JPH06201698A

JPH06201698A - 微量物質の検出方法及び検出装置

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Publication number: JPH06201698A
Application number: JP1584093A
Authority: JP
Inventors: Toshiichi Onishi; 敏一大西; Takeshi Miyazaki; 健宮崎
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1993-01-06
Filing date: 1993-01-06
Publication date: 1994-07-22

Abstract

(57)【要約】【目的】生体関連物質と選択特異的に結合する試料液
中の物質を検出する方法を提供する。【構成】試料液中の微量物質と選択特異的に結合する
生体関連物質を固体材料に担持している固相化試薬に対
して、微量物質及び１種類以上の検出試薬によって反応
結合体を形成させることにより上記微量物質を検出する
方法であって、上記試料液、検出試薬液はイオン導電性
を有し、イオン導電性を有する液体を電極対の間に導入
し、電極対間に周期的に変動する電圧を印加して、上記
液体を撹拌しながら固相化試薬、微量物質、検出試薬の
反応工程を行う。【効果】電極近傍の微小領域の試料液及び試薬液を撹
拌しながら反応工程を行うため、より短時間で微量物質
を検出することができると共に、微少量の試料液でも微
量物質を検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖，タンパク質等の生
体関連の微量物質の検出方法及び検出装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、核酸や免疫的に活性な抗原やその
他生体関連の微量物質の分析には、種々の方法や装置が
用いられている。これらの分析に際して、微量物質と選
択的に結合する試薬をフィルタやラテックス粒子、ガラ
スビーズ等の固体材料に存在させ、検査試料液から固体
材料上に微量物質を結合させ、得られた結合体を放射性
的、光学的に検出する方法が知られている。具体的に
は、「検査と技術ｖｏｌ．１６ＮＯ．７１９８８
年」によれば、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、ＥＩＡ
（酵素免疫測定法）、ＦＩＡ（蛍光免疫測定法）等が挙
げられる。

【０００３】これらの方法では、酵素活性の検出、放射
線量の検出、吸収、発光等の光学的検出のために放射性
同位元素や、色素、更には酵素で標識された試薬によっ
て結合体を標識することが行われる。一般にこれらの方
法では、固体材料上の試薬と結合しなかった余剰の検査
試料や標識試薬を固体材料から除去する洗浄工程、所謂
Ｂ／Ｆ分離が必要とされる。

【０００４】また、上記微量物質の分析における種々の
反応工程及び洗浄工程は一般に液体媒体中で行なわれ、
反応や洗浄の効率向上のためには、液体媒体や固体材料
（ビーズ等の場合）の撹拌が重要となる。

【０００５】撹拌手法としては、磁気ビーズ又は磁性微
粒子の固体材料を用いて磁力を利用する方法や、フィル
ター等の固体材料を用いた場合に撹拌子を用いる方法が
知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、磁性微
粒子を用いる方法は、良好な磁気微粒子の調整が難し
く、また磁気微粒子の粒径が非常に小さくなる（例えば
サブミクロン程度）と磁力の大きさが小さくなり撹拌効
率が悪くなるという欠点がある。また、微少量の液体の
撹拌では、液体を保持するハウジング（セル）の空隙が
狭いので磁気ビーズや磁性微粒子が空隙につまったりし
て、撹拌できなくなるという問題点があった。

【０００７】また、撹拌子を用いる方法は、撹拌子の洗
浄不備によるキャリーオーバーが生じやすいなど、一般
に微少量の液体には不向きであるという問題点があっ
た。

【０００８】本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、
微少量の液体（試料液、試薬液等）に対しても十分な撹
拌を可能にすることにより、反応工程や洗浄工程を効率
良く行い、測定時間の短縮化を可能にする微量物質の検
出方法及び検出装置を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段及び作用】上記目的を達成
するために成された本発明は、試料液中の微量物質と選
択特異的に結合する生体関連物質を固体材料に担持して
いる固相化試薬に対して、該微量物質及び／または１種
類以上の検出試薬によって反応結合体を形成させること
により上記微量物質を検出する方法であって、上記試料
液、検出試薬液はイオン導電性を有し、該イオン導電性
を有する液体を電極対の間に導入し、該電極対間に周期
的に変動する電圧を印加して、上記液体を撹拌しながら
上記固相化試薬、微量物質、検出試薬の反応工程を行う
ことを特徴とする微量物質の検出方法であり、また、上
記検出方法において、前記反応工程の後、イオン導電性
を有する洗浄液による洗浄工程を有し、洗浄液を前記電
極対の間に導入し、該電極対間に周期的に変動する電圧
を印加して、洗浄液を撹拌しながら洗浄工程を行うこと
を特徴とする微量物質の検出方法であり、更には、それ
らの検出方法を実施するための装置であって、前記電極
対を少なくとも１組以上設けた反応セルと、該電極対間
に周期的に変動する電圧を印加する電源手段と、上記反
応セル内の反応結合体中の標識物質を検出する手段を具
備することを特徴とする微量物質の検出装置である。

