JPH06205683A - ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 - Google Patents
ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法Info
- Publication number
- JPH06205683A JPH06205683A JP5227992A JP22799293A JPH06205683A JP H06205683 A JPH06205683 A JP H06205683A JP 5227992 A JP5227992 A JP 5227992A JP 22799293 A JP22799293 A JP 22799293A JP H06205683 A JPH06205683 A JP H06205683A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- restriction endonuclease
- gene
- sphi
- restriction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】１）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を宿主中に導入して前記制限遺伝子を発現させ、
２）ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発
現するプラスミドを含む宿主を発酵させ、３）ＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発現するプラス
ミドを含む発酵した宿主からＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼを精製することからなる、ＳｐｈＩ制限エンドヌ
クレアーゼをクローニングし産生するための方法、並び
にＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離Ｄ
ＮＡ。 【効果】実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うた
めの有用な道具である精製された制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼを多量に合成することができる。
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ由来の制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を宿主中に導入して前記制限遺伝子を発現させ、
２）ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発
現するプラスミドを含む宿主を発酵させ、３）ＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼ活性をコードし発現するプラス
ミドを含む発酵した宿主からＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼを精製することからなる、ＳｐｈＩ制限エンドヌ
クレアーゼをクローニングし産生するための方法、並び
にＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離Ｄ
ＮＡ。 【効果】実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うた
めの有用な道具である精製された制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼを多量に合成することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＳｐｈＩ制限エンドヌ
クレアーゼと修飾メチラーゼ（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）とをコードする組換えＤＮ
Ａ、並びに該組換えＤＮＡからの前記酵素の製造に関す
る。
クレアーゼと修飾メチラーゼ（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）とをコードする組換えＤＮ
Ａ、並びに該組換えＤＮＡからの前記酵素の製造に関す
る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】制限エ
ンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する酵素の一種
である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入細菌成分
から精製して、ＤＮＡを正確なフラグメントに切断する
ために実験室で使用できる。この性質を利用すれば、Ｄ
ＮＡ分子を唯一のものとして同定し且つその構成遺伝子
に分別することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究に不可欠の道具であることが判明した。
制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学及び分析を実施す
るための手段となる生化学的「はさみ」なのである。
ンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する酵素の一種
である。制限エンドヌクレアーゼは、他の混入細菌成分
から精製して、ＤＮＡを正確なフラグメントに切断する
ために実験室で使用できる。この性質を利用すれば、Ｄ
ＮＡ分子を唯一のものとして同定し且つその構成遺伝子
に分別することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
代の遺伝子研究に不可欠の道具であることが判明した。
制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学及び分析を実施す
るための手段となる生化学的「はさみ」なのである。
【０００３】制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の
特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、該
ヌクレオチド配列に結合することによって作用する。こ
のようにして結合した制限エンドヌクレアーゼは認識配
列内で、又は認識配列の片側に、ＤＮＡ分子を開裂す
る。種々の制限エンドヌクレアーゼが種々の認識配列に
対して親和性を示す。これまでに調べられた数百種の細
菌の中で、ほぼ百の異なる制限エンドヌクレアーゼが同
定された。
特定のヌクレオチド配列（「認識配列」）を認識し、該
ヌクレオチド配列に結合することによって作用する。こ
のようにして結合した制限エンドヌクレアーゼは認識配
列内で、又は認識配列の片側に、ＤＮＡ分子を開裂す
る。種々の制限エンドヌクレアーゼが種々の認識配列に
対して親和性を示す。これまでに調べられた数百種の細
菌の中で、ほぼ百の異なる制限エンドヌクレアーゼが同
定された。
【０００４】細菌は種毎に僅かの制限エンドヌクレアー
ゼしか所有しない性向を有する。エンドヌクレアーゼは
通常、その由来源である細菌にちなんで命名される。例
えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ種
は、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩ及びＨａｅＩＩＩという３種
類の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これら
の酵素はそれぞれ配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、Ｐｕ
ＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し開裂する。これに対
し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲＹ
１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する１種類の酵素Ｅｃ
ｏＲＩしか合成しない。
ゼしか所有しない性向を有する。エンドヌクレアーゼは
通常、その由来源である細菌にちなんで命名される。例
えば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ種
は、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩ及びＨａｅＩＩＩという３種
類の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これら
の酵素はそれぞれ配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ）、Ｐｕ
ＧＣＧＣＰｙ及びＧＧＣＣを認識し開裂する。これに対
し、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＲＹ
１３は、配列ＧＡＡＴＴＣを認識する１種類の酵素Ｅｃ
ｏＲＩしか合成しない。
【０００５】理論に拘束されたくはないが、自然界で
は、細菌細胞が安全に生存する上で制限エンドヌクレア
ーゼが保護的役割を果たしていると考えられる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、該酵素がなければ細菌を破壊する
か又は細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミド
のような外来ＤＮＡ分子による感染に細菌が耐えられる
ようにする。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ分
子の長さを走査して、認識配列が出現する毎に前記長さ
を開裂することにより前記耐性を与える。このようにし
て開裂が行われると、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮ
Ａが非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解され
るようになる。
は、細菌細胞が安全に生存する上で制限エンドヌクレア
ーゼが保護的役割を果たしていると考えられる。制限エ
ンドヌクレアーゼは、該酵素がなければ細菌を破壊する
か又は細菌に寄生するであろうウイルス及びプラスミド
のような外来ＤＮＡ分子による感染に細菌が耐えられる
ようにする。制限エンドヌクレアーゼは、感染ＤＮＡ分
子の長さを走査して、認識配列が出現する毎に前記長さ
を開裂することにより前記耐性を与える。このようにし
て開裂が行われると、感染遺伝子の多くが失活し、ＤＮ
Ａが非特異的エンドヌクレアーゼによって更に分解され
るようになる。
【０００６】細菌保護系の第２の成分は修飾メチラーゼ
である。この種の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補
的な関係にあり、細菌が自己のＤＮＡを保護し、該ＤＮ
Ａを外来感染ＤＮＡから判別できるようにする手段を与
える。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアー
ゼと同じヌクレオチド認識配列を認識しこれに結合する
が、ＤＮＡを開裂する代わりに、メチル基の付加によっ
て前記配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾
する。メチル化の後は、制限エンドヌクレアーゼが認識
配列に結合することも、該認識配列を開裂することもな
い。細菌細胞のＤＮＡは常に自己の修飾メチラーゼの活
性によって完全に修飾される。従って、内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対しては全く感受性を示さな
い。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して感
受性を示すのは、修飾されていない、従って識別可能な
外来ＤＮＡだけである。
である。この種の酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補
的な関係にあり、細菌が自己のＤＮＡを保護し、該ＤＮ
Ａを外来感染ＤＮＡから判別できるようにする手段を与
える。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアー
ゼと同じヌクレオチド認識配列を認識しこれに結合する
が、ＤＮＡを開裂する代わりに、メチル基の付加によっ
て前記配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に修飾
する。メチル化の後は、制限エンドヌクレアーゼが認識
配列に結合することも、該認識配列を開裂することもな
い。細菌細胞のＤＮＡは常に自己の修飾メチラーゼの活
性によって完全に修飾される。従って、内因性制限エン
ドヌクレアーゼの存在に対しては全く感受性を示さな
い。制限エンドヌクレアーゼの認識及び攻撃に対して感
受性を示すのは、修飾されていない、従って識別可能な
外来ＤＮＡだけである。
【０００７】遺伝子工学技術の誕生により、現在では遺
伝子をクローン化し、これらの遺伝子によってコードさ
れるタンパク質及び酵素を従来の精製技術よりも多量に
産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローンを単離するための鍵は、この種のクロー
ンを、その発生頻度が１０-3〜１０-4と低いときに、複
雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」法によっ
て誘導されるクローン集団内で同定する簡単で信頼でき
る方法を開発することにある。この方法は、クローンの
大部分を占める望ましくないクローンが破壊され、希少
な望ましいクローンが生き残るように、選択的であるの
が好ましい。
伝子をクローン化し、これらの遺伝子によってコードさ
れるタンパク質及び酵素を従来の精製技術よりも多量に
産生することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローンを単離するための鍵は、この種のクロー
ンを、その発生頻度が１０-3〜１０-4と低いときに、複
雑な「ライブラリー」、即ち「ショットガン」法によっ
て誘導されるクローン集団内で同定する簡単で信頼でき
る方法を開発することにある。この方法は、クローンの
大部分を占める望ましくないクローンが破壊され、希少
な望ましいクローンが生き残るように、選択的であるの
が好ましい。
【０００８】タイプＩＩの制限−修飾系はより高い頻度
でクローン化されている。第１のクローン化系では、バ
クテリオファージ感染が制限エンドヌクレアーゼクロー
ンの同定又は選択手段として使用された（ＥｃｏＲＩ
Ｉ：Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
１７８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａＩＩ：
Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２（１９７
８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８ １５０３−１５０７（１９８
１））。細菌はその中に制限−修飾系が存在していれば
バクテリオファージによる感染に耐えることができるた
め、原則として、クローン化制限−修飾遺伝子を有する
細胞が、ファージの作用を受けたライブラリーからの生
存者として選択的に単離され得る。しかしながらこの方
法の効果には限界があることが判明した。特に、クロー
ン化制限−修飾遺伝子が選択的生存を可能にするのに十
分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが判明し
た。
でクローン化されている。第１のクローン化系では、バ
クテリオファージ感染が制限エンドヌクレアーゼクロー
ンの同定又は選択手段として使用された（ＥｃｏＲＩ
Ｉ：Ｋｏｓｙｋｈら、Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
１７８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａＩＩ：
Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ ３：９７−１１２（１９７
８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８ １５０３−１５０７（１９８
１））。細菌はその中に制限−修飾系が存在していれば
バクテリオファージによる感染に耐えることができるた
め、原則として、クローン化制限−修飾遺伝子を有する
細胞が、ファージの作用を受けたライブラリーからの生
存者として選択的に単離され得る。しかしながらこの方
法の効果には限界があることが判明した。特に、クロー
ン化制限−修飾遺伝子が選択的生存を可能にするのに十
分なファージ耐性を常に示すとは限らないことが判明し
た。
【０００９】別のクローニング方法は、プラスミドによ
って運ばれる（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）という特
徴が初期に付与された系を大腸菌クローニングプラスミ
ド中に移す操作を含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５
９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒ
ａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６（１９８
３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ１９：
３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅ
ｎｔｈａｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０
１−５０９（１９８５））。
って運ばれる（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒｎｅ）という特
徴が初期に付与された系を大腸菌クローニングプラスミ
ド中に移す操作を含む（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅ
ｒｅｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５
９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：Ｇｉｎｇｅｒ
ａｓ及びＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：４０２−４０６（１９８
３）；Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ，Ｇｅｎｅ１９：
３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅ
ｎｔｈａｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０
１−５０９（１９８５））。
【００１０】第３の方法として、現在のところ活性メチ
ラーゼ遺伝子の選択によってクローン化されている更に
多くの系をクローニングするのに使用されている方法も
ある（例えば、１９８６年９月３日公開のＥＰＯ Ｎ
ｏ．：１９３，４１３、及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，
Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２
１（１９８５）参照）。制限遺伝子及び修飾遺伝子はし
ばしば密に関係しているため、これらの遺伝子はしばし
ば両方が同時にクローン化され得る。しかしながら、こ
の選択によって完全な制限系が得られるとは限らず、メ
チラーゼ遺伝子のみが得られることもある（ＢｓｐＲ
Ｉ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０：２１９
−２２５（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉ
ｓら、Ｇｅｎｅ ２０：１９７−２０４（１９８２）；
ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１：１１１−１１９（１９８３）；並びにＭｓＰＩ：
Ｗａｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１
２３５−１２４１（１９８３））。
ラーゼ遺伝子の選択によってクローン化されている更に
多くの系をクローニングするのに使用されている方法も
ある（例えば、１９８６年９月３日公開のＥＰＯ Ｎ
ｏ．：１９３，４１３、及びＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，
Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２
１（１９８５）参照）。制限遺伝子及び修飾遺伝子はし
ばしば密に関係しているため、これらの遺伝子はしばし
ば両方が同時にクローン化され得る。しかしながら、こ
の選択によって完全な制限系が得られるとは限らず、メ
チラーゼ遺伝子のみが得られることもある（ＢｓｐＲ
Ｉ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０：２１９
−２２５（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉ
ｓら、Ｇｅｎｅ ２０：１９７−２０４（１９８２）；
ＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓ及びＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ
２１：１１１−１１９（１９８３）；並びにＭｓＰＩ：
Ｗａｌｄｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１
２３５−１２４１（１９８３））。
【００１１】ある系では、クローニングの問題が、修飾
によって保護されていない宿主中にエンドヌクレアーゼ
遺伝子を挿入する試みに存在し得る。メチラーゼ遺伝子
及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメ
ント上で挿入する場合は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が
宿主の遺伝子を開裂する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を
修飾又は保護しなければならない。
によって保護されていない宿主中にエンドヌクレアーゼ
遺伝子を挿入する試みに存在し得る。メチラーゼ遺伝子
及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメ
ント上で挿入する場合は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が
宿主の遺伝子を開裂する前にメチラーゼ遺伝子が宿主を
修飾又は保護しなければならない。
【００１２】これらの系を大腸菌中でクローン化する上
での別の障害が、種々のメチラーゼのクローニングプロ
セスで発見された。多くの大腸菌株（クローニングで通
常使用されているものを含む）はシトシンメチル化含有
ＤＮＡ（ＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｙｔｏｓｉ
ｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の導入に耐える系を有
する（Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９０７０
−９０７４（１９８６））。従って、どの大腸菌株をク
ローニングに使用するかを熟慮することも必要である。
での別の障害が、種々のメチラーゼのクローニングプロ
セスで発見された。多くの大腸菌株（クローニングで通
常使用されているものを含む）はシトシンメチル化含有
ＤＮＡ（ＤＮＡ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｙｔｏｓｉ
ｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）の導入に耐える系を有
する（Ｒａｌｅｉｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８３：９０７０
−９０７４（１９８６））。従って、どの大腸菌株をク
ローニングに使用するかを熟慮することも必要である。
【００１３】精製した制限エンドヌクレアーゼは、そし
て制限エンドヌクレアーゼほどではないが修飾メチラー
ゼも、実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うため
の有用な道具であるため、これらの酵素を多量に合成す
る細菌株を組換えＤＮＡ技術によって得ることは商業的
に有利なことである。このような株は、精製操作を容易
にすると共に商業的に有用な量で酵素を産生する手段を
与えるため、有用と思われる。
て制限エンドヌクレアーゼほどではないが修飾メチラー
ゼも、実験室でＤＮＡの特徴付け及び再構成を行うため
の有用な道具であるため、これらの酵素を多量に合成す
る細菌株を組換えＤＮＡ技術によって得ることは商業的
に有利なことである。このような株は、精製操作を容易
にすると共に商業的に有用な量で酵素を産生する手段を
与えるため、有用と思われる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】発明の概要 本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−３５５９）から得
ることができるＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修
飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡと、該
組換えＤＮＡから前記酵素を製造するための方法とに関
する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ、即
ちＤＮＡ配列５’−ＧＣＡＴＧＣ−３’を認識し、該認
識配列内で４塩基３’オーバーハングを残して第２のＧ
Ｃ対の間で開裂を行う酵素（Ｆｕｃｈｓ，Ｌ．Ｙ．，
Ｌ．Ｃｏｒｖａｒｒｕｂｉａｓ，ｌ．Ｅｓｃａｌａｎｔ
ｅ，Ｓ．Ｓａｎｃｈｅｚ及びＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｇｅ
ｎｅ １０：３９−４６（１９８０））を発現する形質
転換宿主にも関する。本発明の方法で産生したＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、実施例
１のステップ１３に記載のように従来技術によって形成
した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混入
物を含んでいない。ＳｐｈＩ制限−修飾系をクローニン
グするための好ましい方法の１つは、適当なベクターを
選択し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ由来ＤＮＡを含むライブラリーを幾つ
か形成し、ＳｐｈＩ修飾メチラーゼをコードするＤＮＡ
を含むクローンを単離し、メチラーゼクローンを含む大
腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
株におけるエンドヌクレアーゼ活性のアッセイによって
エンドヌクレアーゼ遺伝子の存在の有無を確認し、前記
アッセイによって制限エンドヌクレアーゼが検出されな
かった場合にはクローン化ＤＮＡとＳｐｈＩ制限エンド
ヌクレアーゼのアミノ末端との配列決定を行い、これら
の配列の比較によってクローン化ＤＮＡフラグメント上
のエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を調べ、エンドヌク
レアーゼ遺伝子の残りを含む染色体ＤＮＡをクローン化
し、サザン分析を用いて該クローンのライブラリーをス
クリーニングし、ＰＣＲを用いて前記ライブラリーから
エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを増幅し、調節された
プロモーターの後方に完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を
クローン化し、これを中間コピー数プラスミド（ｍｅｄ
ｉｕｍ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）上
のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子で予め保護した宿主中
に形質転換する操作を含む。
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−３５５９）から得
ることができるＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修
飾メチラーゼの遺伝子をコードする組換えＤＮＡと、該
組換えＤＮＡから前記酵素を製造するための方法とに関
する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ、即
ちＤＮＡ配列５’−ＧＣＡＴＧＣ−３’を認識し、該認
識配列内で４塩基３’オーバーハングを残して第２のＧ
Ｃ対の間で開裂を行う酵素（Ｆｕｃｈｓ，Ｌ．Ｙ．，
Ｌ．Ｃｏｒｖａｒｒｕｂｉａｓ，ｌ．Ｅｓｃａｌａｎｔ
ｅ，Ｓ．Ｓａｎｃｈｅｚ及びＦ．Ｂｏｌｉｖａｒ，Ｇｅ
ｎｅ １０：３９−４６（１９８０））を発現する形質
転換宿主にも関する。本発明の方法で産生したＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、実施例
１のステップ１３に記載のように従来技術によって形成
した制限エンドヌクレアーゼ調製物に通常見られる混入
物を含んでいない。ＳｐｈＩ制限−修飾系をクローニン
グするための好ましい方法の１つは、適当なベクターを
選択し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ由来ＤＮＡを含むライブラリーを幾つ
か形成し、ＳｐｈＩ修飾メチラーゼをコードするＤＮＡ
を含むクローンを単離し、メチラーゼクローンを含む大
腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
株におけるエンドヌクレアーゼ活性のアッセイによって
エンドヌクレアーゼ遺伝子の存在の有無を確認し、前記
アッセイによって制限エンドヌクレアーゼが検出されな
かった場合にはクローン化ＤＮＡとＳｐｈＩ制限エンド
ヌクレアーゼのアミノ末端との配列決定を行い、これら
の配列の比較によってクローン化ＤＮＡフラグメント上
のエンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を調べ、エンドヌク
レアーゼ遺伝子の残りを含む染色体ＤＮＡをクローン化
し、サザン分析を用いて該クローンのライブラリーをス
クリーニングし、ＰＣＲを用いて前記ライブラリーから
エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを増幅し、調節された
プロモーターの後方に完全エンドヌクレアーゼ遺伝子を
クローン化し、これを中間コピー数プラスミド（ｍｅｄ
ｉｕｍ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）上
のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子で予め保護した宿主中
に形質転換する操作を含む。
【００１５】発明の詳細 本発明は、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードす
る組換えＤＮＡ、並びにこのような組換えＤＮＡから製
造した酵素に関する。
る組換えＤＮＡ、並びにこのような組換えＤＮＡから製
造した酵素に関する。
【００１６】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからＳｐｈＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて困難であっ
た。一般的なメチラーゼ選択法によって得たメチラーゼ
クローンはいずれも完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を含んでいなかった。制限エンドヌクレアーゼの位置
を決定するためには、メチラーゼクローンからのＤＮＡ
の配列と精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼから得た
アミノ末端配列とを比較する必要があった。これらの結
果から、完全な制限−修飾系を得るためには約２００〜
４００ｂｐをクローニングする必要があると推算され
た。しかしながら、従来の方法によって完全な制限エン
ドヌクレアーゼをクローン化する試みは総て失敗に終わ
った。その原因はおそらく、エンドヌクレアーゼ遺伝子
の致死率とＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子の比較的低い発現
とにある。試行された方法には、大腸菌及びＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ中で完全な制限修飾
系をクローニングする方法、並びにＳｐｈＩメチラーゼ
で予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中に制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方法が
ある。制限エンドヌクレアーゼの３’部分は最終的に、
Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡの
ＫａｓＩライブラリーの構築によってクローン化された
（ＫａｓＩは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で該遺伝
子の３’末端の下流で開裂する）。ＰＣＲを用いてフラ
グメントを増幅することによりライブラリーから単離さ
れた正確なフラグメントはｐＵＣ１９中にクローニング
された。ＰＣＲ反応に使用されたプライマーは、制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子内及びライブラリーの構築に使
用されたベクター内の配列を含んでいた。クローニング
後に、低コピープラスミド上の内因性プロモーターの制
御下でＳｐｈＩメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ中で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築す
る試みは総て失敗に終わった。完全な制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子は最終的に、Ｐｔａｃプロモーターの制御
下で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築することに
よって大腸菌中でクローン化され発現された。使用され
た宿主株は、中位コピー数プラスミドｐＳＹＸ２０上の
ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め保護した大腸菌である。
ｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからＳｐｈＩ制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて困難であっ
た。一般的なメチラーゼ選択法によって得たメチラーゼ
クローンはいずれも完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子を含んでいなかった。制限エンドヌクレアーゼの位置
を決定するためには、メチラーゼクローンからのＤＮＡ
の配列と精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼから得た
アミノ末端配列とを比較する必要があった。これらの結
果から、完全な制限−修飾系を得るためには約２００〜
４００ｂｐをクローニングする必要があると推算され
た。しかしながら、従来の方法によって完全な制限エン
ドヌクレアーゼをクローン化する試みは総て失敗に終わ
った。その原因はおそらく、エンドヌクレアーゼ遺伝子
の致死率とＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子の比較的低い発現
とにある。試行された方法には、大腸菌及びＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ中で完全な制限修飾
系をクローニングする方法、並びにＳｐｈＩメチラーゼ
で予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中に制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングする方法が
ある。制限エンドヌクレアーゼの３’部分は最終的に、
Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡの
ＫａｓＩライブラリーの構築によってクローン化された
（ＫａｓＩは制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で該遺伝
子の３’末端の下流で開裂する）。ＰＣＲを用いてフラ
グメントを増幅することによりライブラリーから単離さ
れた正確なフラグメントはｐＵＣ１９中にクローニング
された。ＰＣＲ反応に使用されたプライマーは、制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子内及びライブラリーの構築に使
用されたベクター内の配列を含んでいた。クローニング
後に、低コピープラスミド上の内因性プロモーターの制
御下でＳｐｈＩメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ中で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築す
る試みは総て失敗に終わった。完全な制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子は最終的に、Ｐｔａｃプロモーターの制御
下で制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築することに
よって大腸菌中でクローン化され発現された。使用され
た宿主株は、中位コピー数プラスミドｐＳＹＸ２０上の
ＮｌａＩＩＩメチラーゼで予め保護した大腸菌である。
【００１７】Ｂｅｒｎａｎら，ＡＳＭ Ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ ８９：２０６（１９８６）及びＢｒｏｏｋｓら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
ａｌ１４Ａ：１０６（１９９０）の報告は、大腸菌宿主
中での発現が見られなくても、制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子が部分的ＰｓｔＩライブラリーから単離したメチ
ラーゼクローン上に含まれている可能性があると述べて
いる。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓから単離され
た別の制限修飾系ＳａｌＩについても指摘されたことで
ある（Ｒｏｄｉｃｉｏ及びＣｈａｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：３４９−３５３（１９８
８）、Ｓｌａｔｋｏら，未公開の研究成果）。しかしな
がら、ＤＮＡの配列決定及びＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼのアミノ末端の配列決定の結果、メチラーゼクロ
ーン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含ま
れてないことが判明した。
ｔｓ ８９：２０６（１９８６）及びＢｒｏｏｋｓら，
Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
ａｌ１４Ａ：１０６（１９９０）の報告は、大腸菌宿主
中での発現が見られなくても、制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子が部分的ＰｓｔＩライブラリーから単離したメチ
ラーゼクローン上に含まれている可能性があると述べて
いる。これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓから単離され
た別の制限修飾系ＳａｌＩについても指摘されたことで
ある（Ｒｏｄｉｃｉｏ及びＣｈａｔｅｒ，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１３：３４９−３５３（１９８
８）、Ｓｌａｔｋｏら，未公開の研究成果）。しかしな
がら、ＤＮＡの配列決定及びＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼのアミノ末端の配列決定の結果、メチラーゼクロ
ーン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含ま
れてないことが判明した。
【００１８】ＳｐｈＩ制限遺伝子を好ましくはクローン
化して発現するための本発明の方法は図１に示す通りで
あり、下記のステップを含む： １． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを精製する。
化して発現するための本発明の方法は図１に示す通りで
あり、下記のステップを含む： １． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを精製する。
【００１９】２． 完全ＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子をフ
ラグメントに開裂する制限エンドヌクレアーゼ、例えば
ＰｓｔＩ又はそのアイソシゾマーのうち任意のもので前
記ＤＮＡを完全に及び／又は部分的に消化する。前記フ
ラグメントはクローニング可能な大きさ、即ち約１．５
〜１３ｋｂでなければならない。試用した他のエンドヌ
クレアーゼは、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、
ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ及びＸｂａＩを含めて、
前述の条件を満たさなかった。
ラグメントに開裂する制限エンドヌクレアーゼ、例えば
ＰｓｔＩ又はそのアイソシゾマーのうち任意のもので前
記ＤＮＡを完全に及び／又は部分的に消化する。前記フ
ラグメントはクローニング可能な大きさ、即ち約１．５
〜１３ｋｂでなければならない。試用した他のエンドヌ
クレアーゼは、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩ、
ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｓｉＩ及びＸｂａＩを含めて、
前述の条件を満たさなかった。
【００２０】３． ｐＢＲ３２２（又は好ましくは抗生
物質耐性遺伝子中に少なくとも１つのＳｐｈＩ部位を有
する任意の別のベクター）は、テトラサイクリン耐性遺
伝子中にＳｐｈＩ部位を１つ有するため好ましいクロー
ニングベクターである。
物質耐性遺伝子中に少なくとも１つのＳｐｈＩ部位を有
する任意の別のベクター）は、テトラサイクリン耐性遺
伝子中にＳｐｈＩ部位を１つ有するため好ましいクロー
ニングベクターである。
【００２１】４． 消化したＤＮＡをクローニングベク
ターに連結する。得られた混合物を用いて適当な宿主、
即ちｈｓｄＲ-、ｍｃｒＢＣ-株、例えば大腸菌株ＲＲ１
又はＫ８０２（それぞれＡＴＣＣ ３１３４３及びＡＴ
ＣＣ ３３５２６）を形質転換する。
ターに連結する。得られた混合物を用いて適当な宿主、
即ちｈｓｄＲ-、ｍｃｒＢＣ-株、例えば大腸菌株ＲＲ１
又はＫ８０２（それぞれＡＴＣＣ ３１３４３及びＡＴ
ＣＣ ３３５２６）を形質転換する。
【００２２】５． ＤＮＡ／細胞混合物を、好ましく
は、形質転換細胞に対して選択的な抗生物質、例えばテ
トラサイクリンを含む富栄養培地にプレーティングす
る。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーをま
とめて回収し、一次細胞ライブラリーを形成する。前述
のように、この種の一次細胞ライブラリーは、クローニ
ングエンドヌクレアーゼの様々な組合わせと、それぞれ
のクローニングエンドヌクレアーゼによるＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓＤＮ
Ａの完全な又は部分的な消化とを用いて最終的に合計１
０個構築した。
は、形質転換細胞に対して選択的な抗生物質、例えばテ
トラサイクリンを含む富栄養培地にプレーティングす
る。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーをま
とめて回収し、一次細胞ライブラリーを形成する。前述
のように、この種の一次細胞ライブラリーは、クローニ
ングエンドヌクレアーゼの様々な組合わせと、それぞれ
のクローニングエンドヌクレアーゼによるＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓＤＮ
Ａの完全な又は部分的な消化とを用いて最終的に合計１
０個構築した。
【００２３】６． 組換えプラスミドを一次細胞ライブ
ラリーからｉｎ ｔｏｔｏで精製して一次プラスミドラ
イブラリーを形成する。
ラリーからｉｎ ｔｏｔｏで精製して一次プラスミドラ
イブラリーを形成する。
【００２４】７． 次いで、精製プラスミドライブラリ
ーを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ細胞から調製したＳｐｈＩ制限エンドヌ
クレアーゼ又は任意のＳｐｈＩアイソシゾマー、例えば
ＢｂｖＩもしくはＰａｅＩでｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に
消化する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は、修
飾されていないメチラーゼ無含有クローンを選択的に破
壊し、その結果ＳｐｈＩメチラーゼ含有クローンの相対
頻度が増加する。メチラーゼ無含有クローンの破壊を促
進するために、エキソヌクレアーゼ及び／又はホスファ
ターゼを消化に加えてもよい。
ーを、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｅｓ細胞から調製したＳｐｈＩ制限エンドヌ
クレアーゼ又は任意のＳｐｈＩアイソシゾマー、例えば
ＢｂｖＩもしくはＰａｅＩでｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に
消化する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ消化は、修
飾されていないメチラーゼ無含有クローンを選択的に破
壊し、その結果ＳｐｈＩメチラーゼ含有クローンの相対
頻度が増加する。メチラーゼ無含有クローンの破壊を促
進するために、エキソヌクレアーゼ及び／又はホスファ
ターゼを消化に加えてもよい。
【００２５】８． ＳｐｈＩメチラーゼクローンの同
定：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを形質転換
によって大腸菌株ＲＲ１又はＫ８０２のような適当な宿
主に戻し、形質転換コロニーを抗生物質プレート上での
プレーティングによって再び得る。コロニーを採取し、
そのＤＮＡを、ＳｐｈＩ修飾遺伝子の存在について下記
のの方法で分析する：プラスミドＤＮＡを精製し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼと共に
インキュベートして、ＳｐｈＩ消化に対して耐性である
かどうかを調べる。
定：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを形質転換
によって大腸菌株ＲＲ１又はＫ８０２のような適当な宿
主に戻し、形質転換コロニーを抗生物質プレート上での
プレーティングによって再び得る。コロニーを採取し、
そのＤＮＡを、ＳｐｈＩ修飾遺伝子の存在について下記
のの方法で分析する：プラスミドＤＮＡを精製し、ｉｎ
ｖｉｔｒｏでＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼと共に
インキュベートして、ＳｐｈＩ消化に対して耐性である
かどうかを調べる。
【００２６】９． メチラーゼ遺伝子がクローン化され
たことが確認されたら、そのクローンをＳｐｈＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。活性が検
出されれば、ＳｐｈＩ制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に
結合しており、クローン中に存在することになる。その
場合は、後述のステップ１２まで飛び越すことができ
る。制限活性が検出されなければ、それは制限遺伝子が
メチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は結合してい
るが完全な状態でメチラーゼ遺伝子と共にクローン化さ
れてはいないか、又は完全な状態でクローン化されてい
るが発現はされていないことを意味する。これら３つの
可能性のうちのいずれが現実のものであるかを調べるた
めに、クローン化フラグメントの制限地図を作り、欠失
を形成して、クローン化フラグメント内のメチラーゼ遺
伝子の相対位置を決定する。次いでこの情報を用いて、
制限遺伝子が結合しているものと仮定して、その制限遺
伝子をコードするのに十分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子
のいずれかの側面に存在しているかどうかを調べる。Ｄ
ＮＡが十分に存在していれば、制限遺伝子は結合してい
ないか、又はクローン中に存在していても発現されては
いないとみなされる（ステップ１０に進む）。本発明の
ＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０の場合のように、ク
ローン化ＤＮＡ内でメチラーゼ遺伝子の両側に、結合制
限遺伝子をコードするのに十分な余地（ｒｏｏｍ）が存
在していなければ、メチラーゼ遺伝子の一部分を用いて
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｅｓ染色体の消化物をプローブし、サザンハイブリ
ダイゼーションによって、既存のクローン化ＤＮＡの境
界を超えて延びる領域のゲノム地図を形成する。このデ
ータは、制限−修飾領域をメチラーゼ遺伝子とより多く
の隣接ＤＮＡとを有する個々のフラグメントに開裂する
特定のエンドヌクレアーゼを同定するのに役立つ。この
ようなエンドヌクレアーゼによって形成されたフラグメ
ントの正確な大きさも前記データから計算される。制限
遺伝子と修飾遺伝子とが結合していれば、前述のような
フラグメントは制限遺伝子もコードすると考えられる。
たことが確認されたら、そのクローンをＳｐｈＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性についてアッセイする。活性が検
出されれば、ＳｐｈＩ制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に
結合しており、クローン中に存在することになる。その
場合は、後述のステップ１２まで飛び越すことができ
る。制限活性が検出されなければ、それは制限遺伝子が
メチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は結合してい
るが完全な状態でメチラーゼ遺伝子と共にクローン化さ
れてはいないか、又は完全な状態でクローン化されてい
るが発現はされていないことを意味する。これら３つの
可能性のうちのいずれが現実のものであるかを調べるた
めに、クローン化フラグメントの制限地図を作り、欠失
を形成して、クローン化フラグメント内のメチラーゼ遺
伝子の相対位置を決定する。次いでこの情報を用いて、
制限遺伝子が結合しているものと仮定して、その制限遺
伝子をコードするのに十分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子
のいずれかの側面に存在しているかどうかを調べる。Ｄ
ＮＡが十分に存在していれば、制限遺伝子は結合してい
ないか、又はクローン中に存在していても発現されては
いないとみなされる（ステップ１０に進む）。本発明の
ＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０の場合のように、ク
ローン化ＤＮＡ内でメチラーゼ遺伝子の両側に、結合制
限遺伝子をコードするのに十分な余地（ｒｏｏｍ）が存
在していなければ、メチラーゼ遺伝子の一部分を用いて
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｅｓ染色体の消化物をプローブし、サザンハイブリ
ダイゼーションによって、既存のクローン化ＤＮＡの境
界を超えて延びる領域のゲノム地図を形成する。このデ
ータは、制限−修飾領域をメチラーゼ遺伝子とより多く
の隣接ＤＮＡとを有する個々のフラグメントに開裂する
特定のエンドヌクレアーゼを同定するのに役立つ。この
ようなエンドヌクレアーゼによって形成されたフラグメ
ントの正確な大きさも前記データから計算される。制限
遺伝子と修飾遺伝子とが結合していれば、前述のような
フラグメントは制限遺伝子もコードすると考えられる。
【００２７】１０． Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ又はＮ
ｏｃａｒｄｉａから単離した制限−修飾系に関する過去
の実験では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するク
ローンは通常の粗細胞抽出物アッセイでは同定できない
ことが判明した。これは、大腸菌中での前記遺伝子の発
現度が低いためである。しかしながら、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の遺伝子は、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ中でクローニン
グするとしばしば検出可能な度合いまで発現し得る。メ
チラーゼ遺伝子を含み、場合によってはエンドヌクレア
ーゼ遺伝子も含むクローンｐＳｐｈＭ６．０からのフラ
グメントを、ｐＩＪ４８６のようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓベクター（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８に記述されて
いる）上にサブクローニングし、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
中に形質転換する。得られたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中ク
ローンをメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現
について調べる。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中クローンから
発現されたエンドヌクレアーゼが存在すれば、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子はクローン化されてはいるが大腸菌中
では発現されないことになる（ステップ１２に飛び越
す）。本発明の場合のように発現が見られなければ、Ｓ
ｐｈＩエンドヌクレアーゼをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからできるだけ均
質に精製し、最初の１０〜２０のアミノ酸のアミノ末端
配列を決定する。このタンパク質配列情報をメチラーゼ
クローンの翻訳されたＤＮＡ配列と比較して、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子がそのクローン化フラグメント上に存
在するかどうかを調べ、存在していれば、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の出発点がフラグメント上のどの位置に当
たるかを調べる。これと同時に、タンパク質ゲルによっ
て制限エンドヌクレアーゼタンパク質の大きさは約２７
ｋＤであると決定される。これは、エンドヌクレアーゼ
遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡの量が約０．８ｋ
ｂであることを意味する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレア
ーゼを有するクローンは、エンドヌクレアーゼのアミノ
末端に関連した配列を含み、且つ前記配列の下流に少な
くとも０．８ｋｂのＤＮＡを有するものであると同定さ
れている。しかしながら本発明では、単離したメチラー
ゼクローンのいずれも、エンドヌクレアーゼ遺伝子を完
全にコードするのに十分なＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
出発点の下流に含んでいないことが判明した。
ｏｃａｒｄｉａから単離した制限−修飾系に関する過去
の実験では、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するク
ローンは通常の粗細胞抽出物アッセイでは同定できない
ことが判明した。これは、大腸菌中での前記遺伝子の発
現度が低いためである。しかしながら、Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の遺伝子は、Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ中でクローニン
グするとしばしば検出可能な度合いまで発現し得る。メ
チラーゼ遺伝子を含み、場合によってはエンドヌクレア
ーゼ遺伝子も含むクローンｐＳｐｈＭ６．０からのフラ
グメントを、ｐＩＪ４８６のようなＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓベクター（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８に記述されて
いる）上にサブクローニングし、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
中に形質転換する。得られたＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中ク
ローンをメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子発現
について調べる。Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中クローンから
発現されたエンドヌクレアーゼが存在すれば、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子はクローン化されてはいるが大腸菌中
では発現されないことになる（ステップ１２に飛び越
す）。本発明の場合のように発現が見られなければ、Ｓ
ｐｈＩエンドヌクレアーゼをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓからできるだけ均
質に精製し、最初の１０〜２０のアミノ酸のアミノ末端
配列を決定する。このタンパク質配列情報をメチラーゼ
クローンの翻訳されたＤＮＡ配列と比較して、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子がそのクローン化フラグメント上に存
在するかどうかを調べ、存在していれば、エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の出発点がフラグメント上のどの位置に当
たるかを調べる。これと同時に、タンパク質ゲルによっ
て制限エンドヌクレアーゼタンパク質の大きさは約２７
ｋＤであると決定される。これは、エンドヌクレアーゼ
遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡの量が約０．８ｋ
ｂであることを意味する。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレア
ーゼを有するクローンは、エンドヌクレアーゼのアミノ
末端に関連した配列を含み、且つ前記配列の下流に少な
くとも０．８ｋｂのＤＮＡを有するものであると同定さ
れている。しかしながら本発明では、単離したメチラー
ゼクローンのいずれも、エンドヌクレアーゼ遺伝子を完
全にコードするのに十分なＤＮＡをエンドヌクレアーゼ
出発点の下流に含んでいないことが判明した。
【００２８】１１． ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の残部のクローニング：完全な制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子をメチラーゼ遺伝子と共に又はメチラーゼ
遺伝子なしに、保護してない、又はＳｐｈＩメチラーゼ
で予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主中
にクローニングする試みは総て失敗に終わった。Ｓｐｈ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を得るためには、まず
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分だけをクロー
ニングする必要がある。サザンブロット分析で決定され
るように制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で３’末端の
下流で切断を行う制限エンドヌクレアーゼを用いてＳ．
ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡのライ
ブラリーを構築する。ライブラリーが得られれば、Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎコロニー又はサザンハイブリダイゼーシ
ョンによって制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分
を含む正確なクローンを同定し、次いでＰＣＲ増幅を用
いてライブラリーから単離もしくは増幅することができ
る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端を含むフ
ラグメントのクローンが単離されれば、これを用いて制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築して完全な遺伝子
を得ることができる。
遺伝子の残部のクローニング：完全な制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子をメチラーゼ遺伝子と共に又はメチラーゼ
遺伝子なしに、保護してない、又はＳｐｈＩメチラーゼ
で予め保護した大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主中
にクローニングする試みは総て失敗に終わった。Ｓｐｈ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を得るためには、まず
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分だけをクロー
ニングする必要がある。サザンブロット分析で決定され
るように制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内で３’末端の
下流で切断を行う制限エンドヌクレアーゼを用いてＳ．
ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノムＤＮＡのライ
ブラリーを構築する。ライブラリーが得られれば、Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎコロニー又はサザンハイブリダイゼーシ
ョンによって制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’部分
を含む正確なクローンを同定し、次いでＰＣＲ増幅を用
いてライブラリーから単離もしくは増幅することができ
る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端を含むフ
ラグメントのクローンが単離されれば、これを用いて制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子を再構築して完全な遺伝子
を得ることができる。
【００２９】１２． 過剰発現：制限遺伝子を含むクロ
ーンを過剰発現できる方法は幾つかある。ＤＮＡ配列決
定、詳細な地図の作成及び欠失データは、制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方法の決定に
役立つ。過剰発現させる方法の１つは、大腸菌によって
強く認識されるプロモーター、例えばｐＡＧＲ３上のＰ
ｔａｃ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの
Ｗ．Ｊａｃｋから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始点の前に直接挿入する操作を含む。この操
作は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点及び終了
点の近傍に適当な制限部位をみつけ、ｐＡＧＲ３のプロ
モーターの近傍に相容性制限部位をみつけ、制限遺伝子
をＰｔａｃプロモーターと一直線に並ぶようにｐＡＧＲ
３に移し込むことによって実施し得る。あるいは、完全
な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅のためにポリメ
ラーゼ連鎖反応を使用するために、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の前及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下
流のどこかで直接ハイブリダイズするプライマーを設計
することもできる。得られたＤＮＡフラグメントは、ｐ
ＡＧＲ３のような発現ベクター内で誘発性プロモーター
（Ｐｔａｃ）の下流に直接挿入できる。使用し得る別の
調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２
２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅ
１９：４３−５４（１９８２））及び１ＰＬ（Ｓｈｉ
ｍａｔａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ
２５４：１２８（１９８１））、並びにｐＥＴ３Ａベク
ター上のＴ７プロモーター（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ．，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹのＷｉｌ
ｌｉａｍ Ｓｔｕｄｉｅｒから入手可能）である。ま
た、強力なリボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ ＆ Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７１，１３４２−１３４６（１９７４））
を遺伝子の前に配置して発現を増大させることもでき
る。本発明では、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現す
る安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌク
レアーゼ消化から予め保護しなければならない。この操
作は、別個のプラスミド上で、ＳｐｈＩ制限部位と重な
り合う部位を修飾することによりＳｐｈＩ消化から保護
するＮｌａＩＩＩのような異種メチラーゼ又はＳｐｈＩ
メチラーゼ中でクローニングすることによって達成され
る。使用するプラスミドは発現ベクターに対して相容性
のものでなければならない。メチラーゼはまた、過剰発
現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿
主のゲノムを保護するようなレベルで産生されなければ
ならない。本発明では、ｐＡＣＹＣ１８４のような低コ
ピー数プラスミド上にクローニングしたＳｐｈＩメチラ
ーゼ遺伝子では完全な保護は得られないことが判明し
た。中位コピー数プラスミド上にクローニングしたＮｌ
ａＩＩＩメチラーゼ遺伝子を用いると、宿主ゲノムがＳ
ｐｈＩ消化から完全に保護された。
ーンを過剰発現できる方法は幾つかある。ＤＮＡ配列決
定、詳細な地図の作成及び欠失データは、制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子を過剰発現させる最良の方法の決定に
役立つ。過剰発現させる方法の１つは、大腸菌によって
強く認識されるプロモーター、例えばｐＡＧＲ３上のＰ
ｔａｃ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの
Ｗ．Ｊａｃｋから入手可能）を制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の開始点の前に直接挿入する操作を含む。この操
作は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の開始点及び終了
点の近傍に適当な制限部位をみつけ、ｐＡＧＲ３のプロ
モーターの近傍に相容性制限部位をみつけ、制限遺伝子
をＰｔａｃプロモーターと一直線に並ぶようにｐＡＧＲ
３に移し込むことによって実施し得る。あるいは、完全
な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の増幅のためにポリメ
ラーゼ連鎖反応を使用するために、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の前及び制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下
流のどこかで直接ハイブリダイズするプライマーを設計
することもできる。得られたＤＮＡフラグメントは、ｐ
ＡＧＲ３のような発現ベクター内で誘発性プロモーター
（Ｐｔａｃ）の下流に直接挿入できる。使用し得る別の
調節されたプロモーターは、ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２
２誘導体上のＰｌａｃＵＶ５（Ｆｕｌｌｅｒ，Ｇｅｎｅ
１９：４３−５４（１９８２））及び１ＰＬ（Ｓｈｉ
ｍａｔａｋｅ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ
２５４：１２８（１９８１））、並びにｐＥＴ３Ａベク
ター上のＴ７プロモーター（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂ．，Ｕｐｔｏｎ，ＮＹのＷｉｌ
ｌｉａｍ Ｓｔｕｄｉｅｒから入手可能）である。ま
た、強力なリボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ ＆ Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ７１，１３４２−１３４６（１９７４））
を遺伝子の前に配置して発現を増大させることもでき
る。本発明では、制限エンドヌクレアーゼを過剰発現す
る安定なクローンを得るために、宿主を制限エンドヌク
レアーゼ消化から予め保護しなければならない。この操
作は、別個のプラスミド上で、ＳｐｈＩ制限部位と重な
り合う部位を修飾することによりＳｐｈＩ消化から保護
するＮｌａＩＩＩのような異種メチラーゼ又はＳｐｈＩ
メチラーゼ中でクローニングすることによって達成され
る。使用するプラスミドは発現ベクターに対して相容性
のものでなければならない。メチラーゼはまた、過剰発
現した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子による消化から宿
主のゲノムを保護するようなレベルで産生されなければ
ならない。本発明では、ｐＡＣＹＣ１８４のような低コ
ピー数プラスミド上にクローニングしたＳｐｈＩメチラ
ーゼ遺伝子では完全な保護は得られないことが判明し
た。中位コピー数プラスミド上にクローニングしたＮｌ
ａＩＩＩメチラーゼ遺伝子を用いると、宿主ゲノムがＳ
ｐｈＩ消化から完全に保護された。
【００３０】前記遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌中で更
に効果的に使用されるコドンを使用すべく、部位特異的
突然変異誘発又は遺伝子の再合成によって変えることが
できる（Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５
１：３８９−４０９（１９８１））。
に効果的に使用されるコドンを使用すべく、部位特異的
突然変異誘発又は遺伝子の再合成によって変えることが
できる（Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５
１：３８９−４０９（１９８１））。
【００３１】１３． 産生：ＳｐｈＩメチラーゼ又はエ
ンドヌクレアーゼは、抗生物質を適当に選択して発酵槽
内の富栄養培地で増殖させることにより、ＳｐｈＩメチ
ラーゼ遺伝子（又は異種メチラーゼ）及び過剰発現した
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンから産
生し得る。その後細胞を遠心分離によって回収し、音波
処理により破壊して、ＳｐｈＩメチラーゼ及び制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
ンドヌクレアーゼは、抗生物質を適当に選択して発酵槽
内の富栄養培地で増殖させることにより、ＳｐｈＩメチ
ラーゼ遺伝子（又は異種メチラーゼ）及び過剰発現した
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を有するクローンから産
生し得る。その後細胞を遠心分離によって回収し、音波
処理により破壊して、ＳｐｈＩメチラーゼ及び制限エン
ドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を得る。
【００３２】１４． 精製：ＳｐｈＩメチラーゼ及びエ
ンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、アフィニティ
クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィー
のような標準的タンパク質精製方法によって精製する。
ンドヌクレアーゼを含む粗細胞抽出物を、アフィニティ
クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィー
のような標準的タンパク質精製方法によって精製する。
【００３３】前述の諸ステップは本発明の好ましい実施
態様を構成するものであるが、当業者には明らかなよう
に、前述の方法は当業者に公知の技術に従って変えるこ
とができる。
態様を構成するものであるが、当業者には明らかなよう
に、前述の方法は当業者に公知の技術に従って変えるこ
とができる。
【００３４】
【実施例】以下の実施例は、本発明の現時点で好ましい
実施態様を説明するためのものである。尚、この実施例
は非限定的なものであり、本発明はこれに限定されるこ
とはない。
実施態様を説明するためのものである。尚、この実施例
は非限定的なものであり、本発明はこれに限定されるこ
とはない。
【００３５】実施例１ＳｐｈＩ修飾メチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子のクローニング １．ＤＮＡの精製： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈ
ａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを調製するため
に、１ｇの細胞ペーストを５ｍｌの０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に３０分間
静かに振盪することにより再懸濁させた。該懸濁液を２
つの３．０ｍｌアリコートに分けた。０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に１．
７ｍｇ／ｍｌのリゾチームを溶解した溶液３．５ｍｌを
各アリコートに加え、それぞれを３７℃で１５分間イン
キュベートした。ＳＤＳを１％まで加え、プロテイナー
ゼＫを０．１３ｍｇ／ｍｌまで加え、これらのアリコー
トを３７℃で１時間インキュベートした。１０％ＳＤＳ
及び８％サルコシルの溶液０．４ｍｌを各アリコートに
加え、インキュベーションを５５℃で２時間続けた。２
つのアリコートを合わせ、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を４
回交換して２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を塩
化セシウム−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分離
に使用できるようにするために、総量をＤＮＡ緩衝液で
４０ｍｌに増加し、該ＤＮＡ溶液を２つの２０ｍｌアリ
コートに分け、各々に２０ｇの塩化セシウム及び０．２
ｍｌの５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミドを加えた。該Ｄ
ＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得ら
れたＤＮＡバンドをシリンジ及び１８ゲージニードルを
用いて取り出した。同量の氷冷水飽和Ｎ−ブタノールで
４回抽出することによりエチジウムブロミドを除去し
た。塩化セシウムは透析によって除去した。次いで、Ｎ
ａＣｌを０．５Ｍまで加え、０．５５倍容のイソプロピ
ルアルコールを表面に層状に加えて、ＤＮＡを沈澱させ
た。沈澱したＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた。該ＤＮ
Ａを、最終濃度約３８５μｇ／ｍｌで２ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中に溶解し
た。
伝子のクローニング １．ＤＮＡの精製： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈ
ａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのＤＮＡを調製するため
に、１ｇの細胞ペーストを５ｍｌの０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に３０分間
静かに振盪することにより再懸濁させた。該懸濁液を２
つの３．０ｍｌアリコートに分けた。０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ７．６中に１．
７ｍｇ／ｍｌのリゾチームを溶解した溶液３．５ｍｌを
各アリコートに加え、それぞれを３７℃で１５分間イン
キュベートした。ＳＤＳを１％まで加え、プロテイナー
ゼＫを０．１３ｍｇ／ｍｌまで加え、これらのアリコー
トを３７℃で１時間インキュベートした。１０％ＳＤＳ
及び８％サルコシルの溶液０．４ｍｌを各アリコートに
加え、インキュベーションを５５℃で２時間続けた。２
つのアリコートを合わせ、ＤＮＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）を４
回交換して２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を塩
化セシウム−エチジウムブロミド平衡密度勾配遠心分離
に使用できるようにするために、総量をＤＮＡ緩衝液で
４０ｍｌに増加し、該ＤＮＡ溶液を２つの２０ｍｌアリ
コートに分け、各々に２０ｇの塩化セシウム及び０．２
ｍｌの５ｍｇ／ｍｌエチジウムブロミドを加えた。該Ｄ
ＮＡ溶液を４４，０００ｒｐｍで４８時間遠心し、得ら
れたＤＮＡバンドをシリンジ及び１８ゲージニードルを
用いて取り出した。同量の氷冷水飽和Ｎ−ブタノールで
４回抽出することによりエチジウムブロミドを除去し
た。塩化セシウムは透析によって除去した。次いで、Ｎ
ａＣｌを０．５Ｍまで加え、０．５５倍容のイソプロピ
ルアルコールを表面に層状に加えて、ＤＮＡを沈澱させ
た。沈澱したＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた。該ＤＮ
Ａを、最終濃度約３８５μｇ／ｍｌで２ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０中に溶解し
た。
【００３６】ステップ２〜１０の注意事項：前述のよう
に、合計５種の異なる制限エンドヌクレアーゼをそれぞ
れ使用してＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ染色
体を消化し、１０のライブラリーを構築しスクリーニン
グした。メチラーゼクローンは部分的ＰｓｔＩライブラ
リーだけでしか得られられなかったため、ここでは部分
的ＰｓｔＩライブラリーのみを詳述する。他の９個のラ
イブラリーは、以下に略述する方法と類似の方法で作製
した。
に、合計５種の異なる制限エンドヌクレアーゼをそれぞ
れ使用してＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ染色
体を消化し、１０のライブラリーを構築しスクリーニン
グした。メチラーゼクローンは部分的ＰｓｔＩライブラ
リーだけでしか得られられなかったため、ここでは部分
的ＰｓｔＩライブラリーのみを詳述する。他の９個のラ
イブラリーは、以下に略述する方法と類似の方法で作製
した。
【００３７】２．部分消化： 精製ＤＮＡを以下のよう
にＰｓｔＩで開裂して部分消化を行なった。１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００
ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール緩
衝液中５００ｕｇ／ｍｌのＤＮＡの溶液１００μｌを、
１つの１００μｌアリコートと７つの５０μｌアリコー
トとに分けた。１００μｌの試験管に４０単位のＰｓｔ
Ｉを加え、ＤＮＡ１μｇ当たり４単位の酵素とした。こ
の第１の試験管から５０μｌを取り出し、第２の試験管
に移して２単位ＰｓｔＩ／μｇとし、以下同様にして、
前の試験管の半分の量のＰｓｔＩを次の試験管に移し
た。これらの試験管を３７℃で１時間インキュベート
し、７２℃で１５分間熱処理し、各試験管から１５μｌ
ずつ採取してアガロースゲル電気泳動で分析した。中程
度の、但し不完全な消化を示す試験管を、クローニング
用部分消化フラグメント源として選択した（使用した部
分消化試験管は０．２５Ｕ／μｇ、０．１２Ｕ／μｇ、
０．０６Ｕ／μｇ及び０．０３Ｕ／μｇ試験管であ
る）。個々の反応液を一緒に混ぜ合わせ、下記のステッ
プ３に記載のように使用した。
にＰｓｔＩで開裂して部分消化を行なった。１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2，１００
ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノール緩
衝液中５００ｕｇ／ｍｌのＤＮＡの溶液１００μｌを、
１つの１００μｌアリコートと７つの５０μｌアリコー
トとに分けた。１００μｌの試験管に４０単位のＰｓｔ
Ｉを加え、ＤＮＡ１μｇ当たり４単位の酵素とした。こ
の第１の試験管から５０μｌを取り出し、第２の試験管
に移して２単位ＰｓｔＩ／μｇとし、以下同様にして、
前の試験管の半分の量のＰｓｔＩを次の試験管に移し
た。これらの試験管を３７℃で１時間インキュベート
し、７２℃で１５分間熱処理し、各試験管から１５μｌ
ずつ採取してアガロースゲル電気泳動で分析した。中程
度の、但し不完全な消化を示す試験管を、クローニング
用部分消化フラグメント源として選択した（使用した部
分消化試験管は０．２５Ｕ／μｇ、０．１２Ｕ／μｇ、
０．０６Ｕ／μｇ及び０．０３Ｕ／μｇ試験管であ
る）。個々の反応液を一緒に混ぜ合わせ、下記のステッ
プ３に記載のように使用した。
【００３８】３．連結反応： フラグメント化したＤＮ
Ａを以下の方法でｐＢＲ３２２に連結した。６μｇのＰ
ｓｔＩ部分消化Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＮＡ（６０μｌ）を、Ｐｓ
ｔＩで切断し脱リン酸化した３．０μｇのｐＢＲ３２２
（３０μｌ）と混合した。２０μｌの１０×連結反応ミ
ックス（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１００ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，１００ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＡＴ
Ｐ）を加え、更に１１０．５μｌの無菌蒸留水を加えて
最終量を１９８μｌとした。７．５μｌの濃縮Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（２×１０6Ｕ／ｍｌ）を加え、該混合液
を１７℃で４時間インキュベートし、次いで１０μｌの
クロロホルムを加えて殺菌した。約６２．５μｌの連結
ＤＮＡを使用して大腸菌株Ｋ８０２を次のように形質転
換した。ＤＮＡを０．５ｍｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ2（５
０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ クエン酸三ナトリウム，６
７ｍＭ ＣａＣｌ2）と氷上で混合し、１．０ｍｌの氷
冷コンピテント大腸菌Ｋ８０２（ｈｓｄＲ-Ｍ+，ｍｃｒ
Ａ-，ｍｃｒＢＣ- ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５２６）細胞
を加えた。４２℃で５分間インキュベートした後、１０
ｍｌのルリアブロス（Ｌブロス）を加えて細胞を希釈
し、３７℃で４時間インキュベートした。
Ａを以下の方法でｐＢＲ３２２に連結した。６μｇのＰ
ｓｔＩ部分消化Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏ
ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＮＡ（６０μｌ）を、Ｐｓ
ｔＩで切断し脱リン酸化した３．０μｇのｐＢＲ３２２
（３０μｌ）と混合した。２０μｌの１０×連結反応ミ
ックス（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１００ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2，１００ｍＭ ＤＴＴ，５ｍＭ ＡＴ
Ｐ）を加え、更に１１０．５μｌの無菌蒸留水を加えて
最終量を１９８μｌとした。７．５μｌの濃縮Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（２×１０6Ｕ／ｍｌ）を加え、該混合液
を１７℃で４時間インキュベートし、次いで１０μｌの
クロロホルムを加えて殺菌した。約６２．５μｌの連結
ＤＮＡを使用して大腸菌株Ｋ８０２を次のように形質転
換した。ＤＮＡを０．５ｍｌのＳＳＣ／ＣａＣｌ2（５
０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ クエン酸三ナトリウム，６
７ｍＭ ＣａＣｌ2）と氷上で混合し、１．０ｍｌの氷
冷コンピテント大腸菌Ｋ８０２（ｈｓｄＲ-Ｍ+，ｍｃｒ
Ａ-，ｍｃｒＢＣ- ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５２６）細胞
を加えた。４２℃で５分間インキュベートした後、１０
ｍｌのルリアブロス（Ｌブロス）を加えて細胞を希釈
し、３７℃で４時間インキュベートした。
【００３９】４．一次細胞ライブラリー： 形質転換細
胞培養液を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を１．０ｍ
ｌのＬブロス中に再懸濁させた。２００μｌアリコート
を、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むルリア寒
天（Ｌ寒天）プレート上にプレーティングした。３７℃
で一晩インキュベートした後、各プレートに２．５ｍｌ
の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2を注入し、形質転換コロニーをまとめて掻き取り、
プールし、一次細胞ライブラリーを形成した。 ５．一次プラスミドライブラリー： 一次プラスミドラ
イブラリーを以下のように形成した。２．５ｍｌの一次
細胞ライブラリーを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを含むＬブロス５００ｍｌ中に接種した。該培養液を
３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠
心した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％
スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中に室温
で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０を加え、次いで０．２５ＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０
中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームの溶液３ｍｌを加えた。
得られた溶液を氷上に３時間放置し、次いで１２ｍｌの
溶解用ミックス（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡ）を
ピペットで強く注入し、該細胞懸濁液を静かに撹拌して
溶解を完了させた。溶解後、混合液を５０ｍｌプラスチ
ック遠心管に移し、１７０００ｒｐｍ，４℃で４５分間
遠心した。上清をピペットで取り出した。２０．０ｇの
固体ＣｓＣｌを計量して５０ｍｌプラスチック製ねじ蓋
付き試験管に入れ、２２．０ｇの上清をピペットで加え
て混合した。該混合液に１．０ｍｌのエチジウムブロミ
ド溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロミド）を加えた。得られた溶液を２つの５／８
インチ×３インチのポリアロマー遠心管に移し、密封し
た。これらの遠心管をＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ロータ
ーで、４４０００ｒｐｍ、１７℃で４２時間遠心した。
プラスミドを回収すべく遠心管の頂部にメスで孔をあ
け、２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下で
シリンジによって回収した。両管から得た低い方のバン
ドをねじ蓋付きガラス試験管に一緒に入れ、同量の氷冷
水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出することによりエチジ
ウムブロミドを除去した。 抽出後の溶液を透析チュー
ブに移し、ＤＮＡ緩衝液を４回交換して２４時間透析し
た。透析後のＤＮＡ溶液を予め計量した５０ｍｌ無菌遠
心管に移し、量を測定した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度
０．４Ｍまで加え、２倍容のイソプロパノールを加えて
混合した。該溶液を−２０℃で一晩貯蔵してＤＮＡを沈
澱させた。沈澱後、溶液を１５０００ｒｐｍ、０℃で１
５分間遠心し、上清を捨てた。試験管を１５分間ベンチ
上に放置して空気乾燥し、次いでＤＮＡペレットを５０
０μｌのＤＮＡ緩衝液中に溶解し、−２０℃で貯蔵し
た。このようにして調製したプラスミドのＤＮＡ濃度は
１００〜２００μｇ／ｍｌであった。
胞培養液を簡単に遠心し、上清を捨て、細胞を１．０ｍ
ｌのＬブロス中に再懸濁させた。２００μｌアリコート
を、２５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むルリア寒
天（Ｌ寒天）プレート上にプレーティングした。３７℃
で一晩インキュベートした後、各プレートに２．５ｍｌ
の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2を注入し、形質転換コロニーをまとめて掻き取り、
プールし、一次細胞ライブラリーを形成した。 ５．一次プラスミドライブラリー： 一次プラスミドラ
イブラリーを以下のように形成した。２．５ｍｌの一次
細胞ライブラリーを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリ
ンを含むＬブロス５００ｍｌ中に接種した。該培養液を
３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠
心した。上清を捨て、細胞ペレットを１０ｍｌの２５％
スクロース，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中に室温
で再懸濁させた。５ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ
８．０を加え、次いで０．２５ＭＴｒｉｓ ｐＨ８．０
中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームの溶液３ｍｌを加えた。
得られた溶液を氷上に３時間放置し、次いで１２ｍｌの
溶解用ミックス（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、６７ｍＭ ＥＤＴＡ）を
ピペットで強く注入し、該細胞懸濁液を静かに撹拌して
溶解を完了させた。溶解後、混合液を５０ｍｌプラスチ
ック遠心管に移し、１７０００ｒｐｍ，４℃で４５分間
遠心した。上清をピペットで取り出した。２０．０ｇの
固体ＣｓＣｌを計量して５０ｍｌプラスチック製ねじ蓋
付き試験管に入れ、２２．０ｇの上清をピペットで加え
て混合した。該混合液に１．０ｍｌのエチジウムブロミ
ド溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ中５ｍｇ／ｍｌのエチジ
ウムブロミド）を加えた。得られた溶液を２つの５／８
インチ×３インチのポリアロマー遠心管に移し、密封し
た。これらの遠心管をＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ロータ
ーで、４４０００ｒｐｍ、１７℃で４２時間遠心した。
プラスミドを回収すべく遠心管の頂部にメスで孔をあ
け、２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下で
シリンジによって回収した。両管から得た低い方のバン
ドをねじ蓋付きガラス試験管に一緒に入れ、同量の氷冷
水飽和Ｎ−ブタノールで４回抽出することによりエチジ
ウムブロミドを除去した。 抽出後の溶液を透析チュー
ブに移し、ＤＮＡ緩衝液を４回交換して２４時間透析し
た。透析後のＤＮＡ溶液を予め計量した５０ｍｌ無菌遠
心管に移し、量を測定した。５Ｍ ＮａＣｌを最終濃度
０．４Ｍまで加え、２倍容のイソプロパノールを加えて
混合した。該溶液を−２０℃で一晩貯蔵してＤＮＡを沈
澱させた。沈澱後、溶液を１５０００ｒｐｍ、０℃で１
５分間遠心し、上清を捨てた。試験管を１５分間ベンチ
上に放置して空気乾燥し、次いでＤＮＡペレットを５０
０μｌのＤＮＡ緩衝液中に溶解し、−２０℃で貯蔵し
た。このようにして調製したプラスミドのＤＮＡ濃度は
１００〜２００μｇ／ｍｌであった。
【００４０】６．プラスミドプールの消化： ゲル精製
した一次プラスミドプールを以下のように消化して非Ｓ
ｐｈＩメチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮ
ＡをＳｐｈＩ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ
β−メルカプトエタノール）で３０μｇ／ｍｌに希釈
した。調製した量は合計９００μｌである。１６Ｕ／μ
ｇのＳｐｈＩを加え、該混合液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。１２分間７２℃に加熱して反応液中の酵
素を死滅させた。該消化物にＥＸｏＩＩＩヌクレアーゼ
をＤＮＡ１μｇ当たり５０Ｕの濃度で加えた。３７℃で
１時間インキュベートした後、試験管にクロロホルムを
１０μｌ加えた。遠心分離によってクロロホルムを除去
した。
した一次プラスミドプールを以下のように消化して非Ｓ
ｐｈＩメチラーゼクローンを破壊した。プラスミドＤＮ
ＡをＳｐｈＩ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ
β−メルカプトエタノール）で３０μｇ／ｍｌに希釈
した。調製した量は合計９００μｌである。１６Ｕ／μ
ｇのＳｐｈＩを加え、該混合液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。１２分間７２℃に加熱して反応液中の酵
素を死滅させた。該消化物にＥＸｏＩＩＩヌクレアーゼ
をＤＮＡ１μｇ当たり５０Ｕの濃度で加えた。３７℃で
１時間インキュベートした後、試験管にクロロホルムを
１０μｌ加えた。遠心分離によってクロロホルムを除去
した。
【００４１】７．形質転換： 各試験管から採取した１
２．５μｌ試料を用いて大腸菌ＲＲ１を形質転換した。
４２℃で３分間インキュベートし、Ｌブロス中３７℃で
４５分間増殖させた後、細胞／ＤＮＡ混合物を、２５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ寒天プレート上に
プレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした
後、プレートを調べた。ＳｐｈＩでのプラスミドライブ
ラリーの消化により、形質転換体の数は約１０3に減少
していた。
２．５μｌ試料を用いて大腸菌ＲＲ１を形質転換した。
４２℃で３分間インキュベートし、Ｌブロス中３７℃で
４５分間増殖させた後、細胞／ＤＮＡ混合物を、２５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ寒天プレート上に
プレーティングした。３７℃で一晩インキュベートした
後、プレートを調べた。ＳｐｈＩでのプラスミドライブ
ラリーの消化により、形質転換体の数は約１０3に減少
していた。
【００４２】８．生存固体の分析： セクション７で得
た生存コロニーのうち２８個をテトラサイクリン含有Ｌ
ブロス培養液１０ｍｌ中で増殖させ、それらが保有する
プラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７
９））の方法を改変した下記のミニプレッププラスミド
精製方法によって調製した。
た生存コロニーのうち２８個をテトラサイクリン含有Ｌ
ブロス培養液１０ｍｌ中で増殖させ、それらが保有する
プラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３（１９７
９））の方法を改変した下記のミニプレッププラスミド
精製方法によって調製した。
【００４３】ミニプレップ操作：各培養液を８０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ グルコー
ス、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。室温で１０分後、
２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各試験
管に加え、これらの試験管を振盪して細胞を溶解させ、
次いで氷上に配置した。溶液が透明になった時点で１．
５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８を各試験管に加
え、振盪した。形成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ、
４℃で１０分間遠心した。各上清を、イソプロパノール
３ｍｌを入れた遠心管内に注入し、混合した。室温で１
０分後、前記遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心
し、沈澱核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレット
を室温で３０分間空気乾燥した。乾燥したペレットを８
５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０中に再懸濁させた。７５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ
を各々に加え、該溶液を、５７５μｌのイソプロパノー
ルを入れたエッペンドルフ試験管に移し、再び室温で１
０分間沈澱させた。これらの試験管をマイクロ遠心機で
４５秒間遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥し
た。該ペレットを、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含
む５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中に溶解し、３７℃で１時間インキュベー
トしてＲＮＡを消化した。５０μｌの５ＭＮａＣｌ及び
３５０μｌのイソプロパノールを順次加えてＤＮＡをも
う一度沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを４５秒間
遠心することにより沈降させ、上清を捨て、ペレットを
１５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０からなる最終溶液中に再溶解した。その後、
ＳｐｈＩでの消化によりプラスミドミニプレップを分析
した。
ｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、細胞ペレットを、
１ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む１．０ｍｌの２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ グルコー
ス、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。室温で１０分後、
２．０ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを各試験
管に加え、これらの試験管を振盪して細胞を溶解させ、
次いで氷上に配置した。溶液が透明になった時点で１．
５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．８を各試験管に加
え、振盪した。形成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ、
４℃で１０分間遠心した。各上清を、イソプロパノール
３ｍｌを入れた遠心管内に注入し、混合した。室温で１
０分後、前記遠心管を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心
し、沈澱核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレット
を室温で３０分間空気乾燥した。乾燥したペレットを８
５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ８．０中に再懸濁させた。７５μｌの５Ｍ ＮａＣｌ
を各々に加え、該溶液を、５７５μｌのイソプロパノー
ルを入れたエッペンドルフ試験管に移し、再び室温で１
０分間沈澱させた。これらの試験管をマイクロ遠心機で
４５秒間遠心し、上清を捨て、ペレットを空気乾燥し
た。該ペレットを、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅを含
む５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ中に溶解し、３７℃で１時間インキュベー
トしてＲＮＡを消化した。５０μｌの５ＭＮａＣｌ及び
３５０μｌのイソプロパノールを順次加えてＤＮＡをも
う一度沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを４５秒間
遠心することにより沈降させ、上清を捨て、ペレットを
１５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ
ｐＨ８．０からなる最終溶液中に再溶解した。その後、
ＳｐｈＩでの消化によりプラスミドミニプレップを分析
した。
【００４４】９．メチラーゼ遺伝子クローン： １つの
プラスミドがＳｐｈＩ耐性を示し、２つのＰｓｔＩフラ
グメントを保有することが判明した（図２）。大腸菌ク
ローンから調製した抽出物を下記のｉｎ ｖｉｔｒｏ制
限アッセイにかけた。
プラスミドがＳｐｈＩ耐性を示し、２つのＰｓｔＩフラ
グメントを保有することが判明した（図２）。大腸菌ク
ローンから調製した抽出物を下記のｉｎ ｖｉｔｒｏ制
限アッセイにかけた。
【００４５】エンドヌクレアーゼ活性について試験すべ
きクローンの培養液５０ｍｌを、２５μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬブロスで３７℃で一晩増殖させ
た。５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを３ｍｌの音波
処理緩衝液（２０ｍＭ ＫＰＯ4 ｐＨ７．４、１０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。該
細胞懸濁液にリゾチームを最終濃度２００μｇ／ｍｌで
加えた。該混合液を氷上に３時間維持し、次いで−２０
℃で凍結した。該混合物を氷上で解凍し、得られた懸濁
液２ｍｌを音波処理緩衝液２ｍｌと混合した。該懸濁液
に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の２５％溶液を０．４μ
ｌ加え、ピペットに出し入れすることにより混合した。
破壊された細胞を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し
た。該細胞抽出物７．５μｌを１２０μｌの１×Ｓｐｈ
Ｉ緩衝液及び５０μｇ／ｍｌ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ
（ＰｓｔＩで予め消化したもの）と一緒に３７℃で２時
間インキュベートすることにより、上清の制限エンドヌ
クレアーゼ活性をアッセイした。１５μｌ試料を電気泳
動によって調べたところ、制限エンドヌクレアーゼ活性
は認められなかった。
きクローンの培養液５０ｍｌを、２５μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＬブロスで３７℃で一晩増殖させ
た。５０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞を
ペレット化した。上清を捨て、ペレットを３ｍｌの音波
処理緩衝液（２０ｍＭ ＫＰＯ4 ｐＨ７．４、１０ｍ
Ｍ β−メルカプトエタノール）中に再懸濁させた。該
細胞懸濁液にリゾチームを最終濃度２００μｇ／ｍｌで
加えた。該混合液を氷上に３時間維持し、次いで−２０
℃で凍結した。該混合物を氷上で解凍し、得られた懸濁
液２ｍｌを音波処理緩衝液２ｍｌと混合した。該懸濁液
に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の２５％溶液を０．４μ
ｌ加え、ピペットに出し入れすることにより混合した。
破壊された細胞を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し
た。該細胞抽出物７．５μｌを１２０μｌの１×Ｓｐｈ
Ｉ緩衝液及び５０μｇ／ｍｌ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ
（ＰｓｔＩで予め消化したもの）と一緒に３７℃で２時
間インキュベートすることにより、上清の制限エンドヌ
クレアーゼ活性をアッセイした。１５μｌ試料を電気泳
動によって調べたところ、制限エンドヌクレアーゼ活性
は認められなかった。
【００４６】１０． ４．５及び０．９ｋｂ ＰｓｔＩ
挿入物内のメチラーゼ遺伝子の位置： ＳｐｈＩメチラ
ーゼクローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消化し
て、クローン化ＤＮＡの制限マップを作成した。該マッ
プを用いて前記挿入物内の種々の領域を欠失させ、その
結果生じるメチル化への影響を調べた。ＰｓｔＩ部位に
またがる〜１ｋｂメチラーゼ遺伝子の位置が正確に定め
られ、該遺伝子の両側のクローン化ＤＮＡの長さは３．
５及び０．４ｋｂであることが判明した。メチラーゼク
ローンは、メチラーゼ遺伝子の右側には連結制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
（０．４ｋｂ）をもたないが、メチラーゼ遺伝子の左側
には十分な余地を有すると考えられた。しかしながら、
２つの遺伝子の間の距離、これら遺伝子の正確なサイ
ズ、及びこれら遺伝子が結合しているか否かは不明であ
ったため、クローンにおけるＳｐｈＩエンドヌクレアー
ゼ活性の欠如は、制限遺伝子がクローン中に存在してい
ないか、又は存在していても発現はされていないことを
示すものであった。制限遺伝子が存在していても発現は
されていないという場合には、隣接ＤＮＡを有するクロ
ーン化メチラーゼ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベ
クター中にサブクローニングし、これを用いてＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓを形質転換した
（ステップ１１，１２）。更に、メチラーゼクローンの
ＤＮＡ配列決定及びタンパク質配列決定を行って、クロ
ーン中に制限遺伝子の一部分もしくは全体が存在してい
るか、又は全く存在していないかを決定した（ステップ
１３〜１４）。完全な制限遺伝子が存在していない場合
には、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡのより大きな
領域をクローニングした（ステップ１５〜１７）。
挿入物内のメチラーゼ遺伝子の位置： ＳｐｈＩメチラ
ーゼクローンを多数の制限エンドヌクレアーゼで消化し
て、クローン化ＤＮＡの制限マップを作成した。該マッ
プを用いて前記挿入物内の種々の領域を欠失させ、その
結果生じるメチル化への影響を調べた。ＰｓｔＩ部位に
またがる〜１ｋｂメチラーゼ遺伝子の位置が正確に定め
られ、該遺伝子の両側のクローン化ＤＮＡの長さは３．
５及び０．４ｋｂであることが判明した。メチラーゼク
ローンは、メチラーゼ遺伝子の右側には連結制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡ
（０．４ｋｂ）をもたないが、メチラーゼ遺伝子の左側
には十分な余地を有すると考えられた。しかしながら、
２つの遺伝子の間の距離、これら遺伝子の正確なサイ
ズ、及びこれら遺伝子が結合しているか否かは不明であ
ったため、クローンにおけるＳｐｈＩエンドヌクレアー
ゼ活性の欠如は、制限遺伝子がクローン中に存在してい
ないか、又は存在していても発現はされていないことを
示すものであった。制限遺伝子が存在していても発現は
されていないという場合には、隣接ＤＮＡを有するクロ
ーン化メチラーゼ遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓベ
クター中にサブクローニングし、これを用いてＳｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓを形質転換した
（ステップ１１，１２）。更に、メチラーゼクローンの
ＤＮＡ配列決定及びタンパク質配列決定を行って、クロ
ーン中に制限遺伝子の一部分もしくは全体が存在してい
るか、又は全く存在していないかを決定した（ステップ
１３〜１４）。完全な制限遺伝子が存在していない場合
には、メチラーゼ遺伝子に隣接するＤＮＡのより大きな
領域をクローニングした（ステップ１５〜１７）。
【００４７】１１． Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中へのＳｐ
ｈＩメチラーゼサブクローンのクローニング： メチラ
ーゼクローンでは、制限エンドヌクレアーゼが連結して
いたならば、メチラーゼ遺伝子の正確な位置に依存し
て、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十
分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子の片側にクローン化され
た。しかしながら、前記クローンは制限エンドヌクレア
ーゼ活性を発現しなかったし、２つのＳｐｈＩ制限−修
飾遺伝子が結合されているという証拠もなかったため、
メチラーゼサブクローンを、大腸菌よりもＳ．ｐｈａｅ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓに近い関係をもつ種である
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中にクローニングしてみることに
した［以下に記載するのはｐＳｐｈＭ３．６由来の３．
