JPH06205672A - 日本脳炎ウイルス及びｂ型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質の抗原部位を持つキメラタンパク質の製造法、およびそれに用いる組み換えバキュロウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ウイルス用多価ワクチン用キメラタンパク質
の大量産生方法及び同方法に使用する組み換えバキュロ
ウイルスの提供。 【構成】 日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡの一部分をＢ型肝炎ウイルス表面抗原
タンパク質をコードするＤＮＡを融合させて得られたＤ
ＮＡをバキュロウイルスのゲノムの非必須領域に挿入し
て組み換えバキュロウイルスを作製する。かくして得ら
れた組み換えバキュロウイルスを培養させて多価ワクチ
ンを発現させる。 【効果】 多価ワクチンとして利用可能なキメラタンパ
ク質が多量に産生される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組み換えＤＮＡ技術によ
って作られた新規なキメラタンパク質に関する。さらに
詳しくは日本脳炎とＢ型肝炎という二つの異なるウイル
スの表面抗原タンパク質の抗原部位を有するキメラタン
パク質に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】日本脳炎に対するワクチンとしては、従
来、不活化日本脳炎ウイルスを有効成分とするワクチン
が用いられており、健康なマウス脳内に日本脳炎ウイル
ス中山予研株を接種し、発症したマウスから脳を無菌的
に採取し、アルコール・プロタミン法により精製、不活
化して不活化日本脳炎ウイルスワクチン原液を得ている
（国立予防衛生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂
２版、昭和５２年１月２０日丸善株式会社発行）。この
ようなワクチンの製造法においては、大量の日本脳炎ウ
イルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担当者
にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高かっ
た。

【０００３】一方Ｂ型肝炎ワクチンは患者の血液から精
製した表面抗原タンパク質（Ｓタンパク質またはＨＢｓ
Ａｇと表記する事もある）からなる粒子が用いられてい
る。この製造法においても大量の患者血液を必要とする
ためワクチン製造担当者にとってはウイルス感染の危険
性が高い上、生ウイルスの混入の危険性も捨てきれな
い。組み換えＤＮＡ技術によって安全で安価なワクチン
を開発する研究が進み、Ｂ型肝炎ワクチンにおいてはＨ
ＢｓＡｇからなるワクチンを酵母菌で生産することに成
功した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８０，１−５（１９８３）、Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒ
ａら）。この酵母でつくらせたワクチンは血液由来のワ
クチンと同じ直径２２ｎｍの粒子となっていることが電
子顕微鏡写真によって示された。また組み換えウイルス
技術によってワクシニアウイルスや昆虫ウイルスベクタ
ーを用いて培養細胞でＨＢｓＡｇを発現させる事ができ
た（Ｎａｔｕｒｅ、２９８，３４７−３５０（１９８
２）、Ｇ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，
１５４９−１５５７（１９８９）、Ｒ．Ｌａｎｆｏｒｄ
ら）。

【０００４】一方日本脳炎ワクチンにおいても組み換え
ウイルス技術によってワクシニアウイルスや昆虫ウイル
スベクターを用いて培養細胞で日本脳炎ウイルスの表面
抗原タンパク質（ＪＥ−Ｅと表記する事もある）を発現
させる事ができた（特開昭６４−７４９８２，特開平１
−２８５１９８）。また組み換えＤＮＡ技術によって一
度の免疫で複数の感染症に対する防御効果のあるワクチ
ンの開発も可能になった。複数の抗原を有する組み換え
ワクシニアウイルスの構築（Ｇｅｎｅ、６８，１−１０
（１９８８）、Ｂ．Ｅ．Ｈ．Ｃｏｕｐａｒら）や複数の
抗原部位を持つキメラタンパク質の発現（ＢＩＯＴＥＣ
ＨＮＯＬＯＧＹ、３，３２３−３２６（１９８５）、
Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）が試みられた。しかしな
がら実際にキメラタンパク質を作ってみるとタンパク質
の高次構造の為に抗原性を持たなかったり、宿主のタン
パク質分解酵素による分解の為タンパク質自体が得られ
ない場合も多かった。

