JPH06205689A - 抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JPH06205689A JPH06205689A JP4048630A JP4863092A JPH06205689A JP H06205689 A JPH06205689 A JP H06205689A JP 4048630 A JP4048630 A JP 4048630A JP 4863092 A JP4863092 A JP 4863092A JP H06205689 A JPH06205689 A JP H06205689A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト胎児脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞ＮＳ−
１との細胞融合によって得られた８−アザグアニン耐性
ヒト−マウスヘテロハイブリドーマと、癌患者のリンパ
球との細胞融合によって得られ、抗ヒト癌細胞ヒト型Ｍ
ｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマ及びこのトリ
プルハイブリドーマが産生し、ヒト癌細胞と特異的に反
応する抗ヒト癌細胞ヒト型ＭｏＡｂ。 【効果】 本発明のヒト型ＭｏＡｂは、子宮頸癌、卵巣
癌等の培養癌細胞及び癌組織に特異的に反応する。ま
た、このＭｏＡｂはヒト型抗体なので、患者に投与する
ことができ、さらに、認識する抗原が癌細胞表面に存在
し、正常細胞との反応性が極めて弱いので、抗癌剤と結
合させてミサイル療法による癌治療、アイソトープ標識
して癌の転移等の診断や治療に用いることが可能であ
る。
１との細胞融合によって得られた８−アザグアニン耐性
ヒト−マウスヘテロハイブリドーマと、癌患者のリンパ
球との細胞融合によって得られ、抗ヒト癌細胞ヒト型Ｍ
ｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマ及びこのトリ
プルハイブリドーマが産生し、ヒト癌細胞と特異的に反
応する抗ヒト癌細胞ヒト型ＭｏＡｂ。 【効果】 本発明のヒト型ＭｏＡｂは、子宮頸癌、卵巣
癌等の培養癌細胞及び癌組織に特異的に反応する。ま
た、このＭｏＡｂはヒト型抗体なので、患者に投与する
ことができ、さらに、認識する抗原が癌細胞表面に存在
し、正常細胞との反応性が極めて弱いので、抗癌剤と結
合させてミサイル療法による癌治療、アイソトープ標識
して癌の転移等の診断や治療に用いることが可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト癌の診断、治療に有
効なヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハ
イブリドーマに関する。
効なヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハ
イブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】ケーラーとミルシュタインにより開発さ
れた細胞融合法によるモノクローナル抗体（以下「Ｍｏ
Ａｂ」という）の製造法はマウス骨髄腫細胞とマウス抗
体産生リンパ球とを融合させるものであり、単一な抗原
決定基のみを認識する抗体を大量にかつ安定的に得られ
ることから医学、薬学、生物学の分野で広く用いられて
いる。
れた細胞融合法によるモノクローナル抗体（以下「Ｍｏ
Ａｂ」という）の製造法はマウス骨髄腫細胞とマウス抗
体産生リンパ球とを融合させるものであり、単一な抗原
決定基のみを認識する抗体を大量にかつ安定的に得られ
ることから医学、薬学、生物学の分野で広く用いられて
いる。
【０００３】しかし、診断や治療薬としてＭｏＡｂをヒ
トに投与する場合、これらのマウス型ＭｏＡｂはヒトに
対しては異種蛋白であることから、ヒト体内でマウス型
ＭｏＡｂに対する抗体が産生され治療効果の低減や時と
して重篤なショック症状を起こす危険性がある。従っ
て、診断・治療薬としてはヒト型ＭｏＡｂを用いるのが
はるかに望ましい。
トに投与する場合、これらのマウス型ＭｏＡｂはヒトに
対しては異種蛋白であることから、ヒト体内でマウス型
ＭｏＡｂに対する抗体が産生され治療効果の低減や時と
して重篤なショック症状を起こす危険性がある。従っ
て、診断・治療薬としてはヒト型ＭｏＡｂを用いるのが
はるかに望ましい。
【０００４】一般的にヒト型ＭｏＡｂを製造する方法と
しては、（１）ヒト−ヒトハイブリドーマを用いる方
法、（２）エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）でトランスフォームさせた
細胞を用いる方法、（３）ヒト−マウス−ヘテロハイブ
リドーマを用いる方法等が報告されている。しかし
（１）では融合効率が低く、（２）ではクローニングが
困難である。（３）ではヒト染色体の脱落が起こりやす
く、安定なヒト型ＭｏＡｂの産生が得られにくいなどの
欠点があり、ヒト型ＭｏＡｂの製造技術はマウス型Ｍｏ
Ａｂに比べ著しく遅れていた。しかしながら、診断・治
療薬としてのヒト型ＭｏＡｂ利用の要望は、とりわけ悪
性腫瘍の分野で高まっており、これまでに癌細胞に対す
るヒト型ＭｏＡｂの作製が試みられてきた（例えば、特
開昭５９−１３７４９７号公報、特開平２−４２９号公
報等）。しかし、これらの抗体は今だ実用には至らず、
現段階では、診断・治療薬としてのヒト型ＭｏＡｂはな
いのが現状である。
しては、（１）ヒト−ヒトハイブリドーマを用いる方
法、（２）エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉ
ｎ Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）でトランスフォームさせた
