｌを用いている）の添加量を増やす
ことによりカラムから溶出させた。使用した勾配は以下
のとおりである：０％〜３０％ ５ｍｌの容量の緩衝液
Ｂ、３０％〜６０％ ３０ｍｌの緩衝液Ｂ、６０％〜１
００％ ５ｍｌの容量の緩衝液Ｂ。ＨＲＶ ２Ａプロテ
アーゼがアニオン交換カラムの３０〜６０％の緩衝液Ｂ
の領域から溶出した。この操作をさらに２回繰り返し
た。１５％のポリアクリルアミドゲルで、個々の留分の
２Ａ含有量をクーマシー染料（図１４および図１５）に
より調べた。
【００５６】スーパーデックス２６／６０（ファルマシ
ア製）でのカラムクロマトグラフィ ２Ａタンパク質の大部分を含有する留分を合わせ、ゲル
ロ過カラム（スーパーデックス７５プリプグレード・ハ
イロード２６／６０）にかけ、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｃは緩
衝液Ａと５０ｍＭ ＮａＣｌである）で溶出した。Ｌａ
ｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７，６８０
−６８５）によるＰＡＧＥの方法で個々の留分の２Ａタ
ンパク質を調べた後、少なくとも９５％の２Ａ−含量の
留分を合わせ、アミコン・セントリプリプ（Amicon Cen
triprep)１０−セル（図１５及び図１７）で濃縮した。
この方法で生成した２Ａタンパク質は、少なくとも９８
％の純度である。製剤の純度および均質性は、等電焦点
法、キャピラリー電気泳動、モノＰ−カラムによるクロ
マト焦点法（クロマトフォーカシング）およびゲルクロ
マトグラフィーによる分析により調べた。
【００５７】活性試験 純粋２Ａプロテアーゼの活性は、相当するプロテアーゼ
２Ａ切断部位または３５Ｓで標識化したＶＰ１／２Ａ基
質で合成したペプチド〔ソマーグルーバーら（１９８
９），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６９，６８−７７〕を切断
し、インビトロで翻訳することにより調べることができ
る。典型的なＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼ製剤は、９ユ
ニット／ｍｇの特異的活性を有しており、１ユニットは
２５℃で１分間当たり１μｍｏｌの合成ペプチドにより
切断されるタンパク質の量である。貯蔵のために２Ａプ
ロテアーゼは貯蔵緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍ
Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０，５ｍＭ ＤＴＴ，０．
０５％ＮａＮ３）に移した。この目的のために、２Ａ濃
縮物をウォーターズ・プロテイン・パック１２５ＨＰＬ
Ｃ−ゲルロ過カラムに２００μｌの量で適用し、貯蔵緩
衝液で溶出した。２Ａタンパク質を含有する留分を合わ
せ、アミコン・セントリプリプ１０−セルで濃縮した。
【００５８】実施例４：ＨｅＬａ細胞抽出物中のキャッ
プされたタンパクＲＮＡの翻訳に対するピコルナウィル
スプロテアーゼの影響を検出するためのインビトロシス
テム ＨｅＬａ細胞抽出物を調製するために、１リットルのＨ
ｅＬａ懸濁培養液（たとえば、ＨｅＬａ Ｓ３（０３−
１５７，ＦＬＯＷＬＡＢＳ）またはＨｅＬａＯｈｉｏ
（０３−１４７，ＦＬＯＷＬＡＢＳ））（約４Ｘ１０５
セル／ｍｌ）を半対数相で遠心分離（２０分間，３００
０ｒｐｍ）し、等張緩衝液で洗浄し、繰り返し「ダウン
シング」（４０〜５０回）することにより破壊し、そし
て細胞破片を遠心分離（３分間，３０００ｒｐｍ）によ
り除去した。上澄液をもう一度遠心分離（２０分間，１
０００ｒｐｍ）し、固形物を捨て、新たな上澄液をもう
一度遠心分離（２０分間，１３０００ｒｐｍ）した。得
られた上澄液を、次いで、４℃で透析緩衝液に対して透
析し（それぞれ４００ｍｌで２回）、２０分間、１３０
００ｒｐｍ（２０分間，１３０００ｒｐｍ）でさらに遠
心分離した。上澄液（Ｓ２０抽出液）をバッチに分け、
液体窒素中に貯蔵した。 等張緩衝液：１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ 7.９，１４
０ｍＭ ＫＣｌ，1.５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ 透析緩衝液：０．１Ｍ ＫＣｌ，２０％グリセリン，２
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ7.９，0.２ｍＭ ＥＤＴＡ，
0.５Ｍ ＤＴＴ，0.５ｍＭ ＰＭＳＦ
【００５９】公知の方法に対し、透析緩衝液はマグネシ
ウムイオンを含有していない。Ｓ２０抽出物の１ｍｌ量
を、次いで、生体内由来ＲＮＡを分解するために、ミク
ロコッカスヌクレアーゼ（ベーリンガーマンハイム製；
Ｎｏ．１０７９２１）で処理：先ず、抽出物を遠心分離
（１５分間，４℃，１３０００ｒｐｍ）し、固形物を捨
てた。上澄液（１ｍｌ）に、 １．２μｌ １Ｍ ＣａＣｌ２ １．５μｌ １Ｍ ＭｇＯＡｃ １６．０μｌ ミクロコッカス・ヌクレアーゼ（１５
Ｕ／μｌ） を加えた。混合液を２０℃で１５分間インキュベート
し、ＥＧＴＡを添加することにより（最終濃度３ｍＭ）
反応を停止させた。１／７容の８０％グリセリンを添加
し、短時間の遠心分離をした後、このように予備処理し
た抽出物は、再びバッチに分け、液体窒素中に貯蔵し
た。
【００６０】この方法で調製し、そして処理した抽出物
による典型的なインビトロ翻訳混合物は以下のとおりで
ある。 １０μｌ 抽出物 ２μｌ 35Ｓ−Ｍｅｔ １μｌ ２０×エネルギー混合物：２０ｍＭ ＡＴＰ，
２ｍＭ ＧＴＰ，４０ｍＭ ＤＴＴ，０．２Ｍクレアチ
ンリン酸，１ｍＭアミノ酸（メチオニン含有せず） １μｌ １．３Ｍ 酢酸カリウム １μｌ ３０ｍＭ 酢酸マグネシウム １μｌ ＳＨＴ混合物（４８ｍＭ スペルミジン；０．
２６Ｍ Ｈｅｐｅｓ；０．４８μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ） １μｌ ５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ ２μｌ Ｈ２Ｏ １μｌ ＲＮＡ 反応溶液は３０℃で１時間インキュベートし、１μｌの
１００ｍＭメチオニンを添加することにより、反応を停
止した。
【００６１】２つのＲＮＡ（網状赤血球から単離したウ
サギグロブリンＲＮＡ、すなわち、完全にキャップされ
たＲＮＡ）およびインビトロで転写されたキャップされ
ていないｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−２Ｃ ＲＮＡの翻訳
を図１７に示す。グロビンＲＮＡの５’−翻訳は、ウサ
ギβ−グロビンの分子量に相当する、１６ｋＤの生成物
を与えた。キャップされていないｐＨＲＶ２／５’ＵＴ
Ｒ−２Ｃの中で、３７ｋＤの分子量に相当する一本のバ
ンドのみが再度可視であった。ウサギ網状赤血球からの
抽出物の翻訳において生じた状況に照らして、ｐＨＲＶ
２／５’ＵＴＲ−２ＣのキャップされていないＲＮＡの
翻訳シグナルは、このようにして正確に認識された。次
いで、純粋なＨＲＶ２ ２Ａプロテアーゼ試料を、それ
ら二つのＲＮＡの翻訳へ添加することについて検討し
た。プロテアーゼ試料を図１７のＡに示す。インビトロ
で翻訳した35Ｓ−標識化ＶＰ１／２Ａ基質に対する酵素
の活性を図１７のＢに示す。この酵素を２μｇ添加する
と、グロビンＲＮＡの翻訳が減少する（図１７のＣ、ト
レース１）。トレース３においては、緩衝液のみを試験
した。ここでは、グロビンＲＮＡの翻訳は影響されなか
った。トレース４では、２Ａプロテアーゼは０．５ｍＭ
エラスタチナルで予備インキュベートをした。翻訳に対
する２Ａの効果は阻害された。実験は、２Ａプロテアー
ゼがキャップされたＲＮＡの翻訳を２〜３倍減少させる
が、ライノウィルス５’ＵＴＲとのＲＮＡには影響しな
いことを示している（図１７のＣ、トレース５〜８）。
このシステムは、２Ａプロテアーゼの存在が、ホスト細
胞の遮断をもたらし、そしてホストに対しＲＮＡ固有の
翻訳をやめさせることをインビトロの状況で示してい
る。ウィルスのＲＮＡの翻訳は、このブロックから影響
を受けない。
【００６２】実施例５：オリゴヌクレオチドの存在下で
のｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡのインビトロでの翻訳の研
究 実施例２は、Ｃａｐ構造の存在および非存在でのｐＬｉ
ｎｋ−２Ｃ ＲＮＡのウサギ網状赤血球の翻訳の相違を
明らかに示している。何故、Ｃａｐ構造を有していない
ＲＮＡの翻訳中に、付加的な生成物が形成されるのかと
いう疑問が生じる。２つの仮説が立てられる。先ず、第
一に、リボソームガ５’末端に結合し、部分的に最初の
ＡＵＧで、部分的に３３ｋＤ生成物を生ずるＡＵＧで、
および部分的に２８ｋＤとなるＡＵＧで、等でのみ開始
する。第二の仮説は、リボソームが特別のＡＵＧと結合
することである。それらの仮説を区別するために、以下
の実験を行った。
【００６３】実施例２に記載したように、Ｃａｐ構造の
存在および非存在でのｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡをイン
ビトロで転写した。それらのＲＮＡに、増加する量のオ
リゴヌクレオチド１０９２（図５、配列番号６）および
１８２８（図１９）を加えた。オリゴヌクレオチド１０
９２は、図８に黒の矢印で示したＡＵＧの配列に相補的
であり、オリゴヌクレオチド１８６８（配列番号９）は
プラスミドｐＳＶＬ（ファルマシア製，実施例２参照）
から誘導される。オリゴヌクレオチドは、それ故、ｐＬ
ｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡとは結合すべきではない。ＲＮＡ
−オリゴヌクレオチド混合物は、８５℃で１０分間、そ
して６５℃で１０分間インキュベートし、次いで、ゆっ
くりと雰囲気温度まで冷却した。それらは、次いで、実
施例２に記載したように、インビトロでの翻訳に使用し
た。結果を図２０に示す。オリゴヌクレオチド１０９２
をキャップされていないｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡに増
加する量で添加すると、他の生成物の量に影響すること
なく、３７ｋＤバンドの翻訳が減少した。Ｃａｐ構造を
有するｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡの３７ｋＤバンドの翻
訳も、同様に減少し、他の生成物は形成されなかった。
オリゴヌクレオチド濃度にも拘らず、３３ｋＤバンドの
翻訳が多少観測された。それは、試料中の少量のキャッ
プされていないｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡにより製造さ
れた。オリゴヌクレオチド１８６８を添加しても、ＲＮ
Ａの翻訳には何ら影響しなかった。
【００６４】オリゴヌクレオチド１０９２は第一のＡＵ
Ｇの回りの配列に相補的であるので、リボソームはその
存在下にこのＡＵＧと結合できず、３７ｋＤバンドの翻
訳が減少した。キャップされていないＲＮＡの場合、リ
ボソームは内部のＡＵＧと結合を続け、そしてタンパク
質鎖に着手する。それ故、リボソームは特別のＡＵＧに
直接結合できねばならず、第二の仮説が支持される。Ｃ
ａｐ構造翻訳を有するｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡが阻害
された場合、リボソームはＣａｐ構造と結合するように
みえるが、開始することができない。何故なら、オリゴ
ヌクレオチドの存在がこれを阻害するからである。Ｃａ
ｐ構造は、リボソームがＣａｐ構造を認識する低分子量
の生成物の翻訳を阻害する。
【００６５】実施例６：ＧＲ６の調製 プラスミドＧＲ６（実施例１）は三つのプラスミド、す
なわち、ｐ７７３〔ＨＲＶ２ヌクレオチド５６２−１０
１２；スカーンら（１９８５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，１３，２１１１−２１２６〕、ｐ１９（Ｈ
ＲＶ２ヌクレオチド１９−５１００）（ダチラーら（１
９８９），上記文献）およびｐ８６０を用いて製造され
た。ｐ８６０は、ｐＵＣ９のＰｓｔＩ切断部位における
ＨＲＶ２ヌクレオチド６６０−１４００を含む。配向は
ヌクレオチド１４００がポリリンカーのＥｃｏＲｉ切断
部位の次に位置するようになっている。プラスミドｐＧ