【０００５】そして、発明者らは、日本脳炎ウイルスと
Ｂ型肝炎ウイルスの両方の表面抗原タンパク質の抗原部
位を有するキメラタンパク質を組み換えワクチニアウイ
ルスにより発現させることに成功した（財団法人ヒュー
マンサイエンス振興財団発行の平成２年度官民共同プロ
ジェクト研究報告）。しかし、組み換えワクチニアウイ
ルスを用いた場合、キメラタンパク質の発現量が低く、
ワクチンとして充分な効果が期待できなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
かかる従来技術の下で、日本脳炎ウイルスとＢ型肝炎ウ
イルス２価ワクチンの開発を目指して鋭意検討を進めた
結果、日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質をコード
するＤＮＡの一部分をＢ型肝炎ウイルスの表面抗原タン
パク質をコードするＤＮＡに融合させた遺伝子を組み換
えバキュロウイルスによって発現させた場合に日本脳炎
ウイルスとＢ型肝炎ウイルスの両方の抗原性を有するキ
メラタンパク質が大量に産生され、更にキメラタンパク
質が培養上清に分泌されることを見い出し、本発明を完
成させるに至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、日本脳炎ウイルスとＢ型肝炎ウイルスの両方の表面
抗原タンパク質の抗原部位を持つキメラタンパク質を発
現する組み換えバキュロウイルス及び同タンパク質の製
造法が提供される。本発明において組み変えバキュロウ
イルスの作製に供されるウイルスは特に限定されない
が、例えばオートグラフア・カリフオルニカ（Ａｕｔｏ
ｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、トリコプルシ
ア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、ラキブルシ
ア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｏｕ）、ガレリア
・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌ
ａ）、あるいはボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍ
ｏｒｉ）などが例示される。これらのウイルスの中でも
オートグラフア・カリフオルニカ（以下、ＡｃＮＰＶと
略す）が好適である。これらのウイルスは従来から広く
研究されてきたものであり、そのサンプルは米国コネチ
カット州のエール大学アーボヴィラスリサーチユニット
をはじめ多くの入手源から得ることができる。

【０００８】日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質を
コードするｃＤＮＡは、例えば前記中山予研株やＪａＯ
Ａｒ株（米国コネチカット州のエール大学アーボヴイラ
スリサーチユニット）、Ｓａｇａｙａｍａ株（同所）を
用いて調製することができる。例えば上記Ｓａｇａｙａ
ｍａ株から調製されたｃＤＮＡ５０３７は特開昭６４−
７４９８２号の実施例で開示されているが、本発明にお
いては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を有する範囲
において、修飾されたｃＤＮＡ（即ち、塩基配列が置
換、挿入、欠失したもの）であってもよい。もちろん、
実質的に同一の機能を有するかぎり、アミノ酸配列が異
なる程度に修飾されたものであってもよい。Ｂ型肝炎ウ
イルスの表面抗原タンパク質をコードするｃＤＮＡは大
腸菌でクローニングされており、例えばｐＢＲＨＢａｄ
ｒ７２（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ、
１１，４６０１−４６１０（１９８３））が例示され
る。

【０００９】組み変えウイルスの作製に当たっては、ま
ずバキュロウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域を組み
込んだ第一の組み換えベクターが作製される。この場
合、前記領域にバキュロウイルス内で機能するプロモー
ターを存在させることが必要であり、さらにプロモータ
ーの下流に適当な制限酵素切断配列を有する合成リンカ
ーを挿入することが好ましい。ここで言う増殖に非必須
なＤＮＡ領域とは、外来性ＤＮＡの挿入による変異を受
けても実質上ウイルスの増殖に影響を及ぼさない領域を
言う。

【００１０】また、バキュロウイルス内で機能するプロ
モーターとは、合成、天然を問わずウイルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいかなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は、バキュロウイルスのポリヘドリンをコードする遺伝
子のプロモーターなどが例示される。

【００１１】第一の組み変えベクターの作製は常法（例
えば特開昭６０−３７９８８号、同６１−５７８７号な
ど）に従って行うことができ、例えば次のようにして行
われる。ポリヘドリン遺伝子を有するＤＮＡをバキュロ
ウイルスＡｃＮＰＶから単離し、精製する。次いでＥｃ
ｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化すると、ポリヘド
リン遺伝子を含む７．３キロベースＥｃｏＲＩ−Ｉ断片
及びその他の適当な断片を生成する。上記ＥｃｏＲＩ−
Ｉ断片を、その後適当なクローニングプラスミドのＥｃ
ｏＲＩ部位にクローン化する。この系の場合にはポリヘ
ドリン遺伝子のプロモーターが非必須領域内に存在して
おり、このプロモーターが第二の組み換えベクターにお
いても有効に機能する。

【００１２】また発現量を増加させるめたには、ポリヘ
ドリン遺伝子プロモーターとポリヘドリン遺伝子の５′
非翻訳領域の直後に制限酵素切断配列を付加し、ポリヘ
ドリンの構造遺伝子配列を完全に欠失させ、ポリヘドリ
ンの３′非翻訳領域が続いているベクターを用いること
が好ましい。この様な組み換えベクターとしてｐＡｃＹ
ＭＳ１（特開平１−２８５１９８）が挙げられる。