６ｋｂ ＡｐａＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントのクローニ
ングである。ｐＳｐｈＭ２．６から単離した２．６ｋｂ
のＡｐａＩ−ＳｎａＢＩフラグメントについても同様の
サブクローニングを行った（部位の位置については図２
参照）。結果は同じであったため、ここではＡｐａＩ−
ＢｇｌＩＩサブクローニングのみを詳述する］１５μｌ
（１．０μｇ）のｐＳｐｈＭ３．６を、２０ＵのＥｃｏ
ＲＩ、２０ＵのＳｃａＩ及び２０ＵのＨｉｎｄIIIを含
む５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で３７℃で２時間消化した。
全体を０．７％アガロースゲル中で２時間電気泳動にか
けた。ＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳
動させることにより、３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限フラグメントを回収した。前記ペーパー
を、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌで
２回洗浄した。次いで、１．０ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝
液７５μｌで前記ペーパーを４回洗浄することより、Ｄ
ＮＡをペーパーから溶出させた。その結果得られたＤＮ
Ａフラグメント含有溶液を、３００μｌのフェノール／
クロロホルム及び３００μｌのクロロホルムで順次抽出
し、ドライアイス／エタノール浴中に１５分間配置して
１ｍｌの無水エタノールで沈澱させた。１４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心してＤＮＡをペレット化した。得られた
ペレットを７０％エタノールで濯ぎ、空気乾燥し、最終
量１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。１０μｌ（０．５μｇ）の
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ精製ＤＮＡフラグメント
を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し脱リン酸化し
たｐＩＪ４８６（ｐＩＪ４８６は Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅ
ｎｇｌａｎｄのＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手）２
μｌ（０．２μｇ）に、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（４００Ｕ）を含む１×連結緩衝液中５０μｌの最終量
で、１２℃で一晩連結させた。１０μｌの連結反応ミッ
クスを、約４×１０9のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２
４（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手。ＴＫ２４は、
Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載さ
れている）の原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）に加
えた。該原形質体は前出のＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら
の記述に従い、Ｐ緩衝液［１０３ｇのスクロース、０．
２５ｇのＫ2ＳＯ4、２．０２ｇのＭｇＣｌ2．６Ｈ2Ｏ、
２ｍｌの微量元素溶液及び８００ｍｌにするのに必要な
量の蒸留水。これを８０ｍｌアリコートずつ分配し、オ
ートクレーブ処理する。使用前に各８０ｍｌアリコート
に下記の成分を加える：１ｍｌの０．５％ＫＨ2ＰＯ4、
１０ｍｌの３．６８％ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ及び１０ｍｌ
の５．７３％ＴＥＳ緩衝液ｐＨ７．２。リットル当たり
の微量元素溶液：４０ｍｇのＺｎＣｌ2、２００ｍｇの
ＦｅＣｌ3．６Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、
１０ｍｇのＭｎＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのＮａ2Ｂ4Ｏ
7．１０Ｈ2Ｏ及び１０ｍｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24．４
Ｈ2Ｏ］中で調製した。原形質体／ＤＮＡ混合物に０．
５ｍｌの２５％ポリエチレングリコール１０００を加え
た。これを１ｍｌピペットに３回出し入れした。該形質
転換用ミックス０．１ｍｌを６つのＲ２ＹＥプレートの
各々にプレーティングした［１０３ｇスクロース、０．
２５ｇ Ｋ2ＳＯ4、１０．１２ｇ ＭｇＣｌ2・６Ｈ
2Ｏ、１０ｇグルコース，０．１ｇ Ｄｉｆｃｏカザミ
ノ酸及び８００ｍｌＨ2Ｏ。この溶液８０ｍｌを２．２
ｇのＤｉｆｃｏ寒天と混合し、オートクレーブ処理す
る。プレートを調製するために、前記ベース寒天溶液を
融解し、以下の無菌溶液を加える：１ｍｌ ０．５％Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、８ｍｌ ３．６８％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１．５ｍｌ ２０％Ｌ−プロリン，１０ｍｌ ５．７３
％ＴＥＳ緩衝液 ｐＨ７．２、０．２ｍｌ微量元素溶液
及び０．５ｍｌ １Ｎ ＮａＯＨ。このプレート材料を
層流フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）内
に入れて１時間以上乾燥する］。３０℃で一晩インキュ
ベートした後、前記プレートに１．０ｍｌのチオストレ
プトン水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を塗布した。コロニ
ーが増殖するまでプレートを３〜４日間３０℃に戻し
た。
ｈＩメチラーゼサブクローンのクローニング： メチラ
ーゼクローンでは、制限エンドヌクレアーゼが連結して
いたならば、メチラーゼ遺伝子の正確な位置に依存し
て、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十
分なＤＮＡがメチラーゼ遺伝子の片側にクローン化され
た。しかしながら、前記クローンは制限エンドヌクレア
ーゼ活性を発現しなかったし、２つのＳｐｈＩ制限−修
飾遺伝子が結合されているという証拠もなかったため、
メチラーゼサブクローンを、大腸菌よりもＳ．ｐｈａｅ
ｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓに近い関係をもつ種である
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中にクローニングしてみることに
した［以下に記載するのはｐＳｐｈＭ３．６由来の３．
６ｋｂ ＡｐａＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントのクローニ
ングである。ｐＳｐｈＭ２．６から単離した２．６ｋｂ
のＡｐａＩ−ＳｎａＢＩフラグメントについても同様の
サブクローニングを行った（部位の位置については図２
参照）。結果は同じであったため、ここではＡｐａＩ−
ＢｇｌＩＩサブクローニングのみを詳述する］１５μｌ
（１．０μｇ）のｐＳｐｈＭ３．６を、２０ＵのＥｃｏ
ＲＩ、２０ＵのＳｃａＩ及び２０ＵのＨｉｎｄIIIを含
む５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、５０ｍＭ ＮａＣｌ中で３７℃で２時間消化した。
全体を０．７％アガロースゲル中で２時間電気泳動にか
けた。ＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳
動させることにより、３．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ制限フラグメントを回収した。前記ペーパー
を、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液１５０μｌで
２回洗浄した。次いで、１．０ＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝
液７５μｌで前記ペーパーを４回洗浄することより、Ｄ
ＮＡをペーパーから溶出させた。その結果得られたＤＮ
Ａフラグメント含有溶液を、３００μｌのフェノール／
クロロホルム及び３００μｌのクロロホルムで順次抽出
し、ドライアイス／エタノール浴中に１５分間配置して
１ｍｌの無水エタノールで沈澱させた。１４０００ｒｐ
ｍで５分間遠心してＤＮＡをペレット化した。得られた
ペレットを７０％エタノールで濯ぎ、空気乾燥し、最終
量１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８及び１ｍＭ
ＥＤＴＡ中に再懸濁させた。１０μｌ（０．５μｇ）の
ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ精製ＤＮＡフラグメント
を、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し脱リン酸化し
たｐＩＪ４８６（ｐＩＪ４８６は Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅ
ｎｇｌａｎｄのＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手）２
μｌ（０．２μｇ）に、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（４００Ｕ）を含む１×連結緩衝液中５０μｌの最終量
で、１２℃で一晩連結させた。１０μｌの連結反応ミッ
クスを、約４×１０9のＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２
４（Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．から入手。ＴＫ２４は、
Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載さ
れている）の原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）に加
えた。該原形質体は前出のＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．ら
の記述に従い、Ｐ緩衝液［１０３ｇのスクロース、０．
２５ｇのＫ2ＳＯ4、２．０２ｇのＭｇＣｌ2．６Ｈ2Ｏ、
２ｍｌの微量元素溶液及び８００ｍｌにするのに必要な
量の蒸留水。これを８０ｍｌアリコートずつ分配し、オ
ートクレーブ処理する。使用前に各８０ｍｌアリコート
に下記の成分を加える：１ｍｌの０．５％ＫＨ2ＰＯ4、
１０ｍｌの３．６８％ＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ及び１０ｍｌ
の５．７３％ＴＥＳ緩衝液ｐＨ７．２。リットル当たり
の微量元素溶液：４０ｍｇのＺｎＣｌ2、２００ｍｇの
ＦｅＣｌ3．６Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、
１０ｍｇのＭｎＣｌ2．４Ｈ2Ｏ、１０ｍｇのＮａ2Ｂ4Ｏ
7．１０Ｈ2Ｏ及び１０ｍｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24．４
Ｈ2Ｏ］中で調製した。原形質体／ＤＮＡ混合物に０．
５ｍｌの２５％ポリエチレングリコール１０００を加え
た。これを１ｍｌピペットに３回出し入れした。該形質
転換用ミックス０．１ｍｌを６つのＲ２ＹＥプレートの
各々にプレーティングした［１０３ｇスクロース、０．
２５ｇ Ｋ2ＳＯ4、１０．１２ｇ ＭｇＣｌ2・６Ｈ
2Ｏ、１０ｇグルコース，０．１ｇ Ｄｉｆｃｏカザミ
ノ酸及び８００ｍｌＨ2Ｏ。この溶液８０ｍｌを２．２
ｇのＤｉｆｃｏ寒天と混合し、オートクレーブ処理す
る。プレートを調製するために、前記ベース寒天溶液を
融解し、以下の無菌溶液を加える：１ｍｌ ０．５％Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、８ｍｌ ３．６８％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、
１．５ｍｌ ２０％Ｌ−プロリン，１０ｍｌ ５．７３
％ＴＥＳ緩衝液 ｐＨ７．２、０．２ｍｌ微量元素溶液
及び０．５ｍｌ １Ｎ ＮａＯＨ。このプレート材料を
層流フード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ）内
に入れて１時間以上乾燥する］。３０℃で一晩インキュ
ベートした後、前記プレートに１．０ｍｌのチオストレ
プトン水溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を塗布した。コロニ
ーが増殖するまでプレートを３〜４日間３０℃に戻し
た。
【００４８】１２． 形質転換体の分析： チオストレ
プトン選択によって得たコロニーを、独立コロニーの単
離のために、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを入れた
Ｒ２ＹＥプレートで画線培養した。増殖したコロニーを
用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５ｍｌ
のＴＳＢ、Ｏｘｏｉｄ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ＳｏｙａＢ
ｒｏｔｈに接種した。これらの培養液を通気しながら３
０℃で２４時間インキュベートした。培養液１ｍｌにつ
いてミニプレップを実施した。この操作は、Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．７：１５１３（１９７９））によって記述されて
いる操作と同じであるが、相違点として、ＮａＯＨ−Ｓ
ＤＳ溶液を加える前に、４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５
０ｍＭグルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及
び１０ｍＭ ＥＤＴＡ中３７℃で３０分間インキュベー
トする必要がある。該ミニプレップＤＮＡ１０μｌを
０．７％アガロースゲル上で泳動させることにより分析
した。６つのクローンのうち２つが、ｐＩＪ４８６に挿
入された正確な大きさのフラグメントを有していると思
われた。これら２つの単離体に由来する胞子を回収し、
５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５００ｍｌのＴ
ＳＢに接種した。ＣｓＣｌプラスミドプレップを、前出
のＨｏｐｗｏｏｄらの論文ｐ９３に記載の方法３をスケ
ールアップ（２０倍）した方法に従って、前記培養液上
で調製した。得られたペレットを１７ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１８．７ｇ
ＣｓＣｌ及び０．４４ｍｌ エチジウムブロミド（５
ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。該溶液を２つの５／８
インチ×３インチポリアロマー遠心管に移し、密封し
た。これらの管をＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ローター内
で４４，０００ｒｐｍ、１７℃で４８時間遠心した。プ
ラスミドを回収するために管の頂部にメスで孔をあけ、
２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下でシリ
ンジにより回収した。両管から得た低い方のバンドを１
５ｍｌのＣｏｒｅｘ管に一緒に入れ、同量の水と３倍容
のエタノールとを加えることによりエチジウムブロミド
を除去した。−２０℃で２時間後、１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心することによりＤＮＡをペレット化し
た。得られたペレットを、２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。５０
μｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加え、ＤＮＡをフェノール／ク
ロロホルム及びクロロホルムで順次抽出した。前述のよ
うに３倍容のエタノールを該水溶液に加えてＤＮＡを沈
澱させた。ペレットを、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。精
製したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消
化して挿入物の存在を確認し、ＳｐｈＩで消化して、
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のサブクローンがＳｐｈＩメチ
ラーゼ活性を有しているかどうかを調べた。両サブクロ
ーンは明らかに同じものであり、正しい構造を有すると
共にメチラーゼ活性を示した。即ち、ＳｐｈＩ制限エン
ドヌクレアーゼで消化することができなかった。Ｓｐｈ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性を調べるために、プラス
ミドプレップに使用したものと同様に増殖させた培養液
５０ｍｌをペレット化した。得られたペレットを１０．
３％スクロースで洗浄し、−７０℃で凍結した。解凍
後、ペレットを湿潤細胞重量１ｇ当たり３ｍｌで５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、７ｍＭ β−メルカプトエ
タノール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ アジ化ナトリウ
ム及び２００ｍＭＮＡＣｌの溶液に再懸濁させた。氷上
で音波処理した後、１６，０００ｒｐｍで４５分間遠心
することにより破片を除去した。上清をＳｐｈＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。ｐＥＧｓ
ｐｈＭ２−４及びｐＥＧｓｐｈＭ２−６と称するこれら
のサブクローンは、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で検出可能
なＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。こ
れは、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈ
Ｉメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は該制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈＩメチラーゼクローン
上で完全なものではないことを意味する。
プトン選択によって得たコロニーを、独立コロニーの単
離のために、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを入れた
Ｒ２ＹＥプレートで画線培養した。増殖したコロニーを
用いて、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５ｍｌ
のＴＳＢ、Ｏｘｏｉｄ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ＳｏｙａＢ
ｒｏｔｈに接種した。これらの培養液を通気しながら３
０℃で２４時間インキュベートした。培養液１ｍｌにつ
いてミニプレップを実施した。この操作は、Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ及びＤｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．７：１５１３（１９７９））によって記述されて
いる操作と同じであるが、相違点として、ＮａＯＨ−Ｓ
ＤＳ溶液を加える前に、４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５
０ｍＭグルコース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及
び１０ｍＭ ＥＤＴＡ中３７℃で３０分間インキュベー
トする必要がある。該ミニプレップＤＮＡ１０μｌを
０．７％アガロースゲル上で泳動させることにより分析
した。６つのクローンのうち２つが、ｐＩＪ４８６に挿
入された正確な大きさのフラグメントを有していると思
われた。これら２つの単離体に由来する胞子を回収し、
５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む５００ｍｌのＴ
ＳＢに接種した。ＣｓＣｌプラスミドプレップを、前出
のＨｏｐｗｏｏｄらの論文ｐ９３に記載の方法３をスケ
ールアップ（２０倍）した方法に従って、前記培養液上
で調製した。得られたペレットを１７ｍｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１８．７ｇ
ＣｓＣｌ及び０．４４ｍｌ エチジウムブロミド（５
ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。該溶液を２つの５／８
インチ×３インチポリアロマー遠心管に移し、密封し
た。これらの管をＢｅｃｋｍａｎ Ｔｉ７０ローター内
で４４，０００ｒｐｍ、１７℃で４８時間遠心した。プ
ラスミドを回収するために管の頂部にメスで孔をあけ、
２つの蛍光ＤＮＡバンドのうち低い方を紫外光下でシリ
ンジにより回収した。両管から得た低い方のバンドを１
５ｍｌのＣｏｒｅｘ管に一緒に入れ、同量の水と３倍容
のエタノールとを加えることによりエチジウムブロミド
を除去した。−２０℃で２時間後、１２，０００ｒｐｍ
で２０分間遠心することによりＤＮＡをペレット化し
た。得られたペレットを、２ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。５０
μｌの８Ｍ ＬｉＣｌを加え、ＤＮＡをフェノール／ク
ロロホルム及びクロロホルムで順次抽出した。前述のよ
うに３倍容のエタノールを該水溶液に加えてＤＮＡを沈
澱させた。ペレットを、５００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。精
製したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消
化して挿入物の存在を確認し、ＳｐｈＩで消化して、
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中のサブクローンがＳｐｈＩメチ
ラーゼ活性を有しているかどうかを調べた。両サブクロ
ーンは明らかに同じものであり、正しい構造を有すると
共にメチラーゼ活性を示した。即ち、ＳｐｈＩ制限エン
ドヌクレアーゼで消化することができなかった。Ｓｐｈ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ活性を調べるために、プラス
ミドプレップに使用したものと同様に増殖させた培養液
５０ｍｌをペレット化した。得られたペレットを１０．
３％スクロースで洗浄し、−７０℃で凍結した。解凍
後、ペレットを湿潤細胞重量１ｇ当たり３ｍｌで５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、７ｍＭ β−メルカプトエ
タノール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ アジ化ナトリウ
ム及び２００ｍＭＮＡＣｌの溶液に再懸濁させた。氷上
で音波処理した後、１６，０００ｒｐｍで４５分間遠心
することにより破片を除去した。上清をＳｐｈＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。ｐＥＧｓ
ｐｈＭ２−４及びｐＥＧｓｐｈＭ２−６と称するこれら
のサブクローンは、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ中で検出可能
なＳｐｈＩエンドヌクレアーゼ活性を示さなかった。こ
れは、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈ
Ｉメチラーゼ遺伝子に結合していないか、又は該制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子がＳｐｈＩメチラーゼクローン
上で完全なものではないことを意味する。
【００４９】１３． エンドヌクレアーゼ遺伝子がクロ
ーン化フラグメント上に存在するか否かを調べるため
に、そして存在している場合にはその位置をつきとめる
ために、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを下記の方法
でできるだけ均質に精製した：４１３ｇのＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓから
の粗細胞抽出物１．１リットルを下記のカラム上に下記
の順序で配置した：ホスホセルロース、ヘパリン−セフ
ァロース、Ｑ−セファロース、ＭｏｎｏＱ ＨＰＬＣ及
びＭｏｎｏ−Ｓ ＨＰＬＣ。その結果、〜５０％の純度
のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物が得られた。
ーン化フラグメント上に存在するか否かを調べるため
に、そして存在している場合にはその位置をつきとめる
ために、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼを下記の方法
でできるだけ均質に精製した：４１３ｇのＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓから
の粗細胞抽出物１．１リットルを下記のカラム上に下記
の順序で配置した：ホスホセルロース、ヘパリン−セフ
ァロース、Ｑ−セファロース、ＭｏｎｏＱ ＨＰＬＣ及
びＭｏｎｏ−Ｓ ＨＰＬＣ。その結果、〜５０％の純度
のＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物が得られた。
【００５０】前記精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
を２５〜３０ｐＭ用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ モデル４７０Ａの気相タンパク質配列決定
器（ｇａｓ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ）でアミノ末端タンパク質の配列決定を行っ
た。該制限エンドヌクレアーゼの最初の１３個のアミノ
酸残基は、Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｖａｌ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｎ Ｉｌｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と決定された。
を２５〜３０ｐＭ用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ モデル４７０Ａの気相タンパク質配列決定
器（ｇａｓ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｒ）でアミノ末端タンパク質の配列決定を行っ
た。該制限エンドヌクレアーゼの最初の１３個のアミノ
酸残基は、Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｖａｌ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｎ Ｉｌｅ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と決定された。
【００５１】１４． 前記領域のＤＮＡ配列決定では、
前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域が部分的
ＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０上に存在するが、該
クローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は
存在せず、前記制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子の下流に