【００１０】本発明で用いることのできる前記試料液中
の微量物質及び生体関連物質としては、相互に選択特異
的に結合する物質であれば特に限定されるものではな
い。

【００１１】上記試料液中の物質としては、例えば生体
内の物質では、蛋白質、糖、ホルモン、ウイルス、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ等が挙げられる。

【００１２】一方、試薬としての上記生体関連物質は、
上記の物質に対して生物学的特異性を示すものを選択す
ることができる。

【００１３】ここで、生物学的特異性とは、例えば抗原
−抗体反応や、ＤＮＡ、ＲＮＡのハイブリダイゼーショ
ンやアビジン−ビオチン結合等の特異的結合が形成され
ることを意味する。

【００１４】本発明で言う生体関連物質とは、天然もし
くは合成のペプチド、蛋白質、酵素、糖類、レクチン、
ウイルス、細菌、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原（例えば
リコンビナント抗原も含む）抗体などを含む。また臨床
病理的に特に有用な物質としては、以下のものが挙げら
れる。

【００１５】ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＥなどの免疫グロブ
リン、補体，ＣＲＰ，フェリチン，α₁ マイクログロブ
リン，β₂ マイクログロブリンなどの血漿蛋白およびそ
れらの抗体、α−フェトプロテイン，癌胎児性抗原（Ｃ
ＥＡ），前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ），ＣＡ
１９−９，ＣＡ−１２５などの腫瘍マーカおよびそれら
の抗体、黄体化ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ），ヒト繊毛性ゴナドトロビン（ｈＣＧ），エ
ストロゲン，インスリンなどのホルモン類およびそれら
の抗体、ＨＢＶ関連抗原（ＨＢｓ．ＨＢｅ．ＨＢｃ），
ＨＩＶ，ＡＴＬなどウイルス感染関連物質およびそれら
の抗体、ジフテリア菌，ボツリヌス菌，マイコプラズ
マ，梅毒トレポネーマなどのバクテリア類およびそれら
の抗体、トキソプラズマ，トリコモナス，リーシュマニ
ア，トリバノゾーマ，マラリア原虫などの原虫類および
それらの抗体、フェニトイン，フェノバルビタールなど
の抗てんかん薬、キニジン，ジゴキシニンなどの心血管
薬、テオフィリンなどの抗喘息薬、クロラムフェニコー
ル，ゲンタマイシンなどの抗生物質などの薬物類および
それらの抗体、その他酵素，菌体外毒素（スチレリジン
Ｏなど）およびそれらの抗体などがあり、上記の試料液
中の物質と抗原−抗体反応等を起こす物質が適宜選択さ
れて使用される。

【００１６】本発明において、上記生体関連物質は固体
材料上に担持（固定化）され固相化試薬となる。固体材
料は後述する方法により生体関連物質を固定化できるも
のであればどのような材料を用いても良い。例えば、反
応セルを構成するガラスやプラスチック材料を用いても
良いし、また、ガラスファイバー、セルロース等のフィ
ルター、微粒子を用いても良い。

【００１７】かかる微粒子状の固体材料としては、生物
に由来する微粒子、無機系微粒子、有機系微粒子を挙げ
ることができる。前記生物に由来する微粒子としては、
例えば、赤血球、分散処理されたブドウ球菌、連鎖球菌
等の細菌類等が挙げられる。前記無機系微粒子として
は、例えば、シリカ、アルミナ、ベントナイト等が挙げ
られる。また、前記有機系微粒子としては、例えば、ス
チレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、
アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類などの
ビニル系モノマーの単一重合体および／又はそれらの共
重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタク
リレート−ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重
合体、脂質二分子膜のリポソームなどの微粒子が挙げら
れる。

【００１８】本発明において、上記固体材料の表面に前
述の生体関連物質を固定化させるには、以下の公知の方
法が利用できる。

【００１９】例えば、ｉ）イオン結合法、ｉｉ）物理吸
着法、ｉｉｉ）共有結合法などが挙げられる。

【００２０】イオン結合法は、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ
等の生体関連物質を固体材料表面に静電的に結合させる
ものである。

【００２１】物理吸着法は、固体材料表面の親油性部と
蛋白質の親油性部との疎水結合を利用する結合法であ
る。

【００２２】イオン結合法、および物理吸着法において
は結合反応工程は簡単であるが、固体材料と生体関連物
質との結合力が弱い。

【００２３】一方、共有結合法は、固体材料表面又は生
体関連物質の少なくとも一方に反応性の高い官能基を結
合し、これを介して両者を共有結合するものであり、強
固な結合力が得られる。共有結合法により固体材料と生
体関連物質とを結合させる際に、生体関連物質中の結合
に関与できる官能基としては、遊離のアミノ基、水酸
基、リン酸基、カルボキシル基、システインのスルフヒ
ドリル基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフ
ェノール基、セリン，トレオニンの水酸基などがある。