【００１３】次に挿入するキメラタンパク質の遺伝子が
作製される。キメラタンパク質の遺伝子作製にあたって
用いられるベクターは特に限定されないが遺伝子操作の
容易な大腸菌ベクター、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３
２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ
８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９などのごときプラスミドが例
示される。キメラタンパク質をコードする遺伝子の作製
方法は、遺伝子が日本脳炎ウイルスとＢ型肝炎ウイルス
の両方の表面抗原タンパク質の抗原部位を持つ一つのタ
ンパク質として翻訳されるように同じ読み枠でつながっ
ている限りにおいて特に限定されない。通常、二つの抗
原タンパク質をコードする遺伝子間に翻訳停止コドン存
在しないように、合成リンカーによって接続すればよ
い。

【００１４】次いで、第一の組み換えベクターのプロモ
ーターの下流にキメラタンパク質の遺伝子を挿入して第
二の組み換えベクターが作製される。挿入方法もまた常
法に従えば良く、例えば第一のベクターのプロモーター
の下流にある人為的に付与された制限酵素切断点を利用
してキメラタンパク質の遺伝子断片を挿入すれば良い。
これら第一及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子の操作の容易な大腸菌の系を用いれば良い。

【００１５】次に組み換えウイルスを構築する。組み換
えバキュロウイルスの構築にあたってはバキュロウイル
スのゲノムＤＮＡと第二の組み換えベクターを混合した
のち、昆虫培養細胞に移入し、ベクターＤＮＡとウイル
スゲノムＤＮＡの間に相同組み換えを起こさせる。組み
換えバキュロウイルスの構築に当たっては常法に従えば
良く、例えば特開昭６０−３７９８８号の実施例の記述
に準じて以下のごとき手順に従って実施できる。即ち第
二の組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡをトラ
ンスフェクションし、得られる組み換えバキュロウイル
スを含むウイルス集団を回収し、それをＬ．Ｅ．ボルク
マンら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９，８２０−８３２（１９
７６））に記載されている標準的ＡｃＮＰＶポリヘドリ
ンプラークアッセイにかけ、発達したプラーク群のうち
から封入体を生成しないプラークを組み換えウイルス候
補株として選択し、そのプラークからウイルスを採取す
る。これら候補株の内からキメラタンパク質をコードす
る遺伝子が組み込まれたウイルスを選択する方法は、該
遺伝子をプローブとするハイブリダイゼーション法を利
用してプラークを純化する。

【００１６】こうして純化した組み換えウイルスを昆虫
培養細胞に感染させる。ここで用いられる昆虫培養細胞
は、バキュロウイルスが増殖可能なものであれば良く、
その具体例として、例えばスポドプテラ・フルギペルダ
由来のＳｆ−９細胞などが挙げられる。次いで感染細胞
ライセート中に目的の抗原性を有するキメラタンパク質
が発現しているかどうかを確認する。この方法は日本脳
炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスに対する抗血清ある
いはモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイを利用
すれば良い。例えば、免疫沈降法（“Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”ｐｐ
４２１−４７０，（１９８８）、ＥｄＨａｒｌｏｗ ｅ
ｔ．ａｌ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などが例示される。

【００１７】

【発明の効果】かくして本発明によれば、日本脳炎ウイ
ルスとＢ型肝炎ウイルスの両方の表面抗原タンパク質の
抗原部位を持つキメラタンパク質およびそのタンパク質
を発現する組み換えバキュロウイルスが得られる。この
キメラタンパク質は二価ワクチンとして有用である。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。実施例１ キメラタンパク質をコードする遺伝子の作製 （１）キメラタンパク質Ｒ３：Ｓ（図１〜３参照） ＤＮＡ合成機Ｇｅｎｅｔ−ＩＩ（日本ゼオン社製）を使
用して配列番号１および２記載のＤＮＡプライマーを合
成し、精製した。得られた合成プライマーをそれぞれＰ
−Ｒ３Ｒ（配列番号１）、Ｐ−Ｒ３Ｌ（配列番号２）と
命名した。