あり、メチラーゼ遺伝子と同じ方向で転写されることが
確認された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。該配列からは
更に、制限エンドヌクレアーゼの残りをクローニングし
次いで大腸菌中でのクローン化遺伝子の発現を誘起する
ための後続操作のベースとして使用されるデータも得ら
れた。
前記制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域が部分的
ＰｓｔＩクローンｐＳｐｈＭ６．０上に存在するが、該
クローン上には完全な制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は
存在せず、前記制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子の下流に
あり、メチラーゼ遺伝子と同じ方向で転写されることが
確認された（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。該配列からは
更に、制限エンドヌクレアーゼの残りをクローニングし
次いで大腸菌中でのクローン化遺伝子の発現を誘起する
ための後続操作のベースとして使用されるデータも得ら
れた。
【００５２】１５． 制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
残りをクローニングするのに最も有用な酵素を決定すべ
く、サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，９８：５０３）を用いて隣
接領域のゲノム地図を決定した。メチラーゼ遺伝子の一
部分又は全体を含む幾つかのクローンを使用して、サザ
ン、特定的にはｐＵＣ１９中にクローニングされた０．
９ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント又は１．４ｋｂ Ｓｍａ
Ｉ−ＡｐａＩフラグメント（図２）をプローブした。こ
れらのプラスミドを下記の方法でニックトランスレーシ
ョンにかけた：１μｌ（０．５μｇ）のＤＮＡと、１０
μｌの緩衝液（５００ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ７．８、１０
０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2）と、４μｌのｄＮＴＰ（各々０．１ｍｍｏｌ）
と、５μｌのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ（１００ｐｍｏｌｅ
ｓ、８００キュリー／ミリモル）と、１μｌのＤＮＡポ
リメラーゼＩ（２０単位）と、１μｌのＤＮＡｓｅＩ
（１μｇ／ｍｌ）と７８μｌのＨ2Ｏとを混合し、１５
℃で３時間インキュベートした。該混合物を５分間沸騰
させ、即座に氷上に配置した。
残りをクローニングするのに最も有用な酵素を決定すべ
く、サザンブロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．１９７
５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，９８：５０３）を用いて隣
接領域のゲノム地図を決定した。メチラーゼ遺伝子の一
部分又は全体を含む幾つかのクローンを使用して、サザ
ン、特定的にはｐＵＣ１９中にクローニングされた０．
９ｋｂ ＰｓｔＩフラグメント又は１．４ｋｂ Ｓｍａ
Ｉ−ＡｐａＩフラグメント（図２）をプローブした。こ
れらのプラスミドを下記の方法でニックトランスレーシ
ョンにかけた：１μｌ（０．５μｇ）のＤＮＡと、１０
μｌの緩衝液（５００ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ７．８、１０
０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2）と、４μｌのｄＮＴＰ（各々０．１ｍｍｏｌ）
と、５μｌのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ（１００ｐｍｏｌｅ
ｓ、８００キュリー／ミリモル）と、１μｌのＤＮＡポ
リメラーゼＩ（２０単位）と、１μｌのＤＮＡｓｅＩ
（１μｇ／ｍｌ）と７８μｌのＨ2Ｏとを混合し、１５
℃で３時間インキュベートした。該混合物を５分間沸騰
させ、即座に氷上に配置した。
【００５３】サザンブロットは下記のように調製した：
Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＥｃｏＲＩ，ＫａｓＩ、Ｍｌ
ｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｍｌＩ、ＳａｃＩ，Ｓ
ａｌＩ，ＳｃａＩＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ，ＳｎａＢＩ
及びＳｔｕＩで別個に消化した。消化物を１．０％アガ
ロースゲル上で電気泳動にかけた。該ゲルを０．２５Ｍ
ＨＣｌに１０分間、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌに３０分ずつ２回、次いで０．５Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌに３０分ずつ２回浸
漬した。ニトロセルロースシートを水に短時間浸漬し、
次いで１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）に浸漬した。厚さ２インチに積
重したペーパータオルと、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭペー
パー（１０×ＳＳＣに浸漬したもの）２枚と、湿潤ニト
ロセルロースメンブラン１枚と、処理したアガロースゲ
ルと、もう１枚のニトロセルロースメンブランと、もう
２枚の３ＭＭペーパーと、厚さ２インチに積重したペー
パータオルとを用いてサンドイッチを形成した。該サン
ドイッチに重みをかけて押さえ付け、ニトロセルロース
シートへのＤＮＡの移動を室温で一晩生起させた。該ニ
トロセルロースシートを０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウムで１０分間濯ぎ、真空炉で８０
℃で１．５時間加熱して、移動したＤＮＡフラグメント
をニトロセルロースに固定させた。４ｍｌの２０ｇ／ｌ
Ｆｉｃｏｌｌ、２０ｇ／ｌポリビニルピロリドン及び
１２ｇ／ｌウシ血清アルブミンと、１５ｍｌの２０×Ｓ
ＳＣ（４．５ｍｌの３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン
酸三ナトリウム）と、１００ｍｇ／ｍｌの変性し音波処
理したサケ精子ＤＮＡ１ｍｌと、８０ｍｌのＨ2Ｏとか
らなる溶液を１５ｍｌ入れたプラスチック袋の中に前記
シートを配置した。該シートを振盪しながら６５℃で２
時間インキュベートしてプレハイブリダイズした。１０
０μｌの放射性プローブを前記袋に加え、インキュベー
ションを振盪下６５℃で一晩続けた。次いで、ニトロセ
ルロースシートを２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで３０
分ずつ２回６５℃で洗浄し、０．２×ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳで３０分間６５℃で洗浄した。該シートを空気
乾燥し、一晩かけてオートラジオグラムを作製した。
Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、
ＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＹＩ、ＥｃｏＲＩ，ＫａｓＩ、Ｍｌ
ｕＩ、ＭｓｃＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｍｌＩ、ＳａｃＩ，Ｓ
ａｌＩ，ＳｃａＩＩ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ，ＳｎａＢＩ
及びＳｔｕＩで別個に消化した。消化物を１．０％アガ
ロースゲル上で電気泳動にかけた。該ゲルを０．２５Ｍ
ＨＣｌに１０分間、０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ
ＮａＣｌに３０分ずつ２回、次いで０．５Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５、１．５Ｍ ＮａＣｌに３０分ずつ２回浸
漬した。ニトロセルロースシートを水に短時間浸漬し、
次いで１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、１５０ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）に浸漬した。厚さ２インチに積
重したペーパータオルと、Ｗｈａｔｍａｎ ３ＭＭペー
パー（１０×ＳＳＣに浸漬したもの）２枚と、湿潤ニト
ロセルロースメンブラン１枚と、処理したアガロースゲ
ルと、もう１枚のニトロセルロースメンブランと、もう
２枚の３ＭＭペーパーと、厚さ２インチに積重したペー
パータオルとを用いてサンドイッチを形成した。該サン
ドイッチに重みをかけて押さえ付け、ニトロセルロース
シートへのＤＮＡの移動を室温で一晩生起させた。該ニ
トロセルロースシートを０．９Ｍ ＮａＣｌ、９０ｍＭ
クエン酸三ナトリウムで１０分間濯ぎ、真空炉で８０
℃で１．５時間加熱して、移動したＤＮＡフラグメント
をニトロセルロースに固定させた。４ｍｌの２０ｇ／ｌ
Ｆｉｃｏｌｌ、２０ｇ／ｌポリビニルピロリドン及び
１２ｇ／ｌウシ血清アルブミンと、１５ｍｌの２０×Ｓ
ＳＣ（４．５ｍｌの３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン
酸三ナトリウム）と、１００ｍｇ／ｍｌの変性し音波処
理したサケ精子ＤＮＡ１ｍｌと、８０ｍｌのＨ2Ｏとか
らなる溶液を１５ｍｌ入れたプラスチック袋の中に前記
シートを配置した。該シートを振盪しながら６５℃で２
時間インキュベートしてプレハイブリダイズした。１０
０μｌの放射性プローブを前記袋に加え、インキュベー
ションを振盪下６５℃で一晩続けた。次いで、ニトロセ
ルロースシートを２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで３０
分ずつ２回６５℃で洗浄し、０．２×ＳＳＣ及び０．１
％ＳＤＳで３０分間６５℃で洗浄した。該シートを空気
乾燥し、一晩かけてオートラジオグラムを作製した。
【００５４】該サザンブロットデータから、１０種のエ
ンドヌクレアーゼコーディングフラグメントの大体の寸
法が判明した。ＡｐａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｓｔＹＩ、Ｋ
ａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ，ＳａｃＩ，ＳｍａＩ及
びＳｔｕＩフラグメントはメチラーゼ遺伝子の右側にＤ
ＮＡを有する（図２）。プローブはＡｐａＩ消化物中で
１．２ｋｂバンドにハイブリダイズし、ＢａｍＨＩ消化
物中で７．５ｋｂバンドに、ＢｓｔＹＩ消化物中で４．
９ｋｂバンドに、ＫａｓＩ消化物中で０．９ｋｂバンド
に、ＭｌｕＩ消化物中で３．６ｋｂバンドに、ＰｖｕＩ
Ｉ消化物中で１．８ｋｂバンドに、ＳａｃＩ消化物中で
４．５ｋｂバンドに、ＳｍａＩ消化物中で２．４ｋｂバ
ンドに、そしてＳｔｕＩ消化物中では７．５ｋｂバンド
にハイブリダイズした。その他のバンドはクローン化す
るには大きすぎると判断された。
ンドヌクレアーゼコーディングフラグメントの大体の寸
法が判明した。ＡｐａＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｓｔＹＩ、Ｋ
ａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ，ＳａｃＩ，ＳｍａＩ及
びＳｔｕＩフラグメントはメチラーゼ遺伝子の右側にＤ
ＮＡを有する（図２）。プローブはＡｐａＩ消化物中で
１．２ｋｂバンドにハイブリダイズし、ＢａｍＨＩ消化
物中で７．５ｋｂバンドに、ＢｓｔＹＩ消化物中で４．
９ｋｂバンドに、ＫａｓＩ消化物中で０．９ｋｂバンド
に、ＭｌｕＩ消化物中で３．６ｋｂバンドに、ＰｖｕＩ
Ｉ消化物中で１．８ｋｂバンドに、ＳａｃＩ消化物中で
４．５ｋｂバンドに、ＳｍａＩ消化物中で２．４ｋｂバ
ンドに、そしてＳｔｕＩ消化物中では７．５ｋｂバンド
にハイブリダイズした。その他のバンドはクローン化す
るには大きすぎると判断された。
【００５５】１６． ＳｐｈＩメチラーゼ遺伝子の下流
の領域を有するクローンの単離：ＳｐｈＩメチラーゼで
予め保護した又は保護してない大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ宿主中に完全ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子をメチラーゼと共に又はメチラーゼ無しにクロー
ニングする試みは総て失敗したため、前記制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子の３’末端のみをクローニングする試
みを行った。ＤＮＡ配列及びサザン分析の結果、Ｋａｓ
Ｉ（又はＮａｒＩ）は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内
で切断を行い、約０．９ｋｂ下流の次の部位が制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端の下流のＤＮＡを開裂
する筈であることが判明した。０．９ｋｂのＫａｓＩフ
ラグメントをクローニングすれば、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の残りが得られる筈である。１００μｌ（９
μｇ）のゲノムＤＮＡを採取し、１２０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．９、１００μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ及び２０ＵＫａｓＩ中で３７℃で２時間消
化することによりＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓゲノムＤＮＡでＫａｓＩライブラリーを形成した。全
体を０．７％アガロースゲルで２時間電気泳動にかけ
た。０．７〜１．０ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメント
をＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳動さ
せることによって回収した。ステップ１１と同様の方法
でＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから溶出した。このペレッ
ト化ＤＮＡを２０μｌの１０ｍＭ トリス ｐＨ８．
０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。精製ＫａｓＩ消
化フラグメント２０μｌ（〜０．５μｇ）を、ＫａｓＩ
で開裂し脱リン酸処理した５μｌ（０．２μｇ）のｐＵ
Ｃ１９に、１×連結反応緩衝液（１μｌのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（４００Ｕ）含有）中５０μｌの最終量で４℃
で４８時間にわたり連結させた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
ＶＳ ０．０２５μＭフィルターを用いて滴下透析（ｄ
ｒｏｐ ｄｉａｌｙｓｉｓ）により１０μｌの連結反応
液を脱イオン処理した。次いでＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７
６７中にエレクトロポレート（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ
ｔｅ）させた。該大腸菌は、Ｌブロス中で１リットルの
細胞をＫｌｅｔｔ ５０〜８０まで増殖させることによ
りエレクトロポレーション（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）用に調製した。前記細胞は氷上で１５〜３０分間
冷却し、その後４，０００ｒｐｍで１５分間冷間遠心し
てペレット化した。該ペレットを氷冷無菌水で２回、１
０％グリセロールで１回洗浄した。洗浄したペレットを
１〜２ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁させて最終細
胞濃度を３×１０10細胞／ｍｌとした。細胞は必要時ま
で１００μｌアリコート中−７０℃で凍結した。調製し
た細胞中にＤＮＡをエレクトロポレートさせるべく、前
記細胞をゆっくり解凍し、氷上に配置した。該細胞４０
μｌを１０μｌの連結し透析したＤＮＡと混合した。該
混合物を、冷却した０．２ｃｍのエレクトロポレーショ
ンキュベット内に配置した。該ＤＮＡ細胞混合物に時定
数４〜５ｍｓｅｃ、１２．５ｋＶ／ｃｍで電気パルスを
印加した。大腸菌を２ｍｌのＬブロスで即座に希釈し、
３７℃で１時間増殖させ、その後１５０ｍｍのアンピシ
リン含有Ｌ寒天プレート８つにプレーティングした。３
７℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに１０
ｍｌのＬブロスを注入し、コロニーをまとめて掻き取っ
た。各プレートを別個にプールして、それぞれ５，００
０〜６，０００のコロニーを含むサブライブラリーを形
成した。各サブライブラリー０．８ｍｌに０．２ｍｌの
グリセロールを加え、凍結ストックとして−７０℃に維
持した。Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚのミニプレップ
操作（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ
及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８２，ｐｐ３６８−３
６９に記載）を用いて、但し操作全体を５倍にスケール
アップして、各サブライブラリーの残り９ｍｌ中の細胞
からプラスミドを単離した。最終ＤＮＡペレットを８．
５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、９．３５ｇ ＣｓＣｌ及び０．２５ｍｌエチジ
ウムブロミド（５ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させた。ステッ
プ１２と同様に勾配を形成してＤＮＡを精製した。サブ
ライブラリーから精製したプラスミドをステップ１５と
同様にＫａｓＩで消化し、アガロースゲル上を泳動さ
せ、ブロットし、ｐＳｐｈ０．９でプローブした。８つ
のサブライブラリーのうち３つが所望の０．９ｋｂ Ｋ
ａｓＩフラグメントを有しており、このフラグメントは
プローブとして使用した０．９ｋｂ ＰｓｔＩフラグメ
ントにハイブリダイズした。これらのサブライブラリー
から前記フラグメントを増幅するために、２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを調製した。プライマー１はＫ
ａｓＩ部位の５’側のｐＵＣ１９配列の一部分と、Ｋａ
ｓＩ部位の３’側でクローニングされ且つ配列決定され
た制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の領域とを含む：５’
ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＧＧ ＣＧＣＣＧＴ ＣＡＣ Ｃ
ＡＣ ＧＧＧ Ｃ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
プライマー２は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ製のＭ１３／ｐＵＣ逆配列決定プライマー（製品＃
１２３３）である。クローニングベクターｐＵＣ１９の
一部分を含むＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
３’セグメントを、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、各２００μＭのｄＮＴＰ、１００μｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ、５％ ＤＭＳＯ中で、１ＵＶｅｎｔ（登録
商標）ＤＮＡポリメラーゼとのＰＣＲ反応を、９５℃で
１．５分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２分間で
２０サイクル行うことによりサブライブラリーから増幅
した。該反応混合物を０．７％アガロースゲルで電気泳
動させた。約１．０〜１．２ｋｂの大きさのフラグメン
トをステップ１１と同様にＤＥＡＥペーパーを用いて精
製した。精製フラグメントをＫａｓＩで消化し、Ｋａｓ
Ｉ消化脱リン酸化ｐＵＣ１９中に連結した。得られた連
結体を大腸菌ＥＤ８７６７中にエレクトロポレートさ
せ、アンピシリン含有Ｌ寒天にプレーティングした。Ｉ
ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
前述の文献）を用いて３６の独立コロニー上でプラスミ
ドＤＮＡミニプレップを調製した。３６のコロニーのう
ち１つが、正確な大きさの０．９ｋｂ挿入物を有するプ
ラスミドを含んでいた。制限地図を作成したところ、該
コロニーは正しい制限酵素部位を有していた。サザン分
析の結果、新たに単離された前記コロニーはｐＳｐｈ
０．９にハイブリダイズすることが判明した。これは、
クローン化したフラグメントがおそらくは所望のフラグ
メントであることを意味するものである。前記０．９ｋ
ｂ ＫａｓＩフラグメントはＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の３’部分しか含んでいなかったため、遺
伝子が再構築されるまではエンドヌクレアーゼ活性試験
は不可能であった。該クローンをｐＥＧｓｐｈ４２−
１．４と命名した（図３）。
の領域を有するクローンの単離：ＳｐｈＩメチラーゼで
予め保護した又は保護してない大腸菌又はＳ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ宿主中に完全ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子をメチラーゼと共に又はメチラーゼ無しにクロー
ニングする試みは総て失敗したため、前記制限エンドヌ
クレアーゼ遺伝子の３’末端のみをクローニングする試
みを行った。ＤＮＡ配列及びサザン分析の結果、Ｋａｓ
Ｉ（又はＮａｒＩ）は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子内
で切断を行い、約０．９ｋｂ下流の次の部位が制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子の３’末端の下流のＤＮＡを開裂
する筈であることが判明した。０．９ｋｂのＫａｓＩフ
ラグメントをクローニングすれば、制限エンドヌクレア
ーゼ遺伝子の残りが得られる筈である。１００μｌ（９
μｇ）のゲノムＤＮＡを採取し、１２０μｌの１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．９、１００μｇ／
ｍｌ ＢＳＡ及び２０ＵＫａｓＩ中で３７℃で２時間消
化することによりＳ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓゲノムＤＮＡでＫａｓＩライブラリーを形成した。全
体を０．７％アガロースゲルで２時間電気泳動にかけ
た。０．７〜１．０ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメント
をＤＥＡＥアニオン交換ペーパー中に２時間電気泳動さ
せることによって回収した。ステップ１１と同様の方法
でＤＮＡをＤＥＡＥペーパーから溶出した。このペレッ
ト化ＤＮＡを２０μｌの１０ｍＭ トリス ｐＨ８．
０、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁させた。精製ＫａｓＩ消
化フラグメント２０μｌ（〜０．５μｇ）を、ＫａｓＩ
で開裂し脱リン酸処理した５μｌ（０．２μｇ）のｐＵ
Ｃ１９に、１×連結反応緩衝液（１μｌのＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（４００Ｕ）含有）中５０μｌの最終量で４℃
で４８時間にわたり連結させた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
ＶＳ ０．０２５μＭフィルターを用いて滴下透析（ｄ
ｒｏｐ ｄｉａｌｙｓｉｓ）により１０μｌの連結反応
液を脱イオン処理した。次いでＤＮＡを大腸菌ＥＤ８７
６７中にエレクトロポレート（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ
ｔｅ）させた。該大腸菌は、Ｌブロス中で１リットルの
細胞をＫｌｅｔｔ ５０〜８０まで増殖させることによ
りエレクトロポレーション（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）用に調製した。前記細胞は氷上で１５〜３０分間
冷却し、その後４，０００ｒｐｍで１５分間冷間遠心し
てペレット化した。該ペレットを氷冷無菌水で２回、１
０％グリセロールで１回洗浄した。洗浄したペレットを
１〜２ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁させて最終細
胞濃度を３×１０10細胞／ｍｌとした。細胞は必要時ま
で１００μｌアリコート中−７０℃で凍結した。調製し
た細胞中にＤＮＡをエレクトロポレートさせるべく、前
記細胞をゆっくり解凍し、氷上に配置した。該細胞４０
μｌを１０μｌの連結し透析したＤＮＡと混合した。該
混合物を、冷却した０．２ｃｍのエレクトロポレーショ
ンキュベット内に配置した。該ＤＮＡ細胞混合物に時定
数４〜５ｍｓｅｃ、１２．５ｋＶ／ｃｍで電気パルスを
印加した。大腸菌を２ｍｌのＬブロスで即座に希釈し、
３７℃で１時間増殖させ、その後１５０ｍｍのアンピシ
リン含有Ｌ寒天プレート８つにプレーティングした。３
７℃で一晩インキュベートした後、前記プレートに１０
ｍｌのＬブロスを注入し、コロニーをまとめて掻き取っ
た。各プレートを別個にプールして、それぞれ５，００
０〜６，０００のコロニーを含むサブライブラリーを形
成した。各サブライブラリー０．８ｍｌに０．２ｍｌの
グリセロールを加え、凍結ストックとして−７０℃に維
持した。Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚのミニプレップ
操作（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ
及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８２，ｐｐ３６８−３
６９に記載）を用いて、但し操作全体を５倍にスケール
アップして、各サブライブラリーの残り９ｍｌ中の細胞
からプラスミドを単離した。最終ＤＮＡペレットを８．
５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、９．３５ｇ ＣｓＣｌ及び０．２５ｍｌエチジ
ウムブロミド（５ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させた。ステッ
プ１２と同様に勾配を形成してＤＮＡを精製した。サブ
ライブラリーから精製したプラスミドをステップ１５と
同様にＫａｓＩで消化し、アガロースゲル上を泳動さ
せ、ブロットし、ｐＳｐｈ０．９でプローブした。８つ
のサブライブラリーのうち３つが所望の０．９ｋｂ Ｋ
ａｓＩフラグメントを有しており、このフラグメントは
プローブとして使用した０．９ｋｂ ＰｓｔＩフラグメ
ントにハイブリダイズした。これらのサブライブラリー
から前記フラグメントを増幅するために、２つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーを調製した。プライマー１はＫ
ａｓＩ部位の５’側のｐＵＣ１９配列の一部分と、Ｋａ
ｓＩ部位の３’側でクローニングされ且つ配列決定され
た制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の領域とを含む：５’
ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＧＧ ＣＧＣＣＧＴ ＣＡＣ Ｃ
ＡＣ ＧＧＧ Ｃ ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
