JPH062058B2 - キチナ−ゼおよびその製造法 - Google Patents
キチナ−ゼおよびその製造法Info
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- JPH062058B2 JPH062058B2 JP60277630A JP27763085A JPH062058B2 JP H062058 B2 JPH062058 B2 JP H062058B2 JP 60277630 A JP60277630 A JP 60277630A JP 27763085 A JP27763085 A JP 27763085A JP H062058 B2 JPH062058 B2 JP H062058B2
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- JP
- Japan
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- chitinase
- producing
- chitin
- around
- acetylchitooligosaccharides
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規なキチナーゼおよびその製造法に関する。
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖は臨床検査薬におけるリゾチ
ームやβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの測定基質
として有用である。特にリゾチームの基質としては、５
量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖が極めて有用であ
る。しかしながら現在、５量体以上のＮ−アセチルキト
オリゴ糖は、大量生産することが非常に困難である。例
えば従来からの酸によるキチンの限定加水分解では、２
〜４量体は比較的高い収率で得られるが５量体以上のＮ
−アセチルキトオリゴ糖の収率は非常に低いものであ
る。そこで本発明者等は、５量体以上のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖の大量生産を目的に種々酵素を検索したとこ
ろ、ノカルディア属に属する微生物の生産するキチナー
ゼは、３量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用
し、等転位反応により効率良く５量体以上のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を生産することを見い出し本発明を完成
した。
ームやβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの測定基質
として有用である。特にリゾチームの基質としては、５
量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖が極めて有用であ
る。しかしながら現在、５量体以上のＮ−アセチルキト
オリゴ糖は、大量生産することが非常に困難である。例
えば従来からの酸によるキチンの限定加水分解では、２
〜４量体は比較的高い収率で得られるが５量体以上のＮ
−アセチルキトオリゴ糖の収率は非常に低いものであ
る。そこで本発明者等は、５量体以上のＮ−アセチルキ
トオリゴ糖の大量生産を目的に種々酵素を検索したとこ
ろ、ノカルディア属に属する微生物の生産するキチナー
ゼは、３量体以上のＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用
し、等転位反応により効率良く５量体以上のＮ−アセチ
ルキトオリゴ糖を生産することを見い出し本発明を完成
した。
ところで、従来から、ノカルディア属の生産するキチナ
ーゼについて報告されているが〔Y.Tominaga and Y.Tsu
jisaka:Agr.Biol.Chem.,40(12),2325-2333,1976〕、本
発明のキチナーゼは分子量、等電点などから明らかに異
なる酵素である。すなわち本発明は新規なキチナーゼお
よびその製造法を提供するものである。
ーゼについて報告されているが〔Y.Tominaga and Y.Tsu
jisaka:Agr.Biol.Chem.,40(12),2325-2333,1976〕、本
発明のキチナーゼは分子量、等電点などから明らかに異
なる酵素である。すなわち本発明は新規なキチナーゼお
よびその製造法を提供するものである。
本発明方法のノカルディア属に属するキチナーゼ生産菌
としては、ノカルディア属に属しキチナーゼを生産する
菌であればいずれでも良い。その例としてはたとえばノ
カルディア・オリエンタリス（Nocardia Orientalis）
が挙げられ、具体的にはノカルディア・オリエンタリス
ＩＦＯ 12360，ＩＦＯ12361，ＩＦＯ 12362，ＩＦＯ
12806，ＪＣＭ 4235，ＪＣＭ 4600などが挙げられ
る。上記ＩＦＯ 12360，ＩＦＯ 12361，ＩＦＯ 1236
2，ＩＦＯ 12806株は、財団法人発酵研究所のリスト・
オブ・カルチュアーズ1984年第７版（Institute for Fe
rmentation,Osaka,List of Cultures,1984,7th Editio
n）に掲載されている。上記ＪＣＭ 4235，ＪＣＭ 460
0株は、理化学研究所微生物系統保存施設のカタログ・
オブ・ストレインズ1984年第２版(Japan Collection of
Microorganisms,Catalogue of Stains,1984,2nd Editi
on)に掲載されている。
としては、ノカルディア属に属しキチナーゼを生産する
菌であればいずれでも良い。その例としてはたとえばノ
カルディア・オリエンタリス（Nocardia Orientalis）
が挙げられ、具体的にはノカルディア・オリエンタリス
ＩＦＯ 12360，ＩＦＯ12361，ＩＦＯ 12362，ＩＦＯ
12806，ＪＣＭ 4235，ＪＣＭ 4600などが挙げられ
る。上記ＩＦＯ 12360，ＩＦＯ 12361，ＩＦＯ 1236
2，ＩＦＯ 12806株は、財団法人発酵研究所のリスト・
オブ・カルチュアーズ1984年第７版（Institute for Fe
rmentation,Osaka,List of Cultures,1984,7th Editio
n）に掲載されている。上記ＪＣＭ 4235，ＪＣＭ 460
0株は、理化学研究所微生物系統保存施設のカタログ・
オブ・ストレインズ1984年第２版(Japan Collection of
Microorganisms,Catalogue of Stains,1984,2nd Editi
on)に掲載されている。
本発明のキチナーゼはノカルディア属に属するキチナー
ゼ生産菌を培地に培養し、培養物中に生産せしめること
により製造される。培養に用いられる培地は、上記微生
物が利用し得る栄養源を含むものであればいづれでも良
いが、キチナーゼの生産能をより高めるには誘導基質で
あるキチンを添加することが好ましい。例えばコロイド
キチン0.5％、Ｎ−アセチルグルコサミン0.5％、ペプト
ン0.2％、酵母エキス0.01％、リン酸２水素カリウム0.0
3％、リン酸１水素カリウム0.07％、硫酸マグネシウム
・７水和物0.05％を含有するもの(pH7.0に調整）が挙げ
られる。液体培地でも固体培地でも良いが、大量に行う
場合には液体培地が好ましい。培養の方法は振盪培養が
好ましい。培養の条件は培地の組成、菌株の種類によっ
て異なるが、培養温度は20〜35℃、さらに好ましくは25
〜30℃、培養時間は２〜７日、さらに好ましくは２〜５
日である。目的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積さ
れるので周知の分離、精製手段により培養物から分離、
精製される。たとえば、培養物から遠心分離あるいは瀘
過により菌体を除去した後、培養瀘液に硫酸アンモニウ
ムを加え塩析を行なう。塩析により析出した蛋白質を遠
心分離により採取し、10mM酢酸緩衝液(pH5.0)中で透析
し、これを遠心分離してその上清液を粗酵素溶液とす
る。粗酵素溶液中には目的とするキチナーゼの他、キト
ビアーゼや他の理化学的性質を有するキチナーゼなどが
含まれている。粗酵素溶液から目的とするキチナーゼの
分離、精製はＳＰ‐セファデックスＣ−５０（ファルマ
シア社製）のイオン交換クロマトグラフイーおよびバイ
オゲルＰ−６０（バイオラド社製）への特異的吸着性を
利用して行うことができる。
ゼ生産菌を培地に培養し、培養物中に生産せしめること
により製造される。培養に用いられる培地は、上記微生
