JPH062076B2 - 特定の運動性微生物を検出する方法及びそのための装置 - Google Patents

特定の運動性微生物を検出する方法及びそのための装置

Info

Publication number
JPH062076B2
JPH062076B2 JP60255815A JP25581585A JPH062076B2 JP H062076 B2 JPH062076 B2 JP H062076B2 JP 60255815 A JP60255815 A JP 60255815A JP 25581585 A JP25581585 A JP 25581585A JP H062076 B2 JPH062076 B2 JP H062076B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
motile
medium
microorganisms
motility
selective
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP60255815A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS6261598A (ja
Inventor
ロバート ワード ジユニア ノーマン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BAIOKONTOROORU SHISUTEMUZU Inc
Original Assignee
BAIOKONTOROORU SHISUTEMUZU Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BAIOKONTOROORU SHISUTEMUZU Inc filed Critical BAIOKONTOROORU SHISUTEMUZU Inc
Publication of JPS6261598A publication Critical patent/JPS6261598A/ja
Publication of JPH062076B2 publication Critical patent/JPH062076B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; Fish
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/879—Salmonella

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 （関連出願） この出願は、現在は取下げられている１９８２年４月９
日に出願された出願番号３６６，９７８の継続出願であ
る１９８５年６月１５日に出願された出願人の係属中の
出願番号６２１，１８２の一部継続出願である。
（技術分野） 本発明は、一般的には試料中の微生物の検出に関するも
のであり、更に詳しくは試料中の特定の運動性微生物、
例えばサルモネラ菌のような鞭毛細菌を検出する方法に
関するものである。
（技術的背景） サルモネラ菌は種々の食品、日常品、飼料、水および廃
水中に見い出され、人間に色々な病気を引きおこす原因
となる条件的好気性グラム陰性の鞭毛細菌属の一種であ
る。食中毒の一つであるサルモネロシス(Salmonellosi
s)はその影響力、経済的負担、危険性等の観点からアメ
リカ合衆国において、主要な問題の一つになつている。
サルモネロシスは通常致命的な病気とはされていない
が、幼児や老人に関してはいくつかの死亡例が報告され
ている。
食品、日常品、飼料の各産業は、サルモネラ菌で汚染し
た生産物の回収や投棄破壊および消費者の製品安定性に
関する信用の喪失にかかる経済的衝撃をさけるために、
サルモネラ菌の汚染に関して製品を徹底的に精査する。
サルモネラ菌汚染に対する製品の検査は、その存在量が
非常に低いために非常な困難を伴う。さらに、特に食品
や飼料中に存在する競合する運動性微生物が培養的検出
を妨害するという意味で、他の数多くの微生物の存在が
サルモネラ菌の検出を複雑なものにしている。
従来のサルモネラ菌の検出操作にはいくつかの欠点があ
る。培養操作は非常に繁雑で労力がかかり、高価な薬品
を必要とし、長時間を費やし（完了するのに４日間必要
である）、さらに誤つて否定的結果を与えることがあ
る。蛍光抗体法は高度に熟練した技術者や高価な蛍光顕
微鏡および時として特異性を欠くことのある高価なフル
オレセインラベル抗血清を必要とする。
サルモネラ菌を検出するその他の迅速で簡単な方法を工
夫したいくつかの試みがなされている。この中のいくつ
かは、選択的な半固体流動培地中をサルモネラ菌が優先
的に移動することを利用している。モヒツト(Mohit)等
は医学および微生物学ジャーナル(J.Med.Microbiol.)８
巻１７３頁（１９７５年）中の“多数の細菌共存下での
サルモネラ菌の検出に関する簡単で一段階の免疫的固定
法”で、またスワミナサン(Swaminathan)等は食品科学
ジャーナル(J. Food Science)４３巻５号１４４頁（１
９７８年）中の“メンブレン フイルターデイスク固定
化法を用いた食品中のサルモネラ菌の迅速検出法”の中
で、ペトリ皿中でのサルモネラ菌の移動とそれに続く多
価Ｈ血清による固定を促進する選択的半固体培地につい
て述べている。スワミナサン(Swaminathan)等は、サル
モネラ菌の回収率を増す目的で選択的移動を行なわせる
前に予め選択性培地で一次培養してそれをメンブレンフ
イルター上に濃縮した。
これらの運動性技術は成功の見込みを示したが、操作上
の困難さがそれらの効果を打ち消してしまつている。特
に次のような問題を含んでいる、 (1) サルモネラ菌の存在を示す明確で簡単に説明可能
な反応を欠いていること、 (2) ある種のサルモネラ菌の運動性を著しく減ずるか
もしくは、完全に阻害してしまい、特定のサルモネラ菌
の選択的移動を促進するような化学試薬を運動性培地中
に使用すること、 (3) 組み立てが複雑でイノキユレーシヨンが難かし
く、しかも高価なガラス器具を使用すること。
結果的に、(a)感度が高く特異性があり、(b)迅速で、細
菌学的に安全で、比較的に簡単でしかも安価な、そして
(c)検出すべきサルモネラ菌もしくはその他の特定の運
動性微生物の存在を明確にそして簡単に説明できるよう
な方法で試料中のサルモネラ菌やその他の運動性微生物
を検出する改良された方法を開発する技術の必要性があ
る。本発明はこの必要性を満しており、さらにその他の
関連する長所を合わせ持つている。
（発明の公開） 簡単に言うと、本発明はドライミルク、生肉、家禽、も
しくは臨床標本等に由来する試料中に存在する特定の運
動性微生物を検出する方法およびこれに関連する装置を
公開するものである。本発明の一要素として、この方法
は、少なくとも１種以上の走化性誘引物質を添加した選
択的栄養培地に検出すべき運動性微生物と１種以上の競
合する運動性微生物を含む試料を接種することからな
る、走化性誘引物質は検出すべき運動性微生物および運
動性競合者の運動性を阻害し、また一方栄養化培地は、
運動性競合者に比較して、検出すべき運動性微生物の生
育に選択的に働く。運動性微生物を含む選択的培地は、
選択的培地中ほどの走化性誘引物質を含まない非選択的
運動性培地と接触させる。そして、試料を含む選択的栄
養培地を、検出すべき運動性微生物がその運動性阻害か
ら解放され、運動性培地への移動が可能になる程度の、
運動性培地中よりも低い濃度へと走化性誘引物質を代謝
してしまう条件でインキュベートする。さらに運動性培
地は、遠位末端から検出すべき運動性微生物が存在する
場所の末端部分への運動性培地中での、基本的に一方向
性の運動に制限される、運動性微生物に特異的に働く抗
体を含んでいる。その抗体は、運動性微生物と反応して
接続的な固定化バンドを作るに十分な量存在する。この
反応の結果、固定化バンドの形成を確認でき、特定の運
動性微生物の存在を確めることができる。検出すべき運
動性微生物の性質と試料の状態によつては、インキュレ
ーシヨン段階の前に、非選択的もしくは選択的な栄養培
地で試料を活性化させることも有用である。
本発明のもう一つの関係する態様は、運動性培地中で運
動性微生物に特異的な抗体が運動性微生物をとり囲んで
おり、運動性微生物と反応して持続的な固定化リングを
作るに十分な量存在すること以外は上述と基本的に同様
な方法を公開している。
さらに本発明のもう一つの態様は、導通孔で互いに通じ
た移動チヤンバーと栄養化チヤンバーをもち、その両端
に脱着可能なキヤツプを備えた二つの出入口を有する、
免疫的運動性固定法で使用する運動性試験容器に使用す
る構造物を公開している。栄養化チヤンバーは選択的栄
養化培地と少なくとも１種の走化性誘引物質を含む。移
動チヤンバーは非選択的運動性培地と、栄養化チヤンバ
ーよりも低い濃度の走化性誘引物質を含む。さらに移動
チヤンバーは導通孔の末端部分にある量の抗体を含んで
いる。
この発明のその他の態様は以下に詳細に陳述もしくは図
示することを参照すれば明らかであろう。
（本発明の最適実施様式） 本発明中、試料中に存在する特定の微生物は“免疫的運
動性固定法”により検出される。特定の運動性微生物の
数や生理学的条件、ならびに試料中に共存する競合微生
物の数に依存して、いくつかの操作がとられる。例えば (i) 試料中、検出すべき特定の運動性微生物が非常に
僅かしか存在しない場合や、熱処理、pH変化、乾燥等の
試料中に存在する細菌類に生理的傷害を与えるような処
理がほどこされた場合には、試料を非選択的栄養培地で
活性化する必要がある。一般にこの培地は栄養素及びビ
タミン類を含み、傷害を受けた細菌の回復やこれらの微
生物の増殖を促進させるものである。一般に使用する非
選択的栄養培地の例としてラクトース培地がある。試料
の一例としてはドライミルクがある。
(ii) 試料中、特定の運動性微生物がほとんど存在せ
ず、その他の競合細菌が数多く存在し、しかもいかなる
処理や生存微生物に有害な条件にさらされていない場合
は、競合細菌に比し特定の運動性微生物に選択的な培地
で試料を活性化する必要がある。この選択的栄養培地
は、一般に栄養素、ビタミン類および化学試薬からな
る。これらの化学試薬（以下“選択試薬”とする）は競
合細菌の生育を阻害するか、もしくはこれを死滅させる
が、同時に、競合微生物以上の増殖速度を特定の運動性
微生物に許すようなものである。サルモネラ菌に選択的
で一般的によく使用される栄養培地には、テトラチオネ
ート培地、０．００１％ブリリアントグリーンを含むテ
トラチオネート培地、セレナイト・システイン、ＳＢＧ
−Ｓ、ラパポルテ・バシリアデイス(Rappaporte Vassil
iadis)培地、修正ラパポルテ培地（ＲＩＯ）（バシリア
デイス(Vassiliadis)等．，ＺＢＬ細菌学・微生物学・
衛生学(Bakterioi. Mikroviol.Hyg.)ｉ．ABT．OrgＢ１
７３巻，頁３８２‐３８９，１９８１年），リシン・鉄
・システイン・ニユートラル・レツド培地(LICNR),そし
て修正LICNR培地（ホーベン(Hoben)等、応用微生学物(A
pplied Micro.)２５巻、頁１２３‐１２９、１９７３
年）。試料例としては生肉又は家禽がある。
(iii) 試料中に競合微生物に対して圧倒的に多く検出
すべき特定の運動性微生物が存在し、しかも特定の運動
性微生物が生理的傷害を受けるような条件にさらされな
い場合は、競合微生物に比較して特定の運動性微生物の
増殖を促進するような選択的培地に試料を添加するか、
もしくは以下により詳しく述べるように、走化性誘引物
質を添加した選択的栄養培地に直接試料を加えるように
する。後者の操作は、例えば、下痢のような腸内感染の
徴候を示す患者からの臨床標本由来の試料に対して特に
有効である。この操作法は家禽標本由来の試料について
も等しく応用できる。
試料の選択的又は非選択的活性化につづいて、もしくは
上に述べたような操作をすることなしに、試料を適当な
走化性誘引物質を含む選択的栄養培地に加える。サルモ
ネラ菌の検出に対する選択的栄養培地にはテトラチオネ
ート培地、０．００１％ブリリアントグリーンを含むテ
トラチオネート培地、セレナイト・システイン培地そし
てＳＢＧ‐Ｓ培地が含まれる。サルモネラ菌に優利な走
化性誘引物質はＬ‐セリンである。選択的栄養培地中の
Ｌ−セリン濃度は運動性試験容器中で用いられる運動性
培地中より高くしなければならない。通常この濃度は
０．００１Ｍより高く、好ましくは０．００１Ｍと０．
１Ｍの間が良い。
選択的栄養培地中に走化性誘引物質があること及び運動
性培地中よりも高い濃度で選択的栄養培地中に走化性誘
引物質があることで、試料中に存在する特定の運動性微
生物およびその運動性競合微生物はある一定時間基本的
に“不活性化”され、選択的栄養培地から移動培地への
走化性運動が出来なくなる。特定の運動性微生物とその
競合者は、選択的栄養培地中の走化性誘引物質濃度が特
定の運動性微生物およびその競合者による代謝によつて
運動性培地中の走化性誘引物質濃度よりも低くなるま
で、選択的栄養培地から非選択的栄養培地への移動はで
きない。ある時点で一時的な濃度勾配ができ、その結果
特定の運動性微生物およびその運動性競合細菌は、運動
性培地中により高い走化性誘引物質を認識することがで
き、これらの微生物は走化性由来の運動をすることがで
きるようになる。
さらに、適当な時間内、検出すべき特定の運動性微生物
の増殖を有利に進める選択性試薬の存在下で、走化性誘
引物質は運動性微生物を保持するのに役立つている。走
化性誘引物質の濃度は、運動性微生物の選択的栄養培地
から運動性培地への移動をおよそ４時間阻害するに十分
なことが望ましい。
十分な量の走化性誘引物質が代謝され、運動性の阻害か
ら解放されて始めて、運動性微生物は自由に非選択的移
動培地へと動くことができる。特定の運動性微生物が存
在する試料においては、選択的栄養培地中、特定の運動
性微生物は他の競合微生物よりより高い増殖速度で生育
し走化性誘引物質をすみやかに代謝することができる。
このような場合には、運動性阻害から早く解放されて、
特定の運動性微生物およびその運動性競合者はすみやか
に非選択的運動性培地へと動くことができる。特定の運
動性微生物が存在しないような場合、その競合微生物は
栄養培地中の選択性試薬の存在によつて非常に抑制され
た速度で生育することになる。この結果、この試験に当
てられた時間内でのその競合運動性微生物の非選択的運
動性養培地への移動は阻害されることになる。この運動
性の阻害はこの運動性競合細菌が特定の細菌用の抗血清
と反応して誤つてポジテイブな結果が出てしまうような
場合には特に都合がよい。
検出すべき運動性微生物が移動する運動性培地はうまい
ことに非選択的である。言葉をかえて言うと、それは検
出すべき特定の運動性微生物に比較してその競合運動性
微生物の生育を阻害するような選択的化学試薬を含まな
い。この事は、ある選択的運動性培地の使用がある種の
サルモネラ菌の運動性を減ずるか、もしくはまつたく阻
害してしまう理由でサルモネラ菌の場合に特に重要であ
る。
運動性培地はアガローズのようなゲル化試薬を含むこと
が好ましい。ゲル化試薬はゲル化するのに十分な濃度で
はあるが、運動性微生物がすみやかに運動することがで
きるぐらいには低い濃度を採用すべきである。例えば、
通常適しているのは0.1〜0.4ｇ／１００mlの濃度範囲で
ある。
また運動性培地は、微生物の生育に必要なアミノ酸やビ
タミン類等の栄養素とともに、検出すべき特定の運動性
微生物およびそれらの競合者を誘引する一種以上の走化
性試薬を含んでいる。検出すべき運動性微生物がサルモ
ネラ菌の場合には誘引物質としてグルコースが使用で
き、グルコースが無い場合にはセリンを使うことができ
る。上述のように、Ｌ‐セリンはサルモネラ菌やサルモ
ネラ菌に属さない他の運動性競合者に対する走化性誘引
物質と認められている。運動性免疫学的固定法を完全に
密閉された容器で行なう場合には、グルコースのような
曲型的な炭化化物を含まない運動性培地が好ましい。グ
ルコースのような炭水化物は運動性微生物に気体を産生
させ、その結果ゲルの破壊をひきおこすからである。
また、運動性培地に、検出すべき特定な運動性微生物の
鞭毛に特異的な拡散性モノクローナルもしくはポリクロ
ーナル抗体が加えられる。運動性培地中に、特定の運動
性微生物と反応して持続的な固定化バンドを形成するに
十分な量の抗体を添加しなければならない。検出すべき
特定の運動性微生物がサルモネラ菌の場合には、多価Ｈ
抗血清（デイフコ研究所(Difco Labratories)、デトロ
イト、ミシガン、リー研究所(Lee Labratories)、アト
ランタ、ジヨージア）のような多種の、サルモネラ菌の
鞭毛に特異的な市販の抗体を使用することができる。サ
ルモネラ菌の鞭毛に特異的で適当なモノクローナル抗体
があればポリクローナル抗体にとつてかわることができ
ることはその分野の技術に精通した人ならば明らかであ
ろう。例えばサルモネラ菌はＭＯＰＣ４６７モノクロー
ナル抗体（スミス(Smith)とポツター(Potter)、免疫学
ジヤーナル(J. Immunol.)１４４巻、1847頁、１９７５
年；スミス(Smith)等、免疫学ジヤーナル(J.Immunol.)
１２３巻、１７１５頁、１９７９年）もしくは６Ｈ４モ
ノクローナル抗体（マチングリー(Mattingly)等、食品
技術(Food Technology)３９巻、９０‐９４頁、１９８
５年）によつて固定化することができる。
運動性培地中の走化性誘引物質濃度を注意深くコントロ
ールすることが重要である。誘引物質を高濃度にする
と、代謝すべき誘引物質量が多くなり運動速度が低下し
てしまう。しかし、走化性誘引物質に応答する運動性微
生物の数は増加する。従つてより多い検出すべき特定の
運動性微生物が抗体と反応し、観察されるバンドがより
明確になる。逆に、非常に低い走化性誘引物質濃度が採
用されると、運動速度はより早くなるが、それに比例し
て抗体と反応する細胞の数が減りバンドが薄くなつてし
まう。
この試験法ではおよそ２４時間弱で完了してしまうので
通常、特定の運動性微生物と競合する運動性微生物は選
択的栄養培地中に含まれる選択性試薬によってその生育
が阻害され、運動性培地に致達する前に試験は完了して
しまう。このことは、鞭毛抗体がある種の運動性競合微
生物と反応することによつて引き起こされる誤つたポジ
テイブな結果をまねかないために有益なことである。
従つて運動性培地中の適当な走化性誘引物質濃度とは、
次の二つの要素を満足させるものである。
(1) 試験が完了するまでの時間が、例えば２４時間弱
というように比較的短かくなるように、運動性培地中で
の運動速度がすみやかであること、 (2) 拡散性の鞭毛抗体と、特定の運動性微生物との反
応の結果、明確で強固で顕微鏡で見分けることができる
固定化バンドが形成すること。
以下に“運動性試験容器”と呼ぶように、以上に述べて
きた方法に使用する容器本体は透明のものが好ましく、
一度で使い捨ての透明もしくは光学的に透明なプラスチ
ツク製のものが良いだろう。完全にゆがみのない（光学
的に透明）プラスチツクを使用すれば好ましいが、透明
のプラスチツクの使用が本発明の目的には最も適当であ
る。抗体をしつかりと納め、運動性培地への抗体の移動
を制限して、基本的に一方向性にするという意味で抗体
を導入する連動性試験容器の個所は、それを用いるよう
設計することが望ましい。
このように抗体を納めることによつて、検出すべき特定
の運動性微生物と抗体との反応によつて形成する固定化
ハンドは遷移的というよりむしろ十分永久的であるとい
える。安全性を考えると接種したものと抗体を添加した
後は運動性試験容器はしつかりとシールした方がよいで
あろう。
図１を参照していただくと、本発明の運動性試験容器の
好ましい形状が示してある。運動性試験容器１０は、各
々キヤツプ１８，２０を備えた第１の出入口１４と第２
の出入口１６を有する構造体からなつている。図２をみ
てみると、構造体１２は導通孔２６で連結した中央の移
動チヤンバー２２と栄養化チヤンバー２４を限定してい
る。
運動性試験容器１０を使用するためには出入口１６のキ
ヤツプ２０をはずして、移動チヤンバーの中に運動性培
地が加えられる。使用に際して運動性培地は、好ましく
は１２１℃１５min間の熱処理等の滅菌処理をほどこす
必要がある。溶融した培地は４５℃まで冷却し移動チヤ
ンバー中にそそぎこむ。移動チヤンバーの出入れを可能
にするためにネジ込み式にキヤツプ２０の脱着ができる
ネジ山がついたカラー１７をもつ出入口１６があること
が望ましい。中央の移動チヤンバーがしつかりと満たさ
れるように十分な量の培地を加える必要がある。そして
出入口１６にキヤツプ２０が締めつけられる。図２に示
したように、ゲルを破壊する恐れのある移動チヤンバー
からの気体の泡を除くことができるように、ゲル・デイ
スプレイサー２１を備えたキヤツプ２０を用いることが
望ましい。そのゲル・デイスプレイサーはキヤツプ２０
の一部であつても、分離したものでもよい。そしてこの
様に設計すると、運動性培地が少量で済むということと
同時に、キヤツプ２０をひねることによつて、移動チヤ
ンバー２２から気体の泡を除けることになるであろう。
溶融した運動性培地は、粘調な液体と同様な一様性をも
つて固体化する。走化性誘引物質を含む選択的栄養培地
と試料とで栄養化チヤンバー２４をイノキユレートする
時には、運動性試験容器をキヤツプ１８をはずして水平
な場所に置いた方が良い。一般にチヤンバー２４内の選
択的栄養培地におよそ０．１mlの試料を添加し、続いて
キヤツプ１８がとりつけられる。
さらに、運動性試験容器を垂直立ててキヤツプ２０が再
びはずされる。その後、チヤンバー２２中の固体化した
運動性培地の露出した表面に抗血清を乗せる。抗血清の
量としては２０〜１００マイクロリツトルが適当であ
る。キヤツプ２０をとりつけ、運動性試験容器を３２〜
４３℃の温度範囲、好ましくは３５〜３７℃でインキユ
ベートする。その間容器はしつかりと垂直に保つてお
く。
選択的栄養培地に添加した走化性誘引物質を代謝した
後、検出すべき特定の運動性微生物は導通孔２６を通
り、出入口１６に向つて運動性培地中に移動する。運動
性培地の表面に添加した抗血清は培地中に拡散してい
き、検出すべき運動性微生物を固定化する。この固定化
により、抗血清が加えられた出入口１６の端からおよそ
１〜２mm下に、１つもしくはそれ以上のシヤープで濃い
顕微鏡で観察できるバンドが形成される。
次にあげる実施例は限定のためではなく説明のために述
べたものである。
（実施例） ブリリアンド・グリーンを含むテトラチオネート培地を
製造元の説明書に従つて調製した。生のチキン肝臓２５
ｇの試料を、０．００１％のブリリアンド・グリーンを
含む２２５mlのテトラチオネート培地（デイフコ(Difc
o)）に加え、その配合物をブレンダーに入れて２分間混
合した。混合後、その試料と培地を３５℃で２４時間イ
ンキユベートした（注意：インキユベーシヨンは一般に
３５〜４３℃で８〜４８時間行なわれる）。
上述のように運動性試験容器を滅菌し、中央の移動チヤ
ンバーを１．５％(w／v)のポリペプトン（ＢＢＬ、コツ
キースビル(Cockeysville)、メリーランド）と０．２〜
０．３％(w／v)の寒天からなる滅菌済の溶融した非選択
的運動性培地で満たした。その培地はチヤンバーに入れ
る前に４５〜４８℃に冷却した。そして運動性培地はチ
ヤンバー内で十分固体化された。（注意：脱水を防ぐた
めにしつかりとキヤツプした場合は培地充填後のユニツ
トは９ケ月保存が可能である。） 運動性試験容器はおよそ９０゜傾けられ、栄養化チヤン
バーのキヤツプとゲル・デイスプレイサーをとりはず
す。それから栄養化チヤンバーに０．１ＭＬ‐セリンを
補った０．９mlのテトラチオネート培地を加える。この
栄養培地は製造元の説明書に従つて調製した。この培地
は移動チヤンバー内の非選択的運動性培地と接する。お
よそ０．１mlの選択的に活性化した試料をセリンを補つ
た培地中にインキュレートし、キヤツプをする。
運動性試験容器を垂直にもどし、移動チヤンバーのキヤ
ツプとゲル・デイスプレイサーをとりのぞく。そしてお
よそ０．１mlの５分の１に希釈した多価Ｈ抗体（デイフ
コ(Difco))を、露出している運動性培地の表面に加え、
キヤツプをした。
運動性試験容器をさらに８〜２４時間インキユベートす
ると、抗体を加えた運動性培地の表面の下およそ１〜２
mm下に細胞のうすくぼんやりしたバンドが観察される。
前述より、この発明を特別に具体化したものが説明を目
的として述べられてはいるが、この発明の意図もしくは
範囲をはずれることなしに数多くの修正を行うことがで
きることは明白であろう。従つて本発明は、添付される
特許請求の範囲以外によつては制限されるものではな
い。
【図面の簡単な説明】
図１は本発明の運動性試験容器の上面図である。図２
は、図１の数字２と２を結ぶ線に沿つて垂直に切つた断
面図である。

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】検出すべきある運動性微生物と一つもしく
    は複数の競合する運動性微生物を含む試料を、それら運
    動性微生物の運動性を阻害する少なくとも一種以上の走
    化性誘引物質を含み同時に競合する運動性微生物に比し
    て検出すべき運動性微生物を選択的に生育させる栄養物
    を含む選択的培地に接種し、 選択的栄養培地中よりも走化性誘引物質の濃度が高くな
    い非選択的運動性培地を運動性微生物を含む選択的培地
    と接触させ、 検出すべき運動性微生物が運動性培地中の走化性誘引物
    質よりも低いレベルにまで走化性誘引物質を代謝するこ
    とができる条件で試料を含む選択的栄養培地をインキュ
    ベートし、それによって、検出すべき運動性微生物を該
    運動性培地内に移動させ、検出すべき運動性微生物に特
    異的に働く抗体であって、該運動性培地内の運動性微生
    物の初期位置に対して遠位に存在する十分な量の抗体と
    相互作用させて、持続的な固定化した微生物のバンドを
    作り、そして その微生物の固定化バンドの形成を観察すること、 からなる試料中に存在する特定の運動性微生物を検出す
    る方法。
  2. 【請求項２】試料を接種する前に予め栄養培地で試料を
    活性化しておくことを含む特許請求の範囲１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】栄養培地が非選択的栄養培地である特許請
    求の範囲２項記載の方法。
  4. 【請求項４】栄養培地が競合する運動性微生物に比して
    検出すべき運動性微生物を選択的に生育させるものであ
    る特許請求の範囲２項記載の方法。
  5. 【請求項５】検出すべき運動性微生物がサルモネラ菌(S
    almonella)である特許請求の範囲１項記載の方法。
  6. 【請求項６】選択的栄養培地が、テトラチオネート培
    地、０．００１％ブリリアント・グリーンを含むテトラ
    チオネート培地、セレナイトーシステイン培地およびＳ
    ＢＧ−Ｓ培地からなる群から選ばれたものである特許請
    求の範囲５項記載の方法。
  7. 【請求項７】走化性誘引物質がＬ−セリンである特許請
    求の範囲５項記載の方法。
  8. 【請求項８】走化性誘引物質の濃度が０．００１Ｍと
    ０．１Ｍの間である特許請求の範囲７項記載の方法。
  9. 【請求項９】試料がドライミルク、生肉、家禽および臨
    床標本からなる群に由来するものである特許請求の範囲
    ２項記載の方法。
  10. 【請求項１０】試料が臨床標本に由来するものである特
    許請求の範囲１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】抗体がポリクローナル及び単一クローナ
    ル抗体からなる群から選ばれたものである特許請求の範
    囲１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】モノクローナル抗体がＭＯＰＣもしくは
    ６Ｈ４である特許請求の範囲１１項記載の方法。
  13. 【請求項１３】ポリクローナル抗体が多価Ｈ抗血清であ
    る特許請求の範囲１１項記載の方法。
  14. 【請求項１４】運動性培地がゲル化試薬を含んでいる特
    許請求の範囲１項記載の方法。
  15. 【請求項１５】ゲル化試薬がアガローズもしくは寒天で
    ある特許請求の範囲１１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】運動性培地が基本的に運動性微生物もし
    くは競合する運動性微生物のガス発生を誘発する栄養物
    を含まないものである特許請求の範囲１項記載の方法。
  17. 【請求項１７】検出すべきある運動性微生物と１つもし
    くは複数の競合する運動性微生物を含む試料を、それら
    双方の運動性を阻害する少なくとも一種以上の走化性誘
    引物質を含み、同時に競合する運動性微生物に比較して
    検出すべき運動性微生物を選択的に生育させる栄養物を
    含む培地に接種し、 選択的栄養培地ほどには走化性誘引物質の濃度が高くな
    い非選択的運動性培地を運動性微生物を含む選択的培地
    と接触させ、 検出すべき運動性微生物が運動性培地中の走化性誘引物
    質よりも低いレベルにまで走化性誘引物質を代謝するこ
    とが可能な条件で試料を含む選択的栄養培地をインキュ
    ベーションし、それによって、検出すべき運動性微生物
    を該運動性培地内に移動させ、検出すべき運動性微生物
    に特異的に働く抗体であって、運動性培地中で検出すべ
    き運動性微生物を実質的に取り囲むように存在する十分
    な量の抗体と相互作用させて、持続的な固定化したリン
    グを形成し、そして その固定化したリングを観察すること、 からなる試料中に存在する特定の運動性微生物を検出す
    る方法。
  18. 【請求項１８】選択的栄養培地と少なくとも一種類の走
    化性誘引物質を含む栄養化チャンバーと、非選択的運動
    性培地および栄養化チャンバー中よりも少ない濃度の走
    化性誘引物質を含み、さらに栄養化チャンバーとの間に
    互いに往き来できる様に連結する導通孔の遠位末端部分
    に一定量の抗体を含む移動チャンバーとからなる、両端
    に脱着可能なキャップを備えた出入口を有する構造物か
    らなる免疫的運動性固定化法に使用する運動性試験容
    器。
  19. 【請求項１９】両端の各出入口のキャップの下に一対の
    ゲル・ディスプレーサーを有する特許請求の範囲１８項
    記載の容器。
  20. 【請求項２０】両端に二つの出入口をもち、その間の中
    央に移動領域をもつ運動性試験容器を、ある特定の運動
    性微生物およびその他の競合する運動性微生物の走化性
    誘引物質を含み、特定の運動性微生物に比較して競合す
    る運動性微生物の生育に非選択的な運動性培地で満た
    し、 特定の運動性微生物の生育が他の運動性微生物よりも選
    択的で、特定の運動性微生物の生育が他の運動性微生物
    よりも有利になるに十分な時間、両方の微生物の運動性
    を阻害するに十分な濃度の走化性誘引物質を含む栄養化
    培地と試料を、運動性試験容器の一つの出入口に露出し
    た培地に添加することにより運動性培地に接種し、 特定の運動性微生物の鞭毛に特異的な拡散性抗体を、運
    動性試験容器のもう一方の出入口の露出した培地に添加
    し、 運動性微生物が栄養化培地中で走化性誘引物質を代謝し
    特定の運動性微生物および競合する運動性微生物を運動
    性の阻害から解放する濃度にまで走化性誘引物質濃度を
    下げ、その結果走化性により、拡散する抗体に向って容
    器の中央移動領域へと特定の運動性微生物を移動させ、
    持続的な固定化バンドを形成するに十分な抗体量と、一
    定時間経過した後の栄養化培地中に残存する走化性誘引
    物質濃度より高く、しかも目でみえる程度の固定化バン
    ドを形成するに必要な特定の運動性微生物の移動を可能
    にするに十分な濃度の走化性誘引物質によって、特定の
    運動性微生物を固定化するのに必要な温度及び時間条件
    下で運動性試験容器をインキュベートし、そして この固定化バンドを観察すること、 からなる試料中の特定の運動性微生物の存在を確認する
    方法。
  21. 【請求項２１】運動性試験容器を満たすステップの前
    に、検出すべき特定の運動性微生物に選択的な栄養化培
    地中で特定の運動性微生物を含む試料を活性化しておく
    ことを含む特許請求の範囲２０項記載の方法。
JP60255815A 1985-09-09 1985-11-14 特定の運動性微生物を検出する方法及びそのための装置 Expired - Lifetime JPH062076B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US773201 1985-09-09
US07/773,201 US4920063A (en) 1984-06-15 1985-09-09 Process for detection of selected motile organisms

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS6261598A JPS6261598A (ja) 1987-03-18
JPH062076B2 true JPH062076B2 (ja) 1994-01-12

Family

ID=25097513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP60255815A Expired - Lifetime JPH062076B2 (ja) 1985-09-09 1985-11-14 特定の運動性微生物を検出する方法及びそのための装置

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4920063A (ja)
EP (1) EP0214340B1 (ja)
JP (1) JPH062076B2 (ja)
AT (1) ATE73857T1 (ja)
CA (1) CA1271707A (ja)
DE (1) DE3585689D1 (ja)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3783540T2 (de) * 1986-08-28 1993-07-22 Unilever Nv Vorrichtungen und verfahren zur kultivierung und pruefung von mikroorganismen.
US5071766A (en) * 1987-09-30 1991-12-10 Syntex (U.S.A.) Inc. Cell culture vial
WO1990013033A1 (en) * 1989-04-14 1990-11-01 Biocontrol Systems, Incorporated Process and device for detecting a particular motile organism
WO1991019003A1 (en) * 1990-06-08 1991-12-12 Biotech Australia Pty. Limited Detection process
FR2671100B1 (fr) * 1990-12-28 1993-03-05 Bio Merieux Procede d'analyse bacteriologique, et milieu de detection des bacteries genre salmonella.
US5817472A (en) * 1992-09-25 1998-10-06 The Australian National University Detection of motile fungal zoospores in a sample
DK63093D0 (da) * 1993-06-02 1993-06-02 Foss Electric As Improved method
GB9410136D0 (en) * 1994-05-20 1994-07-06 Mini Agriculture & Fisheries Microorganism detection apparatus and method
HU9401958D0 (en) * 1994-06-30 1994-10-28 Vamos Process and apparatus for rapid propagation and isolation of salmonella species
US5601997A (en) 1995-02-03 1997-02-11 Tchao; Ruy Chemotaxis assay procedure
GB9503436D0 (en) * 1995-02-21 1995-04-12 Mini Agriculture & Fisheries Dielectrophoresis
US5733736A (en) * 1996-12-16 1998-03-31 Springfield College Motility channel pathogen detector and method of use
WO1998055644A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Freeman Group Of Hospitals Nhs Trust Identification of salmonella
US6610528B1 (en) * 1997-08-26 2003-08-26 Diversa Corporation Microbial enrichment using a container having a plurality of solid support particles
JP2002191352A (ja) * 2000-12-27 2002-07-09 Iatron Lab Inc 運動性微生物検出用管状容器及び運動性微生物前培養容器、並びにそれらを用いる運動性微生物の検出方法
AU2003212918A1 (en) * 2002-02-05 2003-09-02 Dennis A. Guritza Stenoprophiluric generation and isolation of chemical products
CA2516592A1 (en) * 2003-02-19 2004-09-02 Waseda University Hydrogel for separating cell and method of separating cell
WO2005103691A1 (en) * 2004-04-21 2005-11-03 Pamgene B.V. Device for sensing of motile living organisms and uses thereof
DE102010019869B4 (de) * 2010-05-07 2012-04-05 Bruker Daltonik Gmbh Massenspektrometrischer Schnellnachweis von Salmonellen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2168179A1 (en) * 1972-01-19 1973-08-31 Diagnostic Research Diagnostic media - for discriminating intestinal bacteria
US4053362A (en) * 1976-04-02 1977-10-11 Anthony Sforza Bacterial isolation method and device
SU739102A1 (ru) * 1978-10-31 1980-06-05 Ивановский государственный медицинский институт Способ идентификации энтерококков
US4563418A (en) * 1982-04-09 1986-01-07 Bio-Controls Systems, Inc. Process for detection of selected motile organisms

Also Published As

Publication number Publication date
CA1271707A (en) 1990-07-17
ATE73857T1 (de) 1992-04-15
EP0214340A2 (en) 1987-03-18
US4920063A (en) 1990-04-24
EP0214340B1 (en) 1992-03-18
DE3585689D1 (de) 1992-04-23
EP0214340A3 (en) 1987-12-16
JPS6261598A (ja) 1987-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH062076B2 (ja) 特定の運動性微生物を検出する方法及びそのための装置
JPS59141067A (ja) 汚染された生物学的媒質中の病原性微生物の免疫細菌学的検出方法
Vernozy-Rozand et al. Enterotoxin production by coagulase-negative staphylococci isolated from goats' milk and cheese
Castaneda Laboratory diagnosis of brucellosis in man
Le Bouvier The D→ C change in poliovirus particles
US4563418A (en) Process for detection of selected motile organisms
Kraybill et al. A selective medium and color test for Mycoplasma pneumoniae
Brown et al. CAMP factor of group B streptococci: production, assay, and neutralization by sera from immunized rabbits and experimentally infected cows
Heidt et al. O and H serotyping of Pseudomonas cepacia
Minor et al. STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND STAPHYLOCOCCAL FOOD INTOXICATIONS. A REVIEW: II. ENTEROTOXINS AND EPIDEMIOLOGY.
EP0194305A1 (en) Colony blot assay for enterotoxigenic bacteria
US5132229A (en) Device for the detection of selected motile organisms
Burrows et al. Laboratory diagnosis of cholera
KR19990063786A (ko) 유두종 사지 피부염의 발견, 예방 및 치료 방법
Kanda et al. Detection and rapid increase of salivary antibodies to Staphylococcus lentus, an indigenous bacterium in rabbit saliva, through a single tonsillar application of bacterial cells
Jansson et al. Search for mycoplasma in rheumatoid arthritis
SU1400075A1 (ru) Штамм бактерий VIвRIо сноLеRае сноLеRае OGaWa, используемый дл получени холерного токсина
JPS60224068A (ja) 日和見感染における病原菌の判定方法
Fairbrother A text-book of medical bacteriology
Morse The application of the complement-fixation reaction to the diphtheria group of organisms
SU595996A1 (ru) Способ обнаружени и идентификации холерных вибрионов
McCarty et al. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types
Swart et al. The origin of antigenic substances in Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903, and serologic manifestations of their antibody-inducing properties
SU1306137A1 (ru) Способ выделени РSеUDомоNаS маLторнILIа
RU95116978A (ru) Способ определения гемолитической активности bacillus anthracis

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term