【００２４】これらの官能基は、種々のジアゾニウム
塩、酸アミド、イソシアナート、活性型のハロゲン化ア
ルキル基、活性型のエステル基などと反応する。従っ
て、これらの官能基を固体材料表面に導入することによ
り、種々の方法で固体材料表面に生体関連物質を担持で
きる。一方、生体関連物質、特に蛋白質を含む生体関連
物質の高次構造は、水素結合、疎水結合、イオン結合な
どの比較的弱い結合によって保持されているため壊れ易
く、従って固定化に際しては、高温、強酸、強アルカリ
などの処理を避けて、緩和な条件下に行なうことが望ま
しい。

【００２５】緩和な条件下に固定化反応を行う１つの方
法として、固体材料と生体関連物質の官能基とに反応す
る二官能性の架橋剤を使用することができる。二官能性
の架橋剤としては例えば、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’
で表わされるカルボジイミド、一般式ＣＨＯ−Ｒ−ＣＨ
Ｏで表わされるジアルデヒド、Ｏ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｎ＝Ｃ
＝Ｏで表わされるジイソシアネート等がある（これらの
一般式中、Ｒ，Ｒ’は同一、又は異なる置換、または未
置換のアルキル基、アリール基、アルキルアリール基又
は、アリールアルキル基である）。

【００２６】本発明で使用できる検出手法には、例えば
以下の手法が挙げられる。（「検査と技術ｖｏｌ．１６
ＮＯ．７５９１頁１９８８年」参照）（サンドイッチ法）微量物質を介して固相化試薬と検出
試薬が結合した反応結合体をつくり、この反応結合体を
検出することにより、微量物質の検出を行うことができ
る。

【００２７】サンドイッチ法の場合、検出試薬は固相化
試薬と同様に、微量物質と生物学的特異性を示す生体関
連物質を利用することができる。

【００２８】（競争法）固相化試薬に対して、試料液中
の微量物質と検出試薬とを競争的に反応させ、固相化試
薬と微量物質、固相化試薬と検出試薬の２種類の反応結
合体をつくり、固相化試薬と検出試薬からなる反応結合
体を検出することにより、相補的に微量物質の検出を行
うことができる。

【００２９】競争法の場合、検出試薬は微量物質（被測
定の微量物質とは区別するため何らかの標識がされてい
ることが必要）または、これと同様に固相化試薬と生物
学的特異性を示す物質を利用することができる。

【００３０】サンドイッチ法、競争法いずれの手法でも
検出試薬を含む反応結合体を検出することが必要であ
る。これは一般に、光学的、放射線的等の検出手段で検
出できる標識物質を検出試薬に導入することにより行う
ことができる。標識物質の導入は、前述の検出試薬に、
あらかじめ標識物質を化学的に結合させても良いし、反
応結合体中の検出試薬に選択特異的に結合し、しかも標
識化された別の検出試薬をさらに結合させても良い。標
識物質としては、従来より用いられている各種放射性同
位元素、色素、酵素等を用いることができる。

【００３１】本発明において、前記試料液及び／または
前記検出試薬液はイオン電導性を有し、これらの液体は
電極対の間に導入され、該電極対間に周期的に変動する
電圧を印加して、電極近傍のイオンに電磁気力を作用さ
せることにより液体を撹拌している。

【００３２】このため、イオン電導性を有する上記液体
の導電率は大きい方が望ましく、好ましい範囲としては
１０^-5Ｓ／ｃｍ以上、さらに好ましくは１０^-4Ｓ／ｃｍ
以上である。この導電率が小さいと、電極対の間に流れ
る電流が小さくなり、また同時に電極近傍に生じる磁界
も小さくなるため、イオンに作用する電磁気力が小さく
なり液体の流動が難しくなる。

【００３３】本発明に用いられる電極としては、金属，
カーボン等、従来公知の電極材料やこれらを導電性フィ
ラーとして分散させた高分子材料やポリピロール等の導
電性高分子材料等が使用可能である。一般にこれら電極
材料の選択は、電極対間に印加する電圧によって異な
る。すなわち、印加電圧に直流（ＤＣ）成分が存在する
と、電極材料によっては陽極酸化を受け、電極の溶解や
酸化被膜の形成が起こり、液体の流動やその耐久安定性
に悪影響を及ぼす場合がある。このような場合、白金等
の陽極酸化を受けにくい電極材料を選択する必要があ
る。また、印加電圧を下げることも考えられるが、イオ
ンに作用する電磁気力が低く制限されるため、液体の流
動スピードの上限が低く抑えられたり、流動できない可
能性もある。