【００１９】配列番号１及び配列番号２はそれぞれ以下
の通りである。

【００２０】

【化１】

【００２１】

【化２】

【００２２】これらの合成プライマーを用いて、特開昭
６４−７４９８２に開示された日本脳炎ウイルスのＣタ
ンパク質の一部、ｐｒＭ（Ｍ）タンパク質、Ｅタンパク
質、及びＮＳ１タンパク質の一部をコードした３．２Ｋ
ｂｐのｃＤＮＡ（２０３）をテンプレートとしてＰＣＲ
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１
５５，３３５−３５０（１９８７）、使用する酵素類は
宝酒造から販売されている。）で遺伝子を増幅し、ｐＵ
Ｃ１９にクローニングした。得られたプラスミドをｐＵ
ＣＲ３と命名した。このｐＵＣＲ３にクローニングされ
た遺伝子は、日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質の
一部をコードしている。

【００２３】次に、配列番号３および４記載のＤＮＡプ
ライマーを合成し、精製した。得られた合成プライマー
をそれぞれＰ−ＨＢＲ（配列番号３）、Ｐ−ＨＢＬ（配
列番号４）と命名した。配列番号３及び配列番号４はそ
れぞれ以下の通りである。

【００２４】

【化３】

【化４】

【００２５】これらの合成プライマーを用いて、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１、１７
４７−１７５７（１９８３）に開示されたＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原タンパク質をコードしたＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＢＲＨＢａｄｒをテンプレートとし、前述と
同様の方法により遺伝子を増幅し、ｐＵＣ１９にクロー
ニングした。得られたプラスミドをｐＵＣＨＢと命名し
た。ｐＵＣＨＢにクローニングされた遺伝子は、Ｂ型肝
炎ウイルスの表面抗原タンパク質をコードしている。

【００２６】得られたｐＵＣＲ３およびｐＵＣＨＢを、
それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで二重切断して
回収したＤＮＡ断片をライゲーションし、ｐＵＣ１９の
ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、数種類のプラスミドを作製
した。これらのプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質転
換し、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断される遺伝
子断片の大きさを調べることによって日本脳炎ウイルス
の表面抗原タンパク質の一部とＢ型肝炎ウイルスの表面
抗原タンパク質を遺伝子を有するプラスミドを選択し
た。選択したプラスミドをｐＵＣＲ３：Ｓと命名した。
このプラスミドが有するキメラタンパク質をコードする
遺伝子（以下、Ｒ３：Ｓという）の塩基配列およびそれ
に対応するアミノ酸配列（配列番号５）を、図１〜３に
示す。

【００２７】（２）キメラタンパク質Ｒ２−３：Ｓ（図
４〜８参照） 合成プライマーとしてＰ−Ｒ３Ｒの代わりにＰ−Ｒ２Ｒ
（配列番号６）を使用するほかは、上記（１）記載の方
法により、日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質の一
部をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド（ｐＵＣＲ
２−３）を作製した。尚、配列番号６は以下の通りであ
る。

【００２８】

【化５】

【００２９】続く操作は、プラスミドがｐＵＣＲ３の代
わりにこのｐＵＣＲ２−３を使用するほかは上記（１）
と同様の操作により数種類のプラスミドを作製し、更に
上記（１）と同様に大腸菌に形質転換し、日本脳炎ウイ
ルスの表面抗原タンパク質の一部とＢ型肝炎ウイルスの
表面抗原タンパク質を遺伝子を有するプラスミドを選択
した。選択したプラスミドをｐＵＣＲ２−３：Ｓと命名
した。このプラスミドが有するキメラタンパク質をコー
ドする遺伝子（以下、Ｒ２−３：Ｓという）の塩基配列
およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号７）を、
図４〜８に示す。

【００３０】（３）キメラタンパク質Ｒ２：Ｓ（図９〜
１２参照） 合成プライマーとしてＰ−Ｒ３Ｌの代わりに、Ｐ−Ｒ２
Ｌ（配列番号８）を使用するほかは、上記（２）記載の
方法により、日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質の
一部をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド（ｐＵＣ
Ｒ２）を作製した。

【００３１】

【化６】

【００３２】続く操作は、プラスミドがｐＵＣＲ３の代
わりにこのｐＵＣＲ２を使用する以外は、上記（１）と
同様の操作により数種類のプラスミドを作製し、更に上
記（１）と同様に大腸菌に形質転換し、日本脳炎ウイル
スの表面抗原タンパク質の一部とＢ型肝炎ウイルスの表
面抗原タンパク質を遺伝子を有するプラスミドを選択し
た。選択したプラスミドをｐＵＣＲ２：Ｓと命名した。
このプラスミドが有するキメラタンパク質をコードする
遺伝子（以下、Ｒ２：Ｓという）の塩基配列およびそれ
に対応するアミノ酸配列（配列番号９）を、図９〜１２
に示す。