細胞を用いる方法、（３）ヒト−マウス−ヘテロハイブ
リドーマを用いる方法等が報告されている。しかし
（１）では融合効率が低く、（２）ではクローニングが
困難である。（３）ではヒト染色体の脱落が起こりやす
く、安定なヒト型ＭｏＡｂの産生が得られにくいなどの
欠点があり、ヒト型ＭｏＡｂの製造技術はマウス型Ｍｏ
Ａｂに比べ著しく遅れていた。しかしながら、診断・治
療薬としてのヒト型ＭｏＡｂ利用の要望は、とりわけ悪
性腫瘍の分野で高まっており、これまでに癌細胞に対す
るヒト型ＭｏＡｂの作製が試みられてきた（例えば、特
開昭５９−１３７４９７号公報、特開平２−４２９号公
報等）。しかし、これらの抗体は今だ実用には至らず、
現段階では、診断・治療薬としてのヒト型ＭｏＡｂはな
いのが現状である。
【０００５】ところで、悪性腫瘍（癌細胞）を特異的に
認識するＭｏＡｂは悪性腫瘍の診断・治療上で大いに利
用されることが期待される。すなわち、腫瘍部の外科的
切除後の再発、転移の診断の際にアイソトープ標識した
ＭｏＡｂを投与し腫瘍の存在を画像診断することができ
る。また、制癌剤をＭｏＡｂに結合させ患者に投与する
ことで癌のみを標的とした治療ができると期待される。
しかし、診断・治療薬としてヒトに投与する場合、上記
にようにマウス型ＭｏＡｂでは異種蛋白としての問題が
あり、反復投与はできず使用が制限される。従って、ヒ
ト型ＭｏＡｂが望まれる。また、癌細胞に対するＭｏＡ
ｂは正常細胞（組織）に対しても弱く反応する場合が多
く、必ずしも特異性が明確ではなかった。さらに、悪性
腫瘍の診断・治療のためには、癌細胞表面に存在する抗
原分子と反応するＭｏＡｂが有利であると考えられる。
認識するＭｏＡｂは悪性腫瘍の診断・治療上で大いに利
用されることが期待される。すなわち、腫瘍部の外科的
切除後の再発、転移の診断の際にアイソトープ標識した
ＭｏＡｂを投与し腫瘍の存在を画像診断することができ
る。また、制癌剤をＭｏＡｂに結合させ患者に投与する
ことで癌のみを標的とした治療ができると期待される。
しかし、診断・治療薬としてヒトに投与する場合、上記
にようにマウス型ＭｏＡｂでは異種蛋白としての問題が
あり、反復投与はできず使用が制限される。従って、ヒ
ト型ＭｏＡｂが望まれる。また、癌細胞に対するＭｏＡ
ｂは正常細胞（組織）に対しても弱く反応する場合が多
く、必ずしも特異性が明確ではなかった。さらに、悪性
腫瘍の診断・治療のためには、癌細胞表面に存在する抗
原分子と反応するＭｏＡｂが有利であると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はヒトの癌診断・治療薬への応用が可能なヒト癌細胞を
特異的に認識するヒト型ＭｏＡｂを提供することにあ
る。
はヒトの癌診断・治療薬への応用が可能なヒト癌細胞を
特異的に認識するヒト型ＭｏＡｂを提供することにあ
る。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは先に、ヒト
型ＭｏＡｂを安定的に生産するハイブリドーマを作製す
ることを目的として、ヒト胎児脾臓細胞とマウス骨髄腫
細胞ＮＳ−１との細胞融合によって免疫グロブリン非分
泌性で８−アザグアニン耐性のマウス−ヒトヘテロハイ
ブリドーマを作製した（特開平３−１５１８７１号公
報）。そして、当該公報において、このヘテロハイブリ
ドーマは、正常ヒトリンパ球と高い効率で融合し、安定
なヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマを
作製する親株となり得ることを報告した。
型ＭｏＡｂを安定的に生産するハイブリドーマを作製す
ることを目的として、ヒト胎児脾臓細胞とマウス骨髄腫
細胞ＮＳ−１との細胞融合によって免疫グロブリン非分
泌性で８−アザグアニン耐性のマウス−ヒトヘテロハイ
ブリドーマを作製した（特開平３−１５１８７１号公
報）。そして、当該公報において、このヘテロハイブリ
ドーマは、正常ヒトリンパ球と高い効率で融合し、安定
なヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマを
作製する親株となり得ることを報告した。
【０００８】そこで、さらに研究を進め上記ヘテロハイ
ブリドーマと癌患者のリンパ球とを融合させたところ、
ヒト癌細胞と特異的に反応するＭｏＡｂを産生するトリ
プルハイブリドーマを単離することに成功し、本発明を
完成した。
ブリドーマと癌患者のリンパ球とを融合させたところ、
ヒト癌細胞と特異的に反応するＭｏＡｂを産生するトリ
プルハイブリドーマを単離することに成功し、本発明を
完成した。
【０００９】すなわち、本発明はヒト胎児脾臓細胞とマ
ウス骨髄腫細胞ＮＳ−１との細胞融合によって得られた
８−アザグアニン耐性ヒト−マウスヘテロハイブリドー
マと、癌患者のリンパ球との細胞融合によって得られ、
抗ヒト癌細胞ヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブ
リドーマを提供するものである。
ウス骨髄腫細胞ＮＳ−１との細胞融合によって得られた
８−アザグアニン耐性ヒト−マウスヘテロハイブリドー
マと、癌患者のリンパ球との細胞融合によって得られ、
抗ヒト癌細胞ヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブ
リドーマを提供するものである。
【００１０】また、本発明は上記トリプルハイブリドー
マが産生し、ヒト癌細胞と特異的に反応する抗ヒト癌細
胞ヒト型ＭｏＡｂを提供するものである。
マが産生し、ヒト癌細胞と特異的に反応する抗ヒト癌細
胞ヒト型ＭｏＡｂを提供するものである。
【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
トリプルハイブリドーマは、ヒト胎児脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞ＮＳ−１との細胞融合によって得られた８−
アザグアニン耐性ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ
と、癌患者のリンパ球とを融合させ、抗ヒト癌細胞ヒト
型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマを選択す
ることにより製造される。
トリプルハイブリドーマは、ヒト胎児脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞ＮＳ−１との細胞融合によって得られた８−
アザグアニン耐性ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ
と、癌患者のリンパ球とを融合させ、抗ヒト癌細胞ヒト
型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブリドーマを選択す
ることにより製造される。
【００１２】細胞融合に用いるヘテロハイブリドーマと
しては、特開平３−１５１８７１号記載のもの、例えば
ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ１Ｅ−３、２Ａ−
５、４Ｄ−５、１１Ｅ−５、１１Ａ−６等が挙げられ
る。
しては、特開平３−１５１８７１号記載のもの、例えば
ヒト−マウスヘテロハイブリドーマ１Ｅ−３、２Ａ−
５、４Ｄ−５、１１Ｅ−５、１１Ａ−６等が挙げられ
る。
【００１３】また、癌患者のリンパ球としては、例えば
産婦人科関係の患者（卵巣癌、子宮頸癌等）の脾臓、リ
ンパ節、末梢血などいずれの由来のものでもよいがリン
パ節由来のリンパ球が望ましい。
産婦人科関係の患者（卵巣癌、子宮頸癌等）の脾臓、リ
ンパ節、末梢血などいずれの由来のものでもよいがリン
パ節由来のリンパ球が望ましい。
【００１４】細胞融合は、例えばバイオケミカル・アン
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，１２９，２６−３，１９８５；特開昭６２−１３０
６８１号公報等に記載の方法に従って行なうことができ
る。すなわち、通常ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤ
Ｍ（これらはギブコ社から購入できる）等の培地中で患
者リンパ球とヘテロハイブリドーマを１０：１〜１：１
の混合比で混合することにより行なわれる。この時、融
合促進剤として平均分子量１，０００〜６，０００のポ
リエチレングリコールを使用することができる。ポリエ
チレングリコールの使用濃度は３０〜５０％が好まし
い。また、電気パルスによる細胞融合も有効である。ヘ
テロハイブリドーマは８−アザグアニン耐性でヒポキサ
ンチン、アミノプテリン及びチミジンを添加した培地
（ＨＡＴ培地）中で成育できないがこの細胞とリンパ球
との融合細胞（トリプルハイブリドーマ）はＨＡＴ培地
中でも成育できるようになり、未融合細胞と区別が可能
である。従って、細胞融合を終えた細胞は９６ウェルの
培養プレートを用いウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地で培
養し、トリプルハイブリドーマのみを生育させることに
より融合細胞が単離できる。
ド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション
ズ，１２９，２６−３，１９８５；特開昭６２−１３０
６８１号公報等に記載の方法に従って行なうことができ
る。すなわち、通常ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤ
Ｍ（これらはギブコ社から購入できる）等の培地中で患
者リンパ球とヘテロハイブリドーマを１０：１〜１：１
の混合比で混合することにより行なわれる。この時、融
合促進剤として平均分子量１，０００〜６，０００のポ
リエチレングリコールを使用することができる。ポリエ
チレングリコールの使用濃度は３０〜５０％が好まし
い。また、電気パルスによる細胞融合も有効である。ヘ
テロハイブリドーマは８−アザグアニン耐性でヒポキサ
ンチン、アミノプテリン及びチミジンを添加した培地
（ＨＡＴ培地）中で成育できないがこの細胞とリンパ球
との融合細胞（トリプルハイブリドーマ）はＨＡＴ培地
中でも成育できるようになり、未融合細胞と区別が可能
である。従って、細胞融合を終えた細胞は９６ウェルの
培養プレートを用いウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地で培
養し、トリプルハイブリドーマのみを生育させることに
より融合細胞が単離できる。
【００１５】ヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプルハイブ
リドーマの検索は培養上清液を採取し、例えば抗ヒト免
疫グロブリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ
−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓ
ａｙ）により行なう。さらに目的の抗癌細胞ヒト型Ｍｏ
Ａｂを産生しているトリプルハイブリドーマの検索には
種々の方法が使用できるが例えば、マイクロプレートに
培養癌細胞を生着させ、これらの細胞へのヒト型ＭｏＡ
ｂの結合をＥＬＩＳＡでみるＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡや患
者の癌組織切片を用いる免疫組織染色法などで行なうこ
とができる。
リドーマの検索は培養上清液を採取し、例えば抗ヒト免
疫グロブリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ
−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓ
ａｙ）により行なう。さらに目的の抗癌細胞ヒト型Ｍｏ
Ａｂを産生しているトリプルハイブリドーマの検索には
種々の方法が使用できるが例えば、マイクロプレートに
培養癌細胞を生着させ、これらの細胞へのヒト型ＭｏＡ
ｂの結合をＥＬＩＳＡでみるＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡや患
者の癌組織切片を用いる免疫組織染色法などで行なうこ
とができる。
【００１６】目的のヒト型ＭｏＡｂを産生するトリプル
ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法を
繰り返し行なうことで単一性のトリプルハイブリドーマ
を得ることができる。以上の操作によってヒト癌細胞に
特異的な本発明のヒト型ＭｏＡｂ産生トリプルハイブリ
ドーマを得ることができる。
ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法を
繰り返し行なうことで単一性のトリプルハイブリドーマ
を得ることができる。以上の操作によってヒト癌細胞に
特異的な本発明のヒト型ＭｏＡｂ産生トリプルハイブリ
ドーマを得ることができる。
【００１７】このようにして得られたトリプルハイブリ
ドーマを用いて本発明のヒト癌細胞に特異的なヒト型Ｍ
ｏＡｂを得るためには、例えばトリプルハイブリドーマ
を培養容器中で培養する。
ドーマを用いて本発明のヒト癌細胞に特異的なヒト型Ｍ
ｏＡｂを得るためには、例えばトリプルハイブリドーマ
を培養容器中で培養する。
【００１８】培地はウシ胎児血清を添加した通常培地
（ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭ等）でよい。培
養上清からの本発明ヒト型ＭｏＡｂの分離・精製は既知
の生化学的手法を組み合わせることによって行なうこと
ができる。例えば、アンモニウムによる塩析、ゲルろ過
法、イオン交換クロマトグラフィーあるいは抗ヒト免疫
グロブリン抗体を固定化した免疫吸着クロマトグラフィ
ーなどにより分離・精製することができる。
（ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭ等）でよい。培
養上清からの本発明ヒト型ＭｏＡｂの分離・精製は既知
の生化学的手法を組み合わせることによって行なうこと
ができる。例えば、アンモニウムによる塩析、ゲルろ過
法、イオン交換クロマトグラフィーあるいは抗ヒト免疫
グロブリン抗体を固定化した免疫吸着クロマトグラフィ
ーなどにより分離・精製することができる。
【００１９】ヘテロハイブリドーマとして１１Ｅ−５を
用いて前記方法に従い、トリプルハイブリドーマ１−１
−２Ｄが〔微工研菌寄第１２７２７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２７２７）〕が得られ、この１−１−２Ｄを培養する
ことによりその培養上清よりヒト型ＭｏＡｂ１−１−２
Ｄが得られた。得られたヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは
次の性質を有していた。 ａ）分子量；重鎖 ７５，０００±３，０００ 軽鎖 ２６，５００±３，０００ ｂ）免疫グロブリンクラス；ＩｇＭ ｃ）子宮頸癌及び卵巣癌の培養癌細胞及び癌組織と特異
的に反応する
用いて前記方法に従い、トリプルハイブリドーマ１−１
−２Ｄが〔微工研菌寄第１２７２７号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１２７２７）〕が得られ、この１−１−２Ｄを培養する
ことによりその培養上清よりヒト型ＭｏＡｂ１−１−２
Ｄが得られた。得られたヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは
次の性質を有していた。 ａ）分子量；重鎖 ７５，０００±３，０００ 軽鎖 ２６，５００±３，０００ ｂ）免疫グロブリンクラス；ＩｇＭ ｃ）子宮頸癌及び卵巣癌の培養癌細胞及び癌組織と特異
的に反応する
【００２０】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。
が、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】実施例１ （１）トリプルハイブリドーマの作製 子宮頸癌患者より摘出されたリンパ節より、リンパ球を
調製し、ＰＷＭ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）
を含む１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で
１週間培養した。細胞融合はマウス−ヒトヘテロハイブ
リドーマ１１Ｅ−５〔微工研菌寄第１１９０４号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１１９０４）〕５×１０7 個と患者リンパ球
１×１０7 を混合して遠心した。上清を捨て細胞沈渣を
解きほぐした後、融合緩衝液（マンニトール ０．２５
Ｍ、ＣａＣｌ2 ０．１mM、ＭｇＣｌ2 １mM、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ０．２mM、pH７．２）に浮遊させた。再度
遠心した後、少量の融合緩衝液に浮遊させ、電気細胞融
合装置（島津製作所、ＳＳＨ−１型）を用いて初期高周
波電圧２０〜４０Ｖ、パルス幅１０〜２０μｓ、交流電
圧２００〜３００Ｖ、パルス電圧２〜３KV／cm2 、高周
波電界２０〜４０Ｖの電気パルスを与え融合させた。融
合した細胞はＨＡＴ（各４×１０-7Ｍ）含有１０％ウシ
胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、９６ウ
ェルのマイクロプレート３枚に１００μｌずつ分注し
た。３〜４日ごとに同培地を５０μｌずつ追加して、こ
のＨＡＴ培地による選択培養によりトリプルハイブリド
ーマのみを増殖させた。トリプルハイブリドーマのコロ
ニーはマイクロプレートの全てのウェルに５〜１０個／
ウェルの割合で認められた。
調製し、ＰＷＭ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ）
を含む１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地で
１週間培養した。細胞融合はマウス−ヒトヘテロハイブ
リドーマ１１Ｅ−５〔微工研菌寄第１１９０４号（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１１９０４）〕５×１０7 個と患者リンパ球
１×１０7 を混合して遠心した。上清を捨て細胞沈渣を
解きほぐした後、融合緩衝液（マンニトール ０．２５
Ｍ、ＣａＣｌ2 ０．１mM、ＭｇＣｌ2 １mM、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ０．２mM、pH７．２）に浮遊させた。再度
遠心した後、少量の融合緩衝液に浮遊させ、電気細胞融
合装置（島津製作所、ＳＳＨ−１型）を用いて初期高周
波電圧２０〜４０Ｖ、パルス幅１０〜２０μｓ、交流電
圧２００〜３００Ｖ、パルス電圧２〜３KV／cm2 、高周
波電界２０〜４０Ｖの電気パルスを与え融合させた。融
合した細胞はＨＡＴ（各４×１０-7Ｍ）含有１０％ウシ
胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、９６ウ
ェルのマイクロプレート３枚に１００μｌずつ分注し
た。３〜４日ごとに同培地を５０μｌずつ追加して、こ
のＨＡＴ培地による選択培養によりトリプルハイブリド
ーマのみを増殖させた。トリプルハイブリドーマのコロ
ニーはマイクロプレートの全てのウェルに５〜１０個／
ウェルの割合で認められた。
【００２２】（２）ヒト型ＭｏＡｂ産生トリプルハイブ
リドーマの検索 トリプルハイブリドーマが増殖した各ウェルの培養上清
液を採取し、以下のＥＬＩＳＡでヒト型ＭｏＡｂを産生
しているウェルを検索した。９６ウェルマイクロプレー
ト（ＮＵＮＣ社）にコーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液、pH９．６）で調製したヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体溶液を各ウェル
に添加し、２５℃で２時間静置して各ウェルに抗体をコ
ーティングした。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含む１０
mMリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、培養
上清を添加し、２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ
で洗浄後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｐ）標識ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ抗体またはＡｌｐ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ
抗体を添加して２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ
で洗浄後、基質溶液（シグマ社、１０４フォスファター
ゼサブストレートを含有する０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3
−１０mM ＭｇＣｌ2（pH９．８）溶液）を添加して２
５℃で３０分反応させた。５Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに
添加し反応を停止させた後、４１５nmの吸光度を測定し
た。その結果、スクリーニングを行なった２８８ウェル
のうち、３６ウェルがヒト型ＭｏＡｂを産生している陽
性ウェルであった。続いて、陽性ウェルのトリプルハイ
ブリドーマを２４ウェルプレートに移し、新たに培養液
を加えて培養をスケールアップした。
リドーマの検索 トリプルハイブリドーマが増殖した各ウェルの培養上清
液を採取し、以下のＥＬＩＳＡでヒト型ＭｏＡｂを産生
しているウェルを検索した。９６ウェルマイクロプレー
ト（ＮＵＮＣ社）にコーティング緩衝液（０．０５Ｍ炭
酸ナトリウム緩衝液、pH９．６）で調製したヤギ抗ヒト
ＩｇＧ抗体またはヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体溶液を各ウェル
に添加し、２５℃で２時間静置して各ウェルに抗体をコ
ーティングした。次に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含む１０
mMリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄後、培養
上清を添加し、２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ
で洗浄後、アルカリフォスファターゼ（Ａｌｐ）標識ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ抗体またはＡｌｐ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ
抗体を添加して２５℃で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔ
で洗浄後、基質溶液（シグマ社、１０４フォスファター
ゼサブストレートを含有する０．０５Ｍ ＮａＨＣＯ3
−１０mM ＭｇＣｌ2（pH９．８）溶液）を添加して２
５℃で３０分反応させた。５Ｎ ＮａＯＨを各ウェルに
添加し反応を停止させた後、４１５nmの吸光度を測定し
た。その結果、スクリーニングを行なった２８８ウェル
のうち、３６ウェルがヒト型ＭｏＡｂを産生している陽
性ウェルであった。続いて、陽性ウェルのトリプルハイ
ブリドーマを２４ウェルプレートに移し、新たに培養液
を加えて培養をスケールアップした。
【００２３】（３）抗ヒト癌細胞抗体産生トリプルハイ
ブリドーマの検索及びそのクローニング トリプルハイブリドーマ培養上清を以下の培養癌細胞を
用いるＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡを行なって、ヒト癌細胞と
反応するウェルを検索した。９６ウェルプレートに培養
癌細胞（子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞またはＭＥ−
１８０細胞または、肺癌細胞であるＡ５４９細胞）をウ
ェルあたり５×１０4個播種し、一晩培養した。培養上
清を捨てＰＢＳで洗浄後１％グルタルアルデヒドで室温
１時間固定した後、再びＰＢＳで洗浄した後、トリプル
ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応さ
せた。洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブ
リン抗体を添加し、室温で２時間反応させた。洗浄後、
酵素基質としてｏ−フェニレンジアミン及びＨ2Ｏ2を含
有する０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH５．０）を各ウェル
に添加して反応させた。４．５Ｍ硫酸で反応を停止後、
４９２nmの吸光度を測定した。陽性と判定されたウェル
については、直ちに下記の限界希釈法で単クローン化を
行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔細胞をフィーダー
細胞として、０．５〜１．０×１０4個／ウェルの割合
で播種した。陽性ウェルのトリプルハイブリドーマを５
個／mlに調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに０．
１mlずつ添加した。細胞が増殖したウェルについて、培
養上清を採取し、上述のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで抗体の
活性を確認した。活性陽性ウェルは限界希釈法を繰り返
して、単クローン化したトリプルハイブリドーマ１−１
−２Ｄを得た。
ブリドーマの検索及びそのクローニング トリプルハイブリドーマ培養上清を以下の培養癌細胞を
用いるＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡを行なって、ヒト癌細胞と
反応するウェルを検索した。９６ウェルプレートに培養
癌細胞（子宮頸癌細胞であるＨｅＬａ細胞またはＭＥ−
１８０細胞または、肺癌細胞であるＡ５４９細胞）をウ
ェルあたり５×１０4個播種し、一晩培養した。培養上
清を捨てＰＢＳで洗浄後１％グルタルアルデヒドで室温
１時間固定した後、再びＰＢＳで洗浄した後、トリプル
ハイブリドーマ培養上清を添加し、室温で２時間反応さ
せた。洗浄後、パーオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブ
リン抗体を添加し、室温で２時間反応させた。洗浄後、
酵素基質としてｏ−フェニレンジアミン及びＨ2Ｏ2を含
有する０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH５．０）を各ウェル
に添加して反応させた。４．５Ｍ硫酸で反応を停止後、
４９２nmの吸光度を測定した。陽性と判定されたウェル
については、直ちに下記の限界希釈法で単クローン化を
行なった。ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔細胞をフィーダー
細胞として、０．５〜１．０×１０4個／ウェルの割合
で播種した。陽性ウェルのトリプルハイブリドーマを５
個／mlに調製し、９６ウェルプレートの各ウェルに０．
１mlずつ添加した。細胞が増殖したウェルについて、培
養上清を採取し、上述のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで抗体の
活性を確認した。活性陽性ウェルは限界希釈法を繰り返
して、単クローン化したトリプルハイブリドーマ１−１
−２Ｄを得た。
【００２４】実施例２ （１）ＭｏＡｂの製造 トリプルハイブリドーマ１−１−２Ｄを１０％ウシ胎児
血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃で培養を継続
し、培養の容量を増やしていった。培養上清を回収し、
１０，０００rpm 、１０分間遠心した後、上清を分取し
た。この上清液をＰＢＳで平衡化したヤギ抗ヒトＩｇＭ
抗体（カッペル社）を固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（ファルマシア社）カラム（１ml）に通液し、ＰＢＳで
充分に洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（pH
２．７）で溶出した。溶出液は１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）を入れた試験管内に分取し、２８０nmの吸
光度を測定して抗体画分を集め、これをＰＢＳで透析す
ることにより精製ヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄを得た。
血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃で培養を継続
し、培養の容量を増やしていった。培養上清を回収し、
１０，０００rpm 、１０分間遠心した後、上清を分取し
た。この上清液をＰＢＳで平衡化したヤギ抗ヒトＩｇＭ
抗体（カッペル社）を固定化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（ファルマシア社）カラム（１ml）に通液し、ＰＢＳで
充分に洗浄した後、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（pH
２．７）で溶出した。溶出液は１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５）を入れた試験管内に分取し、２８０nmの吸
光度を測定して抗体画分を集め、これをＰＢＳで透析す
ることにより精製ヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄを得た。
【００２５】 （２）ヒト型モノクローナル抗体１−１−２Ｄの性状 ａ）培養癌細胞に対する反応性 ヒト型モノクローナル抗体１−１−２Ｄの各種培養癌細
胞の細胞表面に対する反応性を間接蛍光抗体法により検
討した結果を表１に示した。間接蛍光抗体法は、テフロ
ンコーティングした１０穴のスライドグラス（ボクスイ
・ブラウン社）の各穴に培養癌細胞を単層に培養し、固
定していない状態で用いた。４℃に冷やした０．１％Ｎ
ａＮ3、０．９mM ＣａＣｌ2、０．５mM ＭｇＣｌ2を
含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3）で細胞を洗浄
後、１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3
を添加し、４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳ（＋）−
ＮａＮ3で５μｇ／mlの濃度に調製した抗体溶液を４℃
で２時間反応させ、ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3で洗浄後、
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（タゴ社）と４℃で
１時間反応させた。ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3で洗浄後、
マウントし、落射蛍光顕微鏡（オリンパス社）で観察し
て培養癌細胞との反応性を調べた。表１で示したよう
に、ヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは、子宮頸癌、卵巣
癌、肺癌の培養癌細胞の細胞表面と反応し、正常線維芽
細胞とは反応しなかった。
胞の細胞表面に対する反応性を間接蛍光抗体法により検
討した結果を表１に示した。間接蛍光抗体法は、テフロ
ンコーティングした１０穴のスライドグラス（ボクスイ
・ブラウン社）の各穴に培養癌細胞を単層に培養し、固
定していない状態で用いた。４℃に冷やした０．１％Ｎ
ａＮ3、０．９mM ＣａＣｌ2、０．５mM ＭｇＣｌ2を
含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3）で細胞を洗浄
後、１０％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3
を添加し、４℃で３０分間反応させた。ＰＢＳ（＋）−
ＮａＮ3で５μｇ／mlの濃度に調製した抗体溶液を４℃
で２時間反応させ、ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3で洗浄後、
ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（タゴ社）と４℃で
１時間反応させた。ＰＢＳ（＋）−ＮａＮ3で洗浄後、
マウントし、落射蛍光顕微鏡（オリンパス社）で観察し
て培養癌細胞との反応性を調べた。表１で示したよう
に、ヒト型ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは、子宮頸癌、卵巣
癌、肺癌の培養癌細胞の細胞表面と反応し、正常線維芽
細胞とは反応しなかった。
【００２６】
【表１】
【００２７】ｂ）抗体の認識する抗原分子 ａ）の間接蛍光抗体法による培養癌細胞に対するヒト型
ＭｏＡｂ１−１−２Ｄの反応は、過ヨウ素酸処理で消失
し、トリプシン消化ではわずかに弱まった。さらに、Ｈ
ｅＬａ細胞からのクロロホルム−メタノール抽出物（粗
糖脂質）の薄層クロマトグラフィーによる免疫染色法で
陽性スポットを認め、免疫沈降法で分子量３８，０００
のバンドを検出した。以上のことから、ヒト型ＭｏＡｂ
１−１−２Ｄは、細胞表面に存在する糖脂質及び糖蛋白
質（分子量３８，０００）に共通する糖鎖構造を認識す
ると考えられる。
ＭｏＡｂ１−１−２Ｄの反応は、過ヨウ素酸処理で消失
し、トリプシン消化ではわずかに弱まった。さらに、Ｈ
ｅＬａ細胞からのクロロホルム−メタノール抽出物（粗
糖脂質）の薄層クロマトグラフィーによる免疫染色法で
陽性スポットを認め、免疫沈降法で分子量３８，０００
のバンドを検出した。以上のことから、ヒト型ＭｏＡｂ
１−１−２Ｄは、細胞表面に存在する糖脂質及び糖蛋白
質（分子量３８，０００）に共通する糖鎖構造を認識す
ると考えられる。
【００２８】ｃ）患者癌組織の反応性 子宮頸癌患者の癌組織の凍結切片の免疫組織染色では、
頸癌組織１５例中９例が陽性（浸潤癌７／１１例、上皮
内癌２／４例）で、異形成は７例中２例が陽性（重度１
／２例、中程度１／２例、軽度０／３例）であった。一
方、正常扁平上皮は、７例中１例においてのみ、基底層
から旁基底層に陽性所見が見られた。
頸癌組織１５例中９例が陽性（浸潤癌７／１１例、上皮
内癌２／４例）で、異形成は７例中２例が陽性（重度１
／２例、中程度１／２例、軽度０／３例）であった。一
方、正常扁平上皮は、７例中１例においてのみ、基底層
から旁基底層に陽性所見が見られた。
【００２９】ｄ）抗体分子の同定 ＥＬＩＳＡにより抗体の同定を行なったところ、ヒト型
ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは、ＩｇＭに属していた。また、
還元条件下、ＳＤＳ−ゲル電気泳動を行なってたとこ
ろ、重鎖と軽鎖の分子量はそれぞれ７５，０００±３，
０００と２６，５００±３，０００であった。以上のこ
とから本抗体は、子宮頸癌及び卵巣癌の癌細胞の細胞表
面に存在する癌関連抗原の糖鎖部分を認識し、正常細胞
とはほとんど反応しないヒト型ＭｏＡｂであることが判
明した。
ＭｏＡｂ１−１−２Ｄは、ＩｇＭに属していた。また、
還元条件下、ＳＤＳ−ゲル電気泳動を行なってたとこ
ろ、重鎖と軽鎖の分子量はそれぞれ７５，０００±３，
０００と２６，５００±３，０００であった。以上のこ
とから本抗体は、子宮頸癌及び卵巣癌の癌細胞の細胞表
面に存在する癌関連抗原の糖鎖部分を認識し、正常細胞
とはほとんど反応しないヒト型ＭｏＡｂであることが判
明した。
【００３０】このトリプルハイブリドーマ１−１−２Ｄ
は平成４年１月３０日より工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１２７２７の登録番号で寄託され
ている。
は平成４年１月３０日より工業技術院微生物工業技術研
究所にＦＥＲＭ Ｐ−１２７２７の登録番号で寄託され
ている。
【００３１】
【発明の効果】本発明により得られるヒト型ＭｏＡｂ
は、子宮頸癌、卵巣癌等の培養癌細胞及び癌組織に特異
的に反応する。また、このＭｏＡｂはヒト型抗体なの
で、患者に投与することができ、さらに、認識する抗原
が癌細胞表面に存在し、正常細胞との反応性が極めて弱
いので、抗癌剤と結合させてミサイル療法による癌治
療、アイソトープ標識して癌の転移等の診断や治療に用
いることが可能である。
は、子宮頸癌、卵巣癌等の培養癌細胞及び癌組織に特異
的に反応する。また、このＭｏＡｂはヒト型抗体なの
で、患者に投与することができ、さらに、認識する抗原
が癌細胞表面に存在し、正常細胞との反応性が極めて弱
いので、抗癌剤と結合させてミサイル療法による癌治
療、アイソトープ標識して癌の転移等の診断や治療に用
いることが可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/28 15/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 7055−2Ｊ 33/574 Ｄ 9015−2Ｊ (72)発明者 山室 理 愛知県名古屋市熱田区三本松町５−27 神 宮ハイツ503号 (72)発明者 名古屋 隆生 茨城県土浦市中1300−12 (72)発明者 渡辺 雅尚 茨城県つくば市松代５−２−29
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒト胎児脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｎ
Ｓ−１との細胞融合によって得られた８−アザグアニン
耐性ヒト−マウスヘテロハイブリドーマと、癌患者のリ
ンパ球との細胞融合によって得られ、抗ヒト癌細胞ヒト
型モノクローナル抗体を産生するトリプルハイブリドー
マ。 - 【請求項２】 請求項１記載のトリプルハイブリドーマ
が産生し、ヒト癌細胞と特異的に反応する抗ヒト癌細胞
ヒト型モノクローナル抗体。 - 【請求項３】 次の性質を有する請求項２記載の抗癌細
胞ヒト型モノクローナル抗体。 ａ）分子量；重鎖 ７５，０００±３，０００ 軽鎖 ２６，５００±３，０００ ｂ）免疫グロブリンクラス；ＩｇＭ ｃ）子宮頸癌及び卵巣癌の培養癌細胞及び癌組織と特異
的に反応する
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048630A JPH06205689A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4048630A JPH06205689A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06205689A true JPH06205689A (ja) | 1994-07-26 |
Family
ID=12808706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4048630A Pending JPH06205689A (ja) | 1992-03-05 | 1992-03-05 | 抗ヒト癌細胞ヒト型モノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06205689A (ja) |
-
1992
- 1992-03-05 JP JP4048630A patent/JPH06205689A/ja active Pending
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