【００３４】これらの点を考慮すると、電極対間に印加
する電圧としては、周期的に変動する電圧が好ましい。
この場合、その波形には特に制限はなく、矩形波、正弦
波、三角波等を用いることができる。

【００３５】周期的に変動する電圧としては、例えば図
１５（ａ）に示すような交番（ＡＣ）電圧がある。交番
電圧は、印加電圧の時間平均が０であるので、電極の陽
極酸化や液体の電気分解が生じにくいので特に好まし
い。

【００３６】必要に応じては、複数の交番電圧を合成し
た電圧でも良いし、図１５（ｂ）のような交番電圧に直
流電圧を重ねた電圧でもよいが、この際の直流電圧値
は、前述の陽極酸化等が生じない範囲である必要があ
る。

【００３７】また、図１５（ｃ）に示した矩形波電圧の
ようにＤｕｔｙ比が変えられる印加電圧の場合、好まし
いＤｕｔｙ比は、１０〜９０％、さらに好ましくは、２
０〜８０％である。Ｄｕｔｙ比が１０％より小さい場合
や９０％より大きい場合は、電界に対する液体中のイオ
ンの応答性が悪くなり、作用する電磁気力が小さくなる
ので流動が弱くなる。

【００３８】また、その周波数及び振幅電圧値は前述の
電極の陽極酸化や液体の電気分解（気泡の発生、反応
等）の有無と関連があり、一般に周波数が低いほどまた
振幅電圧値が大きいほど陽極酸化や電気分解が生じやす
い。例えば、導電率が１ｍＳ／ｃｍ程度の電解質水溶液
の場合、好ましい周波数は１００ＫＨｚ以上、さらに好
ましくは１ＭＨｚ以上である。また、好ましい振幅電圧
値は電極対間の距離や電極の形状や液体媒体の導電率に
より変化するが、電界値としておおむね１０⁴ 〜１０⁶
Ｖ／ｍである。

【００３９】本発明における液体の流動の原理は不明な
点も多いが、電極対の一方を作用電極、他方を対向電極
として説明すると以下のように考えられる。

【００４０】作用電極と対向電極間に電圧を印加する
と、これらの電極間に電界が生じる。この電界によって
液体中のイオンが動き、この時、両電極間に電流が流れ
る。これと同時に作用電極を流れる電流によって作用電
極の近傍に磁界が生じる。作用電極の近傍で電界により
運動するイオンは、磁界から電磁気力（ローレンツ力）
を受ける。このローレンツ力が本発明における流動のメ
カニズムと思われる。作用電極と対向電極間に印加する
電圧が交番電圧の場合、電界によるイオンの動きは時間
平均すると実質上ほとんどなく、電磁気力のみが作用し
ていることになる。

【００４１】本発明の電極の構成としては、電界による
イオンの運動の大きさ（電流の大きさ）と、電極の近傍
の磁界の強さが大きいことが好ましい。

【００４２】従って、電界と作用電極近傍磁界の大きさ
が共に大きくなるように、電極形状を作用電極に電界が
集中するような形状が好ましい。

【００４３】また、このような作用電極を用いることに
よって、磁界印加と電界印加を同時に、しかも簡単に行
うことができ、磁界印加の手段や電界印加用の手段を独
立に設ける必要がない。

【００４４】以下、本発明で使用される電極の構成例を
図面を用いて説明する。

【００４５】図１において、１は先端が円錐形状の作用
電極であり、４は対向電極である。これらの電極間に電
圧を印加すると、周辺のイオンが電界（電気力線３）に
沿って動き（図中ｉ方向）、作用電極１に電流Ｉが流れ
る。この電流Ｉにより作用電極の円錐軸を中心として同
心円状に磁界２が形成される。この時、作用電極近傍の
イオンは、対向電極４間で形成される電界３から力を受
け運動しているので、磁界２から電磁気力Ｆを受け、そ
の方向はほぼ作用電極の先端の円錐面に沿った方向とな
る。この方向は、印加電圧の極性を逆にしても変わら
ず、また、イオンが正負どちらでも変わらない。

【００４６】また、図２で示されるように、図１で示し
た円錐形状の電極を２本対向させて電極対を構成するこ
ともできる。

【００４７】この場合、２本の電極が相互に作用電極１
と対向電極４の関係となっている。この電極間に電圧を
印加すると図２で矢印で示したような液体の流動が生じ
る。

【００４８】このように、本発明の微量物質の検出方法
では、電極近傍の微小領域の液体中のイオンに電磁気力
を作用させることにより液体を撹拌するため、反応を効
率良く行うことができ反応工程に要する時間を短縮でき
ると共に、少量の液体（試料液，試薬液等）を用いて簡
単に反応工程を行うことができる。