【００３３】（４）キメラタンパク質Ｅ２９１／４５
１：Ｓ（図１３〜１６参照） 合成プライマーとしてＰ−Ｒ３Ｒの代わりにＰ−２９１
Ｒ（配列番号１０）を使用するほかは、上記（１）記載
の方法により、日本脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質
の一部をコードするｃＤＮＡを有するプラスミド（ｐＵ
ＣＥ２９１／４５１）を作製した。尚、配列番号１０は
以下の通りである。

【００３４】

【化７】

【００３５】続く操作は、プラスミドがｐＵＣ３の代わ
りにこのｐＵＣＥ２９１／４５１を使用する以外は、上
記（１）と同様の操作により数種類のプラスミドを作製
し、更に上記（１）と同様に大腸菌に形質転換し、日本
脳炎ウイルスの表面抗原タンパク質の一部とＢ型肝炎ウ
イルスの表面抗原タンパク質を遺伝子を有するプラスミ
ドを選択した。選択したプラスミドをｐＵＣＥ２９１／
４５１：Ｓと命名した。このプラスミドが有するキメラ
タンパク質をコードする遺伝子（以下、Ｅ２９１／４５
１：Ｓという）の塩基配列およびそれに対応するアミノ
酸配列（配列番号１１）を、図１３〜１６に示す。

【００３６】実施例２ キメラタンパク質をコードする遺伝子を挿入した第二の
組み換えベクターの作製 特開平第１−２８５１９８号の実施例２の記載に従って
バキュロウイルスの増殖に非必須なＤＮＡ領域が組み込
まれ、更にそのＤＮＡ領域にバキュロウイルスで機能す
るプロモーターが挿入された第一の組み換えベクターｐ
ＡｃＹＭＳ１を作製した。このｐＡｃＹＭＳ１を制限酵
素ＢａｍＨＩで切断し、実施例１（１）〜（４）で作製
したプラスミドｐＵＣＲ３：Ｓ、ｐＵＣＲ２−３：Ｓ、
ｐＵＣＲ２：Ｓ、およびｐＵＣＥ２９１／４５１：Ｓを
それぞれ、ＢａｍＨＩで処理して得られたキメラ遺伝子
Ｒ３：Ｓ、Ｒ２−３：Ｓ、Ｒ２：Ｓ、およびＥ２９１／
４５１：ＳをＴ４ＤＮＡリガーゼを使ってそれぞれ挿入
した。得られた各プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に形質
転換した。得られた数個の形質転換株からプラスミドを
単離精製し、ｐＡｃＹＭＳ１のＢａｍＨＩ部位に、接続
された遺伝子が正方向（ポリヘドリンプロモーターの転
写方向と同方向に遺伝子の翻訳方向が向いている場合を
正方向という）に接続されているプラスミドを適当な制
限酵素を用いた切断パターンの結果より選択する。こう
して得た第２の組み換えベクターをそれぞれｐＡｃＲ
３：Ｓ、ｐＡｃＲ２−３：Ｓ、ｐＡｃＲ２：Ｓ、ｐＡｃ
Ｅ２９１／４５１：Ｓと命名した。

【００３７】実施例３ キメラタンパク質を発現する組み換えバキュロウイルス
の構築 Ｆ．Ｌ．グラハムらの論文（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻
１９７３年４５６−４６７頁）に記載されている方法に
準じ、ＡｃＮＰＶのゲノムＤＮＡ１μｇを実施例２で作
製した第２の組み換えベクターｐＡｃＲ３：Ｓまたはｐ
ＡｃＲ２−３：ＳまたはｐＡｃＲ２：ＳまたはｐＡｃＥ
２９１／４５１：Ｓ（各１０μｇ）と混合し、１５μｇ
／ｍｌの仔牛胸腺ＤＮＡを含む、１−ＨＥＰＥＳ（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて、全量を９５
０μｌにした。この混合物を攪拌しながら、５０ｍｌの
２．５Ｍ ＣａＣｌ₂ を滴下し、室温下でＤＮＡを沈澱
させた。沈澱したＤＮＡ１ｍｌを、昆虫培養細胞Ｓ．フ
ルギペルダの細胞Ｓｆ−９、４×１０⁶ を含む２ｍｌの
培地に添加した。

【００３８】４時間後、細胞を培地で洗浄し、１０％ウ
シ胎児血清を含む２ｍｌの培地を加えて、２８℃で３日
間インキュベートした。その後、培地を滅菌ピペットで
集めるが、この培地中には組み換え及び非組み換えＡｃ
ＮＰＶが混じっている。これら混合集団より、組み換え
ＡｃＮＰＶを単離するため、集めた培地を適当に希釈
し、単層培養したＳ．フルギペルダＳｆ−９に希釈液を
感染させ、プラークを形成せしめた。ウイルス封入体を
形成しないプラークを選び、そのプラークからウイルス
を回収しこれをＰＢＳ（ｐＨ７．０）に懸濁し、一部は
ドットハイブリダイゼーションをするため、ナイロン又
はニトロセルロースメンブレンにスポットし、一部は、
再びＳ．フルギペルダに感染させ、ウイルスを増やし
た。