ＥＭ２は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで
切断し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸し
た。プラスミドｐ７７３もまた、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＢａｍＨＩで切断した。このように挿入されたＨＲＶ２
は、アガローズゲルから溶離されたものから放出され、
そして、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで直線化されたｐ
ＧＥＭ２ベクター（プロメガ製）で結紮した。適当な大
腸菌細胞中に転換した後、得られたプラスミド（ＧＲ
１）を単離した。ＧＲ１は、次いで、制限酵素のＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＮｃｏＩで、並びにアルカリホスファタ
ーゼにより処理し、プラスミドｐ１９もまたＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＮｃｏＩで切断した。これにより、ＨＲＶ２
遺伝子地図のヌクレオチド２４８〜６０９を有する３６
１ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩフラグメントを得
た。このフラグメントは、アガロースゲルから溶出し、
上記のように処理したＧＲ１プラスミドで結紮した。得
られたプラスミド（ＧＲ２）は、制限酵素のＥｃｏＲＩ
で切断し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、同
様に、プラスミドｐ８６０はＥｃｏＲＩで切断した。Ｅ
ｃｏＲＩ部位のＨＲＶ２遺伝子地図のヌクレオチド７４
３からｐＵＣ９ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位まで（す
なわち、ＨＲＶ２遺伝子地図のヌクレオチド１４００ま
で）の、得られた６８０ｂｐフラグメントを単離し、Ｅ
ｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理した
ＧＲ２ベクターで結紮した。適当な大腸菌細胞中に転換
した後、相当するプラスミドＧＲ５を単離した。プラス
ミドＧＲ５は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ウシ
腸アルカリホスファターゼで処理し、同様に、プラスミ
ドｐ１９はＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ポリリンカーの
ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位から、ＨＲＶ２遺伝子地図のヌ
クレオチド２４８でのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位まで（す
なわち、ＨＲＶ２遺伝子地図のヌクレオチド１９から２
４８まで）により形成される２４０ｂｐフラグメント
は、直線化されたＧＲ５ベクターで結紮した。適当な大
腸菌細胞中に転換した後、プラスミドを単離した。その
構造を図２３〜２４（ＧＲ６）に図示した。制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで直線化した後、インビトロでＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼを転換すると、転換部位からＥｃｏＲｉ部位
まで２８のヌクレオチドから成り、ＨＲＶ２配列の開始
部がＨＲＶ２配列のヌクレオチド１９〜１４００に続く
（図２２）ＲＮＡが得られた。
【００６６】実施例７：ペプチド基質とＨＲＶ２のラン
パク分解酵素２Ａ（ＨＲＶ２ ２Ａ）の基質特異性の決
定 ＨＲＶ２の成熟した組み替えタンパク分解酵素２Ａ（Ｈ
ＲＶ２ ２Ａ）に関する公知の研究に基づき、それは、
驚くべきことに位置Ｐ１ではなく、位置Ｐ２が特に、開
裂性に関係があることを示すことが可能である。Ｃ−お
よびＮ−末端を短くしたペプチド基質を使用すると、Ｐ
−領域（開裂部位の上流）並びにＰ１−およびＰ２−位
置（ソマーグルーバーら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６７，２２６３９−２２６４４）の他の付加
的で重要な位置が示される。基質特異性およびＨＲＶ２
２Ａの認識配列をより正確に特徴づけるために（特
に、Ｐ１−位置およびＰ８−Ｐ３−領域）、１５−ｍｅ
ｒオリゴペプチド類が合成された。それぞれは、Ｐ８〜
Ｐ６’の位置でアミノ酸交換している。個々の位置にお
いて、酸、塩基性、親水性および極性アミノ酸が、それ
ぞれの場合に置換されている。Ｐ２、Ｐ１およびＰ１’
の位置の場合において、数多くのアミノ酸置換が行われ
る。
【００６７】すべてのペプチドは、活性化エステルまた
はＨＯＢｔ／ＤＩＰＣＤＩを用い、Ｆｍｏｃ法（フルオ
レン−９−イルメトキシカルボニル；メリフィールド，
１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４
９−２１５４）を用いて、ミリゲン（Molligen）（９０
５０型）またはジンザー(Zinsser）（ＳＭＰＳ３５０）
ペプチド合成装置により合成した。ペプチド酸用の固相
としては、キーゼルグア（Kieselguhr）（ペプシン Ｋ
Ａ，ミリゲン／バイオサーチ）に基づくポリジメチルア
クリルアミド樹脂、テンタゲル（TentaGel）Ｓ ＡＣ
（ラップ・ポリマーズ製）、サスリン（Sasrin）樹脂ま
たはワング（Wang）樹脂（バケム（Bachem），スイス）
が選択的に使用され、ペプチドアミド用にはテンタゲル
ＡＭ（ラップ・ポリマーズ製）が使用される。遊離のＦ
ｍｏｃ−連結アミノ酸誘導体またはそのペンタフルオロ
フェニルエステル（Ｏｐｆｐエステル）は、バケムおよ
びノババイオケム（Novabiochem)（スイス）から得るこ
とができる。側鎖の保護は、以下の通りである：Ａｒｇ
（Ｍｔｒ），Ａｒｇ（Ｐｍｃ），Ａｓｐ（ｔＢｕ），Ｃ
ｙｓ（Ｔｒｔ），Ｇｌｕ（ｔＢｕ），Ｈｉｓ（Ｂｏ
ｃ），Ｓｅｒ（ｔＢｕ）およびＴｈｒ（ｔＢｕ）。ペプ
チドは樹脂からＴＦＡ処理により開裂した；側鎖は、Ｔ
ＦＡ／チオアニソール／チオクレゾール（ｖ／ｖ ９
５：３：２）中で３時間インキュベーションすることに
より脱保護した。Ａｒｇ位のＭｔｒ−基を完全に除去す
るには、酸中、５０℃で１時間処理する必要があった。
ペプチドは次いで、酢酸に溶解し、ジエチルエーテルで
析出させ、遠心分離し、凍結乾燥した。ＨＰＬＣ（ウォ
ーターズ・システムズ）による分析を、Ｈ２０／ＴＦＡ
＝１００：０．１およびアセトニトリル／ＴＦＡ＝１０
０：０．１（以下Ｂという）の直線勾配で、ベイカーボ
ンド(Bakerbond）Ｃ１８カラム（“ワイド・ポア”）で
行った。半調製分離を同一の条件下で、ハイバー・リク
ロソルブ（Hiber LiChrosorb）ＲＰ１８カラム（２５０
／２５ メルク製）で行った。すべてのペプチドの特性
化を、ＢＩＯ ＩＯＮ ＢＩＮ Ｋ２０装置で「プラズ
マ・脱着・マス・スペクトロスコーピイ」（ＰＤＭＳ）
を用いて行った。
【００６８】基質特異性の研究を、本実施例中のすべて
の他の研究と同様に、成熟した組み替えＨＲＶ２ ２Ａ
を用いてより行った。対象ペプチドとして１６−ｍｅｒ
野性型ペプチド基質（Ｐ８−Ｐ８’）を使用した比較研
究により、成熟したペプチド基質についての特別な（Ｖ
ｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅｌ−値が得られた。Ｐ８−Ｐ８’ペ
プチド（ＴＲＰＩＩＴＴＡ＊ＧＰＳＤＭＹＹＶＨ（配列
番号２３））は、ポリプロテイン（ＴＲＰＩＩＴＴＡは
ＶＰ１のＣ−末端部位であり、ＧＰＳＤＭＹＶＨはＨＲ
Ｖ２ ２ＡのＮ−末端である）中のＨＲＶ２ ２Ａの固
有の開裂部位に相当する。このペプチドは、正に、Ａｌ
ａおよびＧｌｙ間で組み替えＨＲＶ２２Ａにより分子内
処理をされたものである〔Ｋｍ値：（5.４±0.０２）×
１０-4Ｍｏｌ／ｌ；ソマーグルーバーら，上記文献）。
（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅｌ値を決定するための通常の試
験混合物は、以下のとおりである：緩衝液Ａ（１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ，５００μｌトリスＨＣｌ，ｐＨ８，５ｍ
ｍ ＤＴＴ，５％グリセリンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）
の水溶液５００ｍｌ並びに１００μｌＰ８−Ｐ８’およ
び１００μｌの特別な成熟した基質を、３４℃で１０分
間、予備インキュベートした。純粋（約９５％）なＨＲ
Ｖ２ ２Ａ溶液（緩衝液Ａ中２ｍｇ／ｍｌ＋０．０５％
ＮａＮ3 ）１μｌを加えることにより、競合反応を開
始させた。５０μｌの試料を、３０、６０、９０、１２
０および１５０分後に取り、そして２、４、８、１６お
よび３２分後に（反応を停止するための）０．５Ｍ Ｈ
ＣｌＯ4 ２５０μｌを含むＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ試
験管（１０，０００ＮＭＷＬ；ミリポア製）に移し、混
合し、氷上に置き（少なくとも１５分間）、次いで溶液
をシグマ・エッペンドルフ(SIGMA Eppendorf）遠心分離
機で４℃、１４Ｋで３０分間、遠心分離した。ロ過物は
ＨＰＬＣ分析に直接使用した。ペプチド基質およびその
開裂した製造物は、短時間勾配（５．５分間、５．４％
Ｂ／分，メルク・スーパースフィアＣ１８カラム，４
ｘ５０ｃｍ）または長時間勾配（３４．５分間、０．８
％ Ｂ／分，ベイカーボンドＷＰ Ｃ１８カラム，４．
６ｘ２５０ｍｍ）の何れかで分離した。紫外吸収を２１
０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定した。開裂製造物は、対
照ペプチドおよび／またはタンパク配列（ハンカピラー
（Hunkapiller)およびホッド（Hood），１９８３，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２１９，６５０−６５９）のコミグレーシ
ョン（comigration ）により同定した。それぞれの開裂
の百分率量は、Ｃ−およびＮ−末端生成物のピークの領
域と、残りの未開裂ペプチド基質のそれとを比較するこ
とにより決定した。加えて、データは、分類曲線パター
ン（たとえば、Ｓ字型曲線、アロステリズム効果等）か
らの偏差を検出するために、図表から測定した。そのよ
うな効果は、図２５〜２８に示した成熟したペプチド基
質の何れにも見いだせなかった。それぞれの基質および
その開裂生成物について、ピークの総領域は、開裂（＜
５％）の度合いとは独立であった。二つのペプチド基質
１および２について、パライ（Pallai）ら（パライら，
１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，９７３８
−９７４１）による競合分析により得られた（Ｖｍａｘ
／Ｋｍ）ｒｅｌ−値は、以下のとおりである。 （Ｖｍａｘ／Ｋｍ（１／（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）２＝ ｌｏｇ（１−Ｆ１）／ｌｏｇ（１−Ｆ２）
【００６９】ここで、Ｆは反応した基質の割合である。
すべての競合についての研究において、基質および生成
物のピークは、ＨＰＬＣ分析による、長時間または短時
間勾配または両者の勾配により、お互いに分けることが
できた。ＨＲＶ２ ２Ａと共に、３２分間インキュベー
トした後に開裂生成物を生じなかった全てのペプチド
は、別の混合物中で３時間、ＨＲＶ２ ２Ａと共にイン
キュベートした。開裂のない生成物は、「開裂なし」と
して第１表に示した。全ての（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅｌ
−値は、三つの独立した競合実験により決定した。ほと
んど全ての場合において、その値は２０％の限界内であ
った。図２５〜２８において（＃）で印を付けた価の場
合のみ、そのデータの再現性が２０％より幾分高かっ
た。何故なら、開裂生成物のピークは、短時間勾配およ
び長時間勾配の両者に重なっていたからである。Ｔｈｙ
が基質の認識（ソマーグルーバー等，上記文献）におい
て、Ｐ２の非常に重要な役割をしているということが以
前からの研究により知られている。それらのデータは、
図２５〜２８に付加的に加えた。２〜３のアミノ酸のみ
（たとえば、Ａｒｇ，Ｓｅｒ，ＡｓｎまたはＭｅｔ）
が、開裂の効率を大きく減ずることなくまたは開裂を完
全に阻害することなく、Ｐ２に使用できた。
【００７０】ペプチド基質の効率的な処理にそれほど重
要ではないのは、Ｐ１の位置であり、２〜３の例外（た
とえば、Ｐｒｏ，ＡｓｐおよびＧｌｕ）を除いて、全て
のアミノ酸の置換が許容される。Ｐ１において６つのペ
プチドを変更すると（Ｐ１Ｇ，Ｐ１Ｖ，Ｐ１Ｎ，Ｐ１
Ｓ，Ｐ１ＱおよびＰ１Ｋ）、開裂効率が悪くなり（約１
／１０およびそれ以下）、それに対し、Ｐ１Ｌ，Ｐ１
Ｆ，Ｐ１Ｔ，Ｐ１ＨおよびＰ１Ｒでは開裂能力の１．５
〜２．５倍の減少を示した。Ｐ１Ｙ，Ｐ１ＭおよびＰ１
Ｃでは逆に、１．５〜５倍の開裂能力の増大を示した。
Ｐ１Ｙは、Ｔｙｒ／Ｇｌｙが全ての３つのポリオ株の開
裂部位を表しているので、価値があるように思われる。
一般に、Ｐ１に対する酵素類縁体中のＳ１の位置は、そ
れ故、「開かれた」相互反応部位を表すであろう。Ｐｒ
ｏ，ＡｓｐおよびＧｌｕはこの部位に許容されていな
い。位置Ｐ１’に関する現在のデータは、この位置につ
いての、たとえば、位置Ｐ２におけるよりも、大きく限
定されていることを示している。Ｇｌｙの置換がない場
合、如何なる開裂をも検出することが可能であった。
【００７１】Ｐ’−領域（「下流域」）における、更な
る置換のみが、位置Ｐ２（Ｐｒｏ）（図２５〜２８、ペ
プチドＰ２’Ｆ，Ｐ２’Ｔ，Ｐ２’ＤおよびＰ２’Ｋ）
において、2.５〜５倍少ない開裂能力に対するより顕著
な影響を引き起こした。位置Ｐ６までの全ての他の置換
が、より小さい効果のみを示した。これらのデータは、
Ｃ−末端からの削除が、Ｐ２’に関する限り、開裂性に
劇的な効果を有していないことを示すことにより（ソマ
ーグルーバーら，上記文献）、削除したＷｉｌｄタイプ
ペプチド基質を使用して競合研究を簡単に行うことによ
って支持された。この状況は、Ｎー末端短縮ペプチド基
質とは完全に異なっている。Ｐ６−Ｐ８’は、Ｐ８−Ｐ
８’の有効性の１／３だけ開裂されるだけである。Ｐ５
−Ｐ８’およびＰ４−Ｐ８’基質は、Ｐ８−Ｐ８’と比
較して、開裂性で６〜１０倍も減少していた（ソマーグ
ルーバーら，上記文献）。図２５〜２８に示したＰ−領
域を置換したペプチドの（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅｌ値の
中で、Ｐ４−変異種は特に（Ｐ４Ｋ，Ｐ４Ｓ，Ｐ４Ｄお
よびＰ４Ｆ）、劇的に減少した値を示した。コクサッキ
ーウィルス（ペプチドＡ，Ｂ，ＣおよびＣｏｘＭｕｔ）
から誘導した開裂ペプチドを使用することにより、位置
Ｐ４におけるＩｌｅをＬｅｕに変更することが、開裂の
効率を減少することに関係するのを保持することができ
ないことを示すことが可能であった（ペプチドＢの相対
Ｖｍａｘ／Ｋｍ−値は０．８２である）。これは、Ｉｌ
ｅのＬｅｕへの保存性のある交換が、基質の開裂に如何
なる好ましい効果をも有していないが、他のアミノ酸は
この部位には受け入れられないであろうことを意味して
いる（図２５〜２８参照）。
【００７２】Ｐ６およびＰ７位置での置換は、小さい
が、依然として明らかで認識しうる効果を有している。
Ｐ７Ｆ，Ｐ７ＱおよびＰ６Ｆを除いて、ペプチド基質は
４〜５倍低い開裂性を有している（図２５〜２８参照）
しかしながら、逆に、Ｐ−およびＰ’−領域のコクサッ
キーＢ４から成るペプチド基質（Ｃｏｘｗｔ Ｂ４）
は、Ｐ６のＰｒｏの変異種（ＣｏｘＭｕｔ）の０．８２
と比較して、０．１５のみの（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅｌ
値を有している。ペプチド基質Ｃ（Ｐ１におけるＶａ
ｌ）を除いて、コクサッキーＢ４から誘導されるペプチ
ド基質は、ＨＲＶ２２Ａにより、同一の効率で反応され
る。このペプチド基において、Ｐ６のＰｒｏは、Ｐ７の
Ａｒｇよりもより大きな役割を担うことが明らかであ
る。しかしながら、ペプチドＡ，ＣおよびＣｏｘＭｕｔ
の場合においては、Ｐ１のアミノ酸が、（Ｐ１にＡｌａ
を有する、Ｗｉｌｄ型に相当する）ペプチドＢにおける
それと比較して、ペプチドＡ，ＣおよびＣｏｘＭｕｔの
開裂に好ましからざる開始状況を生ずる（図２５〜２８
におけるＰ１変異種を参照）。それ故、消極的効果が、
Ｐ６のＰｒｏの交換によってのみでは引き起こされるこ
とがないという可能性は、除外できない。
【００７３】Ｐ７およびＰ６の重要性にさらに着目して
明らかにし、このモチーフのみが、全ての他の部位に十
分に置換しているペプチド基質を開裂するのに十分であ
るという証拠を提供するために、二つのペプチドＭＭＰ
１およびＭＭＰ２をさらに合成し、それらの（Ｖｍａｘ
／Ｋｍ）ｒｅｌ値を測定した。ＭＭＰ１はＰ７にＡｒｇ
を、Ｐ４にＩｌｅを、Ｐ２にＴｈｒを、Ｐ１’にＧｌｙ
を、そしてＰ２’にＰｒｏを有しており、ＭＭＰ２は、
Ｐ７にＡｒｇがなく、Ｐ６にＰｒｏがあるという点でＭ
ＭＰ１と異なっている。図２５〜２８から明らかなよう
に、双方のペプチドは、Ｗｉｌｄ型ペプチドＰ８−Ｐ
８’よりも１０および５．５倍良好に開裂する。ＭＭＰ
２において位置Ｐ７にＡｒｇがないことは、そのことに
より開裂効率が２倍減少する。加えて、他のライノウィ
ルスおよびエンテロウィルスの開裂領域を比較した場合
には、ほとんど全ての場合において、強力な陽性の電荷
が位置Ｐ７（ＨＲＶ２，ＨＲＶ１Ｂ，ＨＲＶ８５，ＨＲ
Ｖ１４，Ｃｏｘ Ｂ１，Ｃｏｘ Ｂ４）に見出すことが
でき、ＨＲＶ８９およびＣｏｘ Ｂ３の場合には、位置
Ｐ１０に、そして、ＨＲＶ９および３ポリオ株（ＰＶ１
−３）の場合には、位置６に見出すことができる。一
方、プロリンは、ＨＲＶ２では位置Ｐ６に、ＨＲＶ８９
では位置Ｐ９に、ＨＲＶ１Ｂでは位置Ｐ８に、そして３
ポリオ株では位置Ｐ１０に、のみ見出すことができる。
このことは、プロリンではなく、この領域、特にＰ６−
Ｐ１０に、強力な陽性の電荷が必要であることを意味し
ている。開裂部位からの陽性の電荷の距離は、ほとんど
重要ではないであろう。たとえば、開裂部位と陽性電荷
の間の領域は、環状構造を形成することにより、特別の
２Ａ−酵素に適合することが考えられる。
【００７４】位置Ｐ５（Ｐ５Ｄを除く）およびＰ８での
置換は、Ｐ８−置換の場合には、刺激（Ｐ８ＦおよびＰ
８Ｋ）またはＰ８Ｎでの野性型性質がある。Ａｓｐ−置
換は、常に開裂効果を減少させるが、Ｌｙｓ−置換は、
むしろ、より刺激するかまたはその否定的効果はより少
ないことが一般に観察されている。たとえば、Ｐ８Ｄお
よびＰ８Ｋ（０．５６および１．２６）、Ｐ６Ｄおよび
Ｐ６Ｋ（０．０６および０．１９）、Ｐ５ＤおよびＰ５
Ｋ（＜０．０１および０．９５）、Ｐ３ＤおよびＰ３Ｋ
（０．１１および０．７９）、Ｐ５ＤおよびＰ５Ｋ
（０．３９および１．０５）、等の（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）
ｒｅｌ−値である。このことは、基質に導入された陰性
の電荷が酵素との相互作用を妨害することを示している
が、積極的に言えば、それらは一般に、置換効果は低
く、多くの場合には、開裂性を刺激することさえあるか
もしれない（たとえば、Ｐ８Ｋ，Ｐ４ＫおよびＰ５
Ｋ）。それらのデータおよびペプチド基質を削除するこ
とによる研究の結果（ソマーグルーバーら，前記文献）
に基づくと、ペプチド基質のＨＲＶ２ ２Ａについての
可能性のある認識配列は以下のとおりである。 Ｐ７（Ａｒｇ）−Ｐ６（Ｘ）−Ｐ５（Ｘ）−Ｐ４（Ｉｌ
ｅ／Ｌｅｕ）−Ｐ３（Ｘ）−Ｐ２（Ｔｈｒ）−Ｐ１
（Ｘ）＊Ｐ１’（Ｇｌｙ）−Ｐ２’（Ｐｒｏ）
【００７５】実施例８：ｐ２２０−分子における可能性
のある開裂モチーフの決定 実施例７において決定した配列モチーフを、ｐ２２０−
分子における可能性のある開裂部位、プロテアーゼ２Ａ
活性度の可能性のある細胞標的を調べるために使用し
た。（クラウスリッヒら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６１，２７１１−２７１８）。ヒトｐ２２０タンパク質
（ｅＩＦ−４α）のアミノ配列は公開されているので
（ヤンら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
７，２３２２６）、ｐ２２０分子内の可能性のある開裂
領域を調べることが可能である。 調査のモチーフを以
下に規定する。 Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｉｌｅ／Ｌｅｕ−Ｘ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ そして、可能性のある開裂部位を、コンピュータプログ
ラムを用いて様々な程度の説得性を調べた（マックモリ
イ（MacMolly）／ションベルグ（Schoneberg）ら，Ｓｏ
ｆｔｇｅｎｅ ＧａｓｍｂＨおよびＤＮＡ Ｐｒｏｔｅ
ａｎ／ＤＮＡ Ｓｔａｒ Ｉｎｃｏｒｐ．）。さらに、
現在知られている、エンテロ−およびライノウィルスの
ＶＰ１−２Ａ開裂部位領域の配列を、この調査のプロフ
ィールのためにも使用した（要約のために、Ｐａｌｍｅ
ｎｂｅｒｇ，Ａ．，１９８９，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２
１１−２４１；ｅｄｓ．Ｓｅｍｌｅｒ ａｎｄ Ｅｈｒ
ｅｎｆｅｌｄ参照）。５つの可能性のある領域が決定さ
れ、それらは少なくとも基質特異性の要件を部分的に満
足するものである（図２５〜２８のペプチド基質ｐ２２
０−１〜ｐ２２０−５，配列番号１２２〜１２６参
照）。
【００７６】上記したように、１６−ｍｅｒオリゴペプ
チドを合成し競合分析に使用した。驚くべきことに、ペ
プチド基質ｐ２２０−４およびｐ２２０−３がＨＲＶ２
２Ａにより処理され得ることが見出された。そのこと
は、ｐ２２０分子内に、少なくとも可能性がある攻撃さ
れ得る開裂部位があることを意味し、そしてホスト細胞
の遮断中、ｐ２２０の直接のタンパク分解の可能性を除
外することはできない。ｐ２２０−分子中のペプチド配
列の位置は、ｐ２２０−１では４５７−４７２、ｐ２２
０−２では４９３−５０８、ｐ２２０−３では７３７−
７５２、ｐ２２０−４では４７６−４９１およびｐ２２
０−５では８９６−９１１である（ヤンら，（１９９
２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２３２２６−２
３２３１）。
【００７７】ｐ２２０から誘導されるペプチド基質ｐ２
２０−４についてのＫｍ−値は、競合実験について上記
したようにして決定される。但し、反応は１５℃で、種
々のペプチド基質濃度（０．２５−４ｍＭ）で行われ
る。直線領域（開裂＜１０％）でのサンプリングの回数
は、個々の混合物中のペプチド濃度に依存する。Ｋｍ−
値は、ラインウェーバー−バーク（LineWeaver-Burk)
（ラインウェーバーとバーク，１９３４，Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．５６，６５８）により図表から決定さ
れ、回帰線は三つの独立の実験から計算される。ｐ２２
０−４についてのＫｍ−値は１．７１±０．３ｘ１０−
３ｍｏｌ／ｌ、すなわち、（野性型ペプチド基質Ｐ８−
Ｐ８’のＫｍ−値の５．４±０．０２ｘ１０−４ｍｏｌ
／ｌと比較すると）期待される量の範囲内である。ｐ２
２０分子は、ＨＲＶ２ ２Ａによる直接の攻撃への可能
性のある開裂部位を含んでいることがこのようにして示
すことができた。ｐ２２０−３およびｐ２２０−４は、
共に、競合阻害剤として機能し、ホスト細胞遮断を阻害
することが可能である。
【配列表】
【００７８】配列番号:1 配列の長さ：425 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 株名：ヒトライノウィルスタイプ2 配列 Asn Pro Val Glu Asn Tyr Ile Asp Glu Val Leu Asn Glu Val Leu Val 1 5 10 15 Val Pro Asn Ile Asn Ser Ser Asn Pro Thr Thr Ser Asn Ser Ala Pro 20 25 30 Ala Leu Asp Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Ser Val Gln Pro Glu 35 40 45 Asp Val Ile Glu Thr Arg Tyr Val Gln Thr Ser Gln Thr Arg Asp Glu 50 55 60 Met Ser Leu Glu Ser Phe Leu Gly Arg Ser Gly Cys Ile His Glu Ser 65 70 75 80 Lys Leu Glu Val Thr Leu Ala Asn Tyr Asn Lys Glu Asn Phe Thr Val 85 90 95 Trp Ala Ile Asn Leu Gln Glu Met Ala Gln Ile Arg Arg Lys Phe Glu 100 105 110 Leu Phe Thr Tyr Thr Arg Phe Asp Ser Glu Ile Thr Leu Val Pro Cys 115 120 125 Ile Ser Ala Leu Ser Gln Asp Ile Gly His Ile Thr Met Gln Tyr Met 130 135 140 Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Pro Asn Ser Arg Asp Asp Tyr Ala 145 150 155 160 Trp Gln Ser Gly Thr Asn Ala Ser Val Phe Trp Gln His Gly Gln Ala 165 170 175 Tyr Pro Arg Phe Ser Leu Pro Phe Leu Ser Val Ala Ser Ala Tyr Tyr 180 185 190 Met Phe Tyr Asp Gly Tyr Asp Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Gly Thr Ala 195 200 205 Asn Thr Asn Asn Met Gly Ser Leu Cys Ser Arg Ile Val Thr Glu Lys 210 215 220 His Ile His Lys Val His Ile Met Thr Arg Ile Tyr His Lys Ala Lys 225 230 235 240 His Val Lys Ala Trp Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Leu Glu Tyr Thr 245 250 255 Arg Ala His Arg Thr Asn Phe Lys Ile Glu Asp Arg Ser Ile Gln Thr 260 265 270 Ala Ile Val Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met 275 280 285 Tyr Val His Val Gly Asn Leu Ile Tyr Arg Asn Leu His Leu Phe Asn 290 295 300 Ser Glu Met His Glu Ser Ile Leu Val Ser Tyr Ser Ser Asp Leu Ile 305 310 315 320 Ile Tyr Arg Thr Asn Thr Val Gly Asp Asp Tyr Ile Pro Ser Cys Asp 325 330 335 Cys Thr Gln Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys His Lys Asn Arg Tyr Phe Pro 340 345 350 Ile Thr Val Thr Ser His Asp Trp Tyr Glu Ile Gln Glu Ser Glu Tyr 355 360 365 Tyr Pro Lys His Ile Gln Tyr Asn Leu Leu Ile Gly Glu Gly Pro Cys 370 375 380 Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly Lys Leu Leu Cys Lys His Gly Val Ile 385 390 395 400 Gly Ile Val Thr Ala Gly Gly Asp Asn His Val Ala Phe Ile Asp Leu 405 410 415 Arg His Phe His Cys Ala Glu Glu Gln 420 425
【００７９】配列番号：2 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 ATCAATTGGC TATTGGAATA TA 22
【００８０】配列番号：3 配列の長さ：51 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GTTGATGTCA TGACAGCTAT ATTCCAAGGG CCAATTGATA TGAAAAACCC A 51
【００８１】配列番号：4 配列の長さ：51 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GTTGATGTCA TGACAGCTAT ATTCCAATAG CCAATTGATA TGAAAAACCC A 51
【００８２】配列番号：5 配列の長さ：33 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 CTAGACCACC ATGGGGGTTA CAGATTATAT ACA 33
【００８３】配列番号：6 配列の長さ：48 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 CTAGACCACC ATGTCAGATT CATGGTTAAA GAAATTTACT GAAGCATG 48
【００８４】配列番号：7 配列の長さ：52 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 ACACTTGCTT TTGACACAAC TGTGTTTACT TGCAATCCCC CAAAACAGAC AG 52
【００８５】配列番号：8 配列の長さ：39 配列の種類：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 CATGTCAGAT TCATGGTTAA AGAAATTTAC TGAAGCATG 39
【００８６】配列番号：9 配列の長さ：16 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 GGGGTCAAGA TACTGA 16
【００８７】配列番号：10 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 ACCACCAUGU CA 12
【００８８】配列番号：11 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 GACAGCAUGU CA 12
【００８９】配列番号：12 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 GGCACCAUGU CA 12
【００９０】配列番号：13 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 CCCUGAAUGU GG 12
【００９１】配列番号：14 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 ACCACCAUGG GG 12
【００９２】配列番号：15 配列の長さ：9 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 CCRCCAUGG 9
【００９３】配列番号：16 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 GAAUGGAUGA AG 12
【００９４】配列番号：17 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 AAGUCGAUGC UC 12
【００９５】配列番号：18 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 GCUGACAUGA AA 12
【００９６】配列番号：19 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 AUUAAAAUGG AA 12
【００９７】配列番号：20 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 GCCAAAAUGA UA 12
【００９８】配列番号：21 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 AAAUGGAUGU UG 12
【００９９】配列番号：22 配列の長さ：12 配列の種類：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：mRNA 配列 UCAGCAAUGG UC 12
【０１００】配列番号：23 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val His 1 5 10 15
【０１０１】配列番号：24 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０２】配列番号：25 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０３】配列番号：26 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Phe Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０４】配列番号：27 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０５】配列番号：28 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Lys Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０６】配列番号：29 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Gln Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０７】配列番号：30 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Phe Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０８】配列番号：31 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Asp Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１０９】配列番号：32 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Thr Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１０】配列番号：33 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Thr Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１１】配列番号：34 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Lys Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１２】配列番号：35 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Phe Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１３】配列番号：36 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Asp Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１４】配列番号：37 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Thr Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１５】配列番号：38 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Lys Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１６】配列番号：39 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Asp Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１７】配列番号：40 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Phe Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１８】配列番号：41 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Lys Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１１９】配列番号：42 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ser Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２０】配列番号：43 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Asp Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２１】配列番号：44 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Phe Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２２】配列番号：45 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Phe Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２３】配列番号：46 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Ser Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２４】配列番号：47 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Asp Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２５】配列番号：48 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Lys Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２６】配列番号：49 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Ala Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２７】配列番号：50 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Val Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２８】配列番号：51 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Leu Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１２９】配列番号：52 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Ile Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３０】配列番号：53 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Pro Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３１】配列番号：54 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Phe Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３２】配列番号：55 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Gly Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３３】配列番号：56 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Ser Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３４】配列番号：57 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Tyr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３５】配列番号：58 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Asn Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３６】配列番号：59 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Gln Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３７】配列番号：60 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Asp Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３８】配列番号：61 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Glu Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１３９】配列番号：62 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Lys Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４０】配列番号：63 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Arg Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４１】配列番号：64 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr His Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４２】配列番号：65 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Met Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４３】配列番号：66 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Cys Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４４】配列番号：67 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Val Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４５】配列番号：68 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Leu Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４６】配列番号：69 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Pro Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４７】配列番号：70 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Phe Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４８】配列番号：71 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Met Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１４９】配列番号：72 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Thr Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５０】配列番号：73 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Tyr Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５１】配列番号：74 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Asn Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５２】配列番号：75 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Gln Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５３】配列番号：76 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Asp Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５４】配列番号：77 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Glu Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５５】配列番号：78 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Arg Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５６】配列番号：79 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Lys Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５７】配列番号：80 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ser Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５８】配列番号：81 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr His Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１５９】配列番号：82 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Cys Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６０】配列番号：83 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Gly Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６１】配列番号：84 