【００４９】更に、本発明において、上記反応工程の後
に洗浄工程を有する場合には、これに用いる洗浄液もイ
オン電導性を有するものとすると、上述した試料液，試
薬液と同様にして撹拌することにより、洗浄を効率良く
行うことができ洗浄工程に要する時間を短縮できる。

【００５０】次に、本発明の微量物質の検出装置を図面
を用いて説明する。図３は、本発明の検出装置に用いら
れる反応セルの一構成例を示しており、図３（ａ）は斜
視図、図３（ｂ）は断面図である。

【００５１】同図において、中央に円柱形状の液体保持
部６を有する反応セル５は、液体保持部６の底部に固体
材料としてのフィルター７を有し、フィルター７の上面
には、試料液中の微量物質と結合する試薬部領域８が設
けられている。また、液体保持部６には、図２に示した
ような液体撹拌のための針状の電極１及び４が設けられ
外部電源（不図示）によって電圧が印加される。

【００５２】反応セル５の材質としては、ガラス、合成
樹脂材、金属等の従来から公知の素材及びこれらの複合
材料等を用いることができるが、反応セル５を試薬部領
域８の種類に応じて交換する場合に、軽量で低コストで
生産できる合成樹脂材料が好ましい。試薬部領域８は微
量物質と結合する試薬から成り、この試薬はフィルター
７の上面に直接存在していてもよいし、一度、ガラスフ
ァイバー材やポリマの微粒子等の中間媒体に担持させた
後に、これらをフィルター７上に配置してもよい。

【００５３】上記の様にして、フィルター７上に試料液
中の微量物質と選択特異的に結合する生体関連物質を担
持させ、固相化試薬を形成しておき、液体保持部６に試
料液，検出試薬液，洗浄液等を供給して反応工程及び洗
浄工程を行う。液体保持部６への各種液体の供給は、例
えば図４に示されるようにディスペンサ９により必要量
滴下して行なわれる。

【００５４】また、液体保持部６からの液体の排出はフ
ィルター７を通して吸引されることにより行なわれる。

【００５５】ディスペンサ９は液体保持部６に滴下され
る試料液、検出試薬液、洗浄液等の種類に応じて使い分
けられている。必要に応じて、先端部のディスペンサチ
ップは使い捨てのピペットであってもよい。

【００５６】例えばサンドイッチ法の場合の反応工程に
おいては、先ず、ディスペンサ９によって液体保持部６
に試料液を滴下しフィルター７上の試薬部領域８の全面
及び電極１，４が試料液で浸されるようにする（この際
フィルターの裏面からは吸引されていない）。次に、電
極間に交番電圧を印加し、試料液を撹拌し、試料液中の
微量物質と試薬部領域８の試薬とを結合させる。この
際、反応セル５の温度を制御し、結合反応を促進させる
ことも可能である。望ましい温度としては、結合反応の
種類により異なるが、５℃〜１００℃、更に好ましくは
２０℃〜６０℃である。一般に、結合反応に要する時間
は、使用する試薬部領域８の試薬、分析対象物、ｐＨ、
温度等により異なり、例えば免疫反応の場合は数分程
度、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの場合は数時間程
度である。従って、結合に要する時間ができるだけ短く
なるように、これらの条件を選択することが好ましい。

【００５７】次に、フィルターの裏面から吸引し、余剰
の試料液を除去する。

【００５８】次に、再度吸引を停止した状態で、微量物
質と結合し、蛍光色素等により標識された標識試薬液を
ディスペンサ９により液体保持部６に滴下し、前述の試
料液と同様に結合反応、除去を繰り返す。

【００５９】洗浄工程においても同様に、ディスペンサ
９により洗浄液を液体保持部内に滴下し、余剰の試料
液、標識試薬液を除去する。このような洗浄の工程は、
必要に応じて複数回繰り返してもよい。

【００６０】以上の結果、試料液中に微量物質が存在す
れば、フィルター上の試薬部領域に、微量物質を介して
標識試薬が結合した反応複合体が得られる。得られた反
応複合体の存在は、例えば図５に示されるように、フィ
ルター上の試薬部領域に光源１０から光を照射し、試薬
部領域からの蛍光や反射光を光検出器１１により検出す
ることにより確認され、これにより試料液中の微量物質
を検出することができる。この時、光を照射する検出領
域としては、反応セル内に配置された電極対間の撹拌領
域が好ましい。競争法の場合、液体保持部６に試料液と
標識試薬液を同時に滴下し、競争反応させる以外、洗浄
工程、検出は同様である。

【００６１】更に、微量物質の濃度が既知である標準試
料液により蛍光強度等の検量線を求めておけば、未知試
料液中の微量物質の定量も可能である。

【００６２】光源１０はキセノンランプ、ハロゲンラン
プ、タングステンランプ、ＬＥＤ等のノンコヒーレント
な光源や、レーザー光のようなコヒーレントな光源でも
よい。光検出器１１には、フォトマル、フォトダイオー
ド、フォトセル等を用いることができる。

【００６３】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。

【００６４】実施例１本実施例では、図６及び図７に示されるような反応セル
を用いて本発明の検出装置を構成した。

【００６５】図６はその斜視図であり、図７は断面図で
ある。先ず、本実施例における反応セルの作製方法を説
明する。

【００６６】厚さ３ｍｍで２０ｍｍ×３０ｍｍのアクリ
ル製の板１５に直径８ｍｍの穴をあけ、この上にセルロ
ース製のフィルター１６（厚さ：５００μｍ，直径：１
０ｍｍ，孔径：０．２μｍ）を接着して張りつけた。こ
の際、セルロース製のフィルター１６は予めヒトＣＲＰ
抗体（ＩｇＧ分画）で感作させておき、これによって固
相化試薬から成る試薬部領域を形成した。

【００６７】次に、先端が円錐形状の金−タングステン
ワイヤー（直径５０μｍ，先端径１０μｍ以下）から成
る電極１７，１７’を、フィルター１６上で８ｍｍ径の
穴の中心に２００μｍの先端間隔で対向させ、更にこの
上に３ｍｍ厚で直径８ｍｍの穴を有するアクリル板１８
を、電極１７，１７’を挟んで接着した。

【００６８】次に、この上に０．５ｍｍ厚で４ｍｍ径の
穴のあいたアクリル板１９をふた板として配置した。

【００６９】以上の様にして作製した反応セルを用いて
図８及び図９に示されるような構成を有する検出装置を
作製した。

【００７０】これらの図で２０は反応セル、２１はアー
ム、２２はディスペンサチップ、２３はＡｒイオンレー
ザー、２４は光電子増倍管、２５はラバーシート、２６
は集光レンズ、２７はダイクロミラー、２８は液体吸引
口、２９は電極用コンセント、３０，３１はファン、３
２は温度センサである。

【００７１】測定装置には反応セル２０の保持等の作業
が行なわれる作業空間３３があり、この中は空調機器か
らの一定温度の空気がファン３０，３１で循環し、温度
センサ３２からの信号で空調機器からの空気の温度や循
環量を制御することにより、所望の温度とすることがで
きる。

【００７２】図８は微量物質を含む試料液や標識試薬
液、洗浄液を反応セル２０に滴下する場合の説明図であ
る。ディスペンサの先端部は着脱可能な合成樹脂成形体
のディスペンサチップ２２から成り、液体の吸引、排出
を行い、液体の種類に応じてディスペンサチップ２２を
交換することにより、複数の液体間のコンタミネーショ
ンをなくしている。また、ディスペンサはアーム２１に
より反応セルの上方部と、滴下される液体が存在する容
器（不図示）の間を移動することができる。

【００７３】図９は反応セル内のフィルター上の試薬部
領域からの蛍光強度を測定する場合の説明図である。Ａ
ｒイオンレーザー２３からのレーザー光は、集光レンズ
２６により試薬部領域上に照射される。試薬部領域から
の蛍光及びレーザー光の散乱光は再度集光レンズ２６に
より集められ、ダイクロミラー２７により蛍光のみを反
射してレーザー光と分離した後、光電子増倍管２４に入
射して検出される。

【００７４】本実施例では、先ず、ヒトＣＲＰ抗体（Ｉ
ｇＧ分画）をフィルター上に感作させた反応セルを検出
装置のラバーシート２５上にセットする。この時、セル
内の電極は電圧印加用のコネクター２９と接続される。
次に、反応セルのふた板をスライドさせて液体保持部を
開き、ディスペンサにより微量物質を含む試料液２００
μｌを反応セルの液体保持部に滴下し、その後、反応セ
ルのふた板をスライドさせて閉じた。

【００７５】測定装置の作業空間３３の温度を３７℃に
保持しながら、反応セル内の電極間に１ＭＨｚ，±１２
Ｖの矩形波の電圧を印加して、フィルター上の試料液を
１５分間撹拌した。

【００７６】その後、電圧印加を中止し、フィルター裏
面より吸引してフィルター上の余剰の試料液を除去し
た。

【００７７】次に、ディスペンサによって蛍光標識試
薬、ＦＩＴＣ標識ヒトＣＲＰ抗体（ＩｇＧ分画）が０．
２ｍｇ／ｍリットルの濃度になるように、ｐＨ７．２の
リン酸塩緩衝液−生理食塩水（以下ＰＢＳと云う）に溶
解した標識試薬液２００μｌを、試料液と同様に滴下〜
除去までの工程を繰り返し行う。次に、洗浄液（ＰＢ
Ｓ）を１５０μｌ滴下し、洗浄液を同様にフィルター上
から除去する。洗浄液を用いたこの工程を３度繰り返し
洗浄を行い、最後にふた板をスライドさせて開けた後、
集光レンズをフィルター上の試薬部領域に移動し、Ａｒ
⁺ レーザー光を照射したところ試薬部領域からの蛍光が
得られ、試料液中の被測定物質を検出することができ
た。

【００７８】比較例１実施例１で試薬部領域に試料液を作用させ反応させる際
に、反応セル中の電極に電圧を印加しなかった以外は、
同様の操作を行なった。フィルター上の試薬部領域から
の蛍光強度を同様に測定したところ、実施例１の１／２
の強度しか得られなかった。同様の蛍光強度を得るため
には、反応の際の保持時間が実施例１の２倍必要であっ
た。

【００７９】実施例２図１０に示されるように、厚さ５００μｍのスチレンシ
ート３５（３０ｍｍ×４０ｍｍ）上に、電極パターン３
６，３７，３８，３９を印刷法により作成した。

【００８０】次に、図１０の点線で示した領域にヒトβ
２−マイクログロブリン抗体を固定化し、固相化試薬か
ら成る試薬部領域を形成した。

【００８１】次に、電極パターン３６，３７，３８，３
９の端部に金−タングステンワイヤ（直径５０μｍ，先
端径１０μｍ以下）電極４１，４２，４３，４４（対向
電極間距離１５０μｍ）を接続すると共に、この上に図
１１に示されるように、中心に６ｍｍ角の穴をあけた厚
さ３ｍｍのアクリル板４０（３０ｍｍ×３０ｍｍ）を配
置し、これらを接着して図１２に示されるような反応セ
ルを作製した。

【００８２】図１３及び図１４は本実施例で用いた検出
装置の構成を示したものである。

【００８３】反応セル４６は移動ステージ４７上にセッ
トされる。移動ステージ４７上には反応セルの４つの電
極端子と接続するコネクターが存在し、移動ステージ４
７から外部電源（不図示）へは、ケーブル５３によって
接続されている。また、移動ステージ４７内部にはヒー
ターがあり、一定の温度に保持ができる。

【００８４】図１３は、反応セル４６に液体を注入する
際の配置を示したものであり、ディスペンサ５２により
必要量の液体（試料液，試薬液等）が注入される。

【００８５】図１４は、反応セルの試薬部領域からの蛍
光強度を光学的に検出する際の配置を示したものであ
り、Ｘｅランプ４８からの光は、バンドパスフィルター
５４により必要な波長のみが選択され、集光レンズ４９
で試薬部領域に照射される。試薬部領域からの透過光及
び蛍光は集光レンズ４９’で集められ、バンドパスフィ
ルター５０で蛍光のみを透過させた後、光電子増倍管５
１により検出される。

【００８６】この検出装置を用いて、以下の実験を行な
った。

【００８７】先ず、図１３に示したような配置状態で被
測定物質を含む試料液１００μｌを反応セルに注入した
後、反応セルを検出装置の移動ステージ４７上にセット
し、反応セル内の対向する２対の電極間に１ＭＨｚ，±
１０Ｖの矩形波の電圧を８分間印加して撹拌を行なった
（この際、移動ステージの温度を３７℃に保持した）。

【００８８】次に、電圧印加を中断し、ディスペンサ５
２により余剰の試料液を除去し、続いてアルカリ性ホス
ファターゼを酵素標識したヒトβ２−マイクログロブリ
ン抗体（ボリクローナル抗体ＩｇＧ分画）１００μｌ
（濃度０．２ｍｇ／ｍリットル）を滴下して、再度、電
圧を印加して１５分間保持した。その後、同様にディス
ペンサ５２により余剰の標識試薬液を除去し、更に、同
様にＰＢＳで洗浄を２回行う。

【００８９】洗浄後に、４−メチルウンベリフェリルり
ん酸（４−ＭＵＰ）を含有する基質液１ｍリットルを滴
下して、電圧を３分間印加した後、移動ステージを移動
して図１４に示したような配置状態で、電極対間の試薬
部領域に生成している４−メチルウンベリフェロン（４
−ＭＵ）を、試薬部領域からの蛍光を前述した光学的検
知手段を用いて検出することにより、試料液中の被測定
物質を検出できた。

【００９０】比較例２実施例２で試薬部領域に試料液を作用させ反応させる際
に、反応セル中の電極に電圧を印加しなかった以外は、
同様に実験を行なったところ、検出された蛍光強度が実
施例２の３／４であった。