【００３９】スポットしたメンブレンは０．５Ｎ Ｎａ
ＯＨで１０分間、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）
で５分の処理を３回繰り返した後、１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で５分処
理した。２倍ＳＳＣ（１倍ＳＳＣは、０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で飽和させ、
８０℃、２時間焼き付けた。６倍ＳＳＣ、２％スキムミ
ルク、０．１％ＳＤＳで６８℃、２時間浸した。６倍Ｓ
ＳＣ、２％スキムミルク、０．１％ＳＤＳ、５０μｇ／
ｍｌ変形サケ精子ＤＮＡとニックトランスレーションに
よって³²Ｐで標識したＲ３：Ｓ遺伝子断片を入れて６８
℃、１４時間ハイブリダイゼーションした。

【００４０】洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重
ね、オートラジオグラフィーを行い、フィルムが黒化す
るスポットを選択した。黒化したスポットに対応するウ
イルス液を、再度、適当に希釈してＳ．フルギペルダの
細胞Ｓｆ−９に感染させ、プラークを出現させた。出現
するプラークについて上記と同様な操作を行い、出現す
るプラークが全て、ドットハイブリダイゼーションで黒
化するまで純化の操作をくり返した。こうして得られた
ウイルスは目的の組み換えバキュロウイルスであり、用
いた第２の組み換えベクターそれぞれＡｃＲ３：Ｓ、Ａ
ｃＲ２−３：Ｓ、ＡｃＲ２：Ｓ、ＡｃＥ２９１／４５
１：Ｓと命名した。

【００４１】実施例４ 発現したキメラタンパク質の解析 （１）組み換えバキュロウイルスで産生させたキメラタ
ンパク質の大きさ Ｓ．フルギペルダの細胞（Ｓｆ−９）を単層において５
×１０⁶ 細胞／ｍｌの密度まで生育させ、生育培地を除
去し、細胞当り５ｐ．ｆ．ｕ．の組み換えバキュロウイ
ルスＡｃＲ２−３：Ｓを含む培地を加えて２８℃で感染
させた。感染後３日間細胞を培養し、感染細胞内におい
てキメラタンパク質を発現させた。発現タンパク質の分
子量は、ＪＥ−Ｅに対する兎抗血清を用いたウエスタン
プロット法（バーネット、Ｗ．Ｎ．Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１１２巻、１９５−２０３（１９８１））
により調べた。その結果、ＡｃＲ２−３：Ｓ感染細胞
は、分子量約５２，０００ダルトンのタンパク質を産生
していることが判明した。この分子量はキメラタンパク
質のアミノ酸配列から推定される分子量と同じである。

【００４２】（２）組み換えバキュロウイルスで産生さ
せたキメラタンパク質Ｒ３：Ｓの大きさ 用いる組み換えバキュロウイルスがＡｃＲ２−３：Ｓの
代わりにＡｃＲ３：Ｓであること、発現タンパク質の確
認方法が、ＪＥ−Ｅに対する兎抗血清を用いた免疫沈降
法（“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ”ｐｐ４２１−４７０（１９８８）、
Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ．ａｌ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｔｙ）であ
ること以外は上記実施例４（１）と同様の操作を繰り返
し、発現タンパク質を確認した。得られた沈降物をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子
量３４，０００ダルトンと３７，０００ダルトンの２本
の特異的なバンドが出現した。この分子量はキメラタン
パク質の推定分子量３４，０００ダルトンとそれに糖鎖
がついた３７，０００ダルトンの大きさと一致してお
り、予定通りのキメラタンパク質が産生されている事を
確認した。

【００４３】（３）組み換えバキュロウイルスで発現さ
せたキメラタンパク質Ｒ２：Ｓの大きさ 用いる組み換えバキュロウイルスがＡｃＲ２：Ｓである
こと以外は、実施例４（１）と同様の方法によりキメラ
タンパク質発現させ、発現タンパク質の分子量を調べ
た。その結果、分子量約４０，０００ダルトンのタンパ
ク質を産生していることが判明した。この分子量は、キ
メラタンパク質のアミノ酸配列から推定される分子量と
同じであった。

【００４４】（４）組み換えバキュロウイルスで発現さ
せたキメラタンパク質Ｅ２９１／４３５：Ｓの大きさ 用いる組み換えバキュロウイルスがＡｃＥ２９１／４３
５：Ｓであること以外は、実施例４（１）と同様の方法
によりキメラタンパク質を発現させ、発現タンパク質の
分子量を調べた。その結果、分子量約３６，０００ダル
トンのタンパク質を産生していることが判明した。この
分子量は、キメラタンパク質のアミノ酸配列から推定さ
れる分子量と同じであった。

【００４５】（５）組み換えバキュロウイルスで産生さ
せたキメラタンパク質Ｒ３：Ｓ、Ｒ２−３：Ｓの抗体と
の反応性 Ｓ．フルギペルダの細胞Ｓｆ−９に組み換えバキュロウ
イルスＡｃＲ３：ＳおよびＡｃＲ２−３：Ｓをそれぞれ
感染させ６０時間後、細胞を集めＰＢＳ（ｐＨ７．０）
で洗浄し、ＰＢＳで懸濁した後、蛍光抗体用マイクロス
ライドのウエルにスポットして風乾した。この細胞を−
２０℃アセトンに５分浸した後、２％スキムミルクの入
ったＰＢＳに１時間浸してブロッキングした後、２％ス
キムミルクの入ったＰＢＳで適当に希釈した各１次抗体
（第１表記載の兎抗血清またはモノクローナル抗体）に
１時間浸して反応させた。その後ＰＢＳで洗浄し、ＰＢ
Ｓで希釈した２次抗体（イソチアン酸フルオレセイン結
合抗兎ＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧ）に１時間浸し、Ｐ
ＢＳで洗浄後カバーグラスを乗せ、蛍光顕微鏡で１次抗
体との反応性を調べた。その結果を表１にまとめた。

【００４６】

【００４７】使用したＪＥ−Ｅ（日本脳炎ウイルスのＥ
タンパク質）に対するモノクローナル抗体の調製は
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５，１２４−１３２（１９８
３）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７，２６６３−２６
７２（１９８６））の記載によった。またＨＢｓＡｇに
対するモノクローナル抗体０３−６４００はコスモバイ
オ株式会社（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎ
ｃ．製造）から市販されているものを使用した。表１か
らわかるように、キメラタンパク質Ｒ２−３：ＳとＲ
３：ＳはＪＥ−Ｅに対する９種類の独立したモノクロー
ナル抗体のうちそれぞれ４種類、１種類が反応した。ま
たＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体とも反応した
ので日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスという２つの
ウイルス表面抗原タンパク質の抗原部位が形成されてい
ることがわかる。

【００４８】（６）組み換えバキュロウイルスで発現さ
せたキメラタンパク質Ｒ２：Ｓ、Ｅ２９１／４５１：Ｓ
の抗体との反応性 用いた組み換えバキュロウイルスがＡｃＲ３：Ｓおよび
ＡｃＲ２−３：Ｓの代わりに、ＡｃＲ２：ＳおよびＡｃ
Ｅ２９１／４５１：Ｓである以外は、実施例４（５）と
同様の方法によりキメラタンパク質を発現させ、第１次
抗体との反応性を調べた。その結果を表２に示す。

【００４９】

【００５０】表２からわかるように、キメラタンパク質
Ｒ２：ＳとＥ２９１／４５１：ＳはＪＥ−Ｅに対する抗
血清とＨＢｓＡｇに対するモノクローナル抗体とも反応
したので日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスという２
つのウイルス表面抗原タンパク質の抗原部位が形成され
ていることが確認された。

【００５１】（７）組み換えバキュロウイルスで産生さ
せたキメラタンパク質Ｒ３：Ｓの細胞外への分泌 Ｓ．フルギペルダの細胞を単層において５×１０⁶ 細胞
／ｍｌの密度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当
り５ｐ．ｆ．ｕ．のＡｃＲ２−３：ＳまたはＡｃＲ３：
Ｓを含む培地を加えて２８℃で感染させた。感染後３日
間細胞を培養し、その培養上清に分泌したキメラタンパ
ク質をＨＢｓＡｇ抗原検出キットであるオースザイム
（ダイナボット株式会社）で測定した。その結果を表３
に示す。

【００５２】

【００５３】表３から明らかなようにＡｃＲ３：Ｓの産
生するキメラタンパク質Ｒ３：Ｓは培養上清に大量に分
泌された。この分泌されたキメラタンパク質はショ糖密
度勾配遠心分離によって密度およそ１．０７の粒子とな
っている事がわかった。