物が利用し得る栄養源を含むものであればいづれでも良
いが、キチナーゼの生産能をより高めるには誘導基質で
あるキチンを添加することが好ましい。例えばコロイド
キチン0.5％、Ｎ−アセチルグルコサミン0.5％、ペプト
ン0.2％、酵母エキス0.01％、リン酸２水素カリウム0.0
3％、リン酸１水素カリウム0.07％、硫酸マグネシウム
・７水和物0.05％を含有するもの(pH7.0に調整）が挙げ
られる。液体培地でも固体培地でも良いが、大量に行う
場合には液体培地が好ましい。培養の方法は振盪培養が
好ましい。培養の条件は培地の組成、菌株の種類によっ
て異なるが、培養温度は20〜35℃、さらに好ましくは25
〜30℃、培養時間は２〜７日、さらに好ましくは２〜５
日である。目的とするキチナーゼは通常菌体外に蓄積さ
れるので周知の分離、精製手段により培養物から分離、
精製される。たとえば、培養物から遠心分離あるいは瀘
過により菌体を除去した後、培養瀘液に硫酸アンモニウ
ムを加え塩析を行なう。塩析により析出した蛋白質を遠
心分離により採取し、10mM酢酸緩衝液(pH5.0)中で透析
し、これを遠心分離してその上清液を粗酵素溶液とす
る。粗酵素溶液中には目的とするキチナーゼの他、キト
ビアーゼや他の理化学的性質を有するキチナーゼなどが
含まれている。粗酵素溶液から目的とするキチナーゼの
分離、精製はＳＰ‐セファデックスＣ−５０（ファルマ
シア社製）のイオン交換クロマトグラフイーおよびバイ
オゲルＰ−６０（バイオラド社製）への特異的吸着性を
利用して行うことができる。
このようにして得られるキチナーゼの活性や糖転位反応
は次のようにして測定する。
は次のようにして測定する。
(1)キチナーゼの活性 0.2％コロイドキチンを含む0.2Ｍ酢酸緩衝液(pH5.6)2.0
mに酵素液を加えて40℃で10分間反応させる。反応後シ
ャール試薬（0.5gのフェリシアン化カリウムを0.5Ｍ炭
酸ナトリウム溶液１に溶解）3.0mlを加え沸騰湯中で1
5分間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物を除き
上清液の420nmにおける吸光度の減少を測定する。還元
糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用いた標準曲線
から求める。酵素活性１Ｕは１分間に１μmoleのＮ−ア
セチルグルコサミンを生成する酵素量とした。
mに酵素液を加えて40℃で10分間反応させる。反応後シ
ャール試薬（0.5gのフェリシアン化カリウムを0.5Ｍ炭
酸ナトリウム溶液１に溶解）3.0mlを加え沸騰湯中で1
5分間加熱する。水で冷却後遠心分離して不溶物を除き
上清液の420nmにおける吸光度の減少を測定する。還元
糖の生成はＮ−アセチルグルコサミンを用いた標準曲線
から求める。酵素活性１Ｕは１分間に１μmoleのＮ−ア
セチルグルコサミンを生成する酵素量とした。
(2)糖転位反応 ５％のＮ−アセチルキトテトラオースを含む0.1Ｍリン
酸緩衝液(pH5.6)２mlに酵素溶液を加えて40℃で48時間
反応させる。一定時間ごとに反応液を採取し沸騰湯中で
10分加熱し反応を停止させる。これら溶液を高速液体ク
ロマトグラフイーに供し、反応生成物を確認した。
酸緩衝液(pH5.6)２mlに酵素溶液を加えて40℃で48時間
反応させる。一定時間ごとに反応液を採取し沸騰湯中で
10分加熱し反応を停止させる。これら溶液を高速液体ク
ロマトグラフイーに供し、反応生成物を確認した。
以上の如くして得られる本酵素の理化学的性質を示す
と、以下の通りである。
と、以下の通りである。
(a)作用 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に作用し強い糖転位反応を起
こす。本酵素の酵素量に対し過剰のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を作用させた場合、糖転位反応により重合度の高
いＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成する。またキチンま
たはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
解する。
こす。本酵素の酵素量に対し過剰のＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を作用させた場合、糖転位反応により重合度の高
いＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成する。またキチンま
たはＮ−アセチルキトオリゴ糖に作用し、これを加水分
解する。
(b)至適pH コロイドキチンを基質として40℃で反応を行った場合、
本酵素はpH5.5に至適pHを有する。
本酵素はpH5.5に至適pHを有する。
(c)pH安定性 本酵素は4℃で24時間の処理においてpH5.0〜8.0で安定
である。
である。
(d)至適温度 コロイドキチンを基質としてpH5.6で反応を行なった場
合、本酵素は70℃付近に至適pHを有する。
合、本酵素は70℃付近に至適pHを有する。
(e)熱安定性 本酵素はpH5.6で30分間の処理において50℃以下で安定
である。
である。
(f)分子量 ＳＤＳ−ディスク電気泳動法による本酵素の分子量は約
44,000である。
44,000である。
(g)等電点 クリルアミドゲル焦点電気泳動による本酵素の等電点は
pH9.1付近である。
pH9.1付近である。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス0.5％、リ
ン酸２水素カリウム0.03％、リン酸１水素カリウム0.07
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05％(pH7.0に調整）
の組成の前培養培地10mlを含む100ml容フラスコに、ノ
カルディア・オリエンタリスＩＦＯ12806の一白金耳を
接種し、30℃で１日間振盪培養した。
ン酸２水素カリウム0.03％、リン酸１水素カリウム0.07
％、硫酸マグネシウム・７水和物0.05％(pH7.0に調整）
の組成の前培養培地10mlを含む100ml容フラスコに、ノ
カルディア・オリエンタリスＩＦＯ12806の一白金耳を
接種し、30℃で１日間振盪培養した。
次にコロイドキチン0.5％、Ｎ−アセチルグルコサミン
0.5％、ペプトン0.2％、酵母エキス0.01％、リン酸２水
素カリウム0.03％、リン酸１水素カリウム0.07％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.05％の組成の本培養培地150m
lを含む1000ml容フラスコに、前記前培養終了液を接種
し30℃で３日間振盪培養した。このような操作により得
られた培養液450ml（150ml×３）を10,000rpm、15分間
遠心分離して菌体を除き、上清液を75％飽和となるよう
に固型硫安を加え４℃で塩析を行なった。塩析により沈
澱した蛋白質を４℃で8,000rpm、15分間遠心分離して採
取し、これを少量の水に溶解し10mM酢酸緩衝液(pH5.0)
に透析した。透析液を４℃で10,000rpm、15分間遠心分
離して上清液30mlを得、これを粗酵素液とした。
0.5％、ペプトン0.2％、酵母エキス0.01％、リン酸２水
素カリウム0.03％、リン酸１水素カリウム0.07％、硫酸
マグネシウム・７水和物0.05％の組成の本培養培地150m
lを含む1000ml容フラスコに、前記前培養終了液を接種
し30℃で３日間振盪培養した。このような操作により得
られた培養液450ml（150ml×３）を10,000rpm、15分間
遠心分離して菌体を除き、上清液を75％飽和となるよう
に固型硫安を加え４℃で塩析を行なった。塩析により沈
澱した蛋白質を４℃で8,000rpm、15分間遠心分離して採
取し、これを少量の水に溶解し10mM酢酸緩衝液(pH5.0)
に透析した。透析液を４℃で10,000rpm、15分間遠心分
離して上清液30mlを得、これを粗酵素液とした。
粗酵素液30mlを10mM酢酸緩衝液(pH5.0)で平衡化したＳ
Ｐ−セファデックスＣ−50（ファルマシア社製）のカラ
ム(2.5×40cm)に吸着させた。溶出は0→0.5Mの食塩を含
む同上緩衝液による塩濃度勾配溶出法で行なった。なお
流速は60ml／hrであった。ここで得られた活性画分149m
lに80％飽和となるように固形硫安を加え４℃で塩析を
行なった。塩析により沈澱した蛋白質を４℃で8,000rp
m、15分間遠心分離して採取し、0.5Ｍ食塩を含む50mM酢
酸緩衝液(pH5.6)に透析した。透析液を４℃で10,000rp
m、15分間遠心分解して上清液３mlを得た。上記で得ら
れた上清液３mlを0.5Ｍ食塩を含む50mM酢酸緩衝液(pH5.