【００９１】同様の蛍光強度を得るためには、反応の際
の保持時間が実施例２の１．５倍必要であった。

【００９２】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
固相化試薬，試料液中の微量物質や検出試薬を結合させ
る反応工程や、さらには洗浄液による洗浄工程におい
て、電極近傍の微小領域の液体（試料液，試薬液，洗浄
液等）中のイオンに電磁気力を作用させることにより上
記液体を撹拌するため、反応及び洗浄を効率良く行うこ
とができ反応工程，洗浄工程に要する時間を短縮するこ
とができ、より短時間で微量物質を検出することができ
ると共に、微少量の試料液でも微量物質を検出できると
いう効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いることができる電極の構成例及び
液体撹拌方法の原理を説明するための図である。

【図２】本発明で用いることができる電極の他の構成例
を示す図である。

【図３】本発明の検出装置に用いられる反応セルの一構
成例を示す図である。

【図４】本発明の検出装置における液体の供給，排出例
を示す図である。

【図５】本発明の検出装置における光学的検出方法の例
を示す図である。

【図６】実施例１及び比較例１で用いた反応セルの斜視
図である。

【図７】図６の反応セルの断面図である。

【図８】実施例１及び比較例１で用いた本発明の検出装
置の液体供給時の配置構成を示す図である。

【図９】実施例１及び比較例１で用いた本発明の検出装
置の蛍光検出時の配置構成を示す図である。

【図１０】実施例２及び比較例２で用いた反応セル用の
電極パターン図である。

【図１１】実施例２及び比較例２で用いた反応セルの構
成図である。

【図１２】実施例２及び比較例２で用いた反応セルの全
体斜視図である。

【図１３】実施例２及び比較例２で用いた本発明の検出
装置の液体供給時の配置構成を示す図である。

【図１４】実施例２及び比較例２で用いた本発明の検出
装置の蛍光検出時の配置構成を示す図である。

【図１５】周期的に変動する電圧波形の例である。

【符号の説明】

１作用電極２磁界３電気力線４対向電極５反応セル６液体保持部７フィルター８試薬部領域９ディスペンサ１０光源１１光検出器１５アクリル板１６セルロースフィルター１７，１７’ 針電極１８アクリル板１９ふた板２０反応セル２１アーム２２ディスペンサチップ２３Ａｒイオンレーザー２４光電子増倍管２５ラバーシート２６集光レンズ２７ダイクロミラー２８液体吸引口２９電極用コンセント３０，３１ファン３２温度センサ３３作業空間３５ポリスチレンシート３６，３７，３８，３９電極パターン４０アクリル板４１，４２，４３，４４金−タングステンワイヤー４５検出装置４６反応セル４７移動ステージ４８Ｘｅランプ４９，４９’ 集光レンズ５０，５４バンドパスフィルター５１光電子増倍管５２ディスペンサ５３ケーブル

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料液中の微量物質と選択特異的に結合
する生体関連物質を固体材料に担持している固相化試薬
に対して、該微量物質及び／または１種類以上の検出試
薬によって反応結合体を形成させることにより上記微量
物質を検出する方法であって、上記試料液、検出試薬液
はイオン導電性を有し、該イオン導電性を有する液体を
電極対の間に導入し、該電極対間に周期的に変動する電
圧を印加して、上記液体を撹拌しながら上記固相化試
薬、微量物質、検出試薬の反応工程を行うことを特徴と
する微量物質の検出方法。
【請求項２】前記反応工程の後、イオン導電性を有す
る洗浄液による洗浄行程を有し、洗浄液を前記電極対の
間に導入し、該電極対間に周期的に変動する電圧を印加
して、洗浄液を撹拌しながら洗浄工程を行うことを特徴
とする請求項１記載の微量物質の検出方法。
【請求項３】検出試薬の内、少なくとも１つが標識物
質を有する標識試薬であることを特徴とする請求項１又
は２記載の微量物質の検出方法。
【請求項４】前記電極対間の固相化試薬上に結合した
反応結合体中の標識物質を検出することを特徴とする請
求項３記載の微量物質の検出方法。
【請求項５】検出試薬の内、少なくとも１つが前記微
量物質と選択特異的に結合する試薬であることを特徴と
する請求項１〜４いずれかに記載の微量物質の検出方
法。
【請求項６】検出試薬の内、少なくとも１つが前記固
相化試薬と選択特異的に結合する試薬であることを特徴
とする請求項１〜４いずれかに記載の微量物質の検出方
法。
【請求項７】前記周期的に変動する電圧が交番電圧で
あることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の微
量物質の検出方法。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の微量物
質の検出方法を実施するための装置であって、前記電極
対を少なくとも１組以上設けた反応セルと、該電極対間
に周期的に変動する電圧を印加する電源手段と、上記反
応セル内の反応結合体中の標識物質を検出する手段を具
備することを特徴とする微量物質の検出装置。
【請求項９】前記検出手段が、光学的な検出手段であ
ることを特徴とする請求項８記載の微量物質の検出装
置。