【００５４】比較例１ （１）キメラタンパク質を発現する組み換えワクシニア
ウイルスの構築 実施例１で作製したキメラタンパク質Ｒ３：ＳおよびＲ
２−３：Ｓの遺伝子をｐＡＫ８（特開昭６４−７４９８
２に記載）のＢａｍＨＩサイトに、それぞれ正方向に挿
入した。得られた組み換えベクターをそれぞれｐＡＫＲ
３：ＳおよびｐＡＫＲ２−３：Ｓと命名した。これらの
組み換えベクターをトランスフェクションして組み換え
ワクシニアウイルスを作製した。作製方法はトランスフ
ェクションしたプラスミド以外は特開昭６４−７４９８
２の実施例１（８）の方法と同じ方法によった。ウイル
スの純化に用いたＤＮＡプローブはＲ３：Ｓの遺伝子で
あり、それぞれ目的の組み換えワクシニアウイルスＬＡ
Ｒ３：Ｓ、ＬＡＲ２−３：Ｓが得られた。

【００５５】（２）組み換えワクシニアウイルスで産生
させたキメラタンパク質Ｒ３：Ｓ、Ｒ２−３：Ｓの細胞
外への分泌 Ｖｅｒｏ細胞を単層において５×１０⁶ 細胞／ｍｌの密
度まで生育させ、生育培地を除去し、細胞当たり５ｐ．
ｆ．ｕ．のＬＡＲ３：ＳまたはＬＡＲ２−３：Ｓを含む
培地を加えて３７℃で感染させた。感染後２日間細胞を
培養し、その培養上清に分泌したキメラタンパク質をＨ
ＢｓＡｇ抗原検出キットであるオースザイム（ダイナボ
ット株式会社）で測定した。その結果を表４に示す。

【００５６】

【００５７】表３と表４の比較から明らかなように同じ
キメラタンパク質を発現させても組み換えバキュロウイ
ルスの方が組み換えワクシニアウイルスよりもずっと大
量のタンパク質を培養上清に分泌した。このことは組み
換えバキュロウイルスのほうがキメラタンパク質を製造
・精製するのが容易であるという優位性を示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】キメラタンパク質Ｒ３：Ｓの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列（配列番号５）である。

【図２】キメラタンパク質Ｒ３：Ｓの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列（配列番号５）である。

【図３】キメラタンパク質Ｒ３：Ｓの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列（配列番号５）である。

【図４】キメラタンパク質Ｒ２−３：Ｓの塩基配列およ
びそれに対するアミノ酸配列（配列番号７）である。

【図５】キメラタンパク質Ｒ２−３：Ｓの塩基配列およ
びそれに対するアミノ酸配列（配列番号７）である。

【図６】キメラタンパク質Ｒ２−３：Ｓの塩基配列およ
びそれに対するアミノ酸配列（配列番号７）である。

【図７】キメラタンパク質Ｒ２−３：Ｓの塩基配列およ
びそれに対するアミノ酸配列（配列番号７）である。

【図８】キメラタンパク質Ｒ２：Ｓの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。

【図９】キメラタンパク質Ｒ２：Ｓの塩基配列およびそ
れに対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。

【図１０】キメラタンパク質Ｒ２：Ｓの塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。

【図１１】キメラタンパク質Ｒ２：Ｓの塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。

【図１２】キメラタンパク質Ｒ２：Ｓの塩基配列および
それに対応するアミノ酸配列（配列番号９）である。

【図１３】キメラタンパク質Ｅ２９１／４５１：Ｓの塩
基配列およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１
１）である。

【図１４】キメラタンパク質Ｅ２９１／４５１：Ｓの塩
基配列およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１
１）である。

【図１５】キメラタンパク質Ｅ２９１／４５１：Ｓの塩
基配列およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１
１）である。

【図１６】キメラタンパク質Ｅ２９１／４５１：Ｓの塩
基配列およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１
１）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/295 ＡＤＹ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 15/62 15/86 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/62 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県川崎市川崎区夜光一丁目２番１号 (72)発明者 保井 孝太郎 東京都立川市若葉町２−26−32

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスゲノムの非必須領域に日本脳炎
   ウイルスとＢ型肝炎ウイルスの両方の表面抗原タンパク
   質の抗原部位を持つキメラタンパク質をコードする遺伝
   子が挿入され、前記キメラタンパク質をウイルス感染細
   胞中に発現する組み換えバキュロウイルス。
2. 【請求項２】 請求項１記載の組み換えバキュロウイル
   スを昆虫細胞に感染させ、日本脳炎ウイルスとＢ型肝炎
   ウイルスの表面抗原タンパク質の抗原部位を持つキメラ
   タンパク質の製造法。