6)で平衡化したバイオゲルＰ−60（バイオラド社製）の
カラム(2.2×77cm) に供した。溶出は同上緩衝液によ
り行ない、バイオゲルＰ−60への特異的吸着性により遅
れて分離された活性画分100mlを得た。なお流速は12.8m
l／hrであった。以上の精製の要約を第１表に示す。こ
のようにして得られたキチナーゼは、ＳＤＳ−ディスク
電気泳動で均一であった。
Ｐ−セファデックスＣ−50（ファルマシア社製）のカラ
ム(2.5×40cm)に吸着させた。溶出は0→0.5Mの食塩を含
む同上緩衝液による塩濃度勾配溶出法で行なった。なお
流速は60ml／hrであった。ここで得られた活性画分149m
lに80％飽和となるように固形硫安を加え４℃で塩析を
行なった。塩析により沈澱した蛋白質を４℃で8,000rp
m、15分間遠心分離して採取し、0.5Ｍ食塩を含む50mM酢
酸緩衝液(pH5.6)に透析した。透析液を４℃で10,000rp
m、15分間遠心分解して上清液３mlを得た。上記で得ら
れた上清液３mlを0.5Ｍ食塩を含む50mM酢酸緩衝液(pH5.
6)で平衡化したバイオゲルＰ−60（バイオラド社製）の
カラム(2.2×77cm) に供した。溶出は同上緩衝液によ
り行ない、バイオゲルＰ−60への特異的吸着性により遅
れて分離された活性画分100mlを得た。なお流速は12.8m
l／hrであった。以上の精製の要約を第１表に示す。こ
のようにして得られたキチナーゼは、ＳＤＳ−ディスク
電気泳動で均一であった。
Claims (2)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有するキチナーゼ (a)作用：Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に使用し強い糖転
位反応を起こす。またキチンまたはＮ−アセチルキトオ
リゴ糖に作用し、これを加水分解する。 (b)至適ｐＨ：ｐＨ５．５。 (c)ｐＨ安定性：４℃で24時間の処理においてｐＨ５．
０〜８．０で安定。 (d)至適温度：ｐＨ５．６でコロイダルキチンに作用さ
せた場合、70℃付近にある。 (e)熱安定性：ｐＨ５．６で30分間の処理において50℃
以下で安定。 (f)分子量：約44,000。 (g)等電点：ｐＨ９．１付近。 - 【請求項２】ノカルディア属に属するキチナーゼ生産菌
を培地に培養し、培養物中に、 (a)作用：Ｎ−アセチルキトオリゴ糖に使用し強い糖転
位反応を起こす。またキチンまたはＮ−アセチルキトオ
リゴ糖に作用し、これを加水分解する。 (b)至適ｐＨ：ｐＨ５．５ (c)ｐＨ安定性：４℃で24時間の処理においてｐＨ５．
０〜８．０で安定。 (d)至適温度：ｐＨ５．６でコロイダルキチンに作用さ
せた場合、70℃付近にある。 (e)熱安定性：ｐＨ５．６で30分間の処理において50℃
以下で安定。 (f)分子量：約44,000。 (g)等電点：ｐＨ９．１付近。 の理化学的性質を有するキチナーゼを生産せしめこれを
採取することを特徴とするキチナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60277630A JPH062058B2 (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | キチナ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60277630A JPH062058B2 (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | キチナ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62134087A JPS62134087A (ja) | 1987-06-17 |
| JPH062058B2 true JPH062058B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=17586104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60277630A Expired - Lifetime JPH062058B2 (ja) | 1985-12-09 | 1985-12-09 | キチナ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062058B2 (ja) |
-
1985
- 1985-12-09 JP JP60277630A patent/JPH062058B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４０（１２）（１９７６）Ｐ．２３２５−２３３３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62134087A (ja) | 1987-06-17 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |