JPH06209797A

JPH06209797A - カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）の診断的研究のための特異的遺伝子のプローブ

Info

Publication number: JPH06209797A
Application number: JP5289989A
Authority: JP
Inventors: Wolfgang Dr Springer; ボルフガング・シユプリンガー; Manfred Plempel; マンフレート・プレンペル; Antonius Loebberding; アントニウス・レバーデイング
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-26
Publication date: 1994-08-02
Also published as: EP0595167A1; US5489513A; DE59307931D1; ES2111120T3; EP0595167B1; DE4236708A1

Abstract

(57)【要約】【目的】カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）により引き起こされる真菌症の診断
的研究のためのポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオ
チドのプローブを提供する。【構成】カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）からのＤＮＡまたはＲＮＡと特異的
にハイブリダイゼーションするが、他の菌類、バクテリ
ア、ヒト、動物または植物からの核酸とはハイブリダイ
ゼーションしないハイブリダイゼーション試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）は、カンジ
ダ症（Ｃａｎｄｉｄａｍｙｃｏｓｉｓ）の病原性因子
として知られている偏在する酵母菌である。疾患の少な
くとも９０％はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄ
ａａｌｂｉｃａｎｓ）種により引き起こされる。

【０００２】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）は、正常の個体において温和な皮膚の感染のみ
を引き起こすことができる日和見性の酵母菌である。粘
膜の重大な感染および個体器官の侵入性感染に関連する
菌類の感染は、免疫不全の弱点をもつ患者、例えば、後
天性免疫不全症候群の患者または免疫抑制的治療を受け
ている患者の数が増加する結果として、なおいっそう頻
繁に観察される。

【０００３】処置しないで放置する場合、このような全
身的感染はしばしば患者の死亡に導く。現在、侵入性感
染のために原理的に有効な治療は比較的わずかの抗真菌
剤、例えば、アンフォテリンＢおよびフルシチトシン、
またはアゾール誘導体のフルコナゾールおよびイタコナ
ゾールに基づく。

【０００４】これらの抗真菌剤は、重大な、時には異な
る、副作用、例えば、腎不全、低カルシウム血症および
貧血、ならびに不快な体質的症状、例えば、熱、身震い
および低血圧を引き起こす。

【０００５】この理由で、医師および臨床家は、直接お
よび有効な治療を達成するために、菌類の病原体の最も
速くて利用可能な同定を可能とする、有効な診断手順を
得ることに興味をもつ。

【０００６】従来の診断方法は、病原体のｉｎｖｉｔ
ｒｏの培養および形態学的、生理学的または生化学的方
法による菌類の種の同定に基づく。血液からのカンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）
の培養はしばしば非常に困難であり、そして信頼性がな
い。

【０００７】遺伝子のプローブの方法は、とくに増幅技
術に関連し、急速な、特異的かつ高度に感受性であり、
そしてＤＮＡ／ＲＮＡレベルで病原体の速い同定を可能
とする方法である。この技術はｉｎｖｉｔｒｏの培養
なしに研究すべき物質について直接実施することができ
る。

【０００８】ＤＮＡの診断はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダ
イゼーション技術、すなわち、ワトソン−クリック（Ｗ
ａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対の形成を伴う相補的な
一本鎖核酸の特異的ｉｎｖｉｔｒｏ結合に基づく。形
成されるＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡの二本鎖
は、また、ＤＮＡハイブリッドと呼ばれる。ハイブリダ
イゼーション反応により病原体の特定のＤＮＡまたはＲ
ＮＡを検出するために、相補的な配列特異的な遺伝子の
プローブが使用される。これらの遺伝子のプローブは、
１０〜１００ヌクレオチドの長さの短い化学的に合成さ
れたオリゴヌクレオチドのプローブであるか、あるいは
また０．５〜１０ｋｂのＤＮＡ／ＲＮＡ断片であり、こ
れらは組み換え遺伝子技術により調製される。

【０００９】遺伝子のプローブに放射線標識を光化学的
に（Ｎ．Ｄａｔｔｇｕｐｔａ、アナリティカル・バイオ
ケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１
７７、８５、１９８９）あるいは酵素的にニック翻訳に
より（Ｒｉｇｂｙ、Ｐ．Ｗ．、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）
あるいはランダムプライムド技術（Ｆｅｉｂｅｒｇおよ
びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３
２、６、１９８３）により設けることができる。³²Ｐ
ＮＴＰを使用する標識つけ、あるいはジゴキシゲニン−
ｄＵＴＰまたはビオチン−ｄＵＴＰを使用する非放射線
標識つけ、あるいは酵素、例えば、アルカリ性ホスファ
ターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用す
る直接的標識つけはこの目的に適当である。

【００１０】病原体の検出すべき核酸と病原体特異的遺
伝子のプローブの間の特異的ハイブリダイゼーションの
ために、核酸をまず変性（熱またはアルカリ処理）によ
り一本鎖に分割し、次いで温度、緩衝液のイオン強度お
よび有機溶媒により達成されるストリンジェントな条件
下に互いに非常に特異的にハイブリダイゼーションさせ
る。適当なハイブリダイゼーション条件下に、遺伝子の
プローブは検出すべきＤＮＡまたはＲＮＡの相補的配列
にのみ結合する。このハイブリダイゼーション反応は種
々の実験のフォーマット、例えば、支持体、例えば、ニ
トロセルロースにカップリングされたターゲットＤＮＡ
または遺伝子のプローブの固相ハイブリダイゼーション
として、あるいは液体ハイブリダイゼーションとして実
施することができる。評価（リードアウト）は、上に説
明したように遺伝子のプローブをリポーター分子で標識
する方法により実施される。ターゲットＤＮＡおよび標
識した遺伝子のプローブのハイブリダイゼーション複合
体は、未結合の遺伝子のプローブの除去後、使用したリ
ポーター分子により、定量的に決定される。このリード
アウトは、蛍光標識つけまたは放射線標識つけの場合に
おいて直接的に実施するか、あるいは酵素、例えば、ア
ルカリ性ホスファターゼを含有し、こうして色の反応ま
たは化学発光の反応を可能とする抗体接合体を使用する
酵素試験および免疫学的プロセスにより間接的に実施す
ることができる。

【００１１】単一の遺伝子の検出に基づいて、この遺伝
子のプローブの診断方法の試験感度は１０⁵〜１０⁶の生
物の範囲である。試験感度はＤＮＡまたはＲＮＡの増幅
技術、例えば、ＰＣＲ（欧州特許（ＥＰ）第２００，３
６２号）、ＬＣＲ（欧州特許（ＥＰ）第３２０，３０８
号）、ＮＡＳＢＡ（欧州特許（ＥＰ）第３２９，８２２
号）、Ｑβ（ＰＣＴ８７／０６２７０号）またはＨＡＳ
（欧州特許（ＥＰ）第４２７，０７４号）技術との組み
合わせにより増加させることができる。これらの技術を
使用して、検出すべきＤＮＡを１０⁹倍まで増加するこ
とができる。こうして、個々のＤＮＡ分子の検出は増幅
およびハイブリダイゼーションを組み合わせることによ
って可能となる。

【００１２】１０²〜１０³生物／ｍｌの生物数は感染に
関連して発生するので、この技術は進行中の感染の早期
の認識の可能性を提供する。

【００１３】遺伝子のプローブは記載され（欧州特許
（ＥＰ）第４２２，８７２号、ＧｅｎｅｔｒａｋＳｙ
ｓｔｅｍ）、これらはリボソームの配列の検出に基づき
そして一般にバクテリア、ウイルスおよび菌類の感染を
弁別するために菌類の検出に使用される。現在の抗真菌
剤では、広いスペクトルの治療をすべての菌類の疾患に
適用することができないので、個々の病原体について適
当な遺伝子のプローブを開発することがとくに重要であ
る。本発明において、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）のための新規な、特異的な、とくに感
受性の遺伝子のプローブを記載する。

【００１４】本発明によれば、天然に見いだされる増幅
された配列とのハイブリダイゼーションの結果として、
特異的な、とくに強い、ハイブリダイゼーションのシグ
ナルを提供する、新規な遺伝子のプローブが開発され
た。この方法に基づくカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）のためのオリゴヌクレオチドのプロー
ブおよびポリヌクレオチドのプローブの構成を本発明に
おいて記載する。新規な遺伝子のプローブは、病原性因
子、例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ（欧州特許
（ＥＰ）第４６８，８１２号）または他の構造遺伝子
（Ｍ．Ｍ．Ｍａｓｏｎら、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．）、２５、５６３、１９８７）（Ｉ．Ｏｒｅ
ｎら、核酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．）についての遺伝子配列に基づかない。ゲンバンク
（ＧｅｎＢａｎｋ）およびＥＭＢＬのヌクレオチド配列
のデータベースを、われわれの遺伝子のプローブの配列
との相同性についてスクリーニングした。既知の菌類お
よびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）遺伝子のプローブに
対する相同性は見いだされなかった。

【００１５】本発明において記載する遺伝子のプローブ
を使用して、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の分離株の全スペクトルは２つの特定のオリゴ
ヌクレオチドのプローブまたはポリヌクレオチドのプロ
ーブの組み合わせにより検出できることが確立された。

【００１６】さらに、ハイブリダイゼーション試験にお
いてこれらの遺伝子のプローブを使用する方法を記載
し、これらの試験を使用して、カンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のターゲットＤＮＡへの特定
のハイブリダイゼーションを実施する。

【００１７】さらに、本発明において、これらのハイブ
リダイゼーション法と適用技術との組み合わせを記載
し、この組み合わせにより、試験感度の非常に顕著な改
良が達成される。

【００１８】臨床的試料の中のカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を検出するためのこれらの遺
伝子のプローブおよび試験方法の使用を、また、記載す
る。カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のた
めの特定の遺伝子のプローブの構成高い試験感度を有するべきカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のための特定の遺伝子のプロ
ーブを開発するために、次の方法を採用した：１、それらの遺伝子の領域は、多重に増幅された形態で
ゲノムの中に存在ううターゲット配列として選択すべき
である。

【００１９】２、増幅された配列は強く保存され、そし
て欠失または挿入を含有すべきではない。

【００２０】３、増幅された配列はカンジダ・アルビカ
ンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対して特異的であり、
そしていかなる他の菌類またはバクテリア、または他の
真核生物の細胞を反応してはならない。

【００２１】このような遺伝子のプローブを同定するた
めに、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）の遺伝子バンクを、まず、普通の組み換えＤＮＡ方
法（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー
・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス、１９８９）により大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）５Ｋの中で調製した。組み換えクロ
ーンを、分子生物学の技術により、プラスミドのベクタ
ーｐＢＲ３２２の中に組み込まれたカンジダ・アルビカ
ンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＤＮＡのインサートに
ついて分析した。０．５〜７ｋｂのカンジダ・アルビカ
ンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のインサートの大きさを
有するクローンをそれ以上の分析のために使用した。

【００２２】逆相ハイブリダイゼーションを使用して、
どのＤＮＡ断片がカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂ
ｉｃａｎｓ）のＤＮＡをもつとくにすぐれたハイブリダ
イゼーションのシグナルを生成し、結局、増幅された形
態でゲノムの中に存在するかについて実験を実施した。
これを実施するために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）のクローンからの組み換えプラスミドを
サザンブロット技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．）、９８、５０３、１９７８）に従いゲル電気泳
動により分離し、ニトロセルロース膜に移し、固定し、
次いでランダムプライミングにより標識されたカンジダ
・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のゲノムＤＮ
Ａとハイブリダイゼーションさせた。

【００２３】とくに強いハイブリダイゼーションのシグ
ナルを示したカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）のインサートをもつ組み換えクローンを、引き
続く特異性の分析のために使用した。

【００２４】シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）からのミニ
フォルド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）ＩＩ濾過装置を使用し
て、スロットブトロット試験によりカンジダ・アルビカ
ンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の遺伝子の断片の特異性
を検査した。種々のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）菌株
および１系列のグラム陽性およびグラム陰性バクテリア
からのＤＮＡ、他の菌類からのＤＮＡ、真核生物細胞か
らの核酸をニトロセルロース膜に適用し、そして固定し
た。選択したカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の遺伝子断片にランダムプライムド技術により
非放射性リポーター分子を取り付け、次いでスロットブ
トロットとハイブリダイゼーションさせた。カンジダ・
アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＤＮＡのみと
ハイブリダイゼーションしそして他の核酸リゼイトとの
ハイブリダイゼーションのシグナルを与えない遺伝子の
プローブを選抜した。

【００２５】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の８７の異なる臨床的分離株を使用して、選抜
した特定の遺伝子のプローブの検出スペクトルをスロッ
トブトロット技術により分析した。分離された遺伝子の
プローブのいずれも、すべての菌株の同時の検出を可能
としなかった。遺伝子のプローブ４３１−１９は、最も
広い検出スペクトルを有し、図２に描写されている。そ
れを使用して、すべての臨床的分離株のうちの９５％が
検出される。

【００２６】検出されなかった４つのカンジダ・アルビ
カンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の株を微生物学的に特
性決定づける間、生理学的および生物学的試験におい
て、これらは非定型非定型のカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株であることが確立された。
また、これらの４つの株から遺伝子バンクを調製し、そ
して特異的遺伝子のプローブを前述のハイブリダイゼー
ション試験におけるようにして構成した。

【００２７】生理学的に非定型のカンジダ・アルビカン
ス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株を別として、また、種々
の他のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）の分離株を検出した遺伝子のプローブ、および非定
型分離株のみを検出した遺伝子のプローブが得られた。
遺伝子のプローブ４３６−１の制限地図は図５に描写さ
れている。

【００２８】ポリヌクレオチドのプローブの分子の説明カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のた
めの特定のポリヌクレオチドのプローブを、前述の方法
に従い構成した（図１〜６）。特異性、試験感度および
カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）につ
いての検出スペクトルに関する最良の結果は、遺伝子の
プローブ４３１−１９を使用して達成された。この遺伝
子のプローブは７ｋｂの遺伝子のプローブ３０９−６
（図１）からサブクローニングにより開発された。この
ために、遺伝子のプローブをまず分子生物学の技術に従
い制限酵素を使用する切断により特性決定した（図
１）。遺伝子のプローブ３０９−６の個々の遺伝子断片
をｐＢＲ３２２プラスミドベクターの中にＣｌａＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片およびＣｌａＩ−ＣｌａＩ断片としてサブ
クローニングし、そしてそれらの特異性を出発プローブ
との比較により分析した。前述の利点は遺伝子のプロー
ブ４３１−１９について確立された。制限酵素Ｃｌａ
Ｉ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩおよびＳｐｈＩに
基づく制限地図は図２に記載されている。現存する制限
地図を使用して、遺伝子のプローブをサンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）の方法により配列決定して、ヌクレオチド配列
に基づくカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）のためのオリゴヌクレオチドのプローブを調製する
ことができるようにした。

【００２９】遺伝子のプローブ４３６−１は、生理学的
に非定型の株に対して特異的であり、図５に記載されて
いる。それは６．３ｋｂの大きさの遺伝子のプローブ４
３２−８から、制限酵素ＣｌａＩを使用するサブクロー
ニングにより調製した。遺伝子のプローブを、また、オ
リゴヌクレオチドのプローブの合成および増幅技術の使
用について配列決定した。

【００３０】遺伝子のプローブ４３０−１４および４３
７−３は図３および６に記載されている。それらのハイ
ブリダイゼーションの性質は表Ｉから明らかである。

【００３１】ポリヌクレオチドのプローブの配列決定記載する遺伝子のプローブの配列決定は、サンガー（Ｓ
ａｎｇｅｒ）ら、ＰＮＡＳ、７４、５４６３（１９７
７）の連鎖停止法により、ＵＳＢバイオケミカルス（米
国オハイオ州）からのキットを使用して実施した。配列
決定のために、遺伝子のプローブをブルースクリプト
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のベクターｐＫＳの中に再ク
ローニングし、次いでエラーゼ−ａ−ベイス（ｅｒａｓ
ｅ−ａ−ｂａｓｅ）技術によりプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）からのキットを使用して欠失クローンを生成した。
この系はヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）Ｓ、遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ）、７３、３５１、１９８４の方法に基づき、こ
こでエキソヌクレアーゼＩＩＩを使用してオーバーラッ
ピングする５′末端または平滑末端からＤＮＡを特異的
に消化する。酵素による均一な消化速度は、反応混合物
からのアリコートの時間依存的取り出しにより前以て決
定した間隔における欠失の生成を可能とする。この技術
を使用して、数ｋｂにわたって存在する一方向の欠失を
この方法において数時間以内に数時間以内に構成するこ
とができる。

【００３２】オリゴヌクレオチドのプローブの分子の説明ポリヌクレオチドのプローブ４３１．１９から２３の１
００マーのオリゴヌクレオチドを、Ｓ．Ｌ．ベアウケイ
ジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびＭ．Ｈ．カルサース（Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２２、１８５
９、１９８１のホスホルアミダイト方法により化学的に
調製した。これらのオリゴヌクレオチドのプローブの配
列、ならびに遺伝子のプローブ４３１−１９の完全なヌ
クレオチド配列は、配列のリストに記載されている。こ
れらのオリゴヌクレオチドのプローブのハイブリダイゼ
ーションの性質は、ポリヌクレオチドのプローブ４３１
−１９と比較して、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の分
離株およびグラム陽性およびグラム陰性のバクテリア、
ならびに他の菌類および真核生物の細胞からの種々の核
酸について試験した（表３）。ハイブリダイゼーション
のシグナルの強さの多少の差は、消化オリゴヌクレオチ
ドのプローブにおいて観察された。しかしながら、個々
の遺伝子のプローブの間の有意差は、カンジダ・アルビ
カンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するそれらの特異
性に関して検出されなかった。２３のオリゴヌクレオチ
ドのプローブのいずれにおいても他のカンジダ属（Ｃａ
ｎｄｉｄａ）の種、菌類、またはバクテリアからの核酸
との交差ハイブリダイゼーションを観察することができ
なかった。したがって、すべての２３のオリゴヌクレオ
チドのプローブは、とくにポリヌクレオチドのプローブ
４３６−１のオリゴヌクレオチドのプローブとの組み合
わせにおいて、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）の検出のために適当である。

【００３３】ポリヌクレオチドのプローブ４３６−１か
らオリゴヌクレオチドのプローブを化学的に調製した。
オリゴヌクレオチドのプローブのヌクレオチド配列は配
列のリスト２９３６９／２５−３８に描写されている。
これらのオリゴヌクレオチドのプローブのハイブリダイ
ゼーションの性質を、ポリヌクレオチドのプローブ４３
６−１と比較して、非定型のカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株の４つの異なる核酸リゼイ
トについて、ならびにグラム陽性およびグラム陰性のバ
クテリア、菌類および真核生物の細胞について検査し
た。検査したすべての１４のオリゴヌクレオチドのプロ
ーブは４つの異常なカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）株に対して特異的部位が、異なるカンジ
ダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種とのそれらのハイブリダイゼ
ーションの強さに関して事実多少異なる。

【００３４】ポリヌクレオチドのプローブ４３１−１９
およびポリヌクレオチドのプローブ４３６−１を必要に
応じて組み合わせて、１回のハイブリダイゼーションの
試験においてすべてのカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）の分離株を検出することができた。

【００３５】

【実施例】実施例１ポリヌクレオチドのプローブＳＰＮ４３１−１９を使用
するスロットブロットハイブリダイゼーションによりカ
ンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出スロットブロットハイブリダイゼーションのために、試
料物質からの核酸をそれ自体知られている分析用または
調製用核酸法により分離し、次いで種々のフォーマット
で商業的に入手可能な膜、ニトロセルロースまたはナイ
ロンの膜上に固定した。核酸は数に濾過装置［例えば、
シュレイヘル・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ）のミニフォルド（Ｍｉｎ
ｉｆｏｌｄ）ＩＩ］を使用して適用し、固定し、次いで
適当なストリンジェンシー条件下に、リポーター分子を
もつ遺伝子のプローブとのハイブリダイゼーションにつ
いて試験することができる。ターゲットＤＮＡおよび遺
伝子のプローブのＤＮＡのヌクレオチド配列の相補性が
より大きくなればなるほど、ハイブリダイゼーションの
シグナルはよりよくなる。スロットブトロットまたはド
ットブロットのリードアウトを、各場合において遺伝子
のプローブの標識つけに従い、例えば、オートラジオグ
ラフィー（³²Ｐ）、色のシグナル（アルカリ性ホスファ
ターゼ、リン酸ブロモクロロインドリル／ニトロブルー
テトラゾリウム）、または化学発光または蛍光により実
施する。

【００３６】カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の核酸の分離ＹＭ培地（バクト酵母エキス４ｇ；バクト麦芽エキス１
０ｇ；バクトデキストロース４ｇ；Ｈ₂Ｏ１リット
ル、ｐＨ７．３）の中で培養したカンジダ属（Ｃａｎｄ
ｉｄａ）の株を５０００ｒｐｍで５分間遠心し、そして
１Ｍのソルビトールで洗浄した。

【００３７】細胞を１００μｇのアルスロバクター・ル
テウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｔｅｕｓ）から
のジメラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）−１００Ｔ（１０，
０００単位／ｇ）を含有する１ｍｌのソルビトールの中
に再懸濁させ、そして３７℃において約３０分間インキ
ュベーションした。

【００３８】引き続いて、２００ｍｌのＥＤＴＡ、０．
５Ｍ、ｐＨ８．０、および２００μｌの１０％強度のラ
ウロイルサルコシンを試料に添加し、次いでこれを水浴
の中で１００℃に３分間加熱した。氷／イソプロパノー
ルの中で冷却後、試料を１×ＴＥ（１０ｍＭのトリス／
ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２０ｍｌにし、
そしてトリス飽和フェノールで２回処理した；次いでそ
れらを６０００ｒｐｍで遠心し、そして水性ＤＮＡ相を
エーテルで２回抽出して、微量のフェノールを除去し
た。ＤＮＡをイソプロパノールで沈澱させた、そしてＤ
ＮＡのペレットを７０％のエタノールで洗浄した後、試
料を１〜２ｍｌの１×ＴＥの中に取り、そして０．８％
強度のアガロースゲルの中で電気泳動により分析した。

【００３９】バクテリアの核酸の分離１．５ｍｌのバクテリアの培養物または、調製用分離株
の場合において、１．５ｍｌのエッペンドルフのバッチ
のバクテリア培養物、または１５０ｍｌの対応してより
大きい緩衝液のバッチをドットブロットハイブリダイゼ
ーションのために使用した。

【００４０】この方法を１．５ｍｌのバクテリアの培養
物について記載する。１．５ｍｌの６０００ＲＰＭＩで
遠心する。５００μｌのＴＥ＋５ｍｇ／ｍｌのリゾチー
ム中の１５％強度のスクロースをペレットに添加する。
３７℃において３０分間インキュベーションした後、５
０ｍｌの０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８を添加し、そして
溶解が劣る場合、完全な溶解が達成されるまで、試料を
６５℃において１０分間処理する。

【００４１】それ以上の精製のために、１体積のフェノ
ールを添加し、そして試料をよく混合し、次いで１０，
０００ｒｐｍで１０分間遠心する。上のＤＮＡを含有す
る相を１００ｍｌのジエチルエーテル（トリス飽和）と
混合し、次いで１０，０００ｒｐｍにおいて１分間遠心
する。上のエーテル相を廃棄する。１／１０体積の３Ｍ
の酢酸ナトリウムおよび１体積のイソプロパノールを下
のＤＮＡ相に添加し、そしてこの混合物を室温において
５分間放置する。引き続いて、１０，０００ｒｐｍで１
０分間遠心し、上澄み液をデカンテーションし、そして
ペレットをＴＥの中にもとの半分の体積に溶解する。

【００４２】遺伝子のプローブＳＰＮ４３１−１９の分
離および標識つけポリヌクレオチドのプローブをフェインバーグ（Ｆｅｉ
ｎｂｅｒｇ）およびボウゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔ
ｅｉｎ）［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎ
ａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３２、６、１９８
３］に従うランダムプライムド法によるか、あるいは末
端のトランスフェラーゼを使用する３′末端基の標識つ
け［チャング（Ｃｈａｎｇ）、Ｌ．Ｍ．Ｓ．、ボルム
（Ｂｏｌｌｕｍ）Ｔ．Ｊ．、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．）、２４６、９０９、１９７１］により標識つけし
た。

【００４３】遺伝子のプローブＳＰＮ４３１−１９を使
用するスロットブロットハイブリダイゼーションの実施核酸をＴＥで２００ｍｌの体積にする。引き続いて、Ｄ
ＮＡを１００℃において１０分間変性し、次いで試料を
氷／ＮａＣｌ混合物の中に直ちに入れる。２００μｌの
氷冷２０×ＳＳＣを添加し、そして試料をシュレイヘル
・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ
Ｓｃｈｕｅｌｌ）からのミニホルドＩＩ濾過装置を使用
してニトロセルロース／ナイロンフィルターに直ちに適
用する。フィルターを前以て蒸留したＨ₂Ｏの中で１０
分間前処理し、次いで１０×ＳＳＣの中で１０分間前処
理しそして、ＤＮＡの適用後、８０℃において２時間ベ
ーキングした。

【００４４】ニトロセルロースまたはナイロン膜を使用
する固相ハイブリダイゼーションをスロットブトロット
法により実施した。

【００４５】リードアウトは、色反応として、アルカリ
性ホスファターゼとの抗ジゴキシゲニン−抗体接合体、
およびリン酸ブロモクロロインドリル／ニトロブルーテ
トラゾリウムを使用するか、あるいは化学発光反応とし
て、アダマンタン−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）を使用
して実施した。

【００４６】ハイブリダイゼーションの実験のために、
ＤＮＡをまず１００℃１０分間加熱ｓｉそして氷／Ｎａ
Ｃｌ上で急冷することによってＤＮＡの一本鎖に変性し
た。ニトロセルロース膜を水および２０×ＳＳＣ（Ｎａ
Ｃｌ、３ｍｏｌ／ｌ、クエン酸ナトリウム、０．３ｍｏ
ｌ／ｌ、ｐＨ７）の中でソーキングすることによって前
処理し、引き続いて乾燥する。ナイロン膜は前処理しな
いで使用した。変性した核酸の抽出物をフィルター装置
を使用してニトロセルロース膜またはナイロン膜に適用
し、引き続いて８０℃において１時間ベーキングする
か、あるいはＵＶトランシルミネーター（ナイロン膜）
を使用して５分間架橋することによって固定した。ナイ
ロン／ニトロセルロースのフィルターを２０ｍｌのハイ
ブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＣ；ブロッキング
剤、０．５％、Ｎ−ラウロイルサルコシンＮａ塩、０．
１％、ＳＤＳ、０．０２％）と一緒にプラスチックの袋
の中に密閉し、そして６８℃において１時間前インキュ
ベーションした。次いでこの前インキュベーション溶液
を、新しく変性した遺伝子のプローブＤＮＡ（１００ｎ
ｇ）を含有するハイブリダイゼーション溶液（同一の組
成）の２０ｍｌで置換した。ハイブリダイゼーション混
合物を６８℃において２時間インキュベーションした。
フィルターを引き続いて各場合において室温において２
×５分間５０ｍｌの２×ＳＳＣ、ＳＤＳ、０．１％で洗
浄し、次いで６８℃においてもう一度２×１５分間０．
１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで洗浄した。フィルター
をハイブリダイゼーションしたＤＮＡの検出のために直
接を使用するか、あるいは後の段階における検出のため
に空気乾燥して貯蔵した。

【００４７】ハイブリダイゼーションしたＤＮＡの検出ハイブリダイゼーションしたカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＤＮＡを定量的に検出する
ために、免疫学的検出反応を実施した。このために、ア
ルカリ性ホスファターゼにカップリングした抗体から成
る接合体をを使用し、この接合体はハイブリダイゼーシ
ョンしたしたジゴキシゲニン標識ＤＮＡに結合する。色
の反応を、２〜１２時間後に、シマズＣＳ−４３０デン
シトメトメーターを使用して、無色のリン酸５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルおよびニトロブルーテト
ラゾリウムをアルカリ性ｐＨにおいて添加することによ
って、定量的に評価した。

【００４８】次の緩衝液を検出反応のために使用した：緩衝液１：トリス／ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ
７．５、緩衝液２：ブロッキング剤、緩衝液１の中に０．５％に
溶解する、緩衝液３：トリス／ＨＣｌ、１００ｍｍｏｌ／ｌ、Ｍｇ
Ｃｌ₂、５０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ９．５、緩衝液４：トリス／ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ、ＥＤＴ
Ａ、１ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ８、色の溶液（新しく調製した）：４５ｍｌのＮＢＴおよび
３５μｌのＸ−ホスフェートを１０ｍｌの緩衝液３に添
加した。

【００４９】ニトロセルロース／ナイロンのフィルター
を緩衝液１の中で１分間洗浄し、次いで１００μｌの緩
衝液２とともに３０分間インキュベーションし、そして
もう一度緩衝液１で洗浄した。抗体接合体緩衝液１の中
で１：５０００に希釈し、そしてフィルターを約２０μ
ｌの希釈した抗体接合体溶液とともに３０分間インキュ
ベーションした。結合しない抗体を２×１５分間１００
μｌの緩衝液１で洗浄することによって除去し、引き続
いてフィルターを２分間２０μｌの緩衝液３と平衡化し
た。次いでフィルターを２０μｌの色溶液とともに密閉
したプラスチック袋の中で暗所でインキュベーションし
た。個々のスロットブトロットの色強度を適用したカン
ジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＤＮＡ
を使用して標準と比較してデンシトメトメーターで決定
した。

【００５０】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の遺伝子のプローブ４３１−１９の特異性上のハイブリダイゼーション試験を使用する、遺伝子の
プローブ４３１−１９と種々のカンジダ属（Ｃａｎｄｉ
ｄａ）の種およびグラム陽性およびグラム陰性のバクテ
リア、および種々の他の菌類および真核生物の細胞から
のハイブリダイゼーションの性質を表１に要約する。ハ
イブリダイゼーションのデータが証明するように、遺伝
子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）に対して絶対的に特異的である。他の核酸は
この遺伝子のプローブにより検出されない。

【００５１】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の分離株についての遺伝子のプローブ４３１．
１９の検出スペクトル遺伝子のプローブ４３１−１９と８７のカンジダ・アル
ビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分離株からの核酸
とのハイブリダイゼーションの性質を表２に要約する。
ハイブリダイゼーションのデータが証明するように、遺
伝子のプローブは８７カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）株とハイブリダイゼーションするが、
４つの分離株は検出されない。生理学的および生化学的
試験から明らかなように、これらの４つの株は典型的な
カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分
離株ではない。しかしながら、これらの試験はカンジダ
・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するこれ
らの株の根源の決定を事実確証する。

【００５２】実施例２遺伝子のプローブ４３６．１を使用するスロットブロッ
トハイブリダイゼーションによりカンジダ・アルビカン
ス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出異なる試験試料からの核酸の単離、遺伝子のプローブの
単離および標識つけおよびスロットブロットハイブリダ
イゼーションを実施例１におけるように実施した。

【００５３】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の遺伝子のプローブ４３６．１の特異性実施例１に記載するハイブリダイゼーション試験を使用
する、遺伝子のプローブ４３６．１と種々のカンジダ属
（Ｃａｎｄｉｄａ）の種およびグラム陽性およびグラム
陰性のバクテリア、および種々の他の菌類および真核生
物の細胞からのハイブリダイゼーションの性質を表１に
要約する。ハイブリダイゼーションのデータが証明する
ように、遺伝子のプローブは４つの非定型カンジダ属
（Ｃａｎｄｉｄａ）種に対して特異的であるが、他のカ
ンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株、ま
たは他のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種および他のバ
クテリア、菌類および真核生物の細胞はこの遺伝子のプ
ローブにより検出されない。カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分
離株についての遺伝子のプローブ４３６．１の検出スペ
クトル遺伝子のプローブ４３６．１と８７のカンジダ・アルビ
カンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の分離株からの核酸と
のハイブリダイゼーションの性質を表２に要約する。ハ
イブリダイゼーションのデータが証明するように、遺伝
子のプローブは４つの希なカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株とハイブリダイゼーション
するが、他の８４のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）は検出されない。

【００５４】実施例３遺伝子のプローブの組み合わせ４３１．１９および４３
６．１を使用するスロットブロットハイブリダイゼーシ
ョンによりカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａ
ｎｓ）の検出試料物質からの核酸の単離、遺伝子のプローブの単離お
よび標識つけおよびスロットブロットハイブリダイゼー
ションを実施例１および２におけるように実施した。１
００ｎｇの２つの遺伝子のプローブの各々をハイブリダ
イゼーション実験のために使用した。

【００５５】遺伝子のプローブ４３１．１９および４３
６．１の特異性スロットブトロット試験を使用する、遺伝子のプローブ
４３１．１９および４３６．１と種々のカンジダ属（Ｃ
ａｎｄｉｄａ）の種およびグラム陽性およびグラム陰性
のバクテリア、および種々の他の菌類および真核生物の
細胞からのハイブリダイゼーションの性質を表１に要約
する。ハイブリダイゼーションのデータが証明するよう
に、遺伝子のプローブの組み合わせを使用して、カンジ
ダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株は特異的
に検出され、そして他のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）
種および他の菌類およびバクテリアとのハイブリダイゼ
ーションは起こらない。

【００５６】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）の分離株についての組み合わせの遺伝子のプロ
ーブ４３１．１９および４３６．１の検出スペクトル組み合わせた遺伝子のプローブ４３１．１９および４３
６．１と８７のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）の分離株からの核酸とのハイブリダイゼーシ
ョンの性質を表２に要約する。ハイブリダイゼーション
のデータが証明するように、組み合わせた遺伝子のプロ
ーブはすべての８７のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）株とハイブリダイゼーションする。

【００５７】実施例４オリゴヌクレオチドのプローブを使用するスロットブロ
ットハイブリダイゼーションによるカンジダ・アルビカ
ンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の検出ポリヌクレオチドのプローブ４３１．９に基づくオリゴ
ヌクレオチドのプローブの配列（２９３６９／２−２
４）およびポリヌクレオチドのプローブ４３６．１に基
づくオリゴヌクレオチドのプローブの配列（２９３６９
／２５−３８）は、配列のリストに描写されている。こ
れらのオリゴヌクレオチドのプローブは、Ｃ．Ｌ．ベア
ウケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびＭ．Ｈ．カルサー
ス（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ
（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ）、２２、
１８５９（１９８１）のホスホルアミダイト方法により
合成された。

【００５８】オリゴヌクレオチドのプローブを、末端の
トランスフェラーゼまたはポリヌクレオチドキナーゼを
使用してベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）からの３′または５′末端の基
の標識つけキットで標識した。アルファ³²Ｐ−ｄＣＴＰ
またはガンマ³²Ｐ−ＡＴＰまたは非放射性ｄＵＴＰ−ジ
ゴキシゲニンを３′末端の標識つけのためのリポーター
分子として使用した。

【００５９】スロットブロットハイブリダイゼーション
を実施例１におけるように実施した。オリゴヌクレオチ
ドのプローブ２−６および２５−２７とカンジダ属（Ｃ
ａｎｄｉｄａ）種およびグラム陽性およびグラム陰性の
バクテリア、および菌類および真核生物の細胞からの核
酸とのハイブリダイゼーションを、表３に試験したすべ
てのオリゴヌクレオチドのプローブについての例として
記録する。

【００６０】ハイブリダイゼーションのデータが示すよ
うに、表３に記載するオリゴヌクレオチドのプローブ２
−６、ならびにまた試験したオリゴヌクレオチドのプロ
ーブ７−２４は、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂ
ｉｃａｎｓ）と特異的にハイブリダイゼーションし、そ
して他のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種または他のバ
クテリアおよび菌類とのシグナルを与えない。個々のオ
リゴヌクレオチドのプローブの間で観察される唯一の差
はハイブリダイゼーションの強さであった。

【００６１】ハイブリダイゼーション実験は、また、よ
り短いオリゴヌクレオチドのプローブ（１５マーまで）
を使用して実施し、同一のハイブリダイゼーションの結
果が得られた。

【００６２】ポリヌクレオチドのプローブ４３６．１に
基づくオリゴヌクレオチドのプローブ２５−３８は、ポ
リヌクレオチドのプローブに似て、まれな４つのカンジ
ダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株とのみハ
イブリダイゼーションした。対照的に、４３１．１９系
列からのオリゴヌクレオチドのプローブと４３６．１系
列からのオリゴヌクレオチドのプローブとの任意の組み
合わせは、１回のハイブリダイゼーション実験において
すべての８７のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）株の検出を可能とした。

【００６３】実施例５組み合わせた遺伝子のプローブ４３１．１９および４３
６．１を使用する液体ハイブリダイゼーションによる増
幅したカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎ
ｓ）のＤＮＡの検出遺伝子のプローブの技術、例えば、ＰＣＲ（欧州特許
（ＥＰ）第２００，３６２号）、ＬＣＲ（欧州特許（Ｅ
Ｐ）第３２０，３０８号）、ＮＡＳＢＡ（欧州特許（Ｅ
Ｐ）第３２９，８２２号）、Ｑβ（ＰＣＴ８７／０６２
７０号）またはＨＡＳ（欧州特許（ＥＰ）第４２７，０
７４号）技術と適当なターゲット増幅法と組み合わせる
ことによって、感度の有意な増加が普通のリードアウト
法と比較して達成される。

【００６４】ターゲットＤＮＡの増幅はポリメラーゼ連
鎖反応および、別法として、ヘパリン増幅法（ＨＡＳ）
により実施した。

【００６５】ＰＣＲ反応のために、１〜１０００ｐｇの
カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）から
のゲノムＤＮＡ、２μｍｏｌのプライマー１（５′ｄＴ
ＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＴＣＧＴＴＣＴＧＣ）
（ＳＥＱＩＤＮＯ３９）または好ましいプライマ
ー１′（５′ｄＣＣＧＡＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＡＧＡ
ＡＧＣＡＴＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ４０）およびプ
ライマー２（５′ｄＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＡＴＡＣＣＡ
ＧＡＡＧＣＡＴＴ）ＳＥＱＩＤＮＯ４１）２．５
単位のセツス（Ｃｅｔｕｓ）／パーキン−エルマー（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）からのＴａｑポリメラーゼお
よび２００単位のｄＮＴＰおよび６μｍｏｌのジゴキシ
ゲニン−ｄＵＴＰを各場合において合計１００μｌのＰ
ＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．３、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂および０．
０１％のゼラチン）の中で使用した。非定型カンジダ・
アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）株（４３６．１
遺伝子のプローブ）のゲノムＤＮＡの増幅のために、さ
らにプライマー３（５′ｄＴＴＣＴＴＡＣＧＡＡＴＧＴ
ＴＴＧＴＧＴＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ４２）または
好ましいプライマー３′（５′ｄＡＴＣＣＡＣＣＡＡＴ
ＡＴＡＴＡＴＡＣＡＣＡ）（ＳＥＱＩＤＮＯ４
３）およびプライマー４（５′ｄＴＴＴＧＴＣＣＴＡＴ
ＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴ）（ＳＥＱＩＤＮＯ４４）
を添加した。増幅をセツス（Ｃｅｔｕｓ）／パーキン−
エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）からのＰＣＲプ
ロセッサーを使用して実施した。試料を使用して、ＤＮ
Ａの初期の溶融を９４℃において２分３０秒間実施し、
次いで、各場合において、ＤＮＡを９４℃において１分
間変性し、そしてプライマーのアニーリングを４０〜４
５℃において２分間実施し、そしてプライマーの伸長を
７２℃において３分間実施した。３５サイクル後、最後
の２０分の伸長を７２℃において実施し、次いで試料を
４℃に冷却した。

【００６６】逆相試験において１０ｎｇの５′−ビオチ
ニル化遺伝子のプローブを５０μｌの体積で使用して液
体ハイブリダイゼーションを実施した。

【００６７】１００℃に１０分間加熱し、引き続いて０
℃に冷却した後、５０μｌのベーリンガー（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）のハイブリダイゼーション混合物を添加
し、そしてハイブリダイゼーションを６８℃において１
時間実施した。ハイブリダイゼーション複合体を分割す
るために、７５μｌのダイナル（Ｄａｙｎａｌ）からの
ストレプトアビジン被覆した磁性粒子を使用した。磁性
ビーズを１×ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）混
合物で前処理しそして、磁石によりそれらを分割した
後、液体をピペットで除去し、そしてハイブリダイゼー
ション試料を添加し、そして室温においておだやかに撹
拌しながら０．５時間インキュベーションした。カップ
リングしたハイブリダイゼーション複合体をビーズで分
割し、残留液体をピペットで除去し、次いで緩衝液Ａ
（２×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ）で洗浄し、次いで緩衝
液Ｂ（０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ）で２回洗浄し
た。

【００６８】引き続いて、ブロッキング反応を実施し、
次いで化学発光により抗体反応をハイブリダイゼーショ
ンについて検出した。ＤＮＡを負荷したビーズを１５０
μｌの洗浄緩衝液（０．１Ｍのマレイン酸、０．１Ｍの
ＮａＣｌ、ｐＨ５、０．３％のツイーン２０）次いで、
それらを洗浄しそして洗浄緩衝液をピペットで除去した
後、４００μｌの緩衝液２（０．１Ｍのマレイン酸；
０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５；１％のブロッキン
グ試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））を添加した。室温に
おいて０．５時間インキュベーションした後、１００ｍ
ｌの抗体接合体溶液（ＡＣ１：１０，０００、緩衝液
中）を添加し、そして室温において０．５時間インキュ
ベーションした；分割し、次いでピペットで緩衝液を除
去し、次いで４００ｍｌの洗浄緩衝液で２×１５分間お
だやかに撹拌しながら処理した。引き続いて、分割し、
次いで１５０μｌの緩衝液３（０．１ＭのＮａＣｌおよ
び５０ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有する０．１Ｍのトリス／
ＨＣｌ、ｐＨ９．５）で処理した。再び分割を実施し、
次いで水浴の中で緩衝液３中にＡＭＰＰＤ１：１００を
含有する１００μｌの検出溶液と３７℃において１５分
間インキュベーションした；次いで化学発光を発光フォ
トメーター（ＬｕｍａｃＬｕｍａｃｏｕｎｔｅｒ）で
４７７ｎｍにおいて測定した。この試験を使用して、１
０⁶〜１０のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）生物に相当するＤＮＡの量を検出することがで
きる。１０の生物／ｍｌの血液の同一の検出限界が、ま
た、非特異的血液ＤＮＡの添加後に達成された。それ自
体で、血液ＤＮＡはハイブリダイゼーション試験におい
て小さいバックグラウンドのシグナルを与えるだけであ
る。実施例６増幅および遺伝子のプローブ４３１．１９および４３
６．１とのハイブリダイゼーションによる血液、たんま
たはバイオプシーの物質の中のカンジダ属（Ｃａｎｄｉ
ｄａ）真菌症の検出臨床の試料物質を崩壊の適当な機械的または化学的方法
により、例えば、洗浄剤、例えば、陰影を施したを使用
して均質化および溶解した。出発物質として血液を使用
するとき、試料を無菌の水で直接溶解し、次いでカンジ
ダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）の生物を含
有する沈降した血液のペレットを実施例１に記載する崩
壊の酵素的方法により溶解した。次いでカンジダ・アル
ビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）／血液のリゼイトを
適当な増幅法により、実施例５に記載するように、カン
ジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）特異的オ
リゴヌクレオチドのプローブを使用して増幅した。次い
で増幅された核酸をポリヌクレオチドのプローブ４３
１．１９および４３６．１とハイブリダイゼーションさ
せ、そしてストリンジェントの条件下に形成する増幅さ
れたカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）
の核酸および遺伝子のプローブから成る特定のハイブリ
ダイゼーション複合体を、実施例５に記載するように、
ダイナル（Ｄｙｎａｌ）磁性粒子を使用して分割し、そ
して化学発光のリードアウトを定量的に実施した。ま
た、配列のリストに記載されているオリゴヌクレオチド
のプローブを使用して、この試験を実施した。

【００６９】カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）特異的なハイブリダイゼーションのシグナル
は、なお、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａ
ｎｓ）で感染した血液のリゼイトの中の１０の生物の濃
度において困難なく検出された。

【００７０】

【表１】

【００７１】

【表２】

【００７２】

【表３】

【００７３】

【表４】

【００７４】

【表５】

【００７５】

【表６】

【００７６】

【表７】

【００７７】

【表８】

【００７８】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【００７９】１、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂ
ｉｃａｎｓ）からのＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイ
ブリダイゼーションするが、他の菌類、バクテリア、ヒ
ト、動物または植物からの核酸とはハイブリダイゼーシ
ョンしないハイブリダイゼーション試薬。

【００８０】２、約７．２ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはそれらの一部分を含有し、そして第１図における
ように制限酵素により切断されることを特徴とする、上
記第１項記載のハイブリダイゼーション試薬。

【００８１】３、配列リスト識別番号１におけるよう
な、約２．２ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれら
の一部分を含有し、そして第２図におけるように制限酵
素により切断されることを特徴とする、上記第１項記載
のハイブリダイゼーション試薬。

【００８２】４、約２．３ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはそれらの一部分を含有し、そして第３図における
ように制限酵素により切断されることを特徴とする、上
記第１項記載のハイブリダイゼーション試薬。

【００８３】５、約６．３ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはそれらの一部分を含有し、そして第４図における
ように制限酵素により切断されることを特徴とする、上
記第１項記載のハイブリダイゼーション試薬。

【００８４】６、約２．６ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはそれらの一部分を含有し、そして第５図における
ように制限酵素により切断されることを特徴とする、上
記第１項記載のハイブリダイゼーション試薬。

【００８５】７、約３．２ｋｂのＤＮＡまたはＲＮＡ、
またはそれらの一部分を含有し、そして第６図における
ように制限酵素により切断されることを特徴とする、上
記第１項記載のハイブリダイゼーション試薬。

【００８６】８、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂ
ｉｃａｎｓ）からのＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションするが、他の菌類、バクテリア、ヒト、動物
または植物からの核酸とハイブリダイゼーションしない
オリゴヌクレオチド。

【００８７】９、配列リスト識別番号２〜３８における
ような、ヌクレオチド配列、またはそれらの一部分を含
有することを特徴とする、上記第８項記載のオリゴヌク
レオチド。

【００８８】１０、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄ
ｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）を検出するための上記第１
〜７項のいずれかに記載のハイブリダイゼーション試薬
の使用。

【００８９】

【表９】

【００９０】（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１：

【００９１】

【表１０】

【００９２】

【表１１】

【００９３】（２）配列識別番号：２についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２：

【００９４】

【表１２】

【００９５】（２）配列識別番号：３についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３：

【００９６】

【表１３】

【００９７】（２）配列識別番号：４についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４：

【００９８】

【表１４】

【００９９】（２）配列識別番号：５についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：５：

【０１００】

【表１５】

【０１０１】（２）配列識別番号：６についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：６：

【０１０２】

【表１６】

【０１０３】（２）配列識別番号：７についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：７：

【０１０４】

【表１７】

【０１０５】（２）配列識別番号：８についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：８：

【０１０６】

【表１８】

【０１０７】（２）配列識別番号：９についての情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：９：

【０１０８】

【表１９】

【０１０９】（２）配列識別番号：１０についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１０：

【０１１０】

【表２０】

【０１１１】（２）配列識別番号：１１についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１１：

【０１１２】

【表２１】

【０１１３】（２）配列識別番号：１２についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１２：

【０１１４】

【表２２】

【０１１５】（２）配列識別番号：１３についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１３：

【０１１６】

【表２３】

【０１１７】（２）配列識別番号：１４についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１４：

【０１１８】

【表２４】

【０１１９】（２）配列識別番号：１５についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１５：

【０１２０】

【表２５】

【０１２１】（２）配列識別番号：１６についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１６：

【０１２２】

【表２６】

【０１２３】（２）配列識別番号：１７についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１７：

【０１２４】

【表２７】

【０１２５】（２）配列識別番号：１８についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１８：

【０１２６】

【表２８】

【０１２７】（２）配列識別番号：１９についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：１９：

【０１２８】

【表２９】

【０１２９】（２）配列識別番号：２０についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２０：

【０１３０】

【表３０】

【０１３１】（２）配列識別番号：２１についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２１：

【０１３２】

【表３１】

【０１３３】（２）配列識別番号：２２についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２２：

【０１３４】

【表３２】

【０１３５】（２）配列識別番号：２３についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２３：

【０１３６】

【表３３】

【０１３７】（２）配列識別番号：２４についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２４：

【０１３８】

【表３４】

【０１３９】（２）配列識別番号：２５についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２５：

【０１４０】

【表３５】

【０１４１】（２）配列識別番号：２６についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２６：

【０１４２】

【表３６】

【０１４３】（２）配列識別番号：２７についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２７：

【０１４４】

【表３７】

【０１４５】（２）配列識別番号：２８についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２８：

【０１４６】

【表３８】

【０１４７】（２）配列識別番号：２９についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：２９：

【０１４８】

【表３９】

【０１４９】（２）配列識別番号：３０についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３０：

【０１５０】

【表４０】

【０１５１】（２）配列識別番号：３１についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：２２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３１：

【０１５２】

【表４１】

【０１５３】（２）配列識別番号：３２についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３２：

【０１５４】

【表４２】

【０１５５】（２）配列識別番号：３３についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３３：

【０１５６】

【表４３】

【０１５７】（２）配列識別番号：３４についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３４：

【０１５８】

【表４４】

【０１５９】（２）配列識別番号：３５についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３５：

【０１６０】

【表４５】

【０１６１】（２）配列識別番号：３６についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３６：

【０１６２】

【表４６】

【０１６３】（２）配列識別番号：３７についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：１００塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３７：

【０１６４】

【表４７】

【０１６５】（２）配列識別番号：３８についての情
報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：９９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３８：

【０１６６】

【表４８】

【０１６７】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：なし（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ａ）生物：カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：３９：

【０１６８】

【表４９】

【０１６９】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：あり（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ｃ）個体の分離株：プライマー−ＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４０：

【０１７０】

【表５０】

【０１７１】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：あり（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ｃ）個体の分離株：プライマー−ＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４１：

【０１７２】

【表５１】

【０１７３】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：あり（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ｃ）個体の分離株：プライマー−ＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４２：

【０１７４】

【表５２】

【０１７５】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：あり（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ｃ）個体の分離株：プライマー−ＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４３：

【０１７６】

【表５３】

【０１７７】（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖：一本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮説：あり（ｉｉｉ）アンチセンス：なし（ｖｉ）由来源：（Ｃ）個体の分離株：プライマー−ＤＮＡ（ｘｉ）配列記載：配列識別番号：４４：

【０１７８】

【表５４】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした７．２ｋｂの遺伝子のプローブの断片３０９
−６の制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、ある
いはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙す
る。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈａｎｔｓｃｈｋｅ株から由来す
る。

【図２】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした２．２ｋｂの遺伝子のプローブの断片４２１
−１９制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、ある
いはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙す
る。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈａｎｔｓｃｈｋｅから株由来す
る。

【図３】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした２．３ｋｂの遺伝子のプローブの断片４３０
−１４の制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、あ
るいはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙
する。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス
（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈａｎｔｓｃｈｋｅ株から由
来する。

【図４】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした６．３ｋｂの遺伝子のプローブの断片４３２
−８の制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、ある
いはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙す
る。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈ１８００株から由来する。

【図５】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした２．６ｋｂの遺伝子のプローブの断片４３６
−１の制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、ある
いはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙す
る。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈ１８００株から由来する。

【図６】プラスミドベクターｐＢＲ３２２の中にクロー
ニングした３．２ｋｂの遺伝子のプローブの断片４３７
−３の制限地図。遺伝子のプローブを切断するか、ある
いはしないそれ以上の制限酵素をテキストの中に列挙す
る。遺伝子のプローブはカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）Ｈ１８００株から由来する。

フロントページの続き (72)発明者アントニウス・レバーデイングドイツ連邦共和国デー42113ブツペルタール・アムローム105

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カンジダ・アルビカンス（Ｃａｂｄｉｓ
ａａｌｂｉｃａｎｓ）からのＤＮＡまたはＲＮＡと特
異的にハイブリダイゼーションするが、他の菌類、バク
テリア、ヒト、動物または植物からの核酸とはハイブリ
ダイゼーションしないハイブリダイゼーション試薬。