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Phe Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６２】配列番号：85 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Thr Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６３】配列番号：86 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Asp Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６４】配列番号：87 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Lys Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６５】配列番号：88 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Leu Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６６】配列番号：89 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gln Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６７】配列番号：90 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Cys Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６８】配列番号：91 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Arg Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１６９】配列番号：92 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Pro Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７０】配列番号：93 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Tyr Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７１】配列番号：94 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Glu Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７２】配列番号：95 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Ile Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７３】配列番号：96 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Asn Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７４】配列番号：97 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Ala Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７５】配列番号：98 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Ser Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７６】配列番号：99 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Val Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７７】配列番号：100 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Met Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７８】配列番号：101 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala His Pro Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１７９】配列番号：102 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Phe Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８０】配列番号：103 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Thr Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８１】配列番号：104 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Asp Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８２】配列番号：105 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Lys Ser Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８３】配列番号：106 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Thr Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８４】配列番号：107 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Asp Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８５】配列番号：108 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Lys Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８６】配列番号：109 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Phe Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８７】配列番号：110 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Phe Asp Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８８】配列番号：111 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Phe Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１８９】配列番号：112 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Thr Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１９０】配列番号：113 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Glu Met Tyr Val 1 5 10 15
【０１９１】配列番号：114 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Thr Tyr Val 1 5 10 15
【０１９２】配列番号：115 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Phe Tyr Val 1 5 10 15
【０１９３】配列番号：116 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Lys Tyr Val 1 5 10 15
【０１９４】配列番号：117 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Asp Tyr Val 1 5 10 15
【０１９５】配列番号：118 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Asp Val 1 5 10 15
【０１９６】配列番号：119 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Lys Val 1 5 10 15
【０１９７】配列番号：120 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Phe Val 1 5 10 15
【０１９８】配列番号：121 配列の長さ：15 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Thr Val 1 5 10 15
【０１９９】配列番号：122 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Leu Gln Gly Ile Asn Cys Gly Pro Asp Phe Thr Pro Ser Phe 1 5 10 15
【０２００】配列番号：123 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 G1u Leu Ala Arg Gly Ala Gln Ala Gly Leu Gly Pro Arg Arg Ser Gln 1 5 10 15
【０２０１】配列番号：124 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Cys Arg Leu Leu Thr Thr Ile Gly Lys Asp Leu Asp Phe Glu Lys 1 5 10 15
【０２０２】配列番号：125 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Arg Thr Thr Leu Ser Thr Arg Gly Pro Pro Arg Gly Gly Pro Gly 1 5 10 15
【０２０３】配列番号：126 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ala Gln Pro Ser Asp Ala Ala Ser Glu 1 5 10 15
【０２０４】配列番号：127 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Phe Ala Ile Lys Thr Met Gly Pro Lys Phe His Gln Ser Gly 1 5 10 15
【０２０５】配列番号：128 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Phe Pro Ala Ile Lys Thr Met Gly Pro Lys Phe His Gln Ser Gly 1 5 10 15
【０２０６】配列番号：129 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Arg Pro Ile Ile Thr Thr Ala Gly Pro Tyr Gly His Gln Ser Gly 1 5 10 15
【０２０７】配列番号：130 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Ala Ser Leu Ile Thr Thr Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val His 1 5 10 15
【０２０８】配列番号：131 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Pro Ser Leu Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val His 1 5 10 15
【０２０９】配列番号：132 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Ala Ser Leu Ile Thr Val Gly Pro Ser Asp Met Tyr Val His 1 5 10 15
【０２１０】配列番号：133 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Ala Ser Leu Ile Thr Thr Gly Pro Tyr Gly Met Gln Ser Gly 1 5 10 15
【０２１１】配列番号：134 配列の長さ：16 配列の種類：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Arg Ala Ser Leu Ile Thr Thr Gly Pro Tyr Gly His Gln Ser Gly 1 5 10 15
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＵＣ１８−２Ｃ＊３Ａの製造方法
を示す。
【図２】プラスミドｐＵＣ１８−２Ｃ＊３Ａの製造方法
を示す。
【図３】２Ｃ遺伝子の後に終止コドンを挿入するために
使用されるオリゴヌクレオチドを示す。図は、また、変
異誘発前後のこの領域の配列を示し、変異したコドンは
太字で強調した。
【図４】プラスミドｐＳＶＬ−２ＢＣおよびｐＳＶＬ−
２Ｃの製造方法を示す。
【図５】プラスミドｐＳＶＬ−２ＢＣおよびｐＳＶＬ−
２Ｃを製造するために使用されるオリゴヌクレオチドを
示し、ＡＵＧは太字で強調した。
【図６】プラスミドｐＬｉｎｋ−２ＢＣおよびｐＬｉｎ
ｋ−２Ｃを示す。それぞれの場合の黒い矢印は、二つの
遺伝子の前に挿入した、合成ＡＵＧを印付ける。白抜き
矢印は、内部での開始が起こることが考えられるＡＵＧ
を示す。ＳはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを
示す。黒塗円は、標的とする変異誘発により挿入された
終止コドンの位置を示す。ＢａはＢａｍＨＩの省略であ
る。
【図７】ｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−２Ｃ，ｐβ−２Ｃ．
ｐＬｉｎｋ−２ＣおよびｐＬｉｎｋ−２ＢＣの構成を示
す。白抜き菱形は、ウサギβ−グロブリン遺伝子の５’
ＵＴＲを示す。他の印は図６と同一である。
【図８】ｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−２Ｃおよびｐβ−２
Ｃの構成を調製するために使用されるオリゴヌクレオチ
ドを示し、ＡＵＧは太字で強調した。
【図９】Ａは、４つのプラスミド、ｐＨＲＶ２／５’Ｕ
ＴＲ−２Ｃ（トレース１）、ｐβ−２Ｃ（トレース
２）、ｐＬｉｎｋ−２Ｃ（トレース３）およびｐＬｉｎ
ｋ−２ＢＣ（トレース４）のキャップされていないＲＮ
Ａの翻訳生成物についての１２．５％のタンパクゲルで
のフルオログラムを示す。トレース５はＲＮＡを添加せ
ずに翻訳した結果を示す。左側の数字（単位：キロダル
トン）は、プラスミドｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−２Ｃ、
ｐβ−２ＣおよびｐＬｉｎｋ−２ＣのＲＮＡの翻訳生成
物を示す。右側の数字（単位：キロダルトン）は、プラ
スミドｐＬｉｎｋ−２ＢＣのＲＮＡの付加的な翻訳生成
物を示す。Ｂは、以下のプラスミドのＲＮＡの翻訳生成
物についての１２．５％のタンパクゲルのフルオログラ
ムを示す。 トレース１：Ｃａｐ構造のないプラスミドｐＨＲＶ２／
５’ＵＴＲ−２ＣのＲＮＡ トレース２：Ｃａｐ構造のプラスミドｐＨＲＶ２／５’
ＵＴＲ−２ＣのＲＮＡ トレース３：Ｃａｐ構造のないプラスミドｐＬｉｎｋ−
２ＢＣのＲＮＡ トレース４：Ｃａｐ構造のプラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｂ
ＣのＲＮＡ トレース５：Ｃａｐ構造のプラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｃ
のＲＮＡ トレース６：Ｃａｐ構造のないプラスミドｐＬｉｎｋ−
２ＣのＲＮＡ トレース７：Ｃａｐ構造のプラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｃ
のＲＮＡ トレース８：Ｃａｐ構造のプラスミドｐＬｉｎｋ−２Ｃ
のＲＮＡ トレース７においはて、ウサギ網状赤血球抽出物を、実
施例３に記載したように、２Ａプロテアーゼ試料で予備
処理した。トレース８においては、トレース７と同様に
ウサギ網状赤血球抽出物を予備処理した。この場合、２
Ａ試料は、０．５ｍＭのエラスタティナルを混合したも
のを使用した。数字（単位：キロダルトン）は、種々の
ＲＮＡの特別の翻訳生成物を示す。
【図１０】ｐＥＴ／２Ａの構成を示す。水平の点線を入
れた区画はＴ７遺伝子１０タンパク質の１４のアミノ酸
を表し、白抜きの区画はＨＲＶ２ ＶＰ１遺伝子の最後
の７つのアミノ酸を表し、直線の黒い区画は２Ａ遺伝子
の１４２のアミノ酸を表す。ＰＣ２０坑血清の結合部位
は、対角線を描いた四角で表す。ＳはＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼのプロモータを表す。以下に制限切断部位を示
す：ＡはＡｐａＩを、ＢはＢａｍＨＩを、ＨはＨｉｎｄ
ＩＩＩを、ＭはＭｌｕＩを、ＰはＰｓｔＩを示す。制限
切断部位の円は、この引き出し部分が製造中に失われる
ことを示す。
【図１１】ｐＥＴ８ｃ／２ＡΔ３Ｇｌｙの構成を示す。
水平の点線を入れた区画はＴ７遺伝子１０タンパク質の
１３のアミノ酸を表し、次の断片はα−フラグメントの
３つのアミノ酸を表し、白抜きの区画はＨＲＶ２ ＶＰ
１遺伝子の最後の２８のアミノ酸を表し、直線の黒い区
画は２Ａ遺伝子の１４２のアミノ酸の１３９を表す。三
つのグリシン基の削除の部位は、デルタで印を付けた。
ＰＣ２０坑血清の結合部位は、対角線を描いた四角で表
す。ＳはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモータを表
す。以下に制限切断部位を示す：ＡはＡｐａＩを、Ｂは
ＢａｍＨＩを、ＨはＨｉｎｄＩＩＩを、ＰはＰｓｔＩ
を、ＳはＳａｌＩを示す。制限部位の円は、この引き出
し部分が製造中に失われることを示す。
【図１２】ｐＥＴ８ｃ／２Ａの構成を示す。水平の点線
を入れた区画はＴ７遺伝子１０タンパク質の１３のアミ
ノ酸を表し、隣接する断片はα−フラグメントの３つの
アミノ酸を表し、白抜きの区画はＨＲＶ２ ＶＰ１遺伝
子の最後の２８のアミノ酸を表し、直線の黒い区画は２
Ａ遺伝子の１４２のアミノ酸を表す。ＰＣ２０坑血清の
結合部位は、対角線を描いた四角で表す。ＳはＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモータを表す。以下に制限切断
部位を示す：ＡはＡｐａＩを、ＰはＰｓｔＩを示す。
【図１３】クマシーブルーで染色した１５％タンパク質
ゲルを示し、２Ａの精製の、個々の精製段階を示す。そ
れぞれのトレースにおいて、０．１３ＯＤ280 単位を適
用した。 トレース１：可溶性大腸菌粗抽出物のタンパク質成分 トレース２：緩衝液Ａ中で採取した４０％硫酸アンモニ
ウム析出物のタンパク質成分 トレース３：Ｍｏｎｏ−Ｑ留分を合わせたもののタンパ
ク質成分 トレース４：スーパーデックス留分をあわせ、濃縮した
もののタンパク質成分（プールＡ） トレース５：スーパーデックス留分をあわせ、濃縮した
もののタンパク質成分（プールＡ） トレース５において、試料はβ−メルカプトエタノール
の非存在下に、かつ、予備加熱なしに、ラエミリ（Laem
mili）試料緩衝液を適用した。矢印は２Ａタンパク質を
示す。左側の数字（単位：キロダルトン）は、選択した
標識タンパク質の位置を示す。
【図１４】クマシーブルーで染色した、Ｍｏｎｏ−Ｑカ
ラムの１５％タンパク質ゲルの留分を示す。３５０ｍＭ
および５００ｍＭのＮａＣｌの間で溶出した留分を適用
した。矢印は２Ａタンパク質を示す。左側の数字（単
位：キロダルトン）は選択した標識タンパク質の位置を
示す。
【図１５】クマシーブルーで染色した、スーパーデック
スカラムの１５％タンパク質ゲルの留分を示す。留分の
３３〜４４を適用した。留分３６〜４３を合わせ、プー
ルＡとして示した。留分３３〜３５もまた合わせ、プー
ルＢとして示した。矢印は２Ａタンパク質を示す。右側
の数字（単位：キロダルトン）は選択した標識タンパク
質の位置を示す。
【図１６】貯蔵緩衝液に貯蔵した４つの異なる２Ａ試料
（プールＡ濃縮物）の、クマシーブルーで染色した、１
５％タンパク質ゲルを示す。以下の量を適用した。 トレース１：６．３μｇ（総量１．０４ｍｇ、濃度２．
１ｍｇ／ｍｌ） トレース２：２．７４μｇ（総量０．４４ｍｇ、濃度
０．８８ｍｇ／ｍｌ） トレース３：９．８４μｇ（総量１．６４ｍｇ、濃度
３．２８ｍｇ／ｍｌ） トレース４：５．５２μｇ（総量０．９２ｍｇ、濃度
１．８４ｍｇ／ｍｌ） 矢印は２Ａタンパク質を示す。左側の数字（単位：キロ
ダルトン）は選択した標識タンパク質の位置を示す。
【図１７】クマシーブルーで染色した、１５％タンパク
質ゲルを示す。 トレースＭ：標識タンパク質トレース１：標識タンパク
質としてクレアチンキナーゼを１．２５μｇ添加した５
μｇの２ＡプールＢ（図２２） トレース２：５μｇの２ＡプールＢ Ｂは、２Ａプロテアーゼでインキュベートした後のＡｐ
ａＩ切断プラスミドｐβＨＲＶ２／ｓｕｂの翻訳生成物
についての１２．５％のタンパクゲルでのフルオログラ
ムを示す。 トレース１：１０μｇの２Ａ（プールＢ）でインキュベ
ーション（３０分間、３０℃） トレース２：１μｇの２Ａ（プールＢ）でインキュベー
ション（３０分間、３０℃） トレース３：２Ａプロテアーゼの非存在下にインキュベ
ーション 標識化４０ｋＤバンドはｐβＨＲＶ２／ｓｕｂの翻訳生
成物であり、３２ｋＤで標識化されたバンドは２Ａプロ
テアーゼのタンパク分解活性により製造されたものであ
る。Ｃは、以下のＲＮＡの翻訳生成物についての１２．
５％のポリアクリルアミドのフルオログラムを示す。ト
レース１〜４：ウサギ網状赤血球からのＲＮＡ２μｇ トレース５〜８：プラスミドｐＨＲＶ２／５’ＵＴＲ−
２Ｃの（Ｃａｐ構造なしで）インビトロで転写した、約
１μｇのＲＮＡトレース９：ＲＮＡ添加せず トレース
１および５において、ＨｅＬａ翻訳抽出物は、実施例５
に記載したように、２ＡプールＢからの２μｇで予備処
理した。トレース２および６において、ＨｅＬａ翻訳抽
出物は、予備処理しなかった。トレース３および７にお
いて、ＨｅＬａ翻訳抽出物は、１μｌの緩衝液Ｃで処理
した。トレース４および８において、ＨｅＬａ翻訳抽出
物は、トレース１および５と同様に処理したが、この場
合、２Ａプロテアーゼは、０．５ｍＭエラスタチナール
で予め阻害した。左側の矢印は、１６ｋＤのウサギ網状
赤血球の翻訳生成物を示し、右側の矢印は、３７ｋＤの
プラスミドｐＨＲＶ２１／５’ＵＴＲ−２ＣのＲＮＡの
翻訳生成物を示す。
【図１８】オリゴヌクレオチド１８６８の配列を示す。
それはＳＶ４０のヌクレオチド１６９４〜１７１７に相
当する。
【図１９】以下のヌクレオチドの存在下で、Ｃａｐ構造
なしに、ｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡ（約２ｐｍｏｌ）の
翻訳生成物についての１２．５％タンパク質ゲルのフル
オログラムを示す。 トレース１：オリゴヌクレオチドなし トレース２：０．２ｐｍｏｌ １０９２ トレース３：２ｐｍｏｌ １０９２ トレース４：２０ｐｍｏｌ １０９２ トレース５：２００ｐｍｏｌ １０９２ トレース６：０．２ｐｍｏｌ １８６８ トレース７：２ｐｍｏｌ １８６８ トレース８：２０ｐｍｏｌ １８６８ トレースＭにおいて、Ｃ１４−標識化タンパク質サイズ
標識体を示し（Ａｍｅｒｓｈａｍ製、製造物番号：ＣＦ
Ａ６２６）、左側の数字はそれらの分子量を示す。右側
の数字（単位：キロダルトン）は種々のＲＮＡの特別の
翻訳生成物を示す。
【図２０】以下のオリゴヌクレオチドの存在下で、Ｃａ
ｐ構造のもとに、ｐＬｉｎｋ−２Ｃ ＲＮＡ（約２ｐｍ
ｏｌ）の翻訳生成物についての１２．５％タンパク質ゲ
ルのフルオログラムを示す。 トレース１：０．２ｐｍｏｌ １０９２ トレース２：２ｐｍｏｌ １０９２ トレース３：２０ｐｍｏｌ １０９２ トレース４：２００ｐｍｏｌ １０９２ トレース５：０．２ｐｍｏｌ １８６８ トレース６：２ｐｍｏｌ １８６８ トレース７：２０ｐｍｏｌ １８６８ 右側の数字（単位：キロダルトン）は３７ｋＤおよび３
３ｋＤの翻訳生成物を示す。
【図２１】２Ｃおよび２ＢＣ構造（Ａ）のＡＵＧの近傍
のヌクレオチド配列の表にしたリストを示す。ｐＬｉｎ
ｋ−２Ｃの構成に使用されるオリゴヌクレオチドは下線
を引いた。全ての内部翻訳生成物について、２０ｋＤ生
成物を除いて、二つの可能なＡＵＧの開始コドンが存在
する。部分（Ｂ）は、それが翻訳開始コドンとして使用
されるかもしれない、ＨＲＶ２ ２Ｃおよび２Ｂ配列の
内部のＡＵＧを示す。
【図２２】ＨＲＶ２ゲノムの図式的表示およびＧＲ６の
構造である。黒塗りの矢印は４４９および６１１におけ
るＡＴＧコドンを示す。ＳはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモータを示す。以下の限定部位が使用される。Ａ
はＡｃｃＩを、ＡｖはＡｖａＩＩを、ＢはＢａｍＨＩ
を、ＢｎはＢａｎＩＩを、ＨはＨｉｎｃＩＩを、Ｈ３は
ＨｉｎｄＩＩＩを、ＮはＮｃｏＩを、ＰはＰｓｔＩを、
ＲＩはＥｃｏＲＩを、ＲＶはＥｃｏＲＶを、ＳａはＳａ
ｌＩを、ＳｍはＳｍａＩを示す。
【図２３】スカーンら（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１３，２１１１−２１２６およびソマーグ
ルーバーら（１９８９）Ｖｉｏｒｏｌｏｇｙ，１６９，
６８−７７による、ＶＰ１／Ｐ２Ａタンパク質のアミノ
酸配列を示す。
【図２４】図２３の続きのアミノ酸配列を示す。
【図２５】合成ペプチド基質の（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）ｒｅ
ｌ−値で表現した相対的開裂性を示し、 ａ）１５−ｍｅｒ野性型基質におけるＰ８〜Ｐ６’位置
での個々のアミノ酸置換による、 ｂ）可能性のある開裂領域としてのｐ２２０配列から誘
導されたもの、 ｃ）ＨＲＶ２ ２Ａについての可能性のある認識モチー
フを含む、人工アミノ酸配列、 ｄ）２ＡについてのコクサッキーウィルスＢ４開裂領域
から誘導されたもの。 ＊はペプチド基質内の開裂部位を示す。＃は±２０％を
超える再現性の変動を示す。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２５及び図２６の続きである。
【図２８】図２５、図２６及び図２７の続きである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/48 9359−4Ｂ 9/99 9359−4Ｂ 15/10 ＺＮＡ 15/57 (72)発明者 ディーター ブラース オーストリア アー1090 ウィーン リヒ テンシュタインシュトラーセ 119−13 (72)発明者 レーラ フラーゼル オーストリア アー1020 ウィーン オー ベルドナウシュトラーセ ５ (72)発明者 クラウス ハルトムート オーストリア アー1200 ウィーン トロ イシュトラーセ ５−29 (72)発明者 エルンスト キュッヒェラー オーストリア アー1190 ウィーン ゲー ルゲンガッセ 23−６−26 (72)発明者 ハインリッヒ コヴァルスキー オーストリア アー1140 ウィーン アン デルガッセ 12−22−14−12 (72)発明者 ハンス ディーター リービッヒ オーストリア アー1120 ウィーン デル フェルガッセ ３アー−21 (72)発明者 ティモシー スケルン オーストリア アー1160 ウィーン レー ルヒェンフェルダー ギュルテル 45−15 (72)発明者 エリザベス ツィーグラー オーストリア アー1180 ウィーン ハン ス ザッハス ガッセ ４−７

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ピコルナウイルスによって引き起こされ
    る宿主細胞シャット・オフの分析方法であって、（ａ）
    少なくとも１つの内部翻訳開始部位を有する遺伝子由来
    のＲＮＡにＣａｐ構造を与え、（ｂ）これをピコルナウ
    イルス・プロテアーゼとプレ・インキュベーションした
    翻訳混合物中でインビトロで翻訳し、そして、（ｃ）該
    翻訳生産物を分析することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】 インビトロで翻訳されたタンパク質を標
    識することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 得られた生産物を、Ｃａｐ構造をもた
    ず、かつ／またはピコルナウイルスプロテアーゼとの翻
    訳混合物のプレ・インキュベーションを受けないRNA の
    翻訳生産物と比較することを特徴とする請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 RNA をピコルナウイルス2C遺伝子、好ま
    しくはライノウイルス2C遺伝子のインビトロの転写によ
    り得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 RNA をプラスミドpHRV2/5'UTR-2C、p β
    -2C 、pLink-2CまたはpLink-2BC のインビトロの転写に
    より得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 可溶性成熟ピコルナウイルス2Aプロテア
    ーゼを使用することを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 ライノウイルス2Aプロテアーゼを、翻訳
    混合物のプレ・インキュベーションのために濃厚な粗抽
    出物の形態または純粋な形態で使用することを特徴とす
    る請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 翻訳混合物が網状赤血球溶解産物もしく
    はHeLa細胞抽出物またはこれらの翻訳系の分別部分から
    なることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】（ａ）HRV2 2C 遺伝子に開始コドン及び停
    止コドンを備えさせ、インビトロで転写し、転写産物に
    Ｃａｐ構造を与え、そして（ｂ）ライノウイルス2Aプロ
    テアーゼでプレ・インキュベートされる翻訳混合物中で
    翻訳し、そして（ｃ）翻訳タンパク質を電気泳動及びオ
    ートラジオグラフィーによりＣａｐ構造を有しないRNA
    の標識された翻訳生産物と比較することを特徴とするラ
    イノウイルスにより生じた宿主細胞シャット・オフを分
    析するための請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 宿主細胞シャット・オフ中で沈殿する
    細胞タンパク質及びウイルスタンパク質を検出し、分離
    するための請求項１に記載の方法の使用。
  11. 【請求項１１】 宿主細胞シャット・オフのインヒビタ
    ーを分離するための請求項１に記載の方法の使用。
  12. 【請求項１２】 ライノウイルスプロテアーゼのインヒ
    ビターを分離するための請求項１に記載の方法の使用。
  13. 【請求項１３】 プラスミドpHRV2/5'UTR-2C、pLink-2
    C、pLink-2BC 、pSVL-2BC、pSVL-2C 及びp β-2C 。
  14. 【請求項１４】 VP1 タンパク質のＣ末端の遺伝子フラ
    グメントを発現し、その後、発現ベクターpET8c または
    pET3b にクローン化された2Aプロテアーゼの完全遺伝子
    を発現することを特徴とする可溶性の成熟ピコルナウイ
    ルス2Aプロテアーゼの組換え調製法。
  15. 【請求項１５】 2Aプロテアーゼを融合タンパク質とし
    ての大腸菌株BL21(DE3)LysS または-LysE 中で発現し、
    そして成熟2Aプロテアーゼを自己触媒活性により遊離す
    ることを特徴とする請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 VP1 タンパク質のＣ末端及び2Aプロテ
    アーゼの完全遺伝子のために、アミノ酸配列番号１をコ
    ードするDNA 配列を使用することを特徴とする請求項14
    に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 プラスミドpET8c/2A及びpET/2A。
  18. 【請求項１８】 可溶性成熟ライノウイルスプロテアー
    ゼ2Aの精製法であって、（ａ）ライノウイルスプロテア
    ーゼを異種宿主中で発現し、（ｂ）そのプロテアーゼを
    含む細胞を溶解し、（ｃ）そのプロテアーゼを分別硫酸
    アンモニウム沈殿により細胞上澄みから濃縮し、そして
    （ｄ）イオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマト
    グラフィーにより精製することを特徴とする方法。
  19. 【請求項１９】 少なくとも10で、16以下のアミノ酸を
    含み、かつアミノ酸モチーフR-X-X-I/L-X-T-X-G-P(Ｘは
    所望のアミノ酸である）を含むことを特徴とする天然開
    裂配列TRPIITTAGPSPMYVH（配列番号２３）から誘導され
    たライノウイルスHRV2 2A プロテアーゼのインヒビタ
    ー。
  20. 【請求項２０】 位置P1がメチオニンであることを特徴
    とする請求項19に記載のインヒビター。
  21. 【請求項２１】 P8F(配列番号２６) 、P8K(配列番号２
    ８) 、P3K(配列番号４８) 、P1C(配列番号８２) 、P4'K
    （配列番号１１０) 、P4'F（配列番号１１１) 、P4'T
    （配列番号１１２) 、P5'K（配列番号１１６) またはMM
    P-2 （配列番号２７）であることを特徴とする請求項19
    に記載のインヒビター。
  22. 【請求項２２】 アミノ酸モチーフR-X-X-I/L-X-T-X-G-
    P(式中、Ｘは所望のアミノ酸を表す）を含むことを特徴
    とするp220配列から誘導されたライノウイルスHRV2 2A
    プロテアーゼのインヒビター。
  23. 【請求項２３】 p220-3（配列番号１２４) またはp220
    -4（配列番号１２５) であることを特徴とするp220配列
    から誘導されたライノウイルスHRV2 2A プロテアーゼの
    インヒビター。
  24. 【請求項２４】 HRV2A プロテイナーゼを抑制するため
    の医薬組成物を調製するための請求項19〜23に記載のイ
    ンヒビターの使用。
  25. 【請求項２５】 HRV2A プロテイナーゼを抑制するため
    の請求項19〜23に記載のインヒビターを含む薬剤。
  26. 【請求項２６】 活性エステルによるFmoc法により、ま
    たはHOBt/DIPCDI 活性化及び同様の方法により調製する
    ことを特徴とする請求項19〜23に記載のペプチドの調製
    法。
JP4306093A 1992-03-04 1993-03-03 宿主細胞シャット・オフの分析 Pending JPH06197799A (ja)

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DE19924217929 DE4217929A1 (de) 1992-05-30 1992-05-30 Verfahren zur Analyse des "host cell shut-offs"
DE4217929:7 1992-05-30
DE4206796:3 1992-05-30

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AU3078295A (en) * 1994-07-22 1996-02-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Picornavirus l proteinase and methods of making and using thereof
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