JPH06201686A - 細胞の性質を測定し、病気を診断するためのミクロフォトリシス分析法 - Google Patents
細胞の性質を測定し、病気を診断するためのミクロフォトリシス分析法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 細胞膜の強度を測定する方法を提供する。
【構成】 本発明の方法は、選択された周波数およびエ
ネルギー強度のフォーカス光を用いる。 【効果】 本発明の方法は、細胞の性質を変化させる薬
剤に暴露された細胞の膜の強度をコントロール群の細胞
の膜強度と比較することにより、細胞に特定の病気が存
在するかどうかを診断するのに有用である。
ネルギー強度のフォーカス光を用いる。 【効果】 本発明の方法は、細胞の性質を変化させる薬
剤に暴露された細胞の膜の強度をコントロール群の細胞
の膜強度と比較することにより、細胞に特定の病気が存
在するかどうかを診断するのに有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞膜の強度を測定する
方法に関する。
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大部分の細胞は、細胞膜の機能の完全性
を変化させずに、自己の形状を著しく変化させることが
できる（これを、「細胞変形能」という）。ある条件下
では、細胞膜を破壊して、細胞の内容物を失わせること
もできる（これを、「細胞脆弱性」という）。細胞は、
高いレベルから低いレベルまでの細胞変形能と高いレベ
ルから低いレベルまでの細胞脆弱性とのあらゆる組み合
わせをとることができる。しかし、大部分の細胞は通
常、高い細胞変形能と中ないし低度の細胞脆弱性とを有
する。
を変化させずに、自己の形状を著しく変化させることが
できる（これを、「細胞変形能」という）。ある条件下
では、細胞膜を破壊して、細胞の内容物を失わせること
もできる（これを、「細胞脆弱性」という）。細胞は、
高いレベルから低いレベルまでの細胞変形能と高いレベ
ルから低いレベルまでの細胞脆弱性とのあらゆる組み合
わせをとることができる。しかし、大部分の細胞は通
常、高い細胞変形能と中ないし低度の細胞脆弱性とを有
する。
【０００３】「感覚受容器」などの通常静止性である細
胞のあるもの、および、血液細胞やリンパ細胞などの通
常移動性である細胞の機能にとって、細胞変形能は重要
な性質である。細胞環境が変化すると水分が細胞内に浸
透し、脆くなった細胞を破壊する場合があるという点
で、細胞脆弱性はほぼ全ての体細胞にとって重要な性質
である。よって、細胞脆弱性の変化によって、細胞が自
己の正常の正常な機能を果たす能力が変化することがあ
る。例えば、脆弱性が異常に高く、赤血球細胞の循環し
ている集団の一部が破壊されると、組織への酸素の運搬
量が減少する。従って、脆弱性は変形能よりも臨床上重
要な細胞の性質である。
胞のあるもの、および、血液細胞やリンパ細胞などの通
常移動性である細胞の機能にとって、細胞変形能は重要
な性質である。細胞環境が変化すると水分が細胞内に浸
透し、脆くなった細胞を破壊する場合があるという点
で、細胞脆弱性はほぼ全ての体細胞にとって重要な性質
である。よって、細胞脆弱性の変化によって、細胞が自
己の正常の正常な機能を果たす能力が変化することがあ
る。例えば、脆弱性が異常に高く、赤血球細胞の循環し
ている集団の一部が破壊されると、組織への酸素の運搬
量が減少する。従って、脆弱性は変形能よりも臨床上重
要な細胞の性質である。
【０００４】細胞年齢、血液銀行での保存期間、種々の
細胞膜結合薬剤による治療、および、鎌状赤血球貧血や
糖尿病といった細胞膜若しくはヘモグロビン関連の病気
の進行によって、細胞脆弱性は変化する。従って、細胞
が正常に機能する能力（「細胞の完全性」という）の指
標として細胞脆弱性を評価する臨床測定のための、迅
速、高度に正確、且つ適用が容易な方法が必要とされ
る。現行技術では、主に機械の力を利用して赤血球細胞
の変形能若しくは脆弱性を評価を行っている。これらの
現行技術には、浸透勾配エクタサイトメトリー（Ｅｋｔ
ａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、濾過、マイクロピペット吸引
および浸透脆弱性が含まれる。これらの技術のうち浸透
圧脆弱性のみが臨床研究室で通常用いられる。
細胞膜結合薬剤による治療、および、鎌状赤血球貧血や
糖尿病といった細胞膜若しくはヘモグロビン関連の病気
の進行によって、細胞脆弱性は変化する。従って、細胞
が正常に機能する能力（「細胞の完全性」という）の指
標として細胞脆弱性を評価する臨床測定のための、迅
速、高度に正確、且つ適用が容易な方法が必要とされ
る。現行技術では、主に機械の力を利用して赤血球細胞
の変形能若しくは脆弱性を評価を行っている。これらの
現行技術には、浸透勾配エクタサイトメトリー（Ｅｋｔ
ａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、濾過、マイクロピペット吸引
および浸透脆弱性が含まれる。これらの技術のうち浸透
圧脆弱性のみが臨床研究室で通常用いられる。
【０００５】浸透勾配エクタサイトメトリーは、細胞変
形能を測定するために開発された技術の一つである。該
技術では粘度計を用い、様々なレベルの回転速度（「適
用剪断応力」と称されている）における種々の浸透溶液
によって赤血球細胞に誘発された形の変化を測定する。
種々の浸透溶液の使用により、この浸透勾配エクタサイ
トメトリーには、赤血球細胞の変形能に影響を与える複
数の性質を決定できる可能性がある。しかし、浸透勾配
エクタサイトメトリーによって作成された浸透スペクト
ル曲線は複雑で解釈するのが困難である。さらに、サン
プルの周囲温度、ｐＨおよび原形質オスモル濃度の変化
によって、これらの曲線は変動しやすい。よって、浸透
勾配エクタサイトメトリーを現在有効に用いるには、非
常に精密な装置、技術者の高度の熟練およびテスト条件
のコントロールが必要とされるので、基礎研究室数箇所
で行われてのみで、臨床現場では行われていない。
形能を測定するために開発された技術の一つである。該
技術では粘度計を用い、様々なレベルの回転速度（「適
用剪断応力」と称されている）における種々の浸透溶液
によって赤血球細胞に誘発された形の変化を測定する。
種々の浸透溶液の使用により、この浸透勾配エクタサイ
トメトリーには、赤血球細胞の変形能に影響を与える複
数の性質を決定できる可能性がある。しかし、浸透勾配
エクタサイトメトリーによって作成された浸透スペクト
ル曲線は複雑で解釈するのが困難である。さらに、サン
プルの周囲温度、ｐＨおよび原形質オスモル濃度の変化
によって、これらの曲線は変動しやすい。よって、浸透
勾配エクタサイトメトリーを現在有効に用いるには、非
常に精密な装置、技術者の高度の熟練およびテスト条件
のコントロールが必要とされるので、基礎研究室数箇所
で行われてのみで、臨床現場では行われていない。
【０００６】細胞変形能を測定する方法には他に、種々
のサイズの穴を通す濾過、固定サイズおよび固定逓減率
のチップのマイクロピペットへの細胞の吸引および測光
法が含まれる。これらの技術も浸透勾配エクタサイトメ
トリーの場合と同様に、非常に精密な装置および技術者
の実質的な熟練を要する；さらに、これらは数個のサン
プル中のほんの少数の細胞を分析するのにも非常に時間
がかかる。よって、これらの方法も臨床現場で一般的に
使用されるには至っていない。
のサイズの穴を通す濾過、固定サイズおよび固定逓減率
のチップのマイクロピペットへの細胞の吸引および測光
法が含まれる。これらの技術も浸透勾配エクタサイトメ
トリーの場合と同様に、非常に精密な装置および技術者
の実質的な熟練を要する；さらに、これらは数個のサン
プル中のほんの少数の細胞を分析するのにも非常に時間
がかかる。よって、これらの方法も臨床現場で一般的に
使用されるには至っていない。
【０００７】細胞変形能の測定のための濾過法の変型と
して、膜系またはホイル系（ｆｏｉｌ ｓｙｓｔｅｍ）
（Helmut Jahn, United States Patent No.4,797,606）
を加圧下で通過する赤血球細胞を測定する、インピーダ
ンス測定法（Hands et al, United States Patent No.
4,835,547）および時間測定法（David D. Paterson, Un
ited States Patent No.4,491,012）が開発された。こ
れらの変型法は、フィルター若しくはホイルの工業的製
造時の品質の変動に非常に影響を受けやすく、主に細胞
脆弱性よりも変形能の測定に用いられる。よって、これ
らの濾過法の変型法もよはり臨床現場で日常的に使用さ
れるには至っていない。
して、膜系またはホイル系（ｆｏｉｌ ｓｙｓｔｅｍ）
（Helmut Jahn, United States Patent No.4,797,606）
を加圧下で通過する赤血球細胞を測定する、インピーダ
ンス測定法（Hands et al, United States Patent No.
4,835,547）および時間測定法（David D. Paterson, Un
ited States Patent No.4,491,012）が開発された。こ
れらの変型法は、フィルター若しくはホイルの工業的製
造時の品質の変動に非常に影響を受けやすく、主に細胞
脆弱性よりも変形能の測定に用いられる。よって、これ
らの濾過法の変型法もよはり臨床現場で日常的に使用さ
れるには至っていない。
【０００８】浸透脆弱性テストは、赤血球細胞の完全性
の評価のために開発された最も初期の方法のうちの１つ
であり、現在臨床現場で用いられている数少ないテスト
のうちの１つである。浸透脆弱性テストには時間がかか
り、多段階の血液操作を含み、且つ、通常は比較的大量
の血液サンプルを必要をするにもかかわらず、溶解（細
胞膜破壊）の割合に関して何も情報を与えてくれない。
浸透テストには、これらの制限および細胞脆弱性に関す
る少しの（ｍｉｌｄ）またはある低度の（ｍｏｄｅｒａ
ｔｅ）変化に対する感度が不十分であることから、臨床
では、唯一、遺伝性球状赤血球症と呼ばれる病気の診断
にのみ用いられる場合が多い。
の評価のために開発された最も初期の方法のうちの１つ
であり、現在臨床現場で用いられている数少ないテスト
のうちの１つである。浸透脆弱性テストには時間がかか
り、多段階の血液操作を含み、且つ、通常は比較的大量
の血液サンプルを必要をするにもかかわらず、溶解（細
胞膜破壊）の割合に関して何も情報を与えてくれない。
浸透テストには、これらの制限および細胞脆弱性に関す
る少しの（ｍｉｌｄ）またはある低度の（ｍｏｄｅｒａ
ｔｅ）変化に対する感度が不十分であることから、臨床
では、唯一、遺伝性球状赤血球症と呼ばれる病気の診断
にのみ用いられる場合が多い。
【０００９】ある種の化学物質を光によって変化させ
（「光活性化」と呼ぶ）、試験管中の赤血球細胞の破壊
（ｒｕｐｔｕｒｅ）または崩壊（ｂｒｅａｋｕｐ）
（「溶血」と呼ぶ）を引き起こさせることができること
が示されたのはおよそ５０年前のことである。それ以
来、この基本的な過程（「フォトヘモリシス」という）
は、種々の試験管実験によって詳細に研究されている。
（「光活性化」と呼ぶ）、試験管中の赤血球細胞の破壊
（ｒｕｐｔｕｒｅ）または崩壊（ｂｒｅａｋｕｐ）
（「溶血」と呼ぶ）を引き起こさせることができること
が示されたのはおよそ５０年前のことである。それ以
来、この基本的な過程（「フォトヘモリシス」という）
は、種々の試験管実験によって詳細に研究されている。
【００１０】フォトヘモリシスのメカニズムは酸素依存
性で、おそらく、一重項状態の酸素の発生、続いて赤血
球細胞膜中の蛋白質の酸化を含んでいる。この蛋白質の
酸化によって、受動的な陽イオン交換の増加を伴った、
ウォーターチャンネル（ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌ
ｓ）の生成が誘導され、続いて細胞内へ水が流入して溶
血が起こる。フォトヘモリシスはさらに、細胞膜の脂肪
層の過酸化を含む。この過酸化がおこると、脂肪二重層
中の膜流動性が変化し、脂肪二重層中の変化に依存する
細胞の変型能を制限するであろう。
性で、おそらく、一重項状態の酸素の発生、続いて赤血
球細胞膜中の蛋白質の酸化を含んでいる。この蛋白質の
酸化によって、受動的な陽イオン交換の増加を伴った、
ウォーターチャンネル（ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌ
ｓ）の生成が誘導され、続いて細胞内へ水が流入して溶
血が起こる。フォトヘモリシスはさらに、細胞膜の脂肪
層の過酸化を含む。この過酸化がおこると、脂肪二重層
中の膜流動性が変化し、脂肪二重層中の変化に依存する
細胞の変型能を制限するであろう。
【００１１】従って、ある種の化学薬剤を光活性化し、
細胞膜の蛋白質または脂肪層を変化させることによって
赤血球細胞を破壊させることができることを示す多数の
科学的証拠が存在する。これらの膜の変化は、膜の完全
性を破壊し、水の流入を許容し、このことが細胞体積を
増加させて細胞の形を変化させ（「細胞変形能」とい
う）、やがては「細胞内圧」が細胞膜を壊して（「細胞
脆弱性」という）細胞内容物が失われるに至る（「溶
解」または赤血球細胞の場合は「溶血」という）。
細胞膜の蛋白質または脂肪層を変化させることによって
赤血球細胞を破壊させることができることを示す多数の
科学的証拠が存在する。これらの膜の変化は、膜の完全
性を破壊し、水の流入を許容し、このことが細胞体積を
増加させて細胞の形を変化させ（「細胞変形能」とい
う）、やがては「細胞内圧」が細胞膜を壊して（「細胞
脆弱性」という）細胞内容物が失われるに至る（「溶
解」または赤血球細胞の場合は「溶血」という）。
【００１２】現在、臨床で用いられる方法は、溶血の起
こるオスモル濃度（細胞内水圧と等しい）を測定するの
にミリリットル単位の血液溶液を使用する。しかし、こ
れらの溶血法では、変形能による変化を脆弱性による変
化から区別することができず、膜の完全性の喪失が蛋白
質層の変化によるものか、若しくは、脂肪層の変化によ
るものかを区別することができず、さらに、「溶血率」
を決定して臨床に利用できるさらに感度の高い溶血テス
トを提供することもできない。
こるオスモル濃度（細胞内水圧と等しい）を測定するの
にミリリットル単位の血液溶液を使用する。しかし、こ
れらの溶血法では、変形能による変化を脆弱性による変
化から区別することができず、膜の完全性の喪失が蛋白
質層の変化によるものか、若しくは、脂肪層の変化によ
るものかを区別することができず、さらに、「溶血率」
を決定して臨床に利用できるさらに感度の高い溶血テス
トを提供することもできない。
【００１３】現在、臨床で用いられる方法は、「マク
ロ」な技術で、比較的大量の血液（ミリリットル単位）
を種々の浸透溶液にさらして溶血を判断する。これらの
浸透脆弱性テストは、一般に、比較的大きな試験管また
はキュベット中で、活性化には平行化された光を用いて
行う。同様に、現在のフォトヘモリシス検査法もやはり
「マクロ」な技術で、ミリリットル単位の血液を光活性
化にさらし、１回の測定を行うのに長い分析時間を必要
をする。「細胞攻撃」剤としての０.１ｍＭプロトポル
フィリンと共にインキュベートされた血液細胞の光活性
化には、穏和な２０％の溶血を引き起こすのに約２０分
間の照射を必要とし、１００％の溶血には２５分間ある
いはそれ以上の時間が必要とされる。同様に、細胞攻撃
剤としてフェオフォルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄ
ｅ）を用いた場合には、約９０％の溶血を起こすのに２
０分以上の露光が必要である。また、細胞攻撃剤として
エオシン−イソチオシアネート（ｅｏｓｉｎ−ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を用いた場合には、溶血が最大
に達するために３−４時間の露光を要し、しかも、光活
性化の後約１１時間を必要とする。これらの現在用いら
れている方法が時間がかかるのは、焦点を一点に絞って
いない光を使用しているため活性化が低い光エネルギー
濃度に制限されていることが主な原因である。
ロ」な技術で、比較的大量の血液（ミリリットル単位）
を種々の浸透溶液にさらして溶血を判断する。これらの
浸透脆弱性テストは、一般に、比較的大きな試験管また
はキュベット中で、活性化には平行化された光を用いて
行う。同様に、現在のフォトヘモリシス検査法もやはり
「マクロ」な技術で、ミリリットル単位の血液を光活性
化にさらし、１回の測定を行うのに長い分析時間を必要
をする。「細胞攻撃」剤としての０.１ｍＭプロトポル
フィリンと共にインキュベートされた血液細胞の光活性
化には、穏和な２０％の溶血を引き起こすのに約２０分
間の照射を必要とし、１００％の溶血には２５分間ある
いはそれ以上の時間が必要とされる。同様に、細胞攻撃
剤としてフェオフォルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄ
ｅ）を用いた場合には、約９０％の溶血を起こすのに２
０分以上の露光が必要である。また、細胞攻撃剤として
エオシン−イソチオシアネート（ｅｏｓｉｎ−ｉｓｏｔ
ｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を用いた場合には、溶血が最大
に達するために３−４時間の露光を要し、しかも、光活
性化の後約１１時間を必要とする。これらの現在用いら
れている方法が時間がかかるのは、焦点を一点に絞って
いない光を使用しているため活性化が低い光エネルギー
濃度に制限されていることが主な原因である。
【００１４】現在の浸透脆弱性法およびフォトヘモリシ
ス法は全て、細胞溶血の割合を１回測定するのに、多段
階の希釈、遠心および、分光光度計による分析を必要と
する。従って、現在の臨床および研究で用いられる方法
は、時間がかかり、１つの血液サンプルから、光線量依
存性および時間依存性の関係を同時に得るのは殆ど不可
能である。フォトヘモリシスを検出するのに光散乱装置
を用いる研究者もいる。しかし。この装置は、赤血球細
胞の濃度の極めて微妙な変化に対しても非常に影響を受
けやすく、また、濃度が０.０００２５％の赤血球細胞
の単層を必要とするが、最新のマイクロピペットシステ
ムを用いてもこの要件を満たすのは大変難しい。さら
に、この細胞単層法は、細胞攻撃剤としてフロキシンＢ
（ｐｈｌｏｘｉｎｅ）を用いた場合１００％の溶血をを
引き起こすのに４時間を要するため、非常に時間のかか
る方法である。
ス法は全て、細胞溶血の割合を１回測定するのに、多段
階の希釈、遠心および、分光光度計による分析を必要と
する。従って、現在の臨床および研究で用いられる方法
は、時間がかかり、１つの血液サンプルから、光線量依
存性および時間依存性の関係を同時に得るのは殆ど不可
能である。フォトヘモリシスを検出するのに光散乱装置
を用いる研究者もいる。しかし。この装置は、赤血球細
胞の濃度の極めて微妙な変化に対しても非常に影響を受
けやすく、また、濃度が０.０００２５％の赤血球細胞
の単層を必要とするが、最新のマイクロピペットシステ
ムを用いてもこの要件を満たすのは大変難しい。さら
に、この細胞単層法は、細胞攻撃剤としてフロキシンＢ
（ｐｈｌｏｘｉｎｅ）を用いた場合１００％の溶血をを
引き起こすのに４時間を要するため、非常に時間のかか
る方法である。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規な「ミ
クロフォトリシス」法、即ち、正確に定めた量の焦点を
合わせた光源を、非常に少量の細胞サンプル（２５μｌ
以下の細胞ミクロ−サンプル）の正確に定めた微細な領
域に照射し、化学薬剤を活性化して近傍の細胞膜を攻撃
させる方法を含む。本発明は、新規な「ミクロフォトア
ナリシス」法、即ち、細胞攻撃を受ける微細な領域中の
光活性化化学物質によって引き起こされる細胞破壊の正
確な頻度を時間の関数として測定する方法を含む。この
方法は、細胞脆弱性について、定量的、時間関数的、光
線量依存的な測定結果を与える。
クロフォトリシス」法、即ち、正確に定めた量の焦点を
合わせた光源を、非常に少量の細胞サンプル（２５μｌ
以下の細胞ミクロ−サンプル）の正確に定めた微細な領
域に照射し、化学薬剤を活性化して近傍の細胞膜を攻撃
させる方法を含む。本発明は、新規な「ミクロフォトア
ナリシス」法、即ち、細胞攻撃を受ける微細な領域中の
光活性化化学物質によって引き起こされる細胞破壊の正
確な頻度を時間の関数として測定する方法を含む。この
方法は、細胞脆弱性について、定量的、時間関数的、光
線量依存的な測定結果を与える。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明（「ミクロフォト
リシス分析法」という）は、細胞変形能または細胞脆弱
性に関して比較的不正確な評価しか提供できない他の従
来法と比べていくつかの利点を有している。ミクロフォ
トリシス分析法は、焦点を合わせた光を用い、細胞ミク
ロ−サンプルの非常に狭い定められた領域中のみの細胞
攻撃化学物質を活性化する。従って、１つのミクロ−サ
ンプルを用いて、１領域を非活性化コントロールとし、
多数の領域おいて多数回の光活性化を行うことができ
る。さらに、各ミクロ−サンプル領域を光活性化前に分
析し、溶解応答を決定するための自己のコントロール値
を提供することができる。他の方法とは対照的に、本発
明のこの多領域活性化及び自己コントロール提供性の性
質によって、細胞膜脆弱性について非常に正確な時間関
数の測定結果を与える「エネルギー量溶解応答」テスト
が提供される。
リシス分析法」という）は、細胞変形能または細胞脆弱
性に関して比較的不正確な評価しか提供できない他の従
来法と比べていくつかの利点を有している。ミクロフォ
トリシス分析法は、焦点を合わせた光を用い、細胞ミク
ロ−サンプルの非常に狭い定められた領域中のみの細胞
攻撃化学物質を活性化する。従って、１つのミクロ−サ
ンプルを用いて、１領域を非活性化コントロールとし、
多数の領域おいて多数回の光活性化を行うことができ
る。さらに、各ミクロ−サンプル領域を光活性化前に分
析し、溶解応答を決定するための自己のコントロール値
を提供することができる。他の方法とは対照的に、本発
明のこの多領域活性化及び自己コントロール提供性の性
質によって、細胞膜脆弱性について非常に正確な時間関
数の測定結果を与える「エネルギー量溶解応答」テスト
が提供される。
【００１７】他の方法と異なり、本発明では、細胞ミク
ロ−サンプルの狭い領域に焦点を合わせた光を用いるた
め、２−１０分の比較的短い光活性化時間、さらに完全
な細胞溶解には３０−６０分（細胞数に依存する）の短
い時間しか必要とされない。従って、本発明によって初
めて、２５マイクロリットル（μｌ）の１つの細胞ミク
ロ−サンプルについて総計１時間未満の測定時間で細胞
溶解の速度が測定される、完璧なミクロフォトリシス応
答曲線が提供される。
ロ−サンプルの狭い領域に焦点を合わせた光を用いるた
め、２−１０分の比較的短い光活性化時間、さらに完全
な細胞溶解には３０−６０分（細胞数に依存する）の短
い時間しか必要とされない。従って、本発明によって初
めて、２５マイクロリットル（μｌ）の１つの細胞ミク
ロ−サンプルについて総計１時間未満の測定時間で細胞
溶解の速度が測定される、完璧なミクロフォトリシス応
答曲線が提供される。
【００１８】本発明では、種々の薬剤を正確な用量だけ
細胞ミクロ−サンプルに加え、これらの薬剤が細胞脆弱
性の促進に与える効果（効力）をテストすることができ
る。よって、本発明によって初めて、総量１５０μｌの
血液サンプルにおける６種類の薬剤用量に関し、完璧な
用量応答分析を提供することができる。
細胞ミクロ−サンプルに加え、これらの薬剤が細胞脆弱
性の促進に与える効果（効力）をテストすることができ
る。よって、本発明によって初めて、総量１５０μｌの
血液サンプルにおける６種類の薬剤用量に関し、完璧な
用量応答分析を提供することができる。
【００１９】他の方法と異なり、本発明（新規な方法）
では、ミクロ−サンプルがサンプル支持体中に置かれた
後、細胞をさらに処理する必要がない。この新方法は、
ミクロ−サンプルの第二の領域において光活性化を繰り
返すことによって、再現性の簡単なテストを容易に行う
ことができる。この新方法は、光活性化エネルギーおよ
び細胞攻撃化学物質の濃度と組成にのみ依存するミクロ
フォトリシスを提供する。本発明の新方法は、溶解測定
の混乱を招く細胞のブラウン運動を増加させるような
（光源による）サンプル温度の変化、または、細胞ミク
ロ−サンプル中の、プラズマのような赤血球細胞以外の
血液構成成分の非特異的な影響によって、（他の方法の
ように）複雑になることはない。従って、この新方法
は、焦点を合わせた光活性化の領域のみにおいて、非常
に特異的な光依存性の活性を作り出す。
では、ミクロ−サンプルがサンプル支持体中に置かれた
後、細胞をさらに処理する必要がない。この新方法は、
ミクロ−サンプルの第二の領域において光活性化を繰り
返すことによって、再現性の簡単なテストを容易に行う
ことができる。この新方法は、光活性化エネルギーおよ
び細胞攻撃化学物質の濃度と組成にのみ依存するミクロ
フォトリシスを提供する。本発明の新方法は、溶解測定
の混乱を招く細胞のブラウン運動を増加させるような
（光源による）サンプル温度の変化、または、細胞ミク
ロ−サンプル中の、プラズマのような赤血球細胞以外の
血液構成成分の非特異的な影響によって、（他の方法の
ように）複雑になることはない。従って、この新方法
は、焦点を合わせた光活性化の領域のみにおいて、非常
に特異的な光依存性の活性を作り出す。
【００２０】本発明の新方法は、細胞外にのみ留まり活
性化される細胞攻撃薬剤（細胞外薬剤）によって引き起
こされる膜の性質の変化に起因する細胞膜脆弱性の変化
を測定することができる。また、この新方法は、細胞膜
を通り抜けて細胞内構造に結合し、そこで光活性化され
る細胞攻撃薬剤によって引き起こされる、細胞内構造の
変化に起因する細胞膜脆弱性の変化を測定することがで
きる。従って、本発明の新方法によって初めて、細胞膜
のみが変化する病気、細胞内構成成分のみが変化する全
身性の病気、および、薬剤治療による細胞変化の検出が
可能となった。
性化される細胞攻撃薬剤（細胞外薬剤）によって引き起
こされる膜の性質の変化に起因する細胞膜脆弱性の変化
を測定することができる。また、この新方法は、細胞膜
を通り抜けて細胞内構造に結合し、そこで光活性化され
る細胞攻撃薬剤によって引き起こされる、細胞内構造の
変化に起因する細胞膜脆弱性の変化を測定することがで
きる。従って、本発明の新方法によって初めて、細胞膜
のみが変化する病気、細胞内構成成分のみが変化する全
身性の病気、および、薬剤治療による細胞変化の検出が
可能となった。
【００２１】細胞内で働く薬剤の活性化のエネルギーレ
ベルは、細胞の抗オキシダント（ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａ
ｎｔ）状態に部分的に依存する。赤血球細胞などの多く
の細胞は通常酸素を運んでおり、これらの細胞は、非常
に発達した抗オキシダントシステムを維持しており、自
己酸化から細胞を保護している。細胞脆弱性および細胞
変形能の評価のために現在用いられている他の技術で
は、細胞内で酸化反応を引き起こすことができないので
抗オキシダント活性を評価することもできない。本発明
は、細胞内の抗オキシダントシステムの状態を決定する
新規な方法として、細胞外および細胞内化学物質薬剤の
特異的な光活性化によって引き起こされる細胞脆弱性の
変化を測定することができる。
ベルは、細胞の抗オキシダント（ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａ
ｎｔ）状態に部分的に依存する。赤血球細胞などの多く
の細胞は通常酸素を運んでおり、これらの細胞は、非常
に発達した抗オキシダントシステムを維持しており、自
己酸化から細胞を保護している。細胞脆弱性および細胞
変形能の評価のために現在用いられている他の技術で
は、細胞内で酸化反応を引き起こすことができないので
抗オキシダント活性を評価することもできない。本発明
は、細胞内の抗オキシダントシステムの状態を決定する
新規な方法として、細胞外および細胞内化学物質薬剤の
特異的な光活性化によって引き起こされる細胞脆弱性の
変化を測定することができる。
【００２２】本発明は、新規な「ミクロフォトリシス法
およびミクロフォトアナリシス法」であり、新たな順序
での新しい操作、溶液、および新規な調製品のために、
一般に入手可能な装置を新しい組み合わせで使用するも
のである。
およびミクロフォトアナリシス法」であり、新たな順序
での新しい操作、溶液、および新規な調製品のために、
一般に入手可能な装置を新しい組み合わせで使用するも
のである。
【００２３】従って、本発明の目的は、標準化照射下に
おいて細胞イメージを提供するために、顕微鏡、光源、
光制御、テレビイメージ画像、およびビデオ録画装置の
新たな構成を提供することである。
おいて細胞イメージを提供するために、顕微鏡、光源、
光制御、テレビイメージ画像、およびビデオ録画装置の
新たな構成を提供することである。
【００２４】本発明のさらに別の目的は、正確に量を定
め、焦点を合わせた特定周波数の光エネルギーで細胞を
ミクロ照射するための新規な顕微鏡較正操作を提供する
ことである。
め、焦点を合わせた特定周波数の光エネルギーで細胞を
ミクロ照射するための新規な顕微鏡較正操作を提供する
ことである。
【００２５】本発明のさらに別の目的は、一般に知られ
ていてる分離方法を利用して細胞サンプルを得ることで
ある。
ていてる分離方法を利用して細胞サンプルを得ることで
ある。
【００２６】本発明のさらに別の目的は、細胞試料に標
準化された環境を提供するために、標準緩衝溶液の調製
品を利用することである。
準化された環境を提供するために、標準緩衝溶液の調製
品を利用することである。
【００２７】本発明の別の目的は、細胞サンプルの異な
るミクロ−サンプルに定められた量の新規な細胞攻撃刺
激を提供するために、他のタイプの測定法で用いられる
蛍光色素溶液の新規な調製品を使用する新たな方法を提
供することである。
るミクロ−サンプルに定められた量の新規な細胞攻撃刺
激を提供するために、他のタイプの測定法で用いられる
蛍光色素溶液の新規な調製品を使用する新たな方法を提
供することである。
【００２８】本発明のまた別の目的は、標準（緩衝）溶
液環境中に細胞と細胞攻撃刺激との標準化された混合物
を与えるための、細胞試料の新規な調製法を提供するこ
とである。
液環境中に細胞と細胞攻撃刺激との標準化された混合物
を与えるための、細胞試料の新規な調製法を提供するこ
とである。
【００２９】本発明のさらに別の目的は、細胞破壊の測
定に使用できる新規なミクロ−サンプル調製品を提供す
ることである。
定に使用できる新規なミクロ−サンプル調製品を提供す
ることである。
【００３０】本発明のさらに別の目的は、新規標準化方
法でミクロ−サンプル中の細胞を破壊する正確な光刺激
攻撃のための新たなミクロフォトリシス法を提供するこ
とである。
法でミクロ−サンプル中の細胞を破壊する正確な光刺激
攻撃のための新たなミクロフォトリシス法を提供するこ
とである。
【００３１】本発明のさらに別の目的は、ミクロ−サン
プルの狭い領域において光刺激細胞攻撃を受けている細
胞破壊の時間変化を測定するために、ミクロ−サンプル
イメージのミクロフォトアナリシスに関する新たな方法
を提供することである。
プルの狭い領域において光刺激細胞攻撃を受けている細
胞破壊の時間変化を測定するために、ミクロ−サンプル
イメージのミクロフォトアナリシスに関する新たな方法
を提供することである。
【００３２】本発明の、上記およびその他の利点は下記
の記載によってよりよく理解されるであろう。
の記載によってよりよく理解されるであろう。
【００３３】
【実施例】好ましい実施態様 装置の構成 本発明では、顕微鏡対物レンズを通した、細胞ミクロ−
サンプルのエピ照射（epi-illumination）のための７５
−３００Ｗアークランプ（１００Ｗ水銀ランプが好まし
い）および、顕微鏡コンデンサーを通した、細胞ミクロ
−サンプルのトランス照射（transillumination）のた
めの５０−３００Ｗアークランプ若しくはハロゲンラン
プ（１００Ｗハロゲンランプが好ましい）を装備した光
学顕微鏡であれば任意のものを使用できる（Ｚｅｉｓｓ
ｍｏｄｅｌ２０−Ｔが好ましい）。正確な顕微鏡画像検
索、ビデオ記録、ビデオモニター表示、及びミクロフォ
トリシスの分析のための接眼レンズ付属装置と共に、タ
ーゲット電位を外部から制御できるテレビカメラ（電荷
結合素子(ＣＣＤ)カメラが好ましい）を必要とする。ビ
デオカセットレコーダー（パナソニックモデル６２００
が好ましい）、ビデオに日時を挿入する装置（パナソニ
ックモデル８１０が好ましい）、および適度な解像能を
有するテレビモニター（少なくとも６００の水平線を有
するものが好ましい）は標準的なものであれば任意のも
のを使用できる。
サンプルのエピ照射（epi-illumination）のための７５
−３００Ｗアークランプ（１００Ｗ水銀ランプが好まし
い）および、顕微鏡コンデンサーを通した、細胞ミクロ
−サンプルのトランス照射（transillumination）のた
めの５０−３００Ｗアークランプ若しくはハロゲンラン
プ（１００Ｗハロゲンランプが好ましい）を装備した光
学顕微鏡であれば任意のものを使用できる（Ｚｅｉｓｓ
ｍｏｄｅｌ２０−Ｔが好ましい）。正確な顕微鏡画像検
索、ビデオ記録、ビデオモニター表示、及びミクロフォ
トリシスの分析のための接眼レンズ付属装置と共に、タ
ーゲット電位を外部から制御できるテレビカメラ（電荷
結合素子(ＣＣＤ)カメラが好ましい）を必要とする。ビ
デオカセットレコーダー（パナソニックモデル６２００
が好ましい）、ビデオに日時を挿入する装置（パナソニ
ックモデル８１０が好ましい）、および適度な解像能を
有するテレビモニター（少なくとも６００の水平線を有
するものが好ましい）は標準的なものであれば任意のも
のを使用できる。
【００３４】本発明では、可変式内蔵型レンズ絞りを備
えた光学顕微鏡用対物レンズ（開口数０.６０のＵＭＫ
５０×Ｚｅｉｓｓが好ましい）、顕微鏡チューブファク
ター（１．２５×が好ましい）、Ｘ−Ｙ座標系可動式顕
微鏡ステージ（Ｚｅｉｓｓｍｏｄｅｌ２０−Ｔスタンダ
ードが好ましい）、および明視野サブステージコンデン
サー（Ｚｅｉｓｓ ｍｏｄｅｌ２０−Ｔスタンダードが
好ましい）は、任意のものを使用できる。本発明では、
選択された光活性化細胞攻撃蛍光色素（後述するよう
に、外部から細胞攻撃を行うにはＦＩＴＣが好ましい）
の励起周波数および放射周波数と一致させるために、一
定波長帯通過フィルター（４５０−４９０ｎｍが好まし
い）を備えた顕微鏡フィルターキューブ（Ｚｅｉｓｓ
ｍｏｄｅｌＩ−２が好ましい）、二色性の鏡（５１０ｎ
ｍが好ましい）、および長波長通過防止フィルター（５
１５ｎｍが好ましい）を必要とする。
えた光学顕微鏡用対物レンズ（開口数０.６０のＵＭＫ
５０×Ｚｅｉｓｓが好ましい）、顕微鏡チューブファク
ター（１．２５×が好ましい）、Ｘ−Ｙ座標系可動式顕
微鏡ステージ（Ｚｅｉｓｓｍｏｄｅｌ２０−Ｔスタンダ
ードが好ましい）、および明視野サブステージコンデン
サー（Ｚｅｉｓｓ ｍｏｄｅｌ２０−Ｔスタンダードが
好ましい）は、任意のものを使用できる。本発明では、
選択された光活性化細胞攻撃蛍光色素（後述するよう
に、外部から細胞攻撃を行うにはＦＩＴＣが好ましい）
の励起周波数および放射周波数と一致させるために、一
定波長帯通過フィルター（４５０−４９０ｎｍが好まし
い）を備えた顕微鏡フィルターキューブ（Ｚｅｉｓｓ
ｍｏｄｅｌＩ−２が好ましい）、二色性の鏡（５１０ｎ
ｍが好ましい）、および長波長通過防止フィルター（５
１５ｎｍが好ましい）を必要とする。
【００３５】顕微鏡を通したエピ照射光経路は、エピ照
射光源と顕微鏡フィルターキューブとの間に、可変式円
形絞り、固定式四角形絞り（４.０×３.５ミリメートル
口径が好ましい）、および中性密度フィルターキャリア
ーを装備して、顕微鏡ステージ上の細胞ミクロ−サンプ
ルに与える蛍光色素励起エネルギーの量を、段階分けさ
れた既知の量ずつ減少させることを可能としていること
を要する。
射光源と顕微鏡フィルターキューブとの間に、可変式円
形絞り、固定式四角形絞り（４.０×３.５ミリメートル
口径が好ましい）、および中性密度フィルターキャリア
ーを装備して、顕微鏡ステージ上の細胞ミクロ−サンプ
ルに与える蛍光色素励起エネルギーの量を、段階分けさ
れた既知の量ずつ減少させることを可能としていること
を要する。
【００３６】顕微鏡を通したトランス照射光経路は、ト
ランス照射光源とサブステージ顕微鏡コンデンサーとの
間に、円形視野絞り（直径２２ｍｍ口径が望ましい）、
円形視野光制限部（直径７．５ｍｍ口径が望ましい）お
よびカラーフィルター（赤血球細胞には緑色が好まし
い）を装備して、顕微鏡ステージ上の細胞ミクロ−サン
プルに与える光エネルギーのバックグラウンドの制御を
可能としていることを要する。
ランス照射光源とサブステージ顕微鏡コンデンサーとの
間に、円形視野絞り（直径２２ｍｍ口径が望ましい）、
円形視野光制限部（直径７．５ｍｍ口径が望ましい）お
よびカラーフィルター（赤血球細胞には緑色が好まし
い）を装備して、顕微鏡ステージ上の細胞ミクロ−サン
プルに与える光エネルギーのバックグラウンドの制御を
可能としていることを要する。
【００３７】顕微鏡較正操作 本発明は、新規な顕微鏡光較正操作を含み、この操作に
よって、「光学エネルギー濃度」掛ける「露光時間」と
して算出される、一定量の一定周波数の光エネルギーに
細胞をさらすことができる。後述する操作において重要
な段階は、細胞ミクロ−サンプルが顕微鏡ステージ上で
「焦点を合わせられた」際に、該細胞ミクロ−サンプル
の特定の領域にエピ照射光およびトランス照射光の各経
路から一定の光エネルギーが当たるようにするために、
各経路を各々独立して調整する段階である。光経路の任
意の特定の点における光エネルギーは、数ある装置のい
ずれか（例えば、ＥＧＧモデル５８０ラジオメーター）
を用いて測定することができる。好ましい装置はモデル
６１ユナイテッドテクノロジー（ＵＴ）オプトメーター
で、この装置はミリワット単位の電気エネルギーに換算
して光エネルギーを測定することができる。
よって、「光学エネルギー濃度」掛ける「露光時間」と
して算出される、一定量の一定周波数の光エネルギーに
細胞をさらすことができる。後述する操作において重要
な段階は、細胞ミクロ−サンプルが顕微鏡ステージ上で
「焦点を合わせられた」際に、該細胞ミクロ−サンプル
の特定の領域にエピ照射光およびトランス照射光の各経
路から一定の光エネルギーが当たるようにするために、
各経路を各々独立して調整する段階である。光経路の任
意の特定の点における光エネルギーは、数ある装置のい
ずれか（例えば、ＥＧＧモデル５８０ラジオメーター）
を用いて測定することができる。好ましい装置はモデル
６１ユナイテッドテクノロジー（ＵＴ）オプトメーター
で、この装置はミリワット単位の電気エネルギーに換算
して光エネルギーを測定することができる。
【００３８】トランス照射経路の較正は、まず、顕微鏡
スライドガラスにカバーガラスをかぶせ、顕微鏡のステ
ージの上に置く。可変式円形絞りを閉じることによって
エピ照射経路がブロックされる。顕微鏡付属テレビカメ
ラチューブの焦点がカバーグラスに合うように対物レン
ズを調節した後、トランス照射経路の視野絞りを殆ど閉
じたような状態（ピンホールが開いた状態）にまで絞
り、この視野絞りのわずかに開いた部分（ピンホールオ
ープニング）に焦点を合わせるためにサブステージコン
デンサーの位置を上げる。次に、サブステージコンデン
サーのＸ−Ｙ座標系調整を行い、顕微鏡視野の中心にピ
ンホールオープニングがくるようにする。
スライドガラスにカバーガラスをかぶせ、顕微鏡のステ
ージの上に置く。可変式円形絞りを閉じることによって
エピ照射経路がブロックされる。顕微鏡付属テレビカメ
ラチューブの焦点がカバーグラスに合うように対物レン
ズを調節した後、トランス照射経路の視野絞りを殆ど閉
じたような状態（ピンホールが開いた状態）にまで絞
り、この視野絞りのわずかに開いた部分（ピンホールオ
ープニング）に焦点を合わせるためにサブステージコン
デンサーの位置を上げる。次に、サブステージコンデン
サーのＸ−Ｙ座標系調整を行い、顕微鏡視野の中心にピ
ンホールオープニングがくるようにする。
【００３９】トランス照射経路のランプ光源は約９.２
ボルトに合わせる。光エネルギーは視野絞り光制限部の
出口で測定し、光制限部出口の光エネルギーのプラトー
（ｐｌａｔｅａｕ）の値が１.０８−１.８８ミリワット
（１.４８が望ましい）に達するまで視野絞りを開く。
光制限部におけるプラトー光エネルギーが高すぎるか、
あるいは低すぎる場合は、ランプ光源の電位を調節しな
ければならない。次に顕微鏡ステージ上のスライドガラ
スにおける光エネルギーを測定し、サブステージコンデ
ンサーの内蔵型絞りを一部絞って、スライドガラスにお
けるトランス照射光エネルギーが０.０４４−０.０５２
ミリワット（好ましくは０．０４８）になるようにす
る。
ボルトに合わせる。光エネルギーは視野絞り光制限部の
出口で測定し、光制限部出口の光エネルギーのプラトー
（ｐｌａｔｅａｕ）の値が１.０８−１.８８ミリワット
（１.４８が望ましい）に達するまで視野絞りを開く。
光制限部におけるプラトー光エネルギーが高すぎるか、
あるいは低すぎる場合は、ランプ光源の電位を調節しな
ければならない。次に顕微鏡ステージ上のスライドガラ
スにおける光エネルギーを測定し、サブステージコンデ
ンサーの内蔵型絞りを一部絞って、スライドガラスにお
けるトランス照射光エネルギーが０.０４４−０.０５２
ミリワット（好ましくは０．０４８）になるようにす
る。
【００４０】エピ照射経路の較正は、まず、顕微鏡スラ
イドガラスの上にフルオレセインジアセテート（濃度
１.０ｍｇ／ｍｌ）を一滴ほど滴下し、カバーガラスを
被せる。顕微鏡のステージ上のサンプルキャリアーにこ
のスライドガラスを配置する。トランス照射経路を、視
野制限部にオレンジ色のフィルターを装備することによ
ってブロックする。エピ照射経路の可変式円形絞りをわ
ずかに開き、この絞り中のピンホールの蛍光イメージの
焦点を顕微鏡付属テレビカメラチューブに合わせる。絞
りホルダーを調整し、該円形絞りの蛍光イメージがテレ
ビ視野の中心にくるようにする。
イドガラスの上にフルオレセインジアセテート（濃度
１.０ｍｇ／ｍｌ）を一滴ほど滴下し、カバーガラスを
被せる。顕微鏡のステージ上のサンプルキャリアーにこ
のスライドガラスを配置する。トランス照射経路を、視
野制限部にオレンジ色のフィルターを装備することによ
ってブロックする。エピ照射経路の可変式円形絞りをわ
ずかに開き、この絞り中のピンホールの蛍光イメージの
焦点を顕微鏡付属テレビカメラチューブに合わせる。絞
りホルダーを調整し、該円形絞りの蛍光イメージがテレ
ビ視野の中心にくるようにする。
【００４１】次に、円形絞りを全開し、固定式四角形絞
りをエピ照射経路中のキャリアーに挿入する。四角形絞
りのホルダー調整によって、該四角形絞りの蛍光イメー
ジがテレビ視野の中心にくるようにする。次に、エピ照
射経路のためのランプハウジング中のバルブ調整部を用
いて、四角形絞りのテレビイメージ全体に均一な蛍光を
発生させる。エピ照射経路の四角形絞りを一旦完全に閉
じてから、テレビ視野中の迷光線の反射を全く受けず、
四角形絞りが均一な蛍光四角形領域としてイメージされ
る状態まで開く。
りをエピ照射経路中のキャリアーに挿入する。四角形絞
りのホルダー調整によって、該四角形絞りの蛍光イメー
ジがテレビ視野の中心にくるようにする。次に、エピ照
射経路のためのランプハウジング中のバルブ調整部を用
いて、四角形絞りのテレビイメージ全体に均一な蛍光を
発生させる。エピ照射経路の四角形絞りを一旦完全に閉
じてから、テレビ視野中の迷光線の反射を全く受けず、
四角形絞りが均一な蛍光四角形領域としてイメージされ
る状態まで開く。
【００４２】エピ照射経路の光エネルギーは対物レンズ
の焦平面（カバーガラスがテレビ視野中の焦点に合わせ
られている場合は、顕微鏡ステージ上の試料キャリアー
中のカバーガラスの位置に相当する）で測定し、対物レ
ンズの絞りを一部閉じることによって０.３９−０.４１
ミリワット（好ましくはＯ.４０）に調節する。（この
とき光エネルギーが低すぎる場合は、エピ照射光バルブ
が古くなっているので取り換えなければならない。）次
に、中性光学濃度（ＮＤ）フィルターをエピ照射経路に
一度に１枚ずつ置き、対物レンズの焦平面におけるエピ
光エネルギーを徐々に減少させて較正を行う。エピ光エ
ネルギーの値は名目上、ＮＤ０.１は０.３０−０.３２
ミリワット、ＮＤ０.３は０.１８−０.２０ミリワッ
ト、そしてＮＤ０.６は０.１０−０.１２ミリワットに
相当する。
の焦平面（カバーガラスがテレビ視野中の焦点に合わせ
られている場合は、顕微鏡ステージ上の試料キャリアー
中のカバーガラスの位置に相当する）で測定し、対物レ
ンズの絞りを一部閉じることによって０.３９−０.４１
ミリワット（好ましくはＯ.４０）に調節する。（この
とき光エネルギーが低すぎる場合は、エピ照射光バルブ
が古くなっているので取り換えなければならない。）次
に、中性光学濃度（ＮＤ）フィルターをエピ照射経路に
一度に１枚ずつ置き、対物レンズの焦平面におけるエピ
光エネルギーを徐々に減少させて較正を行う。エピ光エ
ネルギーの値は名目上、ＮＤ０.１は０.３０−０.３２
ミリワット、ＮＤ０.３は０.１８−０.２０ミリワッ
ト、そしてＮＤ０.６は０.１０−０.１２ミリワットに
相当する。
【００４３】顕微鏡ステージ上のミクロ−サンプル（後
述）中の細胞を破壊するための光刺激攻撃を提供するの
に用いられるエピ照射の量は、ミクロ−サンプルにおけ
るエピ光エネルギーとエピ光露光時間を掛け合わせたも
のをエピ光に露光されるミクロ−サンプル領域によって
割った光学エネルギー濃度（ＥＤ）として見積もられ
る。上述した装置構成および較正操作によって、エピ光
露光領域は、顕微鏡対物レンズの焦点における０.００
０１７５ｃｍ2（１４０．９１μｍ×１２４．２４μ
ｍ）の投影イメージ領域を有する固定式四角形絞りによ
って定められる。
述）中の細胞を破壊するための光刺激攻撃を提供するの
に用いられるエピ照射の量は、ミクロ−サンプルにおけ
るエピ光エネルギーとエピ光露光時間を掛け合わせたも
のをエピ光に露光されるミクロ−サンプル領域によって
割った光学エネルギー濃度（ＥＤ）として見積もられ
る。上述した装置構成および較正操作によって、エピ光
露光領域は、顕微鏡対物レンズの焦点における０.００
０１７５ｃｍ2（１４０．９１μｍ×１２４．２４μ
ｍ）の投影イメージ領域を有する固定式四角形絞りによ
って定められる。
【００４４】光エネルギー密度の単位として通常用いら
れるのはジュール／ｃｍ2であり、１ジュールは、１ア
ンペアの電流が１オームの抵抗を通って流れることによ
って１秒間に発生する総エネルギー量（電気エネルギー
に換算して、１秒間に１ワットまたは１０００ミリワッ
ト）に等しい。上述した較正操作のために、エピ光エネ
ルギーはＵＴオプトメーターによってミリワット（ｍ
ｗ）単位で測定され、エピ露光時間は、日時をビデオに
挿入する装置によって０.０１分単位で測定される。下
記の式を用いて、これらの測定単位をＪ／ｃｍ2（すな
わちジュール÷ｃｍ2）の単位のエピ光エネルギー密度
（ＥＤ）に変換する。
れるのはジュール／ｃｍ2であり、１ジュールは、１ア
ンペアの電流が１オームの抵抗を通って流れることによ
って１秒間に発生する総エネルギー量（電気エネルギー
に換算して、１秒間に１ワットまたは１０００ミリワッ
ト）に等しい。上述した較正操作のために、エピ光エネ
ルギーはＵＴオプトメーターによってミリワット（ｍ
ｗ）単位で測定され、エピ露光時間は、日時をビデオに
挿入する装置によって０.０１分単位で測定される。下
記の式を用いて、これらの測定単位をＪ／ｃｍ2（すな
わちジュール÷ｃｍ2）の単位のエピ光エネルギー密度
（ＥＤ）に変換する。
【００４５】光エネルギー密度＝光エネルギー×時間÷
面積；または ジュール／ｃｍ2＝ワット×秒÷ｃｍ2；または ＥＤ(Ｊ／ｃｍ2)＝(ｍｗ÷１０００)×(分×６０)÷
(０.０００１７５ｃｍ2)；または ＥＤ(Ｊ／ｃｍ2)＝(３４２.８６)×(ｍｗ)×(分)÷１ｃ
ｍ2 上述した較正操作に従い、好ましいエピ照射中性光学密
度（ＮＤ）フィルターの使用によって、以下のようなエ
ピ光エネルギー密度（顕微鏡対物レンズの焦点における
ＥＤ）が得られる。
面積；または ジュール／ｃｍ2＝ワット×秒÷ｃｍ2；または ＥＤ(Ｊ／ｃｍ2)＝(ｍｗ÷１０００)×(分×６０)÷
(０.０００１７５ｃｍ2)；または ＥＤ(Ｊ／ｃｍ2)＝(３４２.８６)×(ｍｗ)×(分)÷１ｃ
ｍ2 上述した較正操作に従い、好ましいエピ照射中性光学密
度（ＮＤ）フィルターの使用によって、以下のようなエ
ピ光エネルギー密度（顕微鏡対物レンズの焦点における
ＥＤ）が得られる。
【００４６】ＮＤ エネルギー（mw） ＥＤ（ジュール／ｃｍ2） ０.０ ０.４０ １３７.１４×露光時間（分） ０.１ ０.３２ １０９.７１×露光時間（分） ０.３ ０.２０ ６８.５７×露光時間（分） ０.６ ０.１０ ３４.２９×露光時間（分） 顕微鏡ステージ上のミクロ−サンプル中の細胞を破壊す
るための光刺激攻撃として、６８.５８−１,３７１.４
０Ｊ／ｃｍ2の範囲におよぶエピ光エネルギー密度の最
終勾配を与えるのに必要とされる露光時間は、通常２−
１０分間である。
るための光刺激攻撃として、６８.５８−１,３７１.４
０Ｊ／ｃｍ2の範囲におよぶエピ光エネルギー密度の最
終勾配を与えるのに必要とされる露光時間は、通常２−
１０分間である。
【００４７】顕微鏡較正の最終段階は、顕微鏡ステージ
上に細胞ミクロ−サンプルが最初に置かれた時に、カメ
ラターゲット電位の調整を行うことである。この調整に
よって、細胞ミクロ−サンプルのトランス照射イメージ
についての適当なテレビ画像が得られるように、カメラ
ターゲット電位（ベースラインターゲット電流）を一次
電位範囲のおよその中間値に設定する。該開始カメラ電
位の定量的な測定は必要でない。なぜなら、カメラター
ゲットにおける光強度のその後の変化は、カメラターゲ
ット電位の変化のパーセント割合として測定されるから
であり、この変化の割合は、ターゲット電位がカメラの
一次直線的電位範囲内にあるときは開始ターゲット電位
の値とは無関係だからである。
上に細胞ミクロ−サンプルが最初に置かれた時に、カメ
ラターゲット電位の調整を行うことである。この調整に
よって、細胞ミクロ−サンプルのトランス照射イメージ
についての適当なテレビ画像が得られるように、カメラ
ターゲット電位（ベースラインターゲット電流）を一次
電位範囲のおよその中間値に設定する。該開始カメラ電
位の定量的な測定は必要でない。なぜなら、カメラター
ゲットにおける光強度のその後の変化は、カメラターゲ
ット電位の変化のパーセント割合として測定されるから
であり、この変化の割合は、ターゲット電位がカメラの
一次直線的電位範囲内にあるときは開始ターゲット電位
の値とは無関係だからである。
【００４８】細胞収集方法 赤血球のミクロフォトリシスには、動脈血液、静脈血
液、若しくは混合した毛細管血液（指先から採取したも
の）を用いることができる。本出願の明細書中のデータ
は、覚醒中のヒトの肘前静脈および覚醒中のニュージー
ランド白ウサギ（２.５−４ｋｇ）に標準的な静脈穿刺
を行い、凝固を防ぐためにクエン酸塩を含んだ無菌チュ
ーブに血液（通常は１−２ｍｌ）を収集したものを用い
て得た。
液、若しくは混合した毛細管血液（指先から採取したも
の）を用いることができる。本出願の明細書中のデータ
は、覚醒中のヒトの肘前静脈および覚醒中のニュージー
ランド白ウサギ（２.５−４ｋｇ）に標準的な静脈穿刺
を行い、凝固を防ぐためにクエン酸塩を含んだ無菌チュ
ーブに血液（通常は１−２ｍｌ）を収集したものを用い
て得た。
【００４９】血液は、血液試料および細胞ミクロ−サン
プルの調製を行うまでは０−４℃の冷蔵庫に保存する。
細胞の汚染および感染を防ぐために、細胞および溶液を
扱う操作においては、ピペットチップ、ミクロ遠心管、
瓶、栓および実験用器具は全て無菌の使い捨てのものの
みを用いる。
プルの調製を行うまでは０−４℃の冷蔵庫に保存する。
細胞の汚染および感染を防ぐために、細胞および溶液を
扱う操作においては、ピペットチップ、ミクロ遠心管、
瓶、栓および実験用器具は全て無菌の使い捨てのものの
みを用いる。
【００５０】緩衝溶液調製 ７.６ｇ/ｌＮａＣｌ、０．２６ｇ/ｌＮａＨＰＯ4・Ｈ
2０、１．２８ｇ/ｌＮａ2ＨＰＯ4、４ｇ/ｌグルコー
ス、および５ｇ/ｌウシ血清アルブミンを含む典型的な
緩衝溶液を用い、以下の血液の希釈を行う（後述）。１
ＮＮａＯＨを加え、緩衝溶液のｐＨを７.４（正常な血
液のｐＨ）に調製する。該緩衝溶液の最終オスモル濃度
は３１１mOsm（正常な血液に近い）である。他の緩衝溶
液を用いることもできる；しかし、グルコースおよびア
ルブミンは細胞調製品を安定化させ、且つ、続くミクロ
フォトリシス操作に影響を与えるおそれがある細胞通過
性の水分の運動を制御するための透過制限分子を提供す
るのに必須の構成要素である。緩衝溶液オスモル濃度全
体も細胞通過性の水分の運動の初期段階（ｒａｐｉｄ
ｐｈａｓｅ）に影響を与えるので、最終オスモル濃度が
２９５−３１５であることも同様に重要である。
2０、１．２８ｇ/ｌＮａ2ＨＰＯ4、４ｇ/ｌグルコー
ス、および５ｇ/ｌウシ血清アルブミンを含む典型的な
緩衝溶液を用い、以下の血液の希釈を行う（後述）。１
ＮＮａＯＨを加え、緩衝溶液のｐＨを７.４（正常な血
液のｐＨ）に調製する。該緩衝溶液の最終オスモル濃度
は３１１mOsm（正常な血液に近い）である。他の緩衝溶
液を用いることもできる；しかし、グルコースおよびア
ルブミンは細胞調製品を安定化させ、且つ、続くミクロ
フォトリシス操作に影響を与えるおそれがある細胞通過
性の水分の運動を制御するための透過制限分子を提供す
るのに必須の構成要素である。緩衝溶液オスモル濃度全
体も細胞通過性の水分の運動の初期段階（ｒａｐｉｄ
ｐｈａｓｅ）に影響を与えるので、最終オスモル濃度が
２９５−３１５であることも同様に重要である。
【００５１】緩衝溶液調製の最終段階は、無菌０.２ミ
クロンＮａｌｇｅｎｅフィルターを通して緩衝溶液を真
空吸引し、細菌若しくはその他の汚染粒子を取り除くこ
とである。フィルターを通した緩衝溶液をゴム製の栓を
用いて無菌のガラス瓶に分注（２０ｍｌが好ましい）
し、以下の細胞試料調製を行う。
クロンＮａｌｇｅｎｅフィルターを通して緩衝溶液を真
空吸引し、細菌若しくはその他の汚染粒子を取り除くこ
とである。フィルターを通した緩衝溶液をゴム製の栓を
用いて無菌のガラス瓶に分注（２０ｍｌが好ましい）
し、以下の細胞試料調製を行う。
【００５２】蛍光色素溶液調製 細胞攻撃に使用される光活性化試薬の種類は分析される
細胞の種類に特異的なものであり、１種類の細胞に対し
て複数の細胞攻撃試薬が存在する。例えば、フロキシン
Ｂ（ｐｈｌｏｘｉｎｅＢ）、エオシン−イソチオシアネ
ート（ｅｏｓｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、
フェオフォルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）、およ
びプロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉ
ｎ）は、比較的容量の大きいキュベットにおけるフォト
ヘモリシスに使用されてきた。ミクロフォトリシスによ
る赤血球細胞膜の破壊に好ましい細胞攻撃蛍光色素は、
より大きな分子（２０,０００ダルトンデキストランが
望ましい）に結合したフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）である。ＦＩＴＣ−デキストランが好ま
しいのは、ＦＩＴＣ−デキストランは細胞内に入り込ま
ず、また、血液がＦＩＴＣ励起周波数、４８０ｎｍにお
ける光エネルギーをほとんど吸収しないからである。従
って、ミクロ−サンプル上に投射される光エネルギーの
測定値から、細胞攻撃試薬として活性化されたＦＩＴＣ
の正確な量が得られる。
細胞の種類に特異的なものであり、１種類の細胞に対し
て複数の細胞攻撃試薬が存在する。例えば、フロキシン
Ｂ（ｐｈｌｏｘｉｎｅＢ）、エオシン−イソチオシアネ
ート（ｅｏｓｉｎ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、
フェオフォルビド（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）、およ
びプロトポルフィリン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉ
ｎ）は、比較的容量の大きいキュベットにおけるフォト
ヘモリシスに使用されてきた。ミクロフォトリシスによ
る赤血球細胞膜の破壊に好ましい細胞攻撃蛍光色素は、
より大きな分子（２０,０００ダルトンデキストランが
望ましい）に結合したフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）である。ＦＩＴＣ−デキストランが好ま
しいのは、ＦＩＴＣ−デキストランは細胞内に入り込ま
ず、また、血液がＦＩＴＣ励起周波数、４８０ｎｍにお
ける光エネルギーをほとんど吸収しないからである。従
って、ミクロ−サンプル上に投射される光エネルギーの
測定値から、細胞攻撃試薬として活性化されたＦＩＴＣ
の正確な量が得られる。
【００５３】ＦＩＴＣ−デキストランを０.９％ＮａＣ
ｌ溶液と混合し、ＦＩＴＣ−デキストランの濃度を５０
ｍｇ／ｍｌとする。以下の細胞ミクロ−サンプル中にお
いては、赤血球細胞のミクロフォトリシスのために最大
の光活性化細胞攻撃刺激が与えれるように、ミクロ−サ
ンプル中のＦＩＴＣ−デキストランの最終濃度を２−８
ｍｇ／ｍｌの範囲にする必要がある。
ｌ溶液と混合し、ＦＩＴＣ−デキストランの濃度を５０
ｍｇ／ｍｌとする。以下の細胞ミクロ−サンプル中にお
いては、赤血球細胞のミクロフォトリシスのために最大
の光活性化細胞攻撃刺激が与えれるように、ミクロ−サ
ンプル中のＦＩＴＣ−デキストランの最終濃度を２−８
ｍｇ／ｍｌの範囲にする必要がある。
【００５４】細胞試料調製 ミクロフォトリシスは異なる種類の細胞に適用すること
ができ、細胞調製操作の一部分である細胞分離の方法
は、細胞の種類による。赤血球細胞の場合の方法を下記
に記載する。
ができ、細胞調製操作の一部分である細胞分離の方法
は、細胞の種類による。赤血球細胞の場合の方法を下記
に記載する。
【００５５】冷蔵しておいた血液を穏やかに逆さにして
血液を混合し、等量の緩衝溶液（１：１）を用いて希釈
する。希釈した血液の少量（８０−１００μｌ）をミク
ロヘマトクリットチューブへ注入し、ＩＥＣＭＢヘマト
クリット遠心機中、赤血球細胞をミクロヘマトクリット
チューブの片端に集積させるのに適当なスピードで回転
させる。集積された赤血球細胞の長さを測定し、希釈血
液のヘマトクリット（％細胞）を算出する。
血液を混合し、等量の緩衝溶液（１：１）を用いて希釈
する。希釈した血液の少量（８０−１００μｌ）をミク
ロヘマトクリットチューブへ注入し、ＩＥＣＭＢヘマト
クリット遠心機中、赤血球細胞をミクロヘマトクリット
チューブの片端に集積させるのに適当なスピードで回転
させる。集積された赤血球細胞の長さを測定し、希釈血
液のヘマトクリット（％細胞）を算出する。
【００５６】最終細胞−試料は、希釈血液、ＦＩＴＣ−
デキストラン、試験薬剤（存在させる場合）、および緩
衝溶液（細胞−試料を１mlとし、０．５ないし６．０％
赤血球、２．０ないし８．０mg／ml ＦＩＴＣ−デキス
トラン、０ないし１０mg／mlの試験薬剤、および残部緩
衝液とするため）の組み合わせである。説明のために述
べれば、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（上記のと
おり５０mg／ml蛍光色素溶液として用意される）、３％
赤血球（２５％ヘマトクリットの希釈血液として用意さ
れる）、および３mg／mlの試験薬剤（２０mg／ml溶液と
して用意される）を含む細胞試料を得るため、蛍光色素
溶液０．０８ml（４／５０として計算）、希釈血液０．
１２ml（３／２５として計算）、薬剤溶液０．１５ml
（３／２０として計算）、および緩衝溶液０．６５ml
（１．０−０．０８−０．１２−０．１５として計算）
を混合する。このアプローチをもとに、個々のもしくは
混合した溶解性物質もしくは薬剤を試験して、標準化さ
れた光活性化細胞攻撃刺激によるミクロフォトリシスに
対する細胞応答の効果を調べることができる。
デキストラン、試験薬剤（存在させる場合）、および緩
衝溶液（細胞−試料を１mlとし、０．５ないし６．０％
赤血球、２．０ないし８．０mg／ml ＦＩＴＣ−デキス
トラン、０ないし１０mg／mlの試験薬剤、および残部緩
衝液とするため）の組み合わせである。説明のために述
べれば、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（上記のと
おり５０mg／ml蛍光色素溶液として用意される）、３％
赤血球（２５％ヘマトクリットの希釈血液として用意さ
れる）、および３mg／mlの試験薬剤（２０mg／ml溶液と
して用意される）を含む細胞試料を得るため、蛍光色素
溶液０．０８ml（４／５０として計算）、希釈血液０．
１２ml（３／２５として計算）、薬剤溶液０．１５ml
（３／２０として計算）、および緩衝溶液０．６５ml
（１．０−０．０８−０．１２−０．１５として計算）
を混合する。このアプローチをもとに、個々のもしくは
混合した溶解性物質もしくは薬剤を試験して、標準化さ
れた光活性化細胞攻撃刺激によるミクロフォトリシスに
対する細胞応答の効果を調べることができる。
【００５７】細胞ミクロ−サンプル調製 水を透過させない透明な材料、例えばプラスチックまた
はガラス製の任意のタイプの小容量（５０μl 以下）の
チャンバーを、顕微鏡の試料台上の細胞ミクロ−サンプ
ルを与えるために用いることができる。重要な要件はチ
ャンバーおよびミクロ−サンプルの水の損失を防ぐ充填
操作である（水の損失は細胞のミクロ−サンプル構成成
分の濃度を変化させてミクロフォトリシスの結果に影響
する）。次に簡単な新規ミクロ−サンプルの調製法を記
載する。
はガラス製の任意のタイプの小容量（５０μl 以下）の
チャンバーを、顕微鏡の試料台上の細胞ミクロ−サンプ
ルを与えるために用いることができる。重要な要件はチ
ャンバーおよびミクロ−サンプルの水の損失を防ぐ充填
操作である（水の損失は細胞のミクロ−サンプル構成成
分の濃度を変化させてミクロフォトリシスの結果に影響
する）。次に簡単な新規ミクロ−サンプルの調製法を記
載する。
【００５８】血球計算板（ノイバウアー製が好ましい）
およびカバーグラスをアルコール消毒し風乾した。本発
明の新規アプローチとして、４本のKerr absorbent poi
nt(キャビティ調製のための歯科用綿棒）を０．９％ N
aCl中に置いて飽和させる。小ピンセットを用いて、２
本の飽和Kerr pointを血球計算板の各サイドウェルに置
き、その際血球計算板のトラフの内壁にKerr pointが触
れないように用心する（さもないとKerr point内の溶液
がミクロ−サンプルの構成成分の濃度を希釈してしま
う）。この飽和したKerr pointは、血球計算板のチャン
バーの入口から大気中へ蒸発して失われる可能性のある
ミクロ−サンプルの水分を「置換する」「飽和」水蒸気
圧を提供する新規アプローチである。
およびカバーグラスをアルコール消毒し風乾した。本発
明の新規アプローチとして、４本のKerr absorbent poi
nt(キャビティ調製のための歯科用綿棒）を０．９％ N
aCl中に置いて飽和させる。小ピンセットを用いて、２
本の飽和Kerr pointを血球計算板の各サイドウェルに置
き、その際血球計算板のトラフの内壁にKerr pointが触
れないように用心する（さもないとKerr point内の溶液
がミクロ−サンプルの構成成分の濃度を希釈してしま
う）。この飽和したKerr pointは、血球計算板のチャン
バーの入口から大気中へ蒸発して失われる可能性のある
ミクロ−サンプルの水分を「置換する」「飽和」水蒸気
圧を提供する新規アプローチである。
【００５９】小滴分配装置に蒸留水中で希釈した２．５
g/l のグロブリン溶液を取り、この溶液を用いて、血球
計算板のカバーグラス載置台をコーティングした。カバ
ーグラスを血球計算板のカバーグラス載置台に重ね、軽
くたたいてカバーグラスをグロブリンでコーティングし
た血球計算板のカバーグラス載置台にシールする。これ
は細胞ミクロ−サンプルからの水の蒸発を減少させるた
めの新規アプローチである。従来のアプローチにおいて
は、カバーグラスは封止剤（シーラント）を用いること
なく、血球計算板のカバーグラス載置台に単に重ねられ
ていた。載置台の微小な不規則性が、カバーグラスと載
置台の間に小隙間を生じる。このような小隙間を封止す
るために本発明でグロブリン溶液を用いたことは、細胞
ミクロ−サンプルからの蒸発による水分損失を防止する
ための新規アプローチである。
g/l のグロブリン溶液を取り、この溶液を用いて、血球
計算板のカバーグラス載置台をコーティングした。カバ
ーグラスを血球計算板のカバーグラス載置台に重ね、軽
くたたいてカバーグラスをグロブリンでコーティングし
た血球計算板のカバーグラス載置台にシールする。これ
は細胞ミクロ−サンプルからの水の蒸発を減少させるた
めの新規アプローチである。従来のアプローチにおいて
は、カバーグラスは封止剤（シーラント）を用いること
なく、血球計算板のカバーグラス載置台に単に重ねられ
ていた。載置台の微小な不規則性が、カバーグラスと載
置台の間に小隙間を生じる。このような小隙間を封止す
るために本発明でグロブリン溶液を用いたことは、細胞
ミクロ−サンプルからの蒸発による水分損失を防止する
ための新規アプローチである。
【００６０】溶液バイアルを逆さにして細胞ミクロ−サ
ンプル溶液を穏やかに混合する。無菌の移動ピペットを
用いてバイアルから細胞ミクロ−サンプル溶液を吸引
し、２２−２５μl の溶液を血球計算板／カバーグラス
のチャンバーの隙間から供給する。毛細管現象により細
胞ミクロ−サンプル溶液は血球計算板のチャンバー内へ
吸い込まれる（細胞層の数を標準化するために好ましい
チャンバーの深さは０．１mmである) 。
ンプル溶液を穏やかに混合する。無菌の移動ピペットを
用いてバイアルから細胞ミクロ−サンプル溶液を吸引
し、２２−２５μl の溶液を血球計算板／カバーグラス
のチャンバーの隙間から供給する。毛細管現象により細
胞ミクロ−サンプル溶液は血球計算板のチャンバー内へ
吸い込まれる（細胞層の数を標準化するために好ましい
チャンバーの深さは０．１mmである) 。
【００６１】次に血球計算板を顕微鏡のステージ上のサ
ンプル支持部に置く。この時点でトランス照射光の通路
を開き（視野制限部(field limiter) から不透明フィル
ターを取り去る）、細胞ミクロ−サンプルに焦点を合わ
せる。テレビカメラのターゲット電位を中間レンジに調
整する（顕微鏡較正操作において既に記載した）。
ンプル支持部に置く。この時点でトランス照射光の通路
を開き（視野制限部(field limiter) から不透明フィル
ターを取り去る）、細胞ミクロ−サンプルに焦点を合わ
せる。テレビカメラのターゲット電位を中間レンジに調
整する（顕微鏡較正操作において既に記載した）。
【００６２】ミクロフォトリシス細胞−攻撃操作 以下の操作におけるテレビ−顕微鏡イメージは、その後
の分析のためにビデオに録画する（これらのイメージは
操作と同時にオンラインで分析することも可能であ
る）。
の分析のためにビデオに録画する（これらのイメージは
操作と同時にオンラインで分析することも可能であ
る）。
【００６３】ミクロ−サンプル血球計算板チャンバー内
で細胞が静止するまで５分間の待ち時間をとる。室温を
記録し血球計算板の温度を２３．５ないし２４．５℃に
保持して、細胞ミクロ−サンプル中の赤血球のブラウン
運動を最小限にする。トランス照射を行っている間に細
胞に焦点を合わせ、細胞ミクロ−サンプルの「バックグ
ランド光学密度」のコントロール値を読む。次に視野制
限部に不透明フィルターを載せてトランス照射通路を閉
じる。
で細胞が静止するまで５分間の待ち時間をとる。室温を
記録し血球計算板の温度を２３．５ないし２４．５℃に
保持して、細胞ミクロ−サンプル中の赤血球のブラウン
運動を最小限にする。トランス照射を行っている間に細
胞に焦点を合わせ、細胞ミクロ−サンプルの「バックグ
ランド光学密度」のコントロール値を読む。次に視野制
限部に不透明フィルターを載せてトランス照射通路を閉
じる。
【００６４】時間−日付ビデオ挿入装置を時間０．００
（分）にリセットし、エピ照射光通路を開く（エピ−光
通路から不透明なフィルターを除去して）と同時にスタ
ートさせる。蛍光イメージの焦点をチェックして、必要
なら再調整する。エピ照射光は、エピ−光通路中に予め
選択した中程度の濃度のフィルターを用いて必要な時間
（１ないし６分が好ましい）照射して、エピ照射エネル
ギー濃度（ジュール／cm2)として測定される所望の細胞
攻撃刺激を行う（顕微鏡較正操作において既に記載し
た）。細胞攻撃刺激の時間の終了後、エピ照射通路を閉
じ（エピ−光通路中に不透明フィルターを置くことによ
り）、トランス照射通路を開き（視野制限部の不透明フ
ィルターを取り除くことにより）、細胞ミクロ−サンプ
ルイメージを得る。溶解（細胞の破壊）が最高に達する
まで（四角形のエピ照射領域に残っている健全細胞数が
５未満になる）、または６０分が経過するかのいずれか
が最初に生じるまで、これらの細胞イメージを記録す
る。
（分）にリセットし、エピ照射光通路を開く（エピ−光
通路から不透明なフィルターを除去して）と同時にスタ
ートさせる。蛍光イメージの焦点をチェックして、必要
なら再調整する。エピ照射光は、エピ−光通路中に予め
選択した中程度の濃度のフィルターを用いて必要な時間
（１ないし６分が好ましい）照射して、エピ照射エネル
ギー濃度（ジュール／cm2)として測定される所望の細胞
攻撃刺激を行う（顕微鏡較正操作において既に記載し
た）。細胞攻撃刺激の時間の終了後、エピ照射通路を閉
じ（エピ−光通路中に不透明フィルターを置くことによ
り）、トランス照射通路を開き（視野制限部の不透明フ
ィルターを取り除くことにより）、細胞ミクロ−サンプ
ルイメージを得る。溶解（細胞の破壊）が最高に達する
まで（四角形のエピ照射領域に残っている健全細胞数が
５未満になる）、または６０分が経過するかのいずれか
が最初に生じるまで、これらの細胞イメージを記録す
る。
【００６５】この時点で血球計算板の細胞ミクロ−サン
プルの位置を手で移動し、第二細胞攻撃刺激の適用のた
めの別のミクロ−サンプル領域を定める。この操作は、
各細胞ミクロ−サンプルについて、異なる細胞攻撃レベ
ル（エピ照射エネルギー濃度）で何度もミクロフォトリ
シス測定を行うことを可能にする。血球計算板格子のエ
ッチングを利用して、各細胞攻撃領域の位置を突き止め
ることにより、同じ細胞ミクロ−サンプルで複数回のミ
クロフォトリシス操作を行う場合に不注意による細胞攻
撃領域の重複を防止する。
プルの位置を手で移動し、第二細胞攻撃刺激の適用のた
めの別のミクロ−サンプル領域を定める。この操作は、
各細胞ミクロ−サンプルについて、異なる細胞攻撃レベ
ル（エピ照射エネルギー濃度）で何度もミクロフォトリ
シス測定を行うことを可能にする。血球計算板格子のエ
ッチングを利用して、各細胞攻撃領域の位置を突き止め
ることにより、同じ細胞ミクロ−サンプルで複数回のミ
クロフォトリシス操作を行う場合に不注意による細胞攻
撃領域の重複を防止する。
【００６６】ミクロフォトアナリシス操作 細胞ミクロ−サンプル（血球計算板中の）を顕微鏡のス
テージ上に置いた後、細胞をミクロ−サンプルチャンバ
ー内で５分間落ちつかせる。この時点でトランス照射
は、テレビの視野内にミクロ−サンプルの比較的暗い干
渉イメージを与える。図２２に示すこのイメージの干渉
的性質は、両側が凹んだ赤血球の存在のためである。
テージ上に置いた後、細胞をミクロ−サンプルチャンバ
ー内で５分間落ちつかせる。この時点でトランス照射
は、テレビの視野内にミクロ−サンプルの比較的暗い干
渉イメージを与える。図２２に示すこのイメージの干渉
的性質は、両側が凹んだ赤血球の存在のためである。
【００６７】このトランス照射の干渉イメージ領域（エ
ピ照射の四角形の絞り領域よりも６〜１０倍大きい）を
デジタル化して（Ｉｍａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
のデジタル化用ボードを用いることが好ましい）、各イ
メージピクセルの光の強さを表す０から２５５までの値
の５１２×５１２ピクセル（画素）のデジタルイメージ
を得る（１０２４×１０２４ピクセルを用いて、より厳
密な分析をしてもよい）。この干渉イメージ中の全ピク
セル値の平均を、０から２５５までのミクロ−サンプル
の「バックグランド光強度(background light intnsit
y; BLI)」として計算する（典型的値は１００から１５
０である）。
ピ照射の四角形の絞り領域よりも６〜１０倍大きい）を
デジタル化して（Ｉｍａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
のデジタル化用ボードを用いることが好ましい）、各イ
メージピクセルの光の強さを表す０から２５５までの値
の５１２×５１２ピクセル（画素）のデジタルイメージ
を得る（１０２４×１０２４ピクセルを用いて、より厳
密な分析をしてもよい）。この干渉イメージ中の全ピク
セル値の平均を、０から２５５までのミクロ−サンプル
の「バックグランド光強度(background light intnsit
y; BLI)」として計算する（典型的値は１００から１５
０である）。
【００６８】上記のとおり（ミクロフォトリシス細胞−
攻撃操作のセクション）、エピ照射光の通路を予め選択
した時間開き（不透明フィルターを除去して）、細胞ミ
クロ−サンプルイメージ上のエピ照射四角形領域内で、
細胞−攻撃刺激を活性化する。次に、エピ照射光通路を
閉じる。次に、６０分間に渡り（またはイメージ内の四
角形の細胞攻撃領域内の健全細胞が５個未満になるま
で）、３０秒間隔でトランス照射ミクロ−サンプルイメ
ージをデジタル化する。
攻撃操作のセクション）、エピ照射光の通路を予め選択
した時間開き（不透明フィルターを除去して）、細胞ミ
クロ−サンプルイメージ上のエピ照射四角形領域内で、
細胞−攻撃刺激を活性化する。次に、エピ照射光通路を
閉じる。次に、６０分間に渡り（またはイメージ内の四
角形の細胞攻撃領域内の健全細胞が５個未満になるま
で）、３０秒間隔でトランス照射ミクロ−サンプルイメ
ージをデジタル化する。
【００６９】細胞−攻撃刺激のエピ照射四角形領域に対
して照射した後、照射された細胞ミクロ−サンプルの部
分は、トランス照射イメージ内で時間の関数として、明
るさが増してその干渉性外観を失う。この現象は、細胞
攻撃領域内の細胞はその内容物の一部もしくは全部を失
い、そしてそれらの細胞の膜は細胞攻撃刺激に対するミ
クロフォトリシス応答の結果機能の健全性を失うために
起こるのである。
して照射した後、照射された細胞ミクロ−サンプルの部
分は、トランス照射イメージ内で時間の関数として、明
るさが増してその干渉性外観を失う。この現象は、細胞
攻撃領域内の細胞はその内容物の一部もしくは全部を失
い、そしてそれらの細胞の膜は細胞攻撃刺激に対するミ
クロフォトリシス応答の結果機能の健全性を失うために
起こるのである。
【００７０】四角形の細胞攻撃領域内のイメージピクセ
ル（約６０×５０ピクセル）の値を平均し、６０分間ま
たはこのピクセル平均が３分間（６イメージ）にわたっ
て±１％より大きくは変化しないプラトー値に達するま
で、このピクセル平均を連続デジタル化イメージとして
比較する。四角形の細胞攻撃領域内のイメージピクセル
の平均値に関する６０分目におけるトランス照射イメー
ジまたはプラトーに達した最初のトランス照射ミクロ−
サンプルイメージを、最大細胞応答イメージと定義す
る。最大細胞応答イメージの四角形の細胞攻撃領域内の
３０個（全ピクセルの１０％）の最高ピクセル値を平均
して、健全細胞を全く含まないイメージ領域を代表する
デジタル値を定義する（「全溶解」光強度もしくはＴＬ
Ｉと呼ぶ）。
ル（約６０×５０ピクセル）の値を平均し、６０分間ま
たはこのピクセル平均が３分間（６イメージ）にわたっ
て±１％より大きくは変化しないプラトー値に達するま
で、このピクセル平均を連続デジタル化イメージとして
比較する。四角形の細胞攻撃領域内のイメージピクセル
の平均値に関する６０分目におけるトランス照射イメー
ジまたはプラトーに達した最初のトランス照射ミクロ−
サンプルイメージを、最大細胞応答イメージと定義す
る。最大細胞応答イメージの四角形の細胞攻撃領域内の
３０個（全ピクセルの１０％）の最高ピクセル値を平均
して、健全細胞を全く含まないイメージ領域を代表する
デジタル値を定義する（「全溶解」光強度もしくはＴＬ
Ｉと呼ぶ）。
【００７１】各デジタル化されたトランス照射ミクロ−
サンプルのイメージについて、四角形の細胞攻撃領域内
の全ピクセルの平均値を、「応答領域光強度（ｔ）」と
定義する。これらの「応答領域光強度（ＲＬＩ：ｔ）」
を、次の公式によって相対応答領域光学濃度（Ｒｅｓｐ
ｏｎｓｅ ＯＤ（ｔ））に変換する： Response OD (t) = 100(TLI - RLI(t))/(TLI - BLI) ( 式中、TLI はトランス照射されたミクロ−サンプルイ
メージの細胞攻撃領域内の全−溶解光強度であり、BLI
は完全にトランス照射されたミクロ−サンプルイメージ
に関するバックグランド光強度であり、そしてRLI(ｔ)
は細胞攻撃領域内でのトランス照射されたミクロ−サン
プルイメージの時間の関数としての応答光強度である。
(TLI - BLI) の大きさは、完全にトランス照射されたミ
クロ−サンプルイメージに関する平均光強度の範囲を表
す。細胞攻撃前の四角形領域のゼロ時間平均光強度RLI
(0)は、完全にトランス照射されたミクロ−サンプル領
域に関する平均バックグランド光強度（BLI)より大きい
ことも小さいこともある。従って、ゼロ時間応答領域Ｏ
Ｄ（０）は、完全トランス照射されたミクロ−サンプル
領域に関する光学密度範囲の１００％よりも小さい場合
も大きい場合もある。最大細胞応答イメージ内の平均応
答領域光強度（RLI プラトー) は、全溶解光強度(TLI)
よりも小さいことがあり、何故なら、健全細胞のいくら
かは最大応答イメージの四角形領域内に残りうるからで
ある。従って、最低プラトー応答領域ODは零より大きく
てもよい。
サンプルのイメージについて、四角形の細胞攻撃領域内
の全ピクセルの平均値を、「応答領域光強度（ｔ）」と
定義する。これらの「応答領域光強度（ＲＬＩ：ｔ）」
を、次の公式によって相対応答領域光学濃度（Ｒｅｓｐ
ｏｎｓｅ ＯＤ（ｔ））に変換する： Response OD (t) = 100(TLI - RLI(t))/(TLI - BLI) ( 式中、TLI はトランス照射されたミクロ−サンプルイ
メージの細胞攻撃領域内の全−溶解光強度であり、BLI
は完全にトランス照射されたミクロ−サンプルイメージ
に関するバックグランド光強度であり、そしてRLI(ｔ)
は細胞攻撃領域内でのトランス照射されたミクロ−サン
プルイメージの時間の関数としての応答光強度である。
(TLI - BLI) の大きさは、完全にトランス照射されたミ
クロ−サンプルイメージに関する平均光強度の範囲を表
す。細胞攻撃前の四角形領域のゼロ時間平均光強度RLI
(0)は、完全にトランス照射されたミクロ−サンプル領
域に関する平均バックグランド光強度（BLI)より大きい
ことも小さいこともある。従って、ゼロ時間応答領域Ｏ
Ｄ（０）は、完全トランス照射されたミクロ−サンプル
領域に関する光学密度範囲の１００％よりも小さい場合
も大きい場合もある。最大細胞応答イメージ内の平均応
答領域光強度（RLI プラトー) は、全溶解光強度(TLI)
よりも小さいことがあり、何故なら、健全細胞のいくら
かは最大応答イメージの四角形領域内に残りうるからで
ある。従って、最低プラトー応答領域ODは零より大きく
てもよい。
【００７２】図１および２は、ヒト赤血球細胞に対し５
０分間照射の開始から３レベルでの細胞攻撃刺激（平方
センチメートル当たりのジュール値として示す）に対す
る応答領域光学密度を、時間の関数として示す。２４５
Ｊ／ｃｍ2 の細胞攻撃刺激は、零時間値１０５％から細
胞攻撃暴露開始４６分後の最低プラトー値１８％へ減少
する応答領域ＯＤを与える（図１）。これより大きい４
０１Ｊ／ｃｍ2 の細胞攻撃刺激は、１０２％から細胞攻
撃開始３１分後の６％に減少する応答領域ＯＤを与える
（図１）が、さらに大きい細胞攻撃刺激６３８Ｊ／ｃｍ
2 の細胞攻撃刺激は、零時間値９１％から細胞攻撃開始
３７分後の最低プラトー値３％に減少する応答領域ＯＤ
を与える（図２）。これらのデータは、細胞攻撃刺激の
変化が、時間依存性の応答領域ＯＤカーブを変更したこ
と、そして、その変更は最大ＯＤ変化の強さ、応答領域
ＯＤカーブの勾配、および応答領域ＯＤカーブが半最大
変化に達するまでの時間に影響することにより生じたこ
とを示唆する。
０分間照射の開始から３レベルでの細胞攻撃刺激（平方
センチメートル当たりのジュール値として示す）に対す
る応答領域光学密度を、時間の関数として示す。２４５
Ｊ／ｃｍ2 の細胞攻撃刺激は、零時間値１０５％から細
胞攻撃暴露開始４６分後の最低プラトー値１８％へ減少
する応答領域ＯＤを与える（図１）。これより大きい４
０１Ｊ／ｃｍ2 の細胞攻撃刺激は、１０２％から細胞攻
撃開始３１分後の６％に減少する応答領域ＯＤを与える
（図１）が、さらに大きい細胞攻撃刺激６３８Ｊ／ｃｍ
2 の細胞攻撃刺激は、零時間値９１％から細胞攻撃開始
３７分後の最低プラトー値３％に減少する応答領域ＯＤ
を与える（図２）。これらのデータは、細胞攻撃刺激の
変化が、時間依存性の応答領域ＯＤカーブを変更したこ
と、そして、その変更は最大ＯＤ変化の強さ、応答領域
ＯＤカーブの勾配、および応答領域ＯＤカーブが半最大
変化に達するまでの時間に影響することにより生じたこ
とを示唆する。
【００７３】零時間応答領域ＯＤの変動は、細胞攻撃刺
激を行う前に生じ、そして細胞攻撃刺激により生じる時
間依存性の応答領域ＯＤカーブに対する統計的変動を増
大させる。この零時間応答領域ＯＤにおける攻撃に無関
係な影響を除外するため、図３に示すように、次のよう
な３工程の標準化操作を行う：即ち １）零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）から最低プラトー
応答領域ＯＤ（ＰＲＯＤ）を差し引いて、最大ミクロフ
ォトリシス応答（ＭＲ）を計算する； 即ち、ＭＲ＝ＺＲＯＤ − ＰＲＯＤ ２）最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）を１００倍し
てから零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）で割って、最大
応答の百分率（ＭＲ％）を計算する。
激を行う前に生じ、そして細胞攻撃刺激により生じる時
間依存性の応答領域ＯＤカーブに対する統計的変動を増
大させる。この零時間応答領域ＯＤにおける攻撃に無関
係な影響を除外するため、図３に示すように、次のよう
な３工程の標準化操作を行う：即ち １）零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）から最低プラトー
応答領域ＯＤ（ＰＲＯＤ）を差し引いて、最大ミクロフ
ォトリシス応答（ＭＲ）を計算する； 即ち、ＭＲ＝ＺＲＯＤ − ＰＲＯＤ ２）最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）を１００倍し
てから零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）で割って、最大
応答の百分率（ＭＲ％）を計算する。
【００７４】 即ち、ＭＲ％ ＝ （１００）（ＭＲ）／（ＺＲＯＤ） ３）特定時間ｔにおける％応答（％応答（ｔ））の定義
は、零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）から時間ｔにおけ
る応答領域ＯＤ（ＲＯＤ（ｔ））を差引いたものを１０
０倍してから最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）で割
って得た値である； 即ち、％応答（ｔ）＝（１００）（ＺＲＯＤ−ＲＯＤ
（ｔ））／ＭＲ ％最大応答（ＭＲ％）は、細胞攻撃刺激に暴露された四
角形領域内で最終的に破壊される細胞の数の百分率の指
標である。％応答（ｔ）は時間ｔに細胞攻撃刺激に暴露
された四角形領域内で破壊されている細胞の数の指標で
あり、最終的に破壊される細胞数に対する百分率で表さ
れる。
は、零時間応答領域ＯＤ（ＺＲＯＤ）から時間ｔにおけ
る応答領域ＯＤ（ＲＯＤ（ｔ））を差引いたものを１０
０倍してから最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）で割
って得た値である； 即ち、％応答（ｔ）＝（１００）（ＺＲＯＤ−ＲＯＤ
（ｔ））／ＭＲ ％最大応答（ＭＲ％）は、細胞攻撃刺激に暴露された四
角形領域内で最終的に破壊される細胞の数の百分率の指
標である。％応答（ｔ）は時間ｔに細胞攻撃刺激に暴露
された四角形領域内で破壊されている細胞の数の指標で
あり、最終的に破壊される細胞数に対する百分率で表さ
れる。
【００７５】図４に記載されている、三つの％応答カー
ブは、図１および２の三つの応答−領域光学濃度カーブ
に上記公式をあてはめて作成した。上記標準化操作は、
零時間応答領域ＯＤ（図３のＺＲＯＤ）の変動に関係な
く、細胞攻撃刺激の開始後に０％から１００％の間で変
化する時間依存性％応答カーブを与える。これらの標準
化データは、細胞攻撃刺激の変化は、時間依存性％応答
カーブの最大勾配および半最大値（５０％）へ至る時間
を変化させることにより該カーブを変動させることを示
唆している。
ブは、図１および２の三つの応答−領域光学濃度カーブ
に上記公式をあてはめて作成した。上記標準化操作は、
零時間応答領域ＯＤ（図３のＺＲＯＤ）の変動に関係な
く、細胞攻撃刺激の開始後に０％から１００％の間で変
化する時間依存性％応答カーブを与える。これらの標準
化データは、細胞攻撃刺激の変化は、時間依存性％応答
カーブの最大勾配および半最大値（５０％）へ至る時間
を変化させることにより該カーブを変動させることを示
唆している。
【００７６】さらに、図５は、図４の２４５ジュール／
cm2 細胞攻撃刺激の％応答カーブ(白丸) と同じものを
用いて、特定のレベルの細胞攻撃刺激に対する細胞応答
の正確な変化を定量化したもので、次の定義を用いてい
る： １）細胞攻撃の開始から５０％応答値迄の時間としての
応答半値時間（Ｔ1/2)および ２）時間ｔ＝Ｔ1/2 における％応答カーブの最大勾配。
cm2 細胞攻撃刺激の％応答カーブ(白丸) と同じものを
用いて、特定のレベルの細胞攻撃刺激に対する細胞応答
の正確な変化を定量化したもので、次の定義を用いてい
る： １）細胞攻撃の開始から５０％応答値迄の時間としての
応答半値時間（Ｔ1/2)および ２）時間ｔ＝Ｔ1/2 における％応答カーブの最大勾配。
【００７７】Ｔ1/2 は、細胞攻撃刺激による破壊に対す
る細胞の耐性平均の指標である。最大勾配は、細胞攻撃
刺激の開始後の任意の時間における細胞破壊の最大速度
の指標である。この勾配は、細胞攻撃刺激による破壊に
たいする個別細胞の耐性の「集団変動」のインデックス
を与える。例えば、破壊に対して厳密に同一の細胞耐性
をもつ均一細胞集団は、Ｔ1/2 に等しい時間までは零値
を、そしてＴ1/2 に等しい時間の後は１００％値を有す
る「段状の」％応答カーブを与えるであろう。これとは
対照的に、破壊に対してある細胞は非常に耐性が弱く、
ある細胞は非常に耐性が強く、そしてある細胞は非常に
弱い耐性から非常に強い耐性までに分布しているよう
な、非常に不均一な細胞集団においては、細胞攻撃刺激
開始後ただちに始まる小さい勾配を有しそしてＴ1/2 か
らはるかに遅れた時間に１００％に達する％応答カーブ
を与えるであろう。
る細胞の耐性平均の指標である。最大勾配は、細胞攻撃
刺激の開始後の任意の時間における細胞破壊の最大速度
の指標である。この勾配は、細胞攻撃刺激による破壊に
たいする個別細胞の耐性の「集団変動」のインデックス
を与える。例えば、破壊に対して厳密に同一の細胞耐性
をもつ均一細胞集団は、Ｔ1/2 に等しい時間までは零値
を、そしてＴ1/2 に等しい時間の後は１００％値を有す
る「段状の」％応答カーブを与えるであろう。これとは
対照的に、破壊に対してある細胞は非常に耐性が弱く、
ある細胞は非常に耐性が強く、そしてある細胞は非常に
弱い耐性から非常に強い耐性までに分布しているよう
な、非常に不均一な細胞集団においては、細胞攻撃刺激
開始後ただちに始まる小さい勾配を有しそしてＴ1/2 か
らはるかに遅れた時間に１００％に達する％応答カーブ
を与えるであろう。
【００７８】時間Ｔ1/2 における％応答カーブの勾配
は、幾つかの方法で求められる。例えば、％応答カーブ
に当てはめた多項式カーブの時間Ｔ1/2 における一次微
分関数の値は、時間Ｔ1/2 における％応答カーブの勾配
値を与えるであろう。下記に時間Ｔ1/2 における％応答
カーブの勾配を計算する簡単な方法を示す： １）Ｔ７０は細胞攻撃開始から％応答が７０％になるま
での時間を分であらわしたものと定義される。
は、幾つかの方法で求められる。例えば、％応答カーブ
に当てはめた多項式カーブの時間Ｔ1/2 における一次微
分関数の値は、時間Ｔ1/2 における％応答カーブの勾配
値を与えるであろう。下記に時間Ｔ1/2 における％応答
カーブの勾配を計算する簡単な方法を示す： １）Ｔ７０は細胞攻撃開始から％応答が７０％になるま
での時間を分であらわしたものと定義される。
【００７９】２）Ｔ３０は細胞攻撃開始から％応答が３
０％になるまでの時間を分であらわしたものと定義され
る。
０％になるまでの時間を分であらわしたものと定義され
る。
【００８０】３）Ｔ1/2 における勾配は、Ｔ７０からＴ
３０を差し引いた値で７０％から３０％を差し引いた値
を割った値として、１分間当たりの応答の％変化（％／
ＭＩＮ）を単位として定義される；即ち Ｔ1/2 での勾配（％／ＭＩＮ）＝（７０−３０）／（Ｔ
７０−Ｔ３０） この単純な方法は相当に正確である；何故なら、縦軸の
値については全ての％応答カーブは０％から１００％の
範囲にあり、そして例えば図５に示されているように３
０％から７０％の応答範囲においては全ての応答カーブ
はほぼ直線状だからである。
３０を差し引いた値で７０％から３０％を差し引いた値
を割った値として、１分間当たりの応答の％変化（％／
ＭＩＮ）を単位として定義される；即ち Ｔ1/2 での勾配（％／ＭＩＮ）＝（７０−３０）／（Ｔ
７０−Ｔ３０） この単純な方法は相当に正確である；何故なら、縦軸の
値については全ての％応答カーブは０％から１００％の
範囲にあり、そして例えば図５に示されているように３
０％から７０％の応答範囲においては全ての応答カーブ
はほぼ直線状だからである。
【００８１】動物細胞のミクロフォトリシス 図６は、４羽の家兎からの赤血球に関し、採血後第１日
の７時間目（丸）、第２日（四角）、第３日（三角）、
第４日（菱形）、および第５日（逆三角）の％応答カー
ブ（平均±ＳＥＭ）を示し、ミクロ−サンプルの組成は
４％濃度の赤血球および２mg／mlのＦＩＴＣ−デキスト
ラン（１５０，０００ダルトン）を含む。全てのカーブ
について、細胞攻撃刺激は２１０Ｊ／cm2 である。ミク
ロフォトリシスを兎から採血後の７時間ないし５日の細
胞ミクロ−サンプルについて行ったとき、各％応答カー
ブは互いに等しかった。ミクロフォトリシスを兎から採
血後の最初の６時間までの細胞ミクロ−サンプルについ
て行ったときは、％応答カーブは次第に左方に移動し
た。
の７時間目（丸）、第２日（四角）、第３日（三角）、
第４日（菱形）、および第５日（逆三角）の％応答カー
ブ（平均±ＳＥＭ）を示し、ミクロ−サンプルの組成は
４％濃度の赤血球および２mg／mlのＦＩＴＣ−デキスト
ラン（１５０，０００ダルトン）を含む。全てのカーブ
について、細胞攻撃刺激は２１０Ｊ／cm2 である。ミク
ロフォトリシスを兎から採血後の７時間ないし５日の細
胞ミクロ−サンプルについて行ったとき、各％応答カー
ブは互いに等しかった。ミクロフォトリシスを兎から採
血後の最初の６時間までの細胞ミクロ−サンプルについ
て行ったときは、％応答カーブは次第に左方に移動し
た。
【００８２】図７は、４％ヘマトクリット値および２mg
／ml ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダルト
ン）の組成のミクロ−サンプルで、兎（３羽）赤血球に
ついて、１０５Ｊ／cm2 （白四角）、１２６Ｊ／cm2
（黒四角）、１５９Ｊ／cm2 （白三角）、１６８Ｊ／cm
2 （黒三角）、２１０Ｊ／cm2 （白菱形）、および２１
０Ｊ／cm2 （黒菱形）の細胞攻撃刺激の効果を示すため
の％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。白記号の細胞
攻撃刺激は、１０分間のエピ照射の低いエピ照射光強度
で得られ、他方、黒記号の細胞攻撃刺激は、８分間のエ
ピ照射のより強いエピ照射光強度で得た。弱い方のエピ
照射光強度でより長い時間エピ照射暴露時間を用いた場
合の％応答カーブ（白記号）は、等しい細胞攻撃刺激と
なるような同じエネルギーを与える場合は、強い光強度
でより短時間の暴露時間を用いたときの％応答カーブ
（黒記号）と同じである。このことは、暴露時間が４分
間以上であるかぎりいかなるエネルギー強度に関しても
正しい。図７はまた、異なる細胞攻撃刺激レベルについ
ての％応答カーブの勾配およびＴ1/2 は異なることも示
している。兎赤血球の％応答カーブは、ＦＩＴＣ−デキ
ストラン濃度が２．０mg／mlの限界値より低いときは、
ミクロ−サンプルのＦＩＴＣ−デキストラン濃度が異な
ることによってもまた異なる。
／ml ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダルト
ン）の組成のミクロ−サンプルで、兎（３羽）赤血球に
ついて、１０５Ｊ／cm2 （白四角）、１２６Ｊ／cm2
（黒四角）、１５９Ｊ／cm2 （白三角）、１６８Ｊ／cm
2 （黒三角）、２１０Ｊ／cm2 （白菱形）、および２１
０Ｊ／cm2 （黒菱形）の細胞攻撃刺激の効果を示すため
の％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。白記号の細胞
攻撃刺激は、１０分間のエピ照射の低いエピ照射光強度
で得られ、他方、黒記号の細胞攻撃刺激は、８分間のエ
ピ照射のより強いエピ照射光強度で得た。弱い方のエピ
照射光強度でより長い時間エピ照射暴露時間を用いた場
合の％応答カーブ（白記号）は、等しい細胞攻撃刺激と
なるような同じエネルギーを与える場合は、強い光強度
でより短時間の暴露時間を用いたときの％応答カーブ
（黒記号）と同じである。このことは、暴露時間が４分
間以上であるかぎりいかなるエネルギー強度に関しても
正しい。図７はまた、異なる細胞攻撃刺激レベルについ
ての％応答カーブの勾配およびＴ1/2 は異なることも示
している。兎赤血球の％応答カーブは、ＦＩＴＣ−デキ
ストラン濃度が２．０mg／mlの限界値より低いときは、
ミクロ−サンプルのＦＩＴＣ−デキストラン濃度が異な
ることによってもまた異なる。
【００８３】図８は、２mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラ
ン（１５０，０００ダルトン）を含有しそして２１０Ｊ
／cm2 の細胞攻撃刺激を受けたミクロ−サンプル中の兎
（Ｎ＝４）赤血球濃度が３％（丸）、４％（三角）およ
び５％（四角）の場合の％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）
を示す。兎赤血球のこれらの％応答カーブは３〜５％の
範囲における異なるミクロ−サンプル細胞濃度につい
て、統計的に同じであり、細胞濃度の若干の変動は光刺
激による細胞攻撃による破壊に対する細胞の耐性のミク
ロフォトリシス測定に変化を与えないことを示す。
ン（１５０，０００ダルトン）を含有しそして２１０Ｊ
／cm2 の細胞攻撃刺激を受けたミクロ−サンプル中の兎
（Ｎ＝４）赤血球濃度が３％（丸）、４％（三角）およ
び５％（四角）の場合の％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）
を示す。兎赤血球のこれらの％応答カーブは３〜５％の
範囲における異なるミクロ−サンプル細胞濃度につい
て、統計的に同じであり、細胞濃度の若干の変動は光刺
激による細胞攻撃による破壊に対する細胞の耐性のミク
ロフォトリシス測定に変化を与えないことを示す。
【００８４】図９は、全血から分離された兎（Ｎ＝３）
赤血球（丸）および、血漿および血小板または白血球の
ような他の細胞も含む全血中の赤血球（三角）について
の、％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。ミクロ−サ
ンプルの組成の濃度は、赤血球４％およびＦＩＴＣ−デ
キストラン（１５０，０００）２mg／mlであった。これ
らのデータは、兎赤血球の％応答カーブは、ミクロ−サ
ンプル中の血漿または他の血球細胞（例えば白血球）の
存在により影響されないことを示す。従って、ミクロフ
ォトリシス法は、赤血球を注意深く分離する必要なく全
血サンプルに適用可能である。
赤血球（丸）および、血漿および血小板または白血球の
ような他の細胞も含む全血中の赤血球（三角）について
の、％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。ミクロ−サ
ンプルの組成の濃度は、赤血球４％およびＦＩＴＣ−デ
キストラン（１５０，０００）２mg／mlであった。これ
らのデータは、兎赤血球の％応答カーブは、ミクロ−サ
ンプル中の血漿または他の血球細胞（例えば白血球）の
存在により影響されないことを示す。従って、ミクロフ
ォトリシス法は、赤血球を注意深く分離する必要なく全
血サンプルに適用可能である。
【００８５】図１０は、５日（丸）の兎（Ｎ＝４）赤血
球の、赤血球を洗浄して緩衝液とＦＩＴＣ−デキストラ
ンと共に再構築して５日（菱形）、および赤血球を洗浄
して緩衝液と共にしかしＦＩＴＣ−デキストランを用い
ずに再構築して５日（四角）のミクロフォトリシスの％
応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。ミクロ−サンプル
の組成は、ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダ
ルトン）２mg／ml、赤血球濃度４％、および緩衝液であ
り、細胞攻撃刺激は１９８ジュール／cm2 である。５日
目に洗浄しＦＩＴＣ−デキストランを用いずに再構築し
た細胞は、光活性化に暴露したとき血球溶解を示さなか
った。元のＦＩＴＣ−デキストラン緩衝溶液で再構築し
た洗浄細胞は、５日目の未洗浄細胞と同様のミクロフォ
トリシス応答を示し、従って洗浄細胞は依然として反応
性であったが、但しＦＩＴＣ−デキストランの存在下で
のみ反応性であることを示した。従って、図１０はミク
ロフォトリシス法についてＦＩＴＣの存在が必要であ
り、そして光源からの熱のような他の因子がこの方法に
おいて血球溶解を誘発することはないことを示してい
る。ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダルト
ン）は巨大分子量の中性デキストランであり、非炎症状
態では内皮の隙間を通過することすらしない。洗浄細胞
は非反応性であったため、図１０のデータは、ミクロフ
ォトリシス応答が光と細胞内もしくは膜内に結合した薬
剤との非特異的な相互作用の結果ではないことを示して
いる。細胞攻撃刺激剤としてのＦＩＴＣ−デキストラン
を用いたミクロフォトリシス法は、細胞膜の外側での相
互作用と引き続く細胞膜に対する効果によって生じるに
違いない。
球の、赤血球を洗浄して緩衝液とＦＩＴＣ−デキストラ
ンと共に再構築して５日（菱形）、および赤血球を洗浄
して緩衝液と共にしかしＦＩＴＣ−デキストランを用い
ずに再構築して５日（四角）のミクロフォトリシスの％
応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示す。ミクロ−サンプル
の組成は、ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダ
ルトン）２mg／ml、赤血球濃度４％、および緩衝液であ
り、細胞攻撃刺激は１９８ジュール／cm2 である。５日
目に洗浄しＦＩＴＣ−デキストランを用いずに再構築し
た細胞は、光活性化に暴露したとき血球溶解を示さなか
った。元のＦＩＴＣ−デキストラン緩衝溶液で再構築し
た洗浄細胞は、５日目の未洗浄細胞と同様のミクロフォ
トリシス応答を示し、従って洗浄細胞は依然として反応
性であったが、但しＦＩＴＣ−デキストランの存在下で
のみ反応性であることを示した。従って、図１０はミク
ロフォトリシス法についてＦＩＴＣの存在が必要であ
り、そして光源からの熱のような他の因子がこの方法に
おいて血球溶解を誘発することはないことを示してい
る。ＦＩＴＣ−デキストラン（１５０，０００ダルト
ン）は巨大分子量の中性デキストランであり、非炎症状
態では内皮の隙間を通過することすらしない。洗浄細胞
は非反応性であったため、図１０のデータは、ミクロフ
ォトリシス応答が光と細胞内もしくは膜内に結合した薬
剤との非特異的な相互作用の結果ではないことを示して
いる。細胞攻撃刺激剤としてのＦＩＴＣ−デキストラン
を用いたミクロフォトリシス法は、細胞膜の外側での相
互作用と引き続く細胞膜に対する効果によって生じるに
違いない。
【００８６】図１１は、グルコースおよびアルブミンを
含む標準緩衝液（四角）、グルコースを含むがアルブミ
ンを含まない緩衝液（黒菱形）、アルブミンを含みグル
コースを含まない緩衝液（三角）およびアルブミンもグ
ルコースも含まない緩衝液（丸）中で調製された兎（Ｎ
＝４）赤血球のミクロフォトリシスの％応答カーブ（平
均±ＳＥＭ）を示す。全てのミクロ−サンプルはＦＩＴ
Ｃ−デキストラン（１５０，０００ダルトン）を２mg／
mlおよび赤血球を４％濃度で含有し、１８０Ｊ／cm2
（右パネル）および９０Ｊ／cm2 （左パネル）の細胞攻
撃刺激に暴露された。細胞ミクロ−サンプルからアルブ
ミンを除去することにより、兎赤血球の％応答カーブに
変化はなかった。学術文献によると、アルブミンの除去
は赤血球の形状に変化を与える。従って、これらのデー
タは、ミクロフォトリシス法が、細胞形状にのみ依存す
る細胞の性質以外の性質を測定していることを示すもの
である。グルコースを細胞ミクロ−サンプルから除去す
ると、％応答カーブは左方に移動し、標準化された細胞
攻撃刺激に対する細胞の感受性がより大きくなることを
反映する。図１１の左パネルで説明されているように、
グルコースが存在しないと、細胞は非常に低い細胞攻撃
刺激に対してさえも非常に感受性である（勾配の増大と
Ｔ1/2 の減少に現れる）。学術文献によると、グルコー
スは細胞がそのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）レベルを
維持するために必要であり、ＡＴＰは細胞膜の完全性を
維持するための細胞代謝に必要である。従って、これら
のデータはミクロフォトリシス法が細胞膜の完全性の低
下を検出することができることを示す。
含む標準緩衝液（四角）、グルコースを含むがアルブミ
ンを含まない緩衝液（黒菱形）、アルブミンを含みグル
コースを含まない緩衝液（三角）およびアルブミンもグ
ルコースも含まない緩衝液（丸）中で調製された兎（Ｎ
＝４）赤血球のミクロフォトリシスの％応答カーブ（平
均±ＳＥＭ）を示す。全てのミクロ−サンプルはＦＩＴ
Ｃ−デキストラン（１５０，０００ダルトン）を２mg／
mlおよび赤血球を４％濃度で含有し、１８０Ｊ／cm2
（右パネル）および９０Ｊ／cm2 （左パネル）の細胞攻
撃刺激に暴露された。細胞ミクロ−サンプルからアルブ
ミンを除去することにより、兎赤血球の％応答カーブに
変化はなかった。学術文献によると、アルブミンの除去
は赤血球の形状に変化を与える。従って、これらのデー
タは、ミクロフォトリシス法が、細胞形状にのみ依存す
る細胞の性質以外の性質を測定していることを示すもの
である。グルコースを細胞ミクロ−サンプルから除去す
ると、％応答カーブは左方に移動し、標準化された細胞
攻撃刺激に対する細胞の感受性がより大きくなることを
反映する。図１１の左パネルで説明されているように、
グルコースが存在しないと、細胞は非常に低い細胞攻撃
刺激に対してさえも非常に感受性である（勾配の増大と
Ｔ1/2 の減少に現れる）。学術文献によると、グルコー
スは細胞がそのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）レベルを
維持するために必要であり、ＡＴＰは細胞膜の完全性を
維持するための細胞代謝に必要である。従って、これら
のデータはミクロフォトリシス法が細胞膜の完全性の低
下を検出することができることを示す。
【００８７】図１２は、２mg／mlのＦＩＴＣ−デキスト
ラン（１５０，０００ダルトン）、標準緩衝液、および
予め５．０mM（菱形）、０．５mM（四角）、０．０５mM
（丸）、または０．００mM（黒三角）の濃度のジアミド
と１時間インキュベートした４％濃度の赤血球を含む、
兎（Ｎ＝６）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォトリシ
スの％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞攻撃刺
激は１８０Ｊ／cm2 （右パネル）および９０Ｊ／cm2
（左パネル）で行った。兎赤血球の％応答カーブは、ミ
クロ−サンプルが予めジアミドと１時間インキュベート
した細胞を含むときは、左方に移動して細胞攻撃刺激に
対する細胞の感受性の増大を反映した。これらのジアミ
ドとインキュベートした細胞は、図１２の左パネルに示
したように非常に弱い細胞攻撃刺激に対する感受性が増
大していた（勾配の増大とＴ1/2 の減少に現れる）。学
術文献によると、ジアミドは細胞膜のタンパク質のスル
フヒドリル基を酸化して、スペクトリンの架橋結合を増
加させて、これにより細胞膜のタンパク質層を乱して細
胞膜の完全性を破壊する薬剤である。従って、これらの
データはミクロフォトリシス法が細胞膜のタンパク質層
に対する乱れにより生じる細胞の脆弱性を測定できるも
のであることを示している。
ラン（１５０，０００ダルトン）、標準緩衝液、および
予め５．０mM（菱形）、０．５mM（四角）、０．０５mM
（丸）、または０．００mM（黒三角）の濃度のジアミド
と１時間インキュベートした４％濃度の赤血球を含む、
兎（Ｎ＝６）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォトリシ
スの％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞攻撃刺
激は１８０Ｊ／cm2 （右パネル）および９０Ｊ／cm2
（左パネル）で行った。兎赤血球の％応答カーブは、ミ
クロ−サンプルが予めジアミドと１時間インキュベート
した細胞を含むときは、左方に移動して細胞攻撃刺激に
対する細胞の感受性の増大を反映した。これらのジアミ
ドとインキュベートした細胞は、図１２の左パネルに示
したように非常に弱い細胞攻撃刺激に対する感受性が増
大していた（勾配の増大とＴ1/2 の減少に現れる）。学
術文献によると、ジアミドは細胞膜のタンパク質のスル
フヒドリル基を酸化して、スペクトリンの架橋結合を増
加させて、これにより細胞膜のタンパク質層を乱して細
胞膜の完全性を破壊する薬剤である。従って、これらの
データはミクロフォトリシス法が細胞膜のタンパク質層
に対する乱れにより生じる細胞の脆弱性を測定できるも
のであることを示している。
【００８８】図１３は、ＦＩＴＣ−デキストラン（１５
０，０００ダルトン） ２mg／ml、標準緩衝液、および
予め１００mM（丸）、３０μM （菱形）、１０μM （四
角）および０μM （黒四角）の濃度のクロルプロマジン
と２０分間インキュベートした４％濃度の赤血球を含有
する、兎（Ｎ＝５）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォ
トリシスの％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞
攻撃刺激は１８０Ｊ／cm2 （右パネル）および９０Ｊ／
cm2 （左パネル）で行った。兎赤血球の％応答カーブ
は、ミクロ−サンプルが予めクロルプロマジンと２０分
間インキュベートした細胞を含む場合は、左方に移動し
て細胞攻撃に対する細胞の感受性が増大したことを反映
した。これらのクロルプロマジンでインキュベートした
細胞はまた、図１２の左パネルに説明されているよう
に、非常に低いレベルの細胞攻撃刺激に対しても感受性
であった（Ｔ1/2 の減少に現れるが勾配は不変であ
る）。学術文献によると、ここで使用した濃度のクロル
プロマジンは、細胞膜の脂質二重層の配置をクロルプロ
マジンが変化させるが細胞膜のタンパク質層に対する影
響は小さいという作用を介して、主として有口赤血球
（stomatocyte)形成を引き起こす。従って、これらのデ
ータはミクロフォトリシス法が、細胞膜の脂質層の乱れ
から生じる細胞膜の脆弱性の増大を検出できることを示
す。
０，０００ダルトン） ２mg／ml、標準緩衝液、および
予め１００mM（丸）、３０μM （菱形）、１０μM （四
角）および０μM （黒四角）の濃度のクロルプロマジン
と２０分間インキュベートした４％濃度の赤血球を含有
する、兎（Ｎ＝５）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォ
トリシスの％応答カーブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞
攻撃刺激は１８０Ｊ／cm2 （右パネル）および９０Ｊ／
cm2 （左パネル）で行った。兎赤血球の％応答カーブ
は、ミクロ−サンプルが予めクロルプロマジンと２０分
間インキュベートした細胞を含む場合は、左方に移動し
て細胞攻撃に対する細胞の感受性が増大したことを反映
した。これらのクロルプロマジンでインキュベートした
細胞はまた、図１２の左パネルに説明されているよう
に、非常に低いレベルの細胞攻撃刺激に対しても感受性
であった（Ｔ1/2 の減少に現れるが勾配は不変であ
る）。学術文献によると、ここで使用した濃度のクロル
プロマジンは、細胞膜の脂質二重層の配置をクロルプロ
マジンが変化させるが細胞膜のタンパク質層に対する影
響は小さいという作用を介して、主として有口赤血球
（stomatocyte)形成を引き起こす。従って、これらのデ
ータはミクロフォトリシス法が、細胞膜の脂質層の乱れ
から生じる細胞膜の脆弱性の増大を検出できることを示
す。
【００８９】図１４は、２mg／mlのＦＩＴＣ−デキスト
ラン（１５０，０００ダルトン）、標準緩衝液、および
予め０．０２％（ダッシュ付の線を引いた丸）、０．０
１％（菱形）、０．００５％（三角）、０．００２５％
（ダッシュ付の線を引いた四角）、および０．０００％
（黒三角）の濃度のグルタルアルデヒドと１時間インキ
ュベートした４％濃度の赤血球を含む、兎（Ｎ＝６）細
胞ミクロ−サンプルのミクロフォトリシスの％応答カー
ブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞攻撃刺激は１８０Ｊ／
cm2 で行った。兎赤血球の％応答カーブは、ミクロ−サ
ンプルが０．０１％以上のグルタルアルデヒド溶液と１
時間予めインキュベートした細胞を含む場合は、右方へ
移動し、Ｔ1/2 が増大及び勾配が減少して、細胞攻撃刺
激に対する細胞の感受性低下を反映した。学術文献によ
ると、グルタルアルデヒドは膜の脆弱性を低下させ（細
胞が破壊されにくくなる）、そして膜の堅牢性を高める
（細胞の変形能が低下する）。クロルプロマジンは、膜
の堅牢性を変化させるとの報告はなく膜の脆弱性を増大
させる（より破壊されやすくする）。ジアミドは膜の脆
弱性を増大し（より破壊されやすくする）そして膜の堅
牢性を高める（より変形しにくくする）。従って、図１
２、１３および１４に記載されているこれら三種の薬剤
の効果の比較は、ミクロフォトリシス法が単なる細胞膜
の堅牢性ではなく細胞膜の脆弱性の変化を測定し、そし
てミクロフォトリシス法が脂質層の変化およびタンパク
質層の変化による膜の脆弱性の変化を識別することがで
きることを証明している。
ラン（１５０，０００ダルトン）、標準緩衝液、および
予め０．０２％（ダッシュ付の線を引いた丸）、０．０
１％（菱形）、０．００５％（三角）、０．００２５％
（ダッシュ付の線を引いた四角）、および０．０００％
（黒三角）の濃度のグルタルアルデヒドと１時間インキ
ュベートした４％濃度の赤血球を含む、兎（Ｎ＝６）細
胞ミクロ−サンプルのミクロフォトリシスの％応答カー
ブ（平均±ＳＥＭ）を示し、細胞攻撃刺激は１８０Ｊ／
cm2 で行った。兎赤血球の％応答カーブは、ミクロ−サ
ンプルが０．０１％以上のグルタルアルデヒド溶液と１
時間予めインキュベートした細胞を含む場合は、右方へ
移動し、Ｔ1/2 が増大及び勾配が減少して、細胞攻撃刺
激に対する細胞の感受性低下を反映した。学術文献によ
ると、グルタルアルデヒドは膜の脆弱性を低下させ（細
胞が破壊されにくくなる）、そして膜の堅牢性を高める
（細胞の変形能が低下する）。クロルプロマジンは、膜
の堅牢性を変化させるとの報告はなく膜の脆弱性を増大
させる（より破壊されやすくする）。ジアミドは膜の脆
弱性を増大し（より破壊されやすくする）そして膜の堅
牢性を高める（より変形しにくくする）。従って、図１
２、１３および１４に記載されているこれら三種の薬剤
の効果の比較は、ミクロフォトリシス法が単なる細胞膜
の堅牢性ではなく細胞膜の脆弱性の変化を測定し、そし
てミクロフォトリシス法が脂質層の変化およびタンパク
質層の変化による膜の脆弱性の変化を識別することがで
きることを証明している。
【００９０】ストレプトゾチシン(streptozoticin)を注
射した実験室ラットは、血糖値上昇（ハイパーグリセミ
ア）および尿へのグルコースの漏出を伴う、ヒトのイン
シュリン依存性糖尿病の動物モデルとして広く使用され
ている。実験室ラットの食餌管理はヒトの高コレステロ
ール血症の動物モデルとして知られている。図１５は、
５匹の正常対照スプラグドーリー実験室ラット（Ｃ）の
２４８±３．６Ｊ／cm2 処理した赤血球のミクロフォト
リシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならびに
Ｔ1/2 値および勾配値、３匹のストレプトゾチシン−誘
発インシュリン依存性糖尿病スプラグドーリーラット
（Ｄ）の２４５±４．１Ｊ／cm2 処理した赤血球のミク
ロフォトリシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）
ならびにＴ1/2 値および勾配値、および６匹の食事管理
によって誘発した高コレステロール血症スプラグドーリ
ーラット（Ｈ）の２４９±２．７Ｊ／cm2 処理した赤血
球のミクロフォトリシスの％応答カーブの％最大応答
（ＭＲ％）ならびにＴ1/2 値および勾配値を示す。全て
の細胞ミクロ−サンプルは、４mg／ml ＦＩＴＣ−デキ
ストラン（２０，０００ダルトン）、標準緩衝液、およ
び赤血球濃度３％の組成を有した。正常ラット、糖尿病
ラット、および高コレステロール血症ラットの赤血球の
％応答カーブは、このミクロフォトリシス法において類
似した最大応答を示した。高コレステロール血症ラット
の赤血球のＴ1/2 および勾配は正常であり、糖尿病ラッ
トからの細胞は有意に長いＴ1/2 および小さい勾配を有
し、糖尿病ラットでは細胞膜の脆弱性が実質的に減少し
ていることを示唆した。これらのデータはミクロフォト
リシス法が細胞膜のイオンポンプ（例えばカルシウムポ
ンプ）を変化させる病気（例えば糖尿病）を検出できる
ことを示している。
射した実験室ラットは、血糖値上昇（ハイパーグリセミ
ア）および尿へのグルコースの漏出を伴う、ヒトのイン
シュリン依存性糖尿病の動物モデルとして広く使用され
ている。実験室ラットの食餌管理はヒトの高コレステロ
ール血症の動物モデルとして知られている。図１５は、
５匹の正常対照スプラグドーリー実験室ラット（Ｃ）の
２４８±３．６Ｊ／cm2 処理した赤血球のミクロフォト
リシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならびに
Ｔ1/2 値および勾配値、３匹のストレプトゾチシン−誘
発インシュリン依存性糖尿病スプラグドーリーラット
（Ｄ）の２４５±４．１Ｊ／cm2 処理した赤血球のミク
ロフォトリシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）
ならびにＴ1/2 値および勾配値、および６匹の食事管理
によって誘発した高コレステロール血症スプラグドーリ
ーラット（Ｈ）の２４９±２．７Ｊ／cm2 処理した赤血
球のミクロフォトリシスの％応答カーブの％最大応答
（ＭＲ％）ならびにＴ1/2 値および勾配値を示す。全て
の細胞ミクロ−サンプルは、４mg／ml ＦＩＴＣ−デキ
ストラン（２０，０００ダルトン）、標準緩衝液、およ
び赤血球濃度３％の組成を有した。正常ラット、糖尿病
ラット、および高コレステロール血症ラットの赤血球の
％応答カーブは、このミクロフォトリシス法において類
似した最大応答を示した。高コレステロール血症ラット
の赤血球のＴ1/2 および勾配は正常であり、糖尿病ラッ
トからの細胞は有意に長いＴ1/2 および小さい勾配を有
し、糖尿病ラットでは細胞膜の脆弱性が実質的に減少し
ていることを示唆した。これらのデータはミクロフォト
リシス法が細胞膜のイオンポンプ（例えばカルシウムポ
ンプ）を変化させる病気（例えば糖尿病）を検出できる
ことを示している。
【００９１】ヒト細胞のミクロフォトリシス 図１６は、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（２０，
０００ダルトン）を含むミクロ−サンプル中の０．５な
いし３．０％濃度のヒト（Ｎ＝３）赤血球のミクロフォ
トリシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならび
にＴ1/2 値および勾配値を示す。一人の患者は５４９±
０．３Ｊ／cm2 、第二の患者は３４０±１．１Ｊ／cm
2 、そして第三の患者は１９８±１．３Ｊ／cm2 の細胞
攻撃刺激を、５種の細胞濃度全てに対して適用された。
図１６に示されているとおり、ヒト赤血球のミクロフォ
トリシスは、ミクロ−サンプル細胞濃度１．０ないし
３．０％の範囲において同じ％最大応答を与え、細胞濃
度０．５ないし２．０％の範囲において同じＴ1/2 値を
与え、そして細胞濃度０．５％ないし３％の範囲におい
て同じ％応答カーブ勾配を与える。兎の赤血球のミクロ
フォトリシスは、図８に示されているとおり、３％ない
し５％のミクロ−サンプル細胞濃度範囲において、同じ
％応答カーブを与える。これらのデータは、ミクロフォ
トリシス法が動物およびヒトにおいて特定のしかし異な
る濃度範囲内で細胞濃度の変動に比較的感受性でないこ
とを示唆している。
０００ダルトン）を含むミクロ−サンプル中の０．５な
いし３．０％濃度のヒト（Ｎ＝３）赤血球のミクロフォ
トリシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならび
にＴ1/2 値および勾配値を示す。一人の患者は５４９±
０．３Ｊ／cm2 、第二の患者は３４０±１．１Ｊ／cm
2 、そして第三の患者は１９８±１．３Ｊ／cm2 の細胞
攻撃刺激を、５種の細胞濃度全てに対して適用された。
図１６に示されているとおり、ヒト赤血球のミクロフォ
トリシスは、ミクロ−サンプル細胞濃度１．０ないし
３．０％の範囲において同じ％最大応答を与え、細胞濃
度０．５ないし２．０％の範囲において同じＴ1/2 値を
与え、そして細胞濃度０．５％ないし３％の範囲におい
て同じ％応答カーブ勾配を与える。兎の赤血球のミクロ
フォトリシスは、図８に示されているとおり、３％ない
し５％のミクロ−サンプル細胞濃度範囲において、同じ
％応答カーブを与える。これらのデータは、ミクロフォ
トリシス法が動物およびヒトにおいて特定のしかし異な
る濃度範囲内で細胞濃度の変動に比較的感受性でないこ
とを示唆している。
【００９２】学術文献によると、ペントキシフィリン
は、いくつかのヒトの病気において、細胞膜の「柔軟
性」を増大させて血管内を赤血球が通過することを容易
にして末梢血流量を増大させるが、しかしペントキシフ
ィリンは単純に細胞膜の堅牢性（細胞の変形能）を変化
させるわけではない。図１７は、４mg／mlのＦＩＴＣ−
デキストラン（２０，０００ダルトン）および予め１０
mM（黒棒）、１mM（斜線棒）、および０mM（白棒）で１
時間４℃インキュベートした１％濃度の赤血球細胞を含
むヒト（Ｎ＝５）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォト
リシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならびに
Ｔ1/2 値および勾配値を示す。一人の患者は６５８±
６．６Ｊ／cm2 、三人の患者は３２９±１．９Ｊ／cm
2 、そして一人の患者は１９６±０．７Ｊ／cm2 の細胞
攻撃刺激を、３種のペントキシフィリン濃度全てに受け
た。図１８は、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（２
０，０００ダルトン）および予め１０mM（黒棒）、１mM
（斜線棒）および０mM（白棒）の濃度のペントキシフィ
リン（ＰＴＦＸ）と４℃で２４時間インキュベートした
１％濃度の赤血球細胞を含むヒト（Ｎ＝５）細胞ミクロ
−サンプルのミクロフォトリシスの％応答カーブの％最
大応答（ＭＲ％）ならびにＴ1/2 値および勾配値を示
す。これらの患者の一人は６４１±３．３Ｊ／cm2 、三
人の患者は３３０±１．７Ｊ／cm2 、そして一人の患者
は２０５±０．７Ｊ／cm2 の細胞攻撃刺激を、３種のペ
ントキシフィリン濃度全てに受けた。ヒト赤血球をペン
トキシフィリンと１時間インキュベートするとこれらの
細胞のミクロフォトリシス応答は変化する。図１７に示
したとおり、ペントキシフィリン濃度の増大に伴い、徐
々に（用量依存的に）、ミクロフォトリシスの％応答カ
ーブの％最大応答は減少し、Ｔ1/2が増大し、そして勾
配が減少する。図１８に示すとおり、赤血球をペントキ
シフィリンと２４時間インキュベートすると、％最大応
答の減少は消失し、そして勾配の低下が部分的に消失し
たが、Ｔ1/2 の用量依存的増大は依然として存在する。
これらのデータは、ミクロフォトリシス法が薬剤により
誘発されたヒト細胞膜の変化に感受性であり、そして薬
剤処理後に時間の関数として薬剤処理および薬剤未処理
ヒト細胞を識別できることを示している。
は、いくつかのヒトの病気において、細胞膜の「柔軟
性」を増大させて血管内を赤血球が通過することを容易
にして末梢血流量を増大させるが、しかしペントキシフ
ィリンは単純に細胞膜の堅牢性（細胞の変形能）を変化
させるわけではない。図１７は、４mg／mlのＦＩＴＣ−
デキストラン（２０，０００ダルトン）および予め１０
mM（黒棒）、１mM（斜線棒）、および０mM（白棒）で１
時間４℃インキュベートした１％濃度の赤血球細胞を含
むヒト（Ｎ＝５）細胞ミクロ−サンプルのミクロフォト
リシスの％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）ならびに
Ｔ1/2 値および勾配値を示す。一人の患者は６５８±
６．６Ｊ／cm2 、三人の患者は３２９±１．９Ｊ／cm
2 、そして一人の患者は１９６±０．７Ｊ／cm2 の細胞
攻撃刺激を、３種のペントキシフィリン濃度全てに受け
た。図１８は、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（２
０，０００ダルトン）および予め１０mM（黒棒）、１mM
（斜線棒）および０mM（白棒）の濃度のペントキシフィ
リン（ＰＴＦＸ）と４℃で２４時間インキュベートした
１％濃度の赤血球細胞を含むヒト（Ｎ＝５）細胞ミクロ
−サンプルのミクロフォトリシスの％応答カーブの％最
大応答（ＭＲ％）ならびにＴ1/2 値および勾配値を示
す。これらの患者の一人は６４１±３．３Ｊ／cm2 、三
人の患者は３３０±１．７Ｊ／cm2 、そして一人の患者
は２０５±０．７Ｊ／cm2 の細胞攻撃刺激を、３種のペ
ントキシフィリン濃度全てに受けた。ヒト赤血球をペン
トキシフィリンと１時間インキュベートするとこれらの
細胞のミクロフォトリシス応答は変化する。図１７に示
したとおり、ペントキシフィリン濃度の増大に伴い、徐
々に（用量依存的に）、ミクロフォトリシスの％応答カ
ーブの％最大応答は減少し、Ｔ1/2が増大し、そして勾
配が減少する。図１８に示すとおり、赤血球をペントキ
シフィリンと２４時間インキュベートすると、％最大応
答の減少は消失し、そして勾配の低下が部分的に消失し
たが、Ｔ1/2 の用量依存的増大は依然として存在する。
これらのデータは、ミクロフォトリシス法が薬剤により
誘発されたヒト細胞膜の変化に感受性であり、そして薬
剤処理後に時間の関数として薬剤処理および薬剤未処理
ヒト細胞を識別できることを示している。
【００９３】図１９は、鎌状赤血球異常症の臨床所見を
有しない４人の女性および３人の男性米国黒人の赤血球
のミクロフォトリシスに関し、Ａは２４３±２．９Ｊ／
cm2（白棒）、Ｂは４００±３．６Ｊ／cm2 （斜線棒）
およびＣは６４２±４．０Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃
刺激での％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ
1/2 値および勾配値を示す。この細胞ミクロ−サンプル
は、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（２０，０００
ダルトン）、３％濃度の赤血球、および緩衝液を含む。
図２０は、鎌状赤血球異常症の臨床所見を有するが、し
かしヘモグロビン−Ｆ異常を有しない２人の女性および
３人の男性米国黒人の赤血球のミクロフォトリシスに関
し、Ａは２４７±１．１Ｊ／cm2 （白棒）、Ｂは３９５
±５．５Ｊ／cm2 （斜線棒）、およびＣは６４３±４．
０Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃刺激での％応答カーブの
％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ1/2 値および勾配値を示
す。この細胞ミクロ−サンプルは、４mg／mlのＦＩＴＣ
−デキストラン（２０，０００ダルトン）、３％濃度の
赤血球、および緩衝液を含む。図１９の左パネルに示す
とおり、異常鎌状赤血球を有しないヒトからの正常赤血
球は、２４０Ｊ／cm2 から６６０Ｊ／cm2 の広い範囲の
細胞攻撃刺激に対する暴露の後、最終的に８８ないし９
５％の破壊（％最大応答，ＭＲ％）を示す。図１９に示
されているとおり、これらの正常ヒト細胞のミクロフォ
トリシス％応答カーブは、細胞攻撃刺激の増大とともに
Ｔ1/2 が徐々に減少し、そして勾配が徐々に大きくな
る。これとは対照的に、図２０と図１９の対比により明
らかなとおり、鎌状赤血球異常患者の赤血球は、実質的
に減少した％最大応答（そのピークは中間的細胞攻撃刺
激で生じた）、有意に増大したＴ1/2 （これは細胞攻撃
刺激レベルの関数としての増大ではない）、および実質
的に減少した勾配を有した。これらのデータは、ミクロ
フォトリシス法がヒト細胞膜の病的変化に対して感受性
であり、そしてミクロフォトリシスが細胞を変化させる
ヒトの病気の検出のための複数のパラメータを提供する
ことを示している。
有しない４人の女性および３人の男性米国黒人の赤血球
のミクロフォトリシスに関し、Ａは２４３±２．９Ｊ／
cm2（白棒）、Ｂは４００±３．６Ｊ／cm2 （斜線棒）
およびＣは６４２±４．０Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃
刺激での％応答カーブの％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ
1/2 値および勾配値を示す。この細胞ミクロ−サンプル
は、４mg／mlのＦＩＴＣ−デキストラン（２０，０００
ダルトン）、３％濃度の赤血球、および緩衝液を含む。
図２０は、鎌状赤血球異常症の臨床所見を有するが、し
かしヘモグロビン−Ｆ異常を有しない２人の女性および
３人の男性米国黒人の赤血球のミクロフォトリシスに関
し、Ａは２４７±１．１Ｊ／cm2 （白棒）、Ｂは３９５
±５．５Ｊ／cm2 （斜線棒）、およびＣは６４３±４．
０Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃刺激での％応答カーブの
％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ1/2 値および勾配値を示
す。この細胞ミクロ−サンプルは、４mg／mlのＦＩＴＣ
−デキストラン（２０，０００ダルトン）、３％濃度の
赤血球、および緩衝液を含む。図１９の左パネルに示す
とおり、異常鎌状赤血球を有しないヒトからの正常赤血
球は、２４０Ｊ／cm2 から６６０Ｊ／cm2 の広い範囲の
細胞攻撃刺激に対する暴露の後、最終的に８８ないし９
５％の破壊（％最大応答，ＭＲ％）を示す。図１９に示
されているとおり、これらの正常ヒト細胞のミクロフォ
トリシス％応答カーブは、細胞攻撃刺激の増大とともに
Ｔ1/2 が徐々に減少し、そして勾配が徐々に大きくな
る。これとは対照的に、図２０と図１９の対比により明
らかなとおり、鎌状赤血球異常患者の赤血球は、実質的
に減少した％最大応答（そのピークは中間的細胞攻撃刺
激で生じた）、有意に増大したＴ1/2 （これは細胞攻撃
刺激レベルの関数としての増大ではない）、および実質
的に減少した勾配を有した。これらのデータは、ミクロ
フォトリシス法がヒト細胞膜の病的変化に対して感受性
であり、そしてミクロフォトリシスが細胞を変化させる
ヒトの病気の検出のための複数のパラメータを提供する
ことを示している。
【００９４】図２１は、鎌状赤血球異常症の臨床所見を
有し、しかもヘモグロビン−Ｆ異常を有する１人の女性
および１人の男性米国黒人の赤血球のミクロフォトリシ
スに関し、Ａは２５３±２．８Ｊ／cm2 （白棒）、Ｂは
３９９±４．６Ｊ／cm2 （斜線棒）、そしてＣは６６１
±２．１Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃刺激での％応答カ
ーブの％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ1/2 値および勾配
値を示す。この細胞ミクロ−サンプルは、４mg／mlのＦ
ＩＴＣ−デキストラン（２０，０００ダルトン）、３％
濃度の赤血球、および緩衝液を含む。図２１と図１９と
の対比により明らかなとおり、異常鎌状赤血球およびヘ
モグロビン−Ｆ異常の両方を有するヒトの赤血球は、低
い細胞攻撃刺激の場合は正常な％最大応答、異常に高い
Ｔ1/2 、および正常な勾配を有するが、高い細胞攻撃刺
激の場合は勾配が減少している。これらのデータは、ミ
クロフォトリシス法がヒト細胞膜の病気による変化の混
合に対して感受性であることを示している。これらのデ
ータはまた、ミクロフォトリシス法の複数のパラメータ
ーが、図１９に示す正常ヒト細胞と図２０に示す一つの
病気で変化した細胞を識別できること、そしてさらに図
１９と図２０の両方の状態と図２１に示すような複数の
異常の状態とを識別できることも示している。
有し、しかもヘモグロビン−Ｆ異常を有する１人の女性
および１人の男性米国黒人の赤血球のミクロフォトリシ
スに関し、Ａは２５３±２．８Ｊ／cm2 （白棒）、Ｂは
３９９±４．６Ｊ／cm2 （斜線棒）、そしてＣは６６１
±２．１Ｊ／cm2 （黒棒）の細胞攻撃刺激での％応答カ
ーブの％最大応答（ＭＲ％）並びにＴ1/2 値および勾配
値を示す。この細胞ミクロ−サンプルは、４mg／mlのＦ
ＩＴＣ−デキストラン（２０，０００ダルトン）、３％
濃度の赤血球、および緩衝液を含む。図２１と図１９と
の対比により明らかなとおり、異常鎌状赤血球およびヘ
モグロビン−Ｆ異常の両方を有するヒトの赤血球は、低
い細胞攻撃刺激の場合は正常な％最大応答、異常に高い
Ｔ1/2 、および正常な勾配を有するが、高い細胞攻撃刺
激の場合は勾配が減少している。これらのデータは、ミ
クロフォトリシス法がヒト細胞膜の病気による変化の混
合に対して感受性であることを示している。これらのデ
ータはまた、ミクロフォトリシス法の複数のパラメータ
ーが、図１９に示す正常ヒト細胞と図２０に示す一つの
病気で変化した細胞を識別できること、そしてさらに図
１９と図２０の両方の状態と図２１に示すような複数の
異常の状態とを識別できることも示している。
【００９５】上記の詳細な説明は、主として理解を助け
るために記載され、これらの説明から不当な限定的解釈
をすべきではない。なぜなら、当業者がより後の開示を
基にそして本発明の精神および特許請求の範囲を離れる
ことなく、変更を加えうることは自明である。
るために記載され、これらの説明から不当な限定的解釈
をすべきではない。なぜなら、当業者がより後の開示を
基にそして本発明の精神および特許請求の範囲を離れる
ことなく、変更を加えうることは自明である。
【図１】図１は、細胞ミクロ−サンプルの２つの四角形
領域において、該四角形領域の１つには、２４５ジュー
ル／ｃｍ2（白丸）の光の光活性化細胞攻撃刺激を零時
間から与え続けてミクロフォトリシスを起こさせ、もう
一方の四角形領域には４０１ジュール／ｃｍ2（黒丸）
の光を同様に照射してミクロフォトリシスを起こさせた
場合に、無傷のまま（ｉｎｔａｃｔ）生き残ったヒト赤
血球細胞（相対応答領域光学濃度として測定）の数の割
合を時間の関数として表した曲線のプロット図である。
領域において、該四角形領域の１つには、２４５ジュー
ル／ｃｍ2（白丸）の光の光活性化細胞攻撃刺激を零時
間から与え続けてミクロフォトリシスを起こさせ、もう
一方の四角形領域には４０１ジュール／ｃｍ2（黒丸）
の光を同様に照射してミクロフォトリシスを起こさせた
場合に、無傷のまま（ｉｎｔａｃｔ）生き残ったヒト赤
血球細胞（相対応答領域光学濃度として測定）の数の割
合を時間の関数として表した曲線のプロット図である。
【図２】図２は、図１の２４５ジュール／ｃｍ2刺激の
曲線（白丸）、および、図１の実験で用いられた細胞試
料の第三の四角形領域に、６３８ジュール／ｃｍ2（黒
丸）の光活性化細胞攻撃刺激を零時間から与え続けてミ
クロフォトリシスを起こさせた場合の相対応答領域光学
濃度を時間の関数として表した曲線のプロット図であ
る。
曲線（白丸）、および、図１の実験で用いられた細胞試
料の第三の四角形領域に、６３８ジュール／ｃｍ2（黒
丸）の光活性化細胞攻撃刺激を零時間から与え続けてミ
クロフォトリシスを起こさせた場合の相対応答領域光学
濃度を時間の関数として表した曲線のプロット図であ
る。
【図３】図３は、図１の曲線（白丸）に以下の定義を図
表の基準として書き加えたものである： １）最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）： ２）最大応答パーセント（ＭＲ％）： ＭＲ÷ＺＲＯＤ×１００ ３）ある特定時（ｔ）における応答（％）（％応答
（ｔ））： （ＺＲＯＤ−ＲＯＤ(ｔ)）÷ＭＲ×１００ ＲＯＤ（ｔ）：特定時ｔにおける応答領域光学濃度。
表の基準として書き加えたものである： １）最大ミクロフォトリシス応答（ＭＲ）： ２）最大応答パーセント（ＭＲ％）： ＭＲ÷ＺＲＯＤ×１００ ３）ある特定時（ｔ）における応答（％）（％応答
（ｔ））： （ＺＲＯＤ−ＲＯＤ(ｔ)）÷ＭＲ×１００ ＲＯＤ（ｔ）：特定時ｔにおける応答領域光学濃度。
【図４】図４は、図１および図２の３つの応答領域光学
濃度曲線に図３の定義を適用するとによって作成した、
３つのミクロフォトリシス％応答曲線のプロット図であ
る。
濃度曲線に図３の定義を適用するとによって作成した、
３つのミクロフォトリシス％応答曲線のプロット図であ
る。
【図５】図５は、図４のミクロフォトリシス％応答曲線
（白丸）に以下の定義を図表の基準として書き加えたも
のである： １）応答半値時間（Ｔ1/2）：細胞攻撃の開始から５０
パーセントの応答値が得られるまでの時間 ２）時間ｔ＝Ｔ1/2における％応答曲線の最大勾配。
（白丸）に以下の定義を図表の基準として書き加えたも
のである： １）応答半値時間（Ｔ1/2）：細胞攻撃の開始から５０
パーセントの応答値が得られるまでの時間 ２）時間ｔ＝Ｔ1/2における％応答曲線の最大勾配。
【図６】図６は、４羽のウサギから赤血球細胞を収集し
た後、１日（７時間）後（丸）、２日後（四角）、３日
後（三角）、４日後（菱形）、および５日後（逆三角）
にミクロフォトリシスを行った場合の％応答曲線（平均
値±ＳＥＭ）のプロット図である。
た後、１日（７時間）後（丸）、２日後（四角）、３日
後（三角）、４日後（菱形）、および５日後（逆三角）
にミクロフォトリシスを行った場合の％応答曲線（平均
値±ＳＥＭ）のプロット図である。
【図７】図７は、ウサギ（３羽）の赤血球細胞に、１０
５ジュール／ｃｍ2（白丸）、１２６ジュール／ｃｍ
2（黒丸）、１５９ジュール／ｃｍ2（白三角）、１６８
ジュール／ｃｍ2（黒三角）、２１０ジュール／ｃｍ
2（白菱形）、 および２１０ジュール／ｃｍ2（黒菱
形）の細胞攻撃刺激を与えた効果を示した％応答曲線
（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
５ジュール／ｃｍ2（白丸）、１２６ジュール／ｃｍ
2（黒丸）、１５９ジュール／ｃｍ2（白三角）、１６８
ジュール／ｃｍ2（黒三角）、２１０ジュール／ｃｍ
2（白菱形）、 および２１０ジュール／ｃｍ2（黒菱
形）の細胞攻撃刺激を与えた効果を示した％応答曲線
（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
【図８】図８は、３％（丸）、４％（三角）および５％
（四角）の濃度のウサギ（４羽）の赤血球細胞のミクロ
フォトリシスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）の
プロット図である。
（四角）の濃度のウサギ（４羽）の赤血球細胞のミクロ
フォトリシスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）の
プロット図である。
【図９】図９は、ウサギ（３羽）を使用し、血液全体か
ら分離した赤血球細胞（丸）および、プラズマおよび血
小板若しくは白血球細胞などの他の細胞を含む血液全体
中の赤血球細胞（三角）のミクロフォトリシスを示した
％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
ら分離した赤血球細胞（丸）および、プラズマおよび血
小板若しくは白血球細胞などの他の細胞を含む血液全体
中の赤血球細胞（三角）のミクロフォトリシスを示した
％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
【図１０】図１０は、５日後（丸）、洗浄後に緩衝液お
よびＦＩＴＣデキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａ
ｎ）で再構築してから５日後（菱形）、および、洗浄後
に緩衝液のみで（ＦＩＴＣデキストランは用いずに）再
構築してから５日後（四角）のウサギ（４羽）の赤血球
細胞のミクロフォトリシスを示した％応答曲線（平均値
±ＳＥＭ）のプロット図である。
よびＦＩＴＣデキストラン（ＦＩＴＣ−ｄｅｘｔｒａ
ｎ）で再構築してから５日後（菱形）、および、洗浄後
に緩衝液のみで（ＦＩＴＣデキストランは用いずに）再
構築してから５日後（四角）のウサギ（４羽）の赤血球
細胞のミクロフォトリシスを示した％応答曲線（平均値
±ＳＥＭ）のプロット図である。
【図１１】図１１は、グルコースおよびアルブミンの標
準緩衝液中（四角）、グルコースは含むがアルブミンは
含まない緩衝液中（黒菱形）、アルブミンは含むがグル
コースは含まない緩衝液中（三角）、およびアルブミン
もグルコースも含まない緩衝液中（丸）のウサギ（４
羽）の赤血球細胞のミクロフォトリシスを示した％応答
曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
準緩衝液中（四角）、グルコースは含むがアルブミンは
含まない緩衝液中（黒菱形）、アルブミンは含むがグル
コースは含まない緩衝液中（三角）、およびアルブミン
もグルコースも含まない緩衝液中（丸）のウサギ（４
羽）の赤血球細胞のミクロフォトリシスを示した％応答
曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図である。
【図１２】図１２は、５.０ミリモル（ｍＭ）（菱
形）、０.５ｍＭ（四角）、０.０５ｍＭ（丸）、または
０.００ｍＭ（黒三角）の濃度のジアミドとあらかじめ
１時間インキュベートしたウサギ（６羽）の赤血球細胞
について、１８０Ｊ／ｃｍ2（右図）および９０Ｊ／ｃ
ｍ2（左図）の細胞攻撃刺激によって行ったミクロフォ
トリシスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロ
ット図である。
形）、０.５ｍＭ（四角）、０.０５ｍＭ（丸）、または
０.００ｍＭ（黒三角）の濃度のジアミドとあらかじめ
１時間インキュベートしたウサギ（６羽）の赤血球細胞
について、１８０Ｊ／ｃｍ2（右図）および９０Ｊ／ｃ
ｍ2（左図）の細胞攻撃刺激によって行ったミクロフォ
トリシスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロ
ット図である。
【図１３】図１３は、１００マイクロモル（丸）、３０
μＭ（菱形）、１０μＭ（四角）、および０μＭ（黒三
角）の濃度のクロロプロマジンとあらかじめ２０分間イ
ンキュベートしたウサギ（５羽）の赤血球細胞につい
て、１８０Ｊ／ｃｍ2（右図）および９０Ｊ／ｃｍ2（左
図）の細胞攻撃刺激によって行ったミクロフォトリシス
を示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図で
ある。
μＭ（菱形）、１０μＭ（四角）、および０μＭ（黒三
角）の濃度のクロロプロマジンとあらかじめ２０分間イ
ンキュベートしたウサギ（５羽）の赤血球細胞につい
て、１８０Ｊ／ｃｍ2（右図）および９０Ｊ／ｃｍ2（左
図）の細胞攻撃刺激によって行ったミクロフォトリシス
を示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット図で
ある。
【図１４】図１４は、０.０２％（丸、ダッシュの入っ
た線）、０.０１％（菱形）、０.００５％（三角）、
０.００２５％（四角、ダッシュの入った線）、０.００
１２５％（丸）、および０.０００％（黒三角）の濃度
のグルタールアルデヒドとあらかじめ１時間インキュベ
ートしたウサギ（６羽）の赤血球細胞のミクロフォトリ
シスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット
図である。
た線）、０.０１％（菱形）、０.００５％（三角）、
０.００２５％（四角、ダッシュの入った線）、０.００
１２５％（丸）、および０.０００％（黒三角）の濃度
のグルタールアルデヒドとあらかじめ１時間インキュベ
ートしたウサギ（６羽）の赤血球細胞のミクロフォトリ
シスを示した％応答曲線（平均値±ＳＥＭ）のプロット
図である。
【図１５】図１５は、正常なコントロール Sprague-Daw
ley 研究室ラット（Ｃ）（５匹）を２４８±３.６Ｊ／
ｃｍ2照射、ストレプトゾティシン誘導インシュリン依
存性糖尿病 Sprague-Dawley ラット（Ｄ）（３匹）を２
４５±４.１Ｊ／ｃｍ2照射、および、食餌制限による高
コレステロール血症 Sprague-Dawley ラット（Ｈ）（６
匹）を２４９±２.７Ｊ／ｃｍ2照射した各々の赤血球細
胞についてのミクロフォトリシスの％応答曲線の最大％
応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラ
フである。
ley 研究室ラット（Ｃ）（５匹）を２４８±３.６Ｊ／
ｃｍ2照射、ストレプトゾティシン誘導インシュリン依
存性糖尿病 Sprague-Dawley ラット（Ｄ）（３匹）を２
４５±４.１Ｊ／ｃｍ2照射、および、食餌制限による高
コレステロール血症 Sprague-Dawley ラット（Ｈ）（６
匹）を２４９±２.７Ｊ／ｃｍ2照射した各々の赤血球細
胞についてのミクロフォトリシスの％応答曲線の最大％
応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラ
フである。
【図１６】図１６は、０.５％から３.０％の濃度のヒト
（三人）の赤血球細胞について、第１の試料は５４９±
０.３Ｊ／ｃｍ2、第二の試料は３４０±１.１Ｊ／ｃ
ｍ2、そして第三の試料は１９８±１.３Ｊ／ｃｍ2の細
胞攻撃刺激を５種類の各細胞濃度について受けた場合
の、ミクロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（Ｍ
Ｒ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフであ
る。。
（三人）の赤血球細胞について、第１の試料は５４９±
０.３Ｊ／ｃｍ2、第二の試料は３４０±１.１Ｊ／ｃ
ｍ2、そして第三の試料は１９８±１.３Ｊ／ｃｍ2の細
胞攻撃刺激を５種類の各細胞濃度について受けた場合
の、ミクロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（Ｍ
Ｒ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフであ
る。。
【図１７】図１７は、１０ミリモル（黒棒）、１ｍＭ
（斜線棒）、０ｍＭ（白棒）の濃度のペントキシフィリ
ン（pentoxifylline、ＰＴＦＸ）とあらかじめ４℃で１
時間インキュベートさせたヒト（五人）の赤血球細胞に
ついて、一人の試料は６５８±６.６Ｊ／ｃｍ2、三人の
試料は３２９±１.９Ｊ／ｃｍ2、そして残りの一人の試
料は１９６±０.７Ｊ／ｃｍ2の細胞攻撃刺激を３種類の
各ペントキシフィリン濃度について受けた場合の、ミク
ロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、
Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフである。
（斜線棒）、０ｍＭ（白棒）の濃度のペントキシフィリ
ン（pentoxifylline、ＰＴＦＸ）とあらかじめ４℃で１
時間インキュベートさせたヒト（五人）の赤血球細胞に
ついて、一人の試料は６５８±６.６Ｊ／ｃｍ2、三人の
試料は３２９±１.９Ｊ／ｃｍ2、そして残りの一人の試
料は１９６±０.７Ｊ／ｃｍ2の細胞攻撃刺激を３種類の
各ペントキシフィリン濃度について受けた場合の、ミク
ロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、
Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフである。
【図１８】図１８は、１０ミリモル（黒棒）、１ｍＭ
（斜線棒）、０ｍＭ（白棒）の濃度のペントキシフィリ
ン（pentoxifylline、ＰＴＦＸ）とあらかじめ４℃で２
４時間インキュベートさせたヒト（五人）の赤血球細胞
について、一人の試料は６４１±３.３Ｊ／ｃｍ2、三人
の試料は３３０±１.７Ｊ／ｃｍ2、そして残りの一人の
試料は２０５±０.７Ｊ／ｃｍ2の細胞攻撃刺激を３種類
の各ペントキシフィリン濃度について受けた場合の、ミ
クロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ
％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフであ
る。。
（斜線棒）、０ｍＭ（白棒）の濃度のペントキシフィリ
ン（pentoxifylline、ＰＴＦＸ）とあらかじめ４℃で２
４時間インキュベートさせたヒト（五人）の赤血球細胞
について、一人の試料は６４１±３.３Ｊ／ｃｍ2、三人
の試料は３３０±１.７Ｊ／ｃｍ2、そして残りの一人の
試料は２０５±０.７Ｊ／ｃｍ2の細胞攻撃刺激を３種類
の各ペントキシフィリン濃度について受けた場合の、ミ
クロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ
％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフであ
る。。
【図１９】図１９は、鎌形赤血球病の臨床の兆候をなん
ら示さなかったアフリカ系アメリカ人（女性４人、男性
３人）由来の赤血球細胞にＡ＝２４３±２.９Ｊ／ｃｍ2
（白）、Ｂ＝４００±３.６Ｊ／ｃｍ2（斜線）、およ
び、Ｃ＝６４２±４.０Ｊ／ｃｍ2（黒）の細胞攻撃刺激
を与えた場合のミクロフォトリシスの％応答曲線の最大
％応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グ
ラフである。
ら示さなかったアフリカ系アメリカ人（女性４人、男性
３人）由来の赤血球細胞にＡ＝２４３±２.９Ｊ／ｃｍ2
（白）、Ｂ＝４００±３.６Ｊ／ｃｍ2（斜線）、およ
び、Ｃ＝６４２±４.０Ｊ／ｃｍ2（黒）の細胞攻撃刺激
を与えた場合のミクロフォトリシスの％応答曲線の最大
％応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グ
ラフである。
【図２０】図２０は、鎌形赤血球病の臨床診断結果を示
したが、ヘモグロビンＦの異常は認められなかったアフ
リカ系アメリカ人（女性２人、男性３人）由来の赤血球
細胞にＡ＝２４７±１.１Ｊ／ｃｍ2（白）、Ｂ＝３９５
±５.５Ｊ／ｃｍ2（斜線）、および、Ｃ＝６４３±４.
０Ｊ／ｃｍ2（黒）の細胞攻撃刺激を与えた場合のミク
ロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、
Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフである。
したが、ヘモグロビンＦの異常は認められなかったアフ
リカ系アメリカ人（女性２人、男性３人）由来の赤血球
細胞にＡ＝２４７±１.１Ｊ／ｃｍ2（白）、Ｂ＝３９５
±５.５Ｊ／ｃｍ2（斜線）、および、Ｃ＝６４３±４.
０Ｊ／ｃｍ2（黒）の細胞攻撃刺激を与えた場合のミク
ロフォトリシスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、
Ｔ1/2，および勾配値を示した棒グラフである。
【図２１】図２１は、鎌形赤血球病の臨床診断結果、お
よびヘモグロビンＦの異常を共に示したアフリカ系アメ
リカ人（女性１人、男性１人）由来の赤血球細胞にＡ＝
２５３±２.８Ｊ／ｃｍ2（白）、Ｂ＝３９９±４.６Ｊ
／ｃｍ2（斜線）、および、Ｃ＝６６１±２.１Ｊ／ｃｍ
2（黒）の細胞攻撃刺激を与えた場合のミクロフォトリ
シスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，お
よび勾配値を示した棒グラフである。
よびヘモグロビンＦの異常を共に示したアフリカ系アメ
リカ人（女性１人、男性１人）由来の赤血球細胞にＡ＝
２５３±２.８Ｊ／ｃｍ2（白）、Ｂ＝３９９±４.６Ｊ
／ｃｍ2（斜線）、および、Ｃ＝６６１±２.１Ｊ／ｃｍ
2（黒）の細胞攻撃刺激を与えた場合のミクロフォトリ
シスの％応答曲線の最大％応答（ＭＲ％）、Ｔ1/2，お
よび勾配値を示した棒グラフである。
【図２２】図２２は、活性化前（左上図）、活性開始よ
り２０分後（右上図）、４０分後（左下図）および６０
分後（右下図）の細胞ミクロ−サンプルの細胞攻撃を受
けた四角形領域を示した顕微鏡写真の模式図である。
り２０分後（右上図）、４０分後（左下図）および６０
分後（右下図）の細胞ミクロ−サンプルの細胞攻撃を受
けた四角形領域を示した顕微鏡写真の模式図である。
Claims (39)
- 【請求項１】細胞膜の強度を測定する方法において、 約２００ないし約４００ミリオスモルの範囲の選択され
た浸透圧の生理塩水に、膜強度を測定すべき試験細胞を
懸濁して、細胞含有溶液を生じさせ；該細胞含有溶液に
不活性な細胞攻撃用化学薬剤（該不活性な細胞攻撃用化
学薬剤は、約３００ないし約９００ナノメーターの範囲
の放射エネルギーを吸収して高反応性の電子欠損原子を
生じる分子を含む）を添加して、放射エネルギーに感受
性の溶液を生じさせ；該放射エネルギーに感受性の溶液
のミクロ−サンプルを含有する局部的顕微鏡領域を検査
し；約３００ないし約９００ナノメーターの範囲の選択
した波長の焦点化した第一の放射エネルギーを、該放射
エネルギーに感受性の溶液のミクロ−サンプルに適用し
て、該放射エネルギーに感受性の溶液中の細胞を該放射
エネルギーに選択した時間暴露して、該ミクロ−サンプ
ルの該局部的顕微鏡領域内の健全細胞の数を経時的に調
べ；該局部的顕微鏡領域内の健全細胞の数を決定し；約
３００ないし約９００ナノメーターの範囲の第二の焦点
化した放射エネルギーを選択された時間間隔内の選択さ
れた時間、前記第一の放射エネルギーとは異なる選択さ
れた波長で適用して、前記第二の放射エネルギーにより
該細胞攻撃薬剤を光活性化して該細胞攻撃薬剤から高反
応性の電子欠損原子を生じさせ、細胞反応性溶媒を生じ
させ；該細胞反応性溶媒中の該高反応性の電子欠損原子
を、該局部的顕微鏡領域内の試験細胞と反応させて該試
験細胞の細胞膜を破壊して、該細胞の含量を低下させて
該局部的顕微鏡領域内の該試験細胞による前記第一放射
エネルギーの吸収を変化させ；そして該細胞反応性溶媒
に暴露した後の該ミクロ−サンプル中の該細胞の細胞膜
の破壊に用いた該第一放射エネルギーの量を、該第二の
放射エネルギーの適用の前に適用した第一の放射エネル
ギーの量と比較して、選択された時間間隔で該局部的顕
微鏡領域内の健全細胞の数を決定することにより、該細
胞膜の強度を定量的に分析する；ことからなる、上記細
胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２】分析工程が、出発細胞数と破壊された細胞
の最高数との比較、ならびに破壊された細胞数が破壊さ
れるべき最高細胞数の１／２に達するまでの時間、およ
び前記選択された時間間隔の間の細胞破壊の最大速度の
各分析を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方
法。 - 【請求項３】分析工程が、出発細胞数と破壊された細胞
の最高数との比較、破壊されるべき最高細胞数の１／２
に達するまでの時間、および細胞破壊の最大速度の各分
析を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項４】試験細胞を赤血球、白血球、血小板、また
はそれらの混合物からなる群から選択する工程を含む、
請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項５】膜強度を測定すべき試験細胞を、約２００
ないし約４００ミリオスモルの範囲の選択された浸透圧
の生理溶液に懸濁して、細胞含有溶液を生じさせる工程
を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項６】前記焦点化した第一の放射エネルギーを、
約１分ないし約６０分の範囲の時間間隔で適用する工程
を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項７】前記焦点化した第一の放射エネルギーを、
約１分ないし約１０分の範囲の時間間隔で適用する工程
を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項８】前記焦点化した第一の放射エネルギーを、
約１秒ないし約１分の範囲の時間間隔で、６０分間また
は該局部的顕微鏡領域内の健全細胞の数が５個以下にな
るまで適用する工程を含む、請求項１記載の細胞膜の強
度の測定方法。 - 【請求項９】前記放射エネルギーに感受性の溶液約２５
μl からなるミクロ−サンプルを調製する工程を含む、
請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項１０】約３００ないし約９００ナノメーターの
範囲の選択された異なる波長の焦点化した第二の放射エ
ネルギーを、前記不活性な細胞攻撃薬剤を光活性化する
ために、選択した特定の不活性細胞攻撃薬剤に応じて約
１秒ないし約１０分間適用して、該放射エネルギーに感
受性の溶液の中の細胞攻撃薬剤から前記高反応性電子欠
損原子を生じさせる工程を含む、請求項１記載の細胞膜
の強度の測定方法。 - 【請求項１１】該細胞含有溶液に、不活性な細胞攻撃化
学薬剤（該不活性な細胞攻撃化学薬剤は、約３００ない
し約９００ナノメーターの範囲の放射エネルギーを吸収
して高反応性電子欠損原子を生じる分子を含む）を添加
して、放射エネルギー感受性溶液を生じさせる工程を含
み、さらに分析すべき細胞のタイプに特異的な細胞攻撃
化学薬剤を選択する工程を含む、請求項１記載の細胞膜
の強度の測定方法。 - 【請求項１２】該細胞含有溶液に、不活性な細胞攻撃化
学薬剤（該不活性な細胞攻撃化学薬剤は、約３００ない
し約９００ナノメーターの範囲の放射エネルギーを吸収
して高反応性電子欠損原子を生じる分子を含む）を添加
して、放射エネルギー感受性溶液を生じさせる工程を含
み、さらにフロキシンＢ、エオシン−イソチオシアネー
ト、フェオフォルバイド、プロトポルフィリン、フルオ
レセイン イソチオシアネート、フルオレセイン イソ
チオシアネート デキストラン、およびそれらの混合物
からなる群から細胞攻撃化学薬剤を選択する工程を含
む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項１３】試験薬剤を、前記細胞含有溶液に添加す
る工程をさらに含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測
定方法。 - 【請求項１４】グルタルアルデヒド、グルコース、アル
ブミン、クロルプロマジン、ジアミド、およびペントキ
シフィリンからなる群から選択される試験薬剤を、細胞
含有溶液に添加する工程を含む、請求項１記載の細胞膜
の強度の測定方法。 - 【請求項１５】細胞含有溶液に、細胞内部に結合する特
異的試験薬剤を添加する工程を含む、請求項１記載の細
胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項１６】細胞含有溶液にジアミドを添加して、細
胞膜内のタンパク質のスルフヒドリル基を酸化し、スペ
クトリン（spectrin）の架橋を増大させ、細胞膜のタン
パク質層を乱して膜の脆弱性および膜の堅牢性を増大さ
せることにより、膜の完全性を破壊する工程をさらに含
む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項１７】細胞含有溶液にクロルプロマジンを添加
して、有口赤血球を生じさせ、そして該細胞膜の脂質二
重層を変化させて、細胞膜の堅牢性を変化させることな
く膜の脆弱性を増加させることにより細胞膜の完全性を
破壊する工程をさらに含む、請求項１記載の細胞膜の強
度の測定方法。 - 【請求項１８】細胞含有溶液にグルタルアルデヒドを添
加して、細胞膜の脆弱性を減少させそして堅牢性を増大
させる工程をさらに含む、請求項１記載の細胞膜の強度
の測定方法。 - 【請求項１９】単に細胞膜の堅牢性を測定するのではな
く細胞膜の脆弱性の変化を測定して、細胞膜における脂
質層の変化による膜の脆弱性の変化とタンパク質層の変
化による膜の脆弱性の変化とを区別するために、グルタ
ルアルデヒド、クロルプロマジン、ジアミド、グルコー
ス、アルブミン、およびペントキシフィリンからなる群
から選択される少なくとも一つの試験薬剤を細胞含有溶
液に添加し、その効果を比較する工程をさらに含む、請
求項１４記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２０】試験細胞としてヒト赤血球を選択し、そ
して選択した赤血球をコントロール細胞と比較して、糖
尿病により生じる細胞応答カーブの要素の完全性の変化
によって、糖尿病を検知する工程をさらに含む、請求項
３記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２１】既知量の薬剤を未処理細胞に添加し、そ
して別の試験薬剤であるペントキシフィリン（末梢血液
流量を増大させて細胞膜の柔軟性を増大させて血管内の
赤血球の通過を容易にする治療剤である）の効果と比較
して、薬剤によりヒトの細胞膜に誘発された変化を薬剤
処理後の時間の関数として検出し、そして薬剤処理した
ヒト細胞としないヒト細胞を区別する工程を更に含む、
請求項３記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２２】細胞含有溶液を既知量のＡＴＰで処理
し、そして未処理の細胞含有溶液の細胞膜の完全性を処
理した細胞含有溶液のヒト赤血球の膜の完全性と比較す
ることにより、細胞含有溶液中の細胞の細胞膜中のＡＴ
Ｐ（アデノシン三リン酸）のレベルを測定する工程をさ
らに含む、請求項２記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２３】ヒト赤血球を試験細胞として選択し、鎌
状赤血球貧血により生じる細胞膜の完全性の変化による
細胞応答カーブの変化によって、上記選択したヒト赤血
球をコントロールヒト赤血球と比較して、鎌状赤血球貧
血を検出する工程をさらに含む、請求項３記載の細胞膜
の強度の測定方法。 - 【請求項２４】ヒト赤血球を試験細胞として選択し、下
記病気に誘発された病理により生じる細胞膜の完全性の
変化による細胞応答カーブの変化によって、上記選択し
たヒト赤血球をコントロールヒト赤血球と比較して、ヒ
ト細胞膜の病気による変化を検出する工程をさらに含
む、請求項３記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項２５】試験細胞としてヒト赤血球を選択し、選
択した赤血球をコントロールヒト赤血球と比較して、正
常ヒト細胞と単一の病気により変化した細胞とを区別
し、そして正常ヒト細胞および単一の病気により変化し
た細胞と複数の病気により変化した細胞とを区別する工
程をさらに含む、請求項２記載の細胞膜の強度の測定方
法。 - 【請求項２６】不活性な細胞攻撃化学薬剤（該不活性な
細胞攻撃用化学薬剤は、約３００ないし約９００ナノメ
ーターの範囲の放射エネルギーを吸収して高反応性の原
子を生じる分子を含む）を添加して、放射エネルギーに
感受性の溶液を生じさせる工程を含み、さらに特定のタ
イプの細胞に対する細胞攻撃薬剤として特定の蛍光色素
を選択する工程を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の
測定方法。 - 【請求項２７】細胞含有溶液の浸透圧を変化させる工程
をさらに含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測定方
法。 - 【請求項２８】細胞含有溶液に懸濁した細胞の濃度を変
化させる工程を含む、請求項１記載の細胞膜の強度の測
定方法。 - 【請求項２９】正常な膜および正常な代謝を有する未処
理の正常な細胞に対して第二の放射エネルギーを適用し
て、あるパターンの変化を生じさせ、未処理の正常細胞
の膜の強度を化学薬剤に対する暴露により処理された細
胞の膜の強度と比較する工程をさらに含む、請求項２記
載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３０】ペントキシフィリン、ジアミド、グルタ
ルアルデヒド、およびクロルプロマジンを含む群から選
択される細胞膜変化用の麻酔剤を添加する工程を含む、
請求項２９記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３１】重金属を含む群から選択される細胞膜変
化環境毒素を添加する工程をさらに含む、請求項２９記
載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３２】ウイルス、細菌、ホルモンまたは酵素を
含む群から選択される細胞膜変化用の生物学的薬剤を添
加する工程を含む、請求項２９記載の細胞膜の強度の測
定方法。 - 【請求項３３】糖尿病、高血圧、貧血、敗血症および免
疫系の変動を含む群から選択される病気が関与する生物
学的変化を細胞膜に生じる細胞膜変化用の生物学的薬剤
を添加する工程を含む、請求項３２記載の細胞膜の強度
の測定方法。 - 【請求項３４】細胞含有溶液に、細胞内の膜に結合する
特異的試験薬剤を添加する工程をさらに含む、請求項１
記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３５】細胞含有溶液に、細胞外の膜に結合する
特異的試験薬剤を添加する工程をさらに含む、請求項１
記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３６】カバーを有するウェル手段内に放射エネ
ルギー感受性溶液約２５μl からなるミクロ−サンプル
を調製し、そして該放射エネルギーに感受性の溶液のミ
クロ−サンプルの脱水を防止するために、ウェル手段内
のミクロ−サンプルの近傍に水で飽和した芯体を少なく
とも一つ存在させる工程をさらに含む、請求項１記載の
細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３７】細胞強度測定の選択された時間間隔につ
いて、細胞膜の完全性に関する少なくとも４つの異なる
定量測定点を含む細胞応答カーブを得る工程を含む、請
求項１記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３８】既知量のグルコースで細胞含有溶液を処
理し、そして未処理細胞を含む細胞含有溶液の膜の完全
性と、処理された細胞を含有する細胞含有溶液中のヒト
赤血球の膜の完全性とを比較することによって、細胞含
有溶液中の細胞膜中のグルコース量を測定する工程をさ
らに含む、請求項２記載の細胞膜の強度の測定方法。 - 【請求項３９】膜の強度を測定すべき試験細胞を単離
し；約２００ないし約４００ミリオスモルの範囲の選択
された生理溶液中に試験細胞を懸濁して細胞含有溶液を
形成し；細胞含有溶液に不活性な細胞攻撃蛍光色素薬剤
（該細胞攻撃用化学薬剤は、約３００ないし約９００ナ
ノメーターの範囲の放射エネルギーを吸収して高反応性
の電子欠損原子を生じる分子を含む）を添加して、放射
エネルギーに感受性の溶液を生じさせ；局部的顕微鏡領
域中に上記細胞を含む該放射エネルギーに感受性の溶液
のミクロ−サンプルを調製し；約３００ないし約９００
ナノメーターの範囲の選択した波長の焦点化した第一の
放射エネルギーを、該放射エネルギーに感受性の溶液中
の細胞に適用して、選択した時間における該ミクロ−サ
ンプルの該局部的顕微鏡領域内の健全細胞の数を調べ；
該ミクロ−サンプルの局部的顕微鏡領域内の健全な膜を
有する細胞の数を決定し；約３００ないし約９００ナノ
メーターの範囲の選択した波長の第二の焦点化した放射
エネルギーを、選択された時間間隔で選択された時間、
前記第一の放射エネルギーとは異なる選択された波長
で、前記放射エネルギーに感受性の溶液中の不活性な細
胞攻撃蛍光色素薬剤に適用して、前記第二の放射エネル
ギーにより該細胞攻撃薬剤を光活性化して該放射エネル
ギー感受性溶液中で該細胞攻撃薬剤から高反応性の電子
欠損原子を生じさせ；該細胞攻撃蛍光薬剤からの高反応
性の電子欠損原子を、ミクロ−サンプルの局部的顕微鏡
領域内の細胞膜と反応させて細胞膜を破壊して、該細胞
の内容物量を低下させて前記第一放射エネルギーの細胞
による吸収を変化させ；焦点化した第二の放射エネルギ
ーに選択した時間間隔で照射した後に局部的顕微鏡領域
内の細胞によって選択された時間に吸収された焦点化し
た第一の放射エネルギーの量を、焦点化した第二の放射
エネルギーの適用の前、最中および後に適用された焦点
化した第一の放射エネルギーの量と比較することによ
り、該細胞膜の強度を定量的に分析し；そして出発細胞
数と破壊された細胞の最高数とを比較し、破壊される最
高細胞数の１／２の破壊に達するまでの時間および細胞
破壊の最大速度を分析し、および細胞膜の完全性の少な
くとも４つの異なる定量測定を有する細胞応答カーブを
作成する；工程よりなる細胞膜の強度の測定方法。
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