プライマー２は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ製のＭ１３／ｐＵＣ逆配列決定プライマー（製品＃
１２３３）である。クローニングベクターｐＵＣ１９の
一部分を含むＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
３’セグメントを、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、各２００μＭのｄＮＴＰ、１００μｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ、５％ ＤＭＳＯ中で、１ＵＶｅｎｔ（登録
商標）ＤＮＡポリメラーゼとのＰＣＲ反応を、９５℃で
１．５分間、６０℃で１．５分間及び７２℃で２分間で
２０サイクル行うことによりサブライブラリーから増幅
した。該反応混合物を０．７％アガロースゲルで電気泳
動させた。約１．０〜１．２ｋｂの大きさのフラグメン
トをステップ１１と同様にＤＥＡＥペーパーを用いて精
製した。精製フラグメントをＫａｓＩで消化し、Ｋａｓ
Ｉ消化脱リン酸化ｐＵＣ１９中に連結した。得られた連
結体を大腸菌ＥＤ８７６７中にエレクトロポレートさ
せ、アンピシリン含有Ｌ寒天にプレーティングした。Ｉ
ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、
前述の文献）を用いて３６の独立コロニー上でプラスミ
ドＤＮＡミニプレップを調製した。３６のコロニーのう
ち１つが、正確な大きさの０．９ｋｂ挿入物を有するプ
ラスミドを含んでいた。制限地図を作成したところ、該
コロニーは正しい制限酵素部位を有していた。サザン分
析の結果、新たに単離された前記コロニーはｐＳｐｈ
０．９にハイブリダイズすることが判明した。これは、
クローン化したフラグメントがおそらくは所望のフラグ
メントであることを意味するものである。前記０．９ｋ
ｂ ＫａｓＩフラグメントはＳｐｈＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の３’部分しか含んでいなかったため、遺
伝子が再構築されるまではエンドヌクレアーゼ活性試験
は不可能であった。該クローンをｐＥＧｓｐｈ４２−
１．４と命名した（図３）。
【００５６】１７． ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
の再構築及び過剰発現：１０μｌ（５μｇ）のｐＥＧｓ
ｐｈ４２−１．４を使用して制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を再構築し、３μｌ（５μｇ）のｐＳｐｈ０．９を
別個に１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
アセテート、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢
酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．９）中３７℃で
２時間にわたりＭｓｃＩで消化した。インキュベーショ
ン後、消化物をフェノール：クロロホルムの１：１混合
物で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０倍容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍容の９５％エタノールと
で沈澱させた。エッペンドルフ遠心器で室温で５分間遠
心してＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで１回
洗浄した。該ペレットを１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２に再懸
濁させた。ＭｓｃＩで消化したｐＳｐｈ０．９を、２０
ＵのＸｂａＩの添加によって更に消化し、ＭｓｃＩで消
化したｐＥＧｓｐｈ４２−１．４を２０ＵのＨｉｎｄＩ
ＩＩの添加によって更に消化した。３７°で２時間後、
ＤＮＡを０．７％アガロースゲル上で泳動させた。Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを製造業者
の指示通りに使用して、ｐＳｐｈ０．９消化物から０．
６ｋｂバンドを精製し、ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４消化
物から１ｋｂバンドを精製した。これら２つのフラグメ
ント（各々〜０．５μｇ）を１×リガーゼ緩衝液、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）中１２℃で１８時間連結
反応させた（図４）。この連結フラグメントを、Ｓｐｈ
Ｉメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主
中で高コピープラスミド中にクローニングする試みは総
て失敗に終わったため、再構築フラグメントを、調節し
た大腸菌プロモーターの後ろに直接クローニングしてみ
ることにした。ＤＮＡ及びタンパク質の配列データを用
いて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを形成した。
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質の
配列決定によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点であ
ることが判明したＡＵＧコドンと重複する配列を含んで
おり、２つの塩基が変化してＢｓｐＨＩ部位を形成して
いた：５’ ＣＣＴ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＴＧ
ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ ３’ ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４。第２のオリゴヌクレオチドプライマ
ーはｐＵＣ１９中のＫａｓＩ部位の左側に配列を含んで
おり、増幅したフラグメントのクローニングを助けるた
めにＨｉｎｄＩＩＩ部位が該プライマー中に含まれてい
る：５’ ＧＣＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＧＡ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５。これら２つのプライマーを、ｐＳｐｈ０．９及
びｐＥＧｓｐｈ４２−１．４（既述）由来の連結フラグ
メントと一緒に、１ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅す
るためのＰＣＲ（ステップ１６の条件を使用する）で鋳
型として使用した。ステップ１１と同様にＤＥＡＥペー
パーを用いてバンドを精製した。精製したＰＣＲ生成物
を１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４中で２ＵのＢｓｐＨＩで２時
間消化し、次いで１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中で２０Ｕの
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＥＡＥペーパーを用いてア
ガロースゲルから精製した（図４）。精製フラグメント
（〜０．１μｇ）を、４００ＵのＴＡ ＤＮＡリガーゼ
を用いて３７℃で２時間にわたり総量４０μｌでＮｃｏ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ（〜０．０５μｇ）で消化したＰ
tac発現ベクターｐＡＧＲ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｗ．Ｊａｃｋから入手）中に連結し
た。（ｐＡＧＲ３は、アンピシリン耐性遺伝子とｌａｃ
Ｉqの単一コピーと、Ｐｔａｃプロモーターと、リード
スルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写を防止するた
めのＰｔａｃプロモーターの上流のｒｒｎbターミネー
ターの４倍直接反復（４ ｆｏｌｄ ｄｉｒｅｃｔ ｒ
ｅｐｅａｔ）と、ｌａｃリボソーム結合部位の下流のＮ
ｃｏＩ部位とを含むｐＢＲ３２２ベースのベクターであ
る。）ｐＳＹＸ２０上のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子
を有するコンピテント大腸菌ＥＤ８７６７を形質転換す
るために前記連結体を２０μｌ使用した。［ＮｌａＩＩ
Ｉメチル化認識部位ＣＡＴＧはＳｐｈＩ制限エンドヌク
レアーゼ認識部位と重複するため宿主をＳｐｈＩ消化か
ら防護する。ｐＳＹＸ２０（ＡＴＣＣ＃７５２６０）は
ｐＳＣ１０１複製開始点上にＫａｎr及びＴｃr遺伝子を
有する中間コピー数プラスミドである。Ｔｃr遺伝子に
挿入されたメチラーゼ遺伝子はＴｃプロモーターから構
築的に発現できる。］形質転換細胞を３７℃で３０分間
増殖させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含むＬ寒天にプレーティ
ングした。３６のコロニーを採取し、独立したコロニー
を単離すべく、アンピシリン及びカナマイシン含有Ｌ寒
天上で画線培養した。ステップ８のミニプラスミドプレ
ップ操作を用いて個々のコロニーからプラスミドを単離
した。各ミニプレップ５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を
ｐＡＧＲ３のＨｉｎｄＩＩＩ消化物と比較した。３６の
クローンのうち２４がｐＡＧＲ３より大きいプラスミド
を有していると思われた。特徴を更に調べるために、こ
れらのクローンから６つを選択した。これら６つのクロ
ーンをアンピシリン及びカナマイシン含有Ｌブロス２０
０ｍｌ中でＫｌｅｔｔ６０（中間対数期）まで増殖さ
せ、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。誘導後２時間で培養
液を５０ｍｌ採取した。遠心分離によって細胞を回収
し、音波処理用冷却緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び１ｍＭアジ化ナト
リウム）で１回洗浄し、ペレットを−７０℃で凍結し
た。３０分後、ペレットを氷上で解凍し、細胞１ｇ当た
り３ｍｌの音波処理用緩衝液に再懸濁させ、氷上で音波
処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐ
ｍで１時間遠心した。各抽出物１μｌを、１２μｌのｐ
ＢＲ３２２（１２μｇ）と９０μｌの１０×ＮＥＢｕｆ
ｆｅｒ２と２２．５μｌのＰｓｔＩ（２０Ｕ／μｌ）と
を含むＤＮＡ混合物４９μｌと混合し、水で９００μｌ
にした。該試験管から２５μｌを採取して２５μｌのＤ
ＮＡ混合物と混合し、１：１の希釈を行った。１：１希
釈を更に３回続けて行った。該反応混合物を３７℃で１
時間インキュベートした。２５μｌの反応混合物全部を
０．７％アガロースゲル上で泳動させた。粗細胞抽出物
からの力価を、精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼか
らの既知の力価と比較した。６つのクローンのうち１つ
は、検出可能なＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
殆ど又は全く示さなかった。これに対し、５つのクロー
ンはＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性が大きすぎ
て、該アッセイでは力価を正確に測定することができな
かった。しかしながら、該酵素の力価は細胞１ｇ当たり
１０5単位を超えると推定された。更に滴定したとこ
ろ、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性は約１．５×
１０7〜３×１０7であった。この値は、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓの粗抽
出物で観察される細胞１ｇ当たりのＳｐｈＩ制限エンド
ヌクレアーゼ活性の約１０００倍以上である。特徴を更
に調べ且つ最適化するために前記クローンから選択した
１つのクローンに株名ＮＥＢ＃８０８を付与し、プラス
ミドはｐＧＥｓｐｈ５０−２と命名した。ＮＥＢ＃８０
８の試料を、１９９２年８月５日にＭａｒｙｌａｎｄ，
ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した。受託
番号は６９０４５である。ＮＥＢ＃８０８の粗抽出物か
ら得たＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図
５に示す。
の再構築及び過剰発現：１０μｌ（５μｇ）のｐＥＧｓ
ｐｈ４２−１．４を使用して制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子を再構築し、３μｌ（５μｇ）のｐＳｐｈ０．９を
別個に１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
アセテート、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ酢
酸カリウム、１ｍＭ ＤＴＴ ｐＨ７．９）中３７℃で
２時間にわたりＭｓｃＩで消化した。インキュベーショ
ン後、消化物をフェノール：クロロホルムの１：１混合
物で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０倍容の
３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍容の９５％エタノールと
で沈澱させた。エッペンドルフ遠心器で室温で５分間遠
心してＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで１回
洗浄した。該ペレットを１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２に再懸
濁させた。ＭｓｃＩで消化したｐＳｐｈ０．９を、２０
ＵのＸｂａＩの添加によって更に消化し、ＭｓｃＩで消
化したｐＥＧｓｐｈ４２−１．４を２０ＵのＨｉｎｄＩ
ＩＩの添加によって更に消化した。３７°で２時間後、
ＤＮＡを０．７％アガロースゲル上で泳動させた。Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを製造業者
の指示通りに使用して、ｐＳｐｈ０．９消化物から０．
６ｋｂバンドを精製し、ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４消化
物から１ｋｂバンドを精製した。これら２つのフラグメ
ント（各々〜０．５μｇ）を１×リガーゼ緩衝液、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ）中１２℃で１８時間連結
反応させた（図４）。この連結フラグメントを、Ｓｐｈ
Ｉメチラーゼで予め保護したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ宿主
中で高コピープラスミド中にクローニングする試みは総
て失敗に終わったため、再構築フラグメントを、調節し
た大腸菌プロモーターの後ろに直接クローニングしてみ
ることにした。ＤＮＡ及びタンパク質の配列データを用
いて２つのオリゴヌクレオチドプライマーを形成した。
第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、タンパク質の
配列決定によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の出発点であ
ることが判明したＡＵＧコドンと重複する配列を含んで
おり、２つの塩基が変化してＢｓｐＨＩ部位を形成して
いた：５’ ＣＣＴ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＴＡ ＧＴＧ
ＡＡＧ ＴＣＡ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｇ ３’ ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４。第２のオリゴヌクレオチドプライマ
ーはｐＵＣ１９中のＫａｓＩ部位の左側に配列を含んで
おり、増幅したフラグメントのクローニングを助けるた
めにＨｉｎｄＩＩＩ部位が該プライマー中に含まれてい
る：５’ ＧＣＧ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＡＡ ＴＧＡ
ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＣ ３’ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：５。これら２つのプライマーを、ｐＳｐｈ０．９及
びｐＥＧｓｐｈ４２−１．４（既述）由来の連結フラグ
メントと一緒に、１ｋｂ ＤＮＡフラグメントを増幅す
るためのＰＣＲ（ステップ１６の条件を使用する）で鋳
型として使用した。ステップ１１と同様にＤＥＡＥペー
パーを用いてバンドを精製した。精製したＰＣＲ生成物
を１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ４中で２ＵのＢｓｐＨＩで２時
間消化し、次いで１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ２中で２０Ｕの
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＤＥＡＥペーパーを用いてア
ガロースゲルから精製した（図４）。精製フラグメント
（〜０．１μｇ）を、４００ＵのＴＡ ＤＮＡリガーゼ
を用いて３７℃で２時間にわたり総量４０μｌでＮｃｏ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ（〜０．０５μｇ）で消化したＰ
tac発現ベクターｐＡＧＲ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｗ．Ｊａｃｋから入手）中に連結し
た。（ｐＡＧＲ３は、アンピシリン耐性遺伝子とｌａｃ
Ｉqの単一コピーと、Ｐｔａｃプロモーターと、リード
スルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写を防止するた
めのＰｔａｃプロモーターの上流のｒｒｎbターミネー
ターの４倍直接反復（４ ｆｏｌｄ ｄｉｒｅｃｔ ｒ
ｅｐｅａｔ）と、ｌａｃリボソーム結合部位の下流のＮ
ｃｏＩ部位とを含むｐＢＲ３２２ベースのベクターであ
る。）ｐＳＹＸ２０上のＮｌａＩＩＩメチラーゼ遺伝子
を有するコンピテント大腸菌ＥＤ８７６７を形質転換す
るために前記連結体を２０μｌ使用した。［ＮｌａＩＩ
Ｉメチル化認識部位ＣＡＴＧはＳｐｈＩ制限エンドヌク
レアーゼ認識部位と重複するため宿主をＳｐｈＩ消化か
ら防護する。ｐＳＹＸ２０（ＡＴＣＣ＃７５２６０）は
ｐＳＣ１０１複製開始点上にＫａｎr及びＴｃr遺伝子を
有する中間コピー数プラスミドである。Ｔｃr遺伝子に
挿入されたメチラーゼ遺伝子はＴｃプロモーターから構
築的に発現できる。］形質転換細胞を３７℃で３０分間
増殖させ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）とを含むＬ寒天にプレーティ
ングした。３６のコロニーを採取し、独立したコロニー
を単離すべく、アンピシリン及びカナマイシン含有Ｌ寒
天上で画線培養した。ステップ８のミニプラスミドプレ
ップ操作を用いて個々のコロニーからプラスミドを単離
した。各ミニプレップ５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ消化物を
ｐＡＧＲ３のＨｉｎｄＩＩＩ消化物と比較した。３６の
クローンのうち２４がｐＡＧＲ３より大きいプラスミド
を有していると思われた。特徴を更に調べるために、こ
れらのクローンから６つを選択した。これら６つのクロ
ーンをアンピシリン及びカナマイシン含有Ｌブロス２０
０ｍｌ中でＫｌｅｔｔ６０（中間対数期）まで増殖さ
せ、１ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。誘導後２時間で培養
液を５０ｍｌ採取した。遠心分離によって細胞を回収
し、音波処理用冷却緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ及び１ｍＭアジ化ナト
リウム）で１回洗浄し、ペレットを−７０℃で凍結し
た。３０分後、ペレットを氷上で解凍し、細胞１ｇ当た
り３ｍｌの音波処理用緩衝液に再懸濁させ、氷上で音波
処理した。音波処理した細胞抽出物を１６，０００ｒｐ
ｍで１時間遠心した。各抽出物１μｌを、１２μｌのｐ
ＢＲ３２２（１２μｇ）と９０μｌの１０×ＮＥＢｕｆ
ｆｅｒ２と２２．５μｌのＰｓｔＩ（２０Ｕ／μｌ）と
を含むＤＮＡ混合物４９μｌと混合し、水で９００μｌ
にした。該試験管から２５μｌを採取して２５μｌのＤ
ＮＡ混合物と混合し、１：１の希釈を行った。１：１希
釈を更に３回続けて行った。該反応混合物を３７℃で１
時間インキュベートした。２５μｌの反応混合物全部を
０．７％アガロースゲル上で泳動させた。粗細胞抽出物
からの力価を、精製ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼか
らの既知の力価と比較した。６つのクローンのうち１つ
は、検出可能なＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を
殆ど又は全く示さなかった。これに対し、５つのクロー
ンはＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性が大きすぎ
て、該アッセイでは力価を正確に測定することができな
かった。しかしながら、該酵素の力価は細胞１ｇ当たり
１０5単位を超えると推定された。更に滴定したとこ
ろ、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性は約１．５×
１０7〜３×１０7であった。この値は、Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓの粗抽
出物で観察される細胞１ｇ当たりのＳｐｈＩ制限エンド
ヌクレアーゼ活性の約１０００倍以上である。特徴を更
に調べ且つ最適化するために前記クローンから選択した
１つのクローンに株名ＮＥＢ＃８０８を付与し、プラス
ミドはｐＧＥｓｐｈ５０−２と命名した。ＮＥＢ＃８０
８の試料を、１９９２年８月５日にＭａｒｙｌａｎｄ，
ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託した。受託
番号は６９０４５である。ＮＥＢ＃８０８の粗抽出物か
ら得たＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ活性の滴定を図
５に示す。
【００５７】１８． ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
は次の方法でＮＥＢ＃８０８から産生し得る。まず、ア
ンピシリン及びカナマイシン含有豊栄養培地を入れた発
酵槽で中間対数期まで増殖させる。次いでＩＰＴＧを最
終濃度１ｍＭまで添加することにより前記培地を誘導
し、１〜２時間増殖させ続ける。その後、遠心分離によ
って細胞を回収する。
は次の方法でＮＥＢ＃８０８から産生し得る。まず、ア
ンピシリン及びカナマイシン含有豊栄養培地を入れた発
酵槽で中間対数期まで増殖させる。次いでＩＰＴＧを最
終濃度１ｍＭまで添加することにより前記培地を誘導
し、１〜２時間増殖させ続ける。その後、遠心分離によ
って細胞を回収する。
【００５８】１９． ＮＥＢ＃８０８からのＳｐｈＩ制
限エンドヌクレアーゼの精製：以下の操作は総て氷上又
は４℃で実施した。０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ
（２０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ６．９、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、５
％グリセロール）２９１ｍｌに細胞９７ｇを再懸濁さ
せ、１１，５００ＰＳＩＧでフレンチプレスに１回通し
て破壊した。該抽出物を１２，０００ｒｐｍ、４℃で９
０分間遠心し、得られた上清を、０．２Ｍ ＮａＣｌ含
有緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６
Ｂのカラム（５×１０ｃｍ）に通した。素通り液（ｆｌ
ｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を集め、緩衝液Ａで１：１で希
釈し、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで平衡化したヘ
パリンセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（５×８ｃｍ）
にかけた。該カラムを、０．１ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ
３５０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液
Ａ８００ｍｌと１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ ８００ｍ
ｌとで調製した塩化ナトリウム直線勾配にかけた。フラ
クションを流速５ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピーク
をプールし、０．５５〜０．７５Ｍ ＮａＣｌでカラム
から溶離した。５０ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａに対し
て一晩透析した後、プールした酵素を、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ含有緩衝液Ａで平衡化したＭｏｎｏ Ｑ（登録商
標）ＨＲ １０／１０（８ｍｌ）に充填した。フラクシ
ョンを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピーク
をプールし、０．３〜０．３５Ｍ ＮａＣｌでカラムか
ら溶離した。該プールを緩衝液ＡでＮａＣｌ濃度５０ｍ
Ｍまで希釈し、ＴＳＫ−ヘパリンＴｏｓｏＨａａｓ ５
ＰＷカラム（７．５ｃｍ×７．５ｍｍ ＩＤ）に充填し
た。フラクションを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵
素活性ピークを０．４２〜０．５Ｍ ＮａＣｌでカラム
から溶離した。活性を含むフラクションをプールし、緩
衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ
塩化ナトリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５０％グリセロール）に対して透析することにより
濃縮した。この精製方法では合計１０．８×１０6単位
の酵素が得られた。収率は１％である。
限エンドヌクレアーゼの精製：以下の操作は総て氷上又
は４℃で実施した。０．２Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ
（２０ｍＭ リン酸カリウム ｐＨ６．９、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、５
％グリセロール）２９１ｍｌに細胞９７ｇを再懸濁さ
せ、１１，５００ＰＳＩＧでフレンチプレスに１回通し
て破壊した。該抽出物を１２，０００ｒｐｍ、４℃で９
０分間遠心し、得られた上清を、０．２Ｍ ＮａＣｌ含
有緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６
Ｂのカラム（５×１０ｃｍ）に通した。素通り液（ｆｌ
ｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を集め、緩衝液Ａで１：１で希
釈し、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａで平衡化したヘ
パリンセファロースＣＬ−６Ｂのカラム（５×８ｃｍ）
にかけた。該カラムを、０．１ＭＮａＣｌ含有緩衝液Ａ
３５０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液
Ａ８００ｍｌと１Ｍ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａ ８００ｍ
ｌとで調製した塩化ナトリウム直線勾配にかけた。フラ
クションを流速５ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピーク
をプールし、０．５５〜０．７５Ｍ ＮａＣｌでカラム
から溶離した。５０ｍＭ ＮａＣｌ含有緩衝液Ａに対し
て一晩透析した後、プールした酵素を、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ含有緩衝液Ａで平衡化したＭｏｎｏ Ｑ（登録商
標）ＨＲ １０／１０（８ｍｌ）に充填した。フラクシ
ョンを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵素活性ピーク
をプールし、０．３〜０．３５Ｍ ＮａＣｌでカラムか
ら溶離した。該プールを緩衝液ＡでＮａＣｌ濃度５０ｍ
Ｍまで希釈し、ＴＳＫ−ヘパリンＴｏｓｏＨａａｓ ５
ＰＷカラム（７．５ｃｍ×７．５ｍｍ ＩＤ）に充填し
た。フラクションを流速１．０ｍｌ／分で回収した。酵
素活性ピークを０．４２〜０．５Ｍ ＮａＣｌでカラム
から溶離した。活性を含むフラクションをプールし、緩
衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５０ｍＭ
塩化ナトリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ、５０％グリセロール）に対して透析することにより
濃縮した。この精製方法では合計１０．８×１０6単位
の酵素が得られた。収率は１％である。
【００５９】前記精製方法によって得たＳｐｈＩ制限エ
ンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エン
ドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなか
った。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度を
下記の基準に従って調べた。
ンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的エン
ドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなか
った。ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ調製物の純度を
下記の基準に従って調べた。
【００６０】１）連結反応：λＤＮＡの２０倍過剰消化
後には、産生したＤＮＡフラグメントの９５％以上がＴ
４ ＤＮＡリガーゼに連結した（５’末端濃度は１６℃
で１〜２μＭ）。これらの連結フラグメントの９５％は
再切断が可能であった。２）長時間の消化：１μｇのλ
ＤＮＡと１０単位の酵素とを含む５０μｌの反応混合物
を１６時間インキュベートすると、１単位の酵素で１時
間反応させた場合と同じパターンのＤＮＡバンドが形成
された。３）エキソヌクレアーゼ活性：音波処理した3
Ｈ ＤＮＡ（１０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む５０
μｌの反応液中３７℃で４時間にわたり３，０００単位
の酵素をインキュベートすると、０．０１％未満の放射
能が放出された。４）エンドヌクレアーゼ汚染：1μgの
ΦＸ１７４ＲＦＩ ＤＮＡを含む５０μｌの反応液中３
７℃で４時間にわたり１５０単位の酵素をインキュベー
トすると、２５％未満がＲＦ ＩＩに転換した。試験は
総て次の反応緩衝液中で実施した：５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨは２５℃で７．９）。
後には、産生したＤＮＡフラグメントの９５％以上がＴ
４ ＤＮＡリガーゼに連結した（５’末端濃度は１６℃
で１〜２μＭ）。これらの連結フラグメントの９５％は
再切断が可能であった。２）長時間の消化：１μｇのλ
ＤＮＡと１０単位の酵素とを含む５０μｌの反応混合物
を１６時間インキュベートすると、１単位の酵素で１時
間反応させた場合と同じパターンのＤＮＡバンドが形成
された。３）エキソヌクレアーゼ活性：音波処理した3
Ｈ ＤＮＡ（１０5 ｃｐｍ／μｇ）１μｇを含む５０
μｌの反応液中３７℃で４時間にわたり３，０００単位
の酵素をインキュベートすると、０．０１％未満の放射
能が放出された。４）エンドヌクレアーゼ汚染：1μgの
ΦＸ１７４ＲＦＩ ＤＮＡを含む５０μｌの反応液中３
７℃で４時間にわたり１５０単位の酵素をインキュベー
トすると、２５％未満がＲＦ ＩＩに転換した。試験は
総て次の反応緩衝液中で実施した：５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
2、１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨは２５℃で７．９）。
【００６１】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：２３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【００６２】
【化１】 配列番号：２ 配列の長さ：２６９２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７０３．．１６５３ 他の情報：／ｎｏｔｅ＝「メチラーゼ遺伝子は位置７０
３で始まり１６５３で終わる。制限エンドヌクレアーゼ
は位置１７０３で始まり２４１０で終わる」 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１７０３．．２４１０ 配列
３で始まり１６５３で終わる。制限エンドヌクレアーゼ
は位置１７０３で始まり２４１０で終わる」 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１７０３．．２４１０ 配列
【００６３】
【化２】
【００６４】
【化３】
【００６５】
【化４】
【００６６】
【化５】 配列番号：３ 配列の長さ：２５塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６７】
【化６】 配列番号：４ 配列の長さ：２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列
【００６８】
【化７】 配列番号：５ 配列の長さ：２６塩基対 配列の型：核酸 鎖の長さ：不明 トポロジー：不明 配列
【００６９】
【化８】
【図１】ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをクローン化
し産生するための好ましい方法の説明図である。クロー
ニングプロジェクトに着手した時には、ＳｐｈＩ制限−
修飾系のクローニングでどのエンドヌクレアーゼ又は条
件が有利であるかも、またこれらのクローンにおける制
限及び修飾遺伝子の位置も不明であった。図１及び実施
例１に記載のクローニングの結果及びＤＮＡの配列決
定、マッピング並びにクローンの特徴分析は、当初不明
であったＳｐｈＩ制限−修飾系のクローニング及び発現
の直接的経路を明らかにするものである。
し産生するための好ましい方法の説明図である。クロー
ニングプロジェクトに着手した時には、ＳｐｈＩ制限−
修飾系のクローニングでどのエンドヌクレアーゼ又は条
件が有利であるかも、またこれらのクローンにおける制
限及び修飾遺伝子の位置も不明であった。図１及び実施
例１に記載のクローニングの結果及びＤＮＡの配列決
定、マッピング並びにクローンの特徴分析は、当初不明
であったＳｐｈＩ制限−修飾系のクローニング及び発現
の直接的経路を明らかにするものである。
【図２】ＰｓｔＩライブラリーのメチラーゼ選択によっ
て得たＰｓｔＩの部分的クローンｐＳｐｈＭ６．０の地
図である。
て得たＰｓｔＩの部分的クローンｐＳｐｈＭ６．０の地
図である。
【図３】Ｓ．ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓゲノム
ＤＮＡから調製したＫａｓＩライブラリーからＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを単離する方法を
簡単に示す説明図である。図面上部に示されている点々
模様の大きな四角い枠はＫａｓＩライブラリーを表し、
該枠内の２つの円は種々のクローンの中の２つのプラス
ミドであって、（円内に長い矢印で示されているよう
に）ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含
んでいる。矢頭は、ＫａｓＩライブラリーから所望のフ
ラグメントを増幅するのに使用されるプライマーの位置
を示している。プラスミド上の小さな四角い枠はベクタ
ー上の多重クローニング部位の位置を示す。
ＤＮＡから調製したＫａｓＩライブラリーからＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを単離する方法を
簡単に示す説明図である。図面上部に示されている点々
模様の大きな四角い枠はＫａｓＩライブラリーを表し、
該枠内の２つの円は種々のクローンの中の２つのプラス
ミドであって、（円内に長い矢印で示されているよう
に）ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の残りを含
んでいる。矢頭は、ＫａｓＩライブラリーから所望のフ
ラグメントを増幅するのに使用されるプライマーの位置
を示している。プラスミド上の小さな四角い枠はベクタ
ー上の多重クローニング部位の位置を示す。
【図４】ｐＥＧｓｐｈ４２−１．４と、ｐＥＧｓｐｈＲ
５０−２を得るための制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
最構築及びＰＣＲとを簡単に示す説明図である。ｐＳｐ
ｈＭ０．９はｐＵＣ１９にクローニングされたｐＳｐｈ
Ｍ６．０からの０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントであ
る。ｐＳｐｈＭ０．９の地図に示されているＸｂａＩ部
位はベクター内の部位であり、ＳｐｈＩ制限修飾系をコ
ードするＤＮＡの一部分ではない。ｐＥＧｓｐｈ４２−
１．４内の点線は、地図上の該領域がベクターｐＵＣ１
９に由来するものであることを示している（ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位も含まれる）。再構築エンドヌクレアーゼ遺伝
子の下に記されている太枠で囲まれた矢印は、過剰発現
用にｐＥＧｓｐｈＲ５０−１を構築するためにエンドヌ
クレアーゼ遺伝子のＰＣＲに使用されるプライマーの位
置及び方向を示している。
５０−２を得るための制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の
最構築及びＰＣＲとを簡単に示す説明図である。ｐＳｐ
ｈＭ０．９はｐＵＣ１９にクローニングされたｐＳｐｈ
Ｍ６．０からの０．９ｋｂのＰｓｔＩフラグメントであ
る。ｐＳｐｈＭ０．９の地図に示されているＸｂａＩ部
位はベクター内の部位であり、ＳｐｈＩ制限修飾系をコ
ードするＤＮＡの一部分ではない。ｐＥＧｓｐｈ４２−
１．４内の点線は、地図上の該領域がベクターｐＵＣ１
９に由来するものであることを示している（ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位も含まれる）。再構築エンドヌクレアーゼ遺伝
子の下に記されている太枠で囲まれた矢印は、過剰発現
用にｐＥＧｓｐｈＲ５０−１を構築するためにエンドヌ
クレアーゼ遺伝子のＰＣＲに使用されるプライマーの位
置及び方向を示している。
【図５】ＮＥＢ＃８０８の細胞抽出物から得たＳｐｈＩ
制限エンドヌクレアーゼ活性の力価をアガロースゲルの
電気泳動写真で示す説明図である。ゲルのレーンの番号
付けは左から右に向かって行われ、ゲルの左側のレーン
が１、右側のレーンが２５である。１６μｌのｐＢＲ３
２２（１６μｇ）と８０μｌの１０Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ２と、１０μｌのＰｓｔＩ（２００Ｕ）とを混合し無
菌水で８００μｌにしてＤＮＡ混合物を形成した。ＮＥ
Ｂ＃８０８から調製した粗抽出物１μｌを４９μｌのＤ
ＮＡ混合物に加えた（図５、レーン１）。混合後、該試
験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と一
緒に第２の試験管に加えた（図５、レーン２）。第２の
試験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と
一緒に第３の試験管に加えた（図５、レーン３）。第３
の試験管から２５μｌを採取し、２５μｌのＤＮＡ混合
物と一緒に第４の試験管に加えた（図５、レーン４）。
１：１の希釈を更に６回行った（図５、レーン５〜１
６）。同様の１：１希釈をＳ．Ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓから精製した１μｌのＳｐｈＩについて行い
（図５、レーン１８〜２５）、粗抽出物中の酵素の力価
を評価した。３７℃で１時間インキュベートした後、各
希釈物を２５μｌずつ０．７％アガロースゲル上に充填
し、２時間泳動させた。
制限エンドヌクレアーゼ活性の力価をアガロースゲルの
電気泳動写真で示す説明図である。ゲルのレーンの番号
付けは左から右に向かって行われ、ゲルの左側のレーン
が１、右側のレーンが２５である。１６μｌのｐＢＲ３
２２（１６μｇ）と８０μｌの１０Ｘ ＮＥＢｕｆｆｅ
ｒ２と、１０μｌのＰｓｔＩ（２００Ｕ）とを混合し無
菌水で８００μｌにしてＤＮＡ混合物を形成した。ＮＥ
Ｂ＃８０８から調製した粗抽出物１μｌを４９μｌのＤ
ＮＡ混合物に加えた（図５、レーン１）。混合後、該試
験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と一
緒に第２の試験管に加えた（図５、レーン２）。第２の
試験管から５μｌを採取し、４５μｌのＤＮＡ混合物と
一緒に第３の試験管に加えた（図５、レーン３）。第３
の試験管から２５μｌを採取し、２５μｌのＤＮＡ混合
物と一緒に第４の試験管に加えた（図５、レーン４）。
１：１の希釈を更に６回行った（図５、レーン５〜１
６）。同様の１：１希釈をＳ．Ｐｈａｅｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓから精製した１μｌのＳｐｈＩについて行い
（図５、レーン１８〜２５）、粗抽出物中の酵素の力価
を評価した。３７℃で１時間インキュベートした後、各
希釈物を２５μｌずつ０．７％アガロースゲル上に充填
し、２時間泳動させた。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１１月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 プラスミドｐＥＧｓｐｈ５０−２から得
られる、ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする
単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコー
ドする単離ＤＮＡをベクターに挿入したものからなる組
換えベクター。 - 【請求項３】 請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む組換
えベクター。 - 【請求項４】 ベクターがプラスミドｐＥＧｓｐｈ５０
−２からなる請求項３に記載の組換えベクター。 - 【請求項５】 請求項２から４のいずれか一項に記載の
組換えベクターで形質転換した宿主細胞。 - 【請求項６】 ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼの製造
方法であって、請求項２から４のいずれか一項に記載の
組換えベクターで形質転換した宿主を前記エンドヌクレ
アーゼの発現に適した条件下で培養することからなる方
法。 - 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む請求項１
に記載の単離ＤＮＡ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/932,454 US5262318A (en) | 1992-08-20 | 1992-08-20 | Isolated DNA encoding the SPHI restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| US932454 | 1992-08-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06205683A true JPH06205683A (ja) | 1994-07-26 |
| JP3578781B2 JP3578781B2 (ja) | 2004-10-20 |
Family
ID=25462351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22799293A Expired - Fee Related JP3578781B2 (ja) | 1992-08-20 | 1993-08-20 | ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5262318A (ja) |
| EP (1) | EP0586116B1 (ja) |
| JP (1) | JP3578781B2 (ja) |
| DE (1) | DE69332450T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010200660A (ja) * | 2009-03-03 | 2010-09-16 | Toyobo Co Ltd | 改良された増幅試薬 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050567A1 (en) * | 1997-05-02 | 1998-11-12 | Abbott Laboratories | Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate |
| US6157774A (en) * | 1997-05-16 | 2000-12-05 | Tokyo Electron Limited | Vapor generating method and apparatus using same |
| US6846658B1 (en) * | 2000-10-12 | 2005-01-25 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the Msel restriction endonuclease |
| AU2004314710A1 (en) * | 2003-12-12 | 2005-08-11 | Conjugon, Inc. | Systems for tightly regulated gene expression |
| EP2568040A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-13 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identyfing new endonucleases with the same or varied specificity |
| CN101802183B (zh) * | 2007-07-12 | 2016-02-24 | 新英格兰生物实验室公司 | 高保真度限制性内切核酸酶 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| US5278060A (en) * | 1990-08-30 | 1994-01-11 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Nla III restriction endonuclease and methylase |
| US5288696A (en) * | 1990-09-07 | 1994-02-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing and cloning SacII restriction endonuclease and methylase |
| US5202248A (en) * | 1990-11-02 | 1993-04-13 | New England Biolabs, Inc. | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase |
-
1992
- 1992-08-20 US US07/932,454 patent/US5262318A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-10 DE DE69332450T patent/DE69332450T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-10 EP EP93306310A patent/EP0586116B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-20 JP JP22799293A patent/JP3578781B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010200660A (ja) * | 2009-03-03 | 2010-09-16 | Toyobo Co Ltd | 改良された増幅試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3578781B2 (ja) | 2004-10-20 |
| EP0586116A3 (en) | 1994-07-06 |
| US5262318A (en) | 1993-11-16 |
| EP0586116B1 (en) | 2002-10-30 |
| DE69332450T2 (de) | 2003-06-18 |
| EP0586116A2 (en) | 1994-03-09 |
| DE69332450D1 (de) | 2002-12-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5945326A (en) | Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease | |
| US5202248A (en) | Method for cloning and producing the nco i restriction endonuclease and methylase | |
| JP4825383B2 (ja) | ＭｓｅＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングする方法及び製造する方法 | |
| US5405768A (en) | Method for cloning and producing the AATII and ALUI restriction endonuclease and methylase and related method for overexpressing restriction endonucleases | |
| EP0388212A1 (en) | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase | |
| JPH06205683A (ja) | ＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ及び該制限エンドヌクレアーゼを製造するための方法 | |
| US5534428A (en) | Cloned Ssti/SacI restriction-modification system | |
| US5292651A (en) | Method for cloning and producing the NaeI restriction endonuclease and methylase | |
| US5371006A (en) | Isolated DNA encoding the NotI restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
| US5637476A (en) | Method for cloning and producing the SFII restriction endonuclease and methylase | |
| US5543308A (en) | Isolated DNA encoding the FSEI restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
| US5945288A (en) | Method for cloning and producing the PmeI restriction endonuclease | |
| EP0959131B1 (en) | Method for cloning and producing the AgeI restriction endonuclease in E. coli | |
| US7186538B2 (en) | Type II restriction endonuclease, CstMI, obtainable from Corynebacterium striatum M82B and a process for producing the same | |
| US5516678A (en) | Method for producing the SSPI restriction endonuclease and methylase | |
| JP4498496B2 (ja) | ＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび製造並びに組換えＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製のための方法 | |
| US5731185A (en) | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same | |
| US5824529A (en) | Method for cloning and producing the PshAI restriction endonuclease | |
| EP0422951A1 (en) | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031209 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040302 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040305 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040526 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040622 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040714 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070723 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080723 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080723 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090723 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100723 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110723 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110723 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120723 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120723 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130723 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |