JPH06217765A - 裸化ウシ卵母細胞の試験管内成熟 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は裸化ウシ卵母細胞を成熟する方法に
係る。 【構成】 方法は卵細胞を卵母細胞からはがし、裸化卵
母細胞がそこに単一層の卵細胞を有する維持培地を含む
調整培地で略１０−２４時間、望ましくは１６−２０時
間成熟させるのを可能にすることを含む。方法は又受精
及び胚発育用によい候補にするウシ卵母細胞を選択する
卵母細胞ふるい分け方法に適用されうる。方法は極体の
発育及び排出の観察を含む。この現象はウシ卵母細胞の
発育可能性と直接相関を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は一般的に試験管内卵母細
胞成熟、特に裸化ウシ卵母細胞の試験管内成熟に係る。
更に、本発明は高品質ウシ卵母細胞、即ち核移転又は他
の遺伝子操作技術用の受精の際活性胚に発育する高確率
を有する卵母細胞を予め選択する方法に係る。

【０００２】本発明は又より高い発育胚子適応を有する
卵エンクローズド卵母細胞を成熟する方法に係る。

【０００３】

【従来の技術】クローニングによるウシ胚の供給及び遺
伝移転によるその遺伝子交代を増す技術はほぼ商業的に
使用される。これらの技術は（１）核摘出の際核移転用
受容体細胞として役立つ試験管内での卵母細胞の成熟
（中期II）と；（２）受精の際、活性胚に発育し、核移
転の核供与体として用いられうる成熟（中期II) 卵母細
胞の生成と；（３）受精から受容体雌牛の子宮への移転
と両立性のある段階に、一般的に桑実胚又は胞胚段階で
試験管内の胚を培養する能力とを必要とする。

【０００４】遺伝子工学又はクローニングのような技術
の成果のある商業的使用のため、それらが核移転用受容
体細胞として用いられる前又はそれらが胚に発育するよ
う精子細胞により受精される前に卵母細胞を得、試験管
内で成熟させることが可能でなければならない。この処
理は一般的に屠殺所で得られた牛の卵巣から未成熟（前
期Ｉ）卵母細胞を収集し、受精又は核摘出以前に卵母細
胞を成熟培地で成熟することを必要とする。

【０００５】卵母細胞は正常に成熟し、多数の卵細胞、
即ち卵母細胞を覆い、卵母細胞を成熟するのに必要とさ
れる保護と栄養素の両方を提供すると考えられる非生殖
又は体細胞で保護される。しかし、卵細胞の存在は成熟
期間中卵母細胞を観察することが不可能でない場合それ
を非常に困難にする卵母細胞の周りに雲を作る。従っ
て、卵エンクローズド卵母細胞の核成熟を決定すること
は困難である。

【０００６】ねずみの卵母細胞成熟の１つの研究では、
卵細胞はねずみ卵母細胞からはがされる（シュロエダー
及びエピッグ、１９８９年、発育生物学、１０２巻、４
９３−４９７頁）。研究者は裸化ねずみ卵母細胞が特定
の成熟培地で成熟されたことを決める一方、この研究に
関連する明らかな効用又は経済的価値はない。同様な研
究はウシ卵母細胞にも行なわれた。しかし、裸化ウシ卵
母細胞用成熟観察はこれらの卵母細胞から発育する少な
い数の胚を生じた。ＰＣＴ特許出願第９０１３６２７号
でのバーンズは試験管内での牛卵母細胞の成熟を研究し
た。この方法で、バーンズはウシ卵母細胞から卵エンク
ローズド卵母細胞（ＣＥＯ）を収集し、連続した時間成
熟培地でそれらを成熟させ、卵細胞を卵母細胞（裸化）
からはがし、卵管細胞及び培地の芝培養を含む標本に卵
母細胞を維持するよう試みた。卵母細胞は成熟処理の後
裸化された。

【０００７】これらの研究は卵細胞層を取除いた卵母細
胞、即ち裸化卵母細胞で実行されたが、胚発育に対する
主な候補になる卵母細胞を得るため選択的に卵母細胞を
選別する方法はまだ確かめられていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は
裸化卵母細胞の成熟用方法を開発することである。本発
明の更なる目的は裸化卵母細胞成熟を研究する方法を開
発することである。目的は更に試験管内でウシ卵母細胞
がうまく受精し活性胚に発育するようになる最も高い確
率を有する手段を決める選別方法を開発することであ
る。現在、試験管内で成熟培地で成熟された２０乃至３
０％のウシ卵母細胞だけがうまく胚を発育させることが
評価されている。

【０００９】本発明の目的は又発育的にコンピーテント
ウシ卵母細胞の頻度を増すことである。更に、本発明の
目的は卵母細胞発育の速度を高める調整培地を開発する
ことである。本発明の他の目的は極体形成の反応速度論
（即ち還元分裂Ｉ相）間の関係、ゴナドトロピンの存
在、受精の効果、卵エンクローズド卵母細胞の発育を調
査することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】これら及び他の目的は牛
卵巣から牛卵エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）を得て
分離し、ＣＥＯを維持培地に置き、卵母細胞（「裸化」
卵母細胞）から卵細胞を取除き、略１０−２４時間前も
って形成された単一層の卵細胞を含む条件は培地で裸化
卵母細胞を成熟することからなる裸化ウシ卵母細胞を成
熟させる方法に係る本発明によりなされる。

【００１１】本発明は又上記の段階からなる受精、核移
転及び他の遺伝子操作処理用のより高い品質のウシ卵母
細胞を選択し、第１の極体の存在及び排出（又はシェデ
ィング）を観察する方法に係る。遺伝子操作は遺伝子、
遺伝子の一部、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの一部を挿入及
び／又は削除又は全体ゲノムを挿入又は削除する手順で
ある。遺伝子操作は核移転処理、遺伝子移転、胚クロー
ニング、遺伝子移転による遺伝子変更を含む。特定の操
作プロトコルが用いられる場合、それらの極体を早く排
出するそれらの卵母細胞と胚発育に直接の相関があるこ
とが分かった。本発明は又単一層の卵細胞が培地を発育
及び条件付けするのが可能である維持培地からなる裸化
ウシ卵母細胞を成熟させる特別の調整培地に係る。

【００１２】有利なことに、本発明は極体の排出を観察
することで受精及び核摘出の前にウシ卵母細胞をふるい
分けする方法を提供することである。従って、卵母細胞
での第１の極体の観察は受精又は核摘出用の適切な候補
を予想するのに用いられうる。本発明は発育的な胚子適
応卵母細胞を得る回数を増やす。１つの説明に制限され
るのを望むことなく、卵母細胞からの第１の極体の排出
が卵母細胞の核成熟と一致すると考えられる。極体を早
く排出するそれらの卵母細胞は核移転の後、胚発育に続
いてより受精及び／又は活性化すると考えられる。

【００１３】本発明の状態下での略１０−１６時間の発
育で、卵母細胞は卵割し、受精し、胞胚段階まで発育す
るのにより健康で、より活動性で、よりしやすいことが
分かった。従って本発明即ち健康な卵母細胞を得るため
の主な目的は単一層の卵細胞を含む条件付培地の裸化ウ
シ卵母細胞を略１０−２４時間成熟させることで達成さ
れる。望ましくは成熟期間は、卵母細胞が条件は培地か
ら取除かれ、維持培地で略８時間維持され、受精した
後、略１６時間続く。

【００１４】本発明は又ＣＥＯの極体形成に必要とされ
る時間を減少することで発育的な胚子適応卵母細胞の選
択を改良するようＣＥＯを含む維持培地で黄体形成ホル
モン又は黄体形成ホルモンに構造的に化学的に似ている
ホルモンを加えることに係る。卵母細胞の極体形成は培
地で略１０−１６時間の成熟で認められる。この技術は
卵母細胞を初めに裸化することなくウシ卵母細胞を選択
することを含む。この処理にて、ＣＥＯは分離され、黄
体形成ホルモンを含む維持培地で略１０−２４時間、望
ましくは略１４−２２時間、最も望ましくは略１６−２
０時間、特に略１６時間成熟される。成熟の後、卵細胞
は取除かれ、卵母細胞は第１の極体の存在に対し観察さ
れる。ウシ卵母細胞はこの観察に基づいて選択される。

【００１５】本発明の更なる目的、特徴及び利点は本発
明の以下の詳細な説明から明らかになる。

【００１６】

【実施例】本発明の為、用語「卵母細胞」は卵子（例え
ば未受精、非運動性雌配偶子）及び第１の極体を形成す
るよう還元分裂を行なう卵細胞を定義するのに用いられ
る。極体は卵形成（卵子の形成）の還元分裂中に生成さ
れ、還元分裂Ｉとも呼ばれる第１の還元分裂（減数分
裂）段階の完了の後成熟卵母細胞から排出された小さい
細胞である。卵母細胞成熟は発育段階が還元分裂IIの中
期段階で阻止されるまで、還元分裂Ｉを介する１次卵母
細胞の進行として定義される。卵母細胞、ここで２次の
卵母細胞は受精が還元分裂IIの完了（アルバート ビー
他による、１９８９年、ガーランド出版社、ニューヨー
ク、細胞の分子生物学、第２版の８５９−８６３頁）を
トリガするまでこの阻止段階のままでいる。従って、第
１の成熟分裂は１次の卵母細胞で生じ、２次の卵母細胞
を生成する。次にこれは卵子を生成するよう２次の還元
分裂を行なう。

【００１７】本発明の過程は、特に、受精又は摘出用１
次候補であると考えられるそれらの卵母細胞の受精及び
選択以前に裸化卵母細胞の試験管内成熟に関する。本発
明の為、これらの卵細胞は「発育的胚子適応卵母細胞」
とも呼ばれる。ここで用いられる用語「発育的胚子適応
卵母細胞」は胚を発育する能力を有する卵母細胞を称す
る。

【００１８】本発明の出現で、通常の受精及び胚発育に
必要である卵母細胞の成熟を決定する基準点が提供され
る。この基準点は卵母細胞の極体の形成及び排出の観察
である。極体の観察の重要性は次の如く説明される。雌
配偶子は受精しうる様になる前に半数体数の染色体を有
するべきである。受精以前に、雌配偶子は正しい数の染
色体を定めるよう減数分裂をしなければならない。極体
は発育し、第１の還元分裂、即ち還元分裂Ｉの完了の後
排出される。この点で、極体は卵母細胞に初めてある染
色体の半分を含む。卵母細胞は他の半分を含む。第１の
極体が排出された時、卵母細胞は所望の半数体数の染色
体を取得する。精子細胞による受精の際、二倍体接合子
胚の形成を可能にするコンピーテント半数体精子染色体
が加えられる。

【００１９】従来は、最初に試験管内成熟が卵母細胞を
囲み、観察からそれを隠す卵細胞の存在を必要とするの
で、卵母細胞を観察することで卵母細胞発育の段階を決
定することは不可能であった。従って第１の極体の形成
の動力学に続いて、卵母細胞発育的コンピーテンスへの
その関連は不可能であった。本発明の展開により、卵細
胞を囲む質料の必要性はもはや必要ではない。卵母細胞
を見ることができ、第１の極体の存在が決定されうる。

【００２０】維持培地 胚、特にウシ胚の収集及び維持に慣用されている種々の
胚培養及び維持培地がある。ウシ胚培養及び維持に用い
られる公知の培地の例は、ハムＦ−１０＋１０％胎内小
牛血清、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１
０％胎内子牛血清、タイロード−アンブシン−ラクター
ト−ピルベート（ＴＡＬＰ）、ダルベコ燐酸緩衝液塩類
（ＰＢＳ）、イーグル及びホワイトン培地を含む。胚の
収集及び冷凍に用いられる最も一般的培地の１つはＴＣ
Ｍ１９９と胎内子牛血清、新生子牛血清又は子牛血清を
含む１乃至２０％の血清追加である。望ましい維持培地
はアール塩、１０％の胎内子牛血清、０．２ＭＭＮａ−
ピルベート及び５０μｇ／／ｍｌゲンタミシン硫酸塩を
有するＴＣＭ１９９を含む。

【００２１】他の維持培地はここで参照の為挙げた「ウ
シ胚培地」という名称のローゼンクランス ジュニア他
による米国特許第５０９６８２２号に記載されている。
ＣＲ１と呼ばれるこの胚培地は胚を支持するのに必要で
ある栄養物質を含む。ＣＲ１は１．０ｍＭ乃至１０ｍ
Ｍ、望ましくは１．０ｍＭ乃至５．０ｍＭの範囲の量の
ヘミカルシウムＬ−乳酸塩を含む。ヘミカルシウムＬ−
乳酸塩はそこに組込まれるヘミカルシウム塩を有するＬ
−乳酸塩である。ヘミカルシウムＬ−乳酸塩は単一成分
が培養培地の２つの主な必要条件：即ち、１）コンパク
ト化及び細胞骨格配置に必要であるカルシウム必要量；
２）代謝及び電子伝送に必要である乳酸塩必要量を満足
することが重要である。ヘミカルシウムＬ−乳酸塩は胚
の生存力に必要な培地用価値のあるミネラル及びエネル
ギー源としても作用する。有利なことに、ＣＲ１培地は
胎内子牛血清のような血清を含まず、動物細胞又は他の
生物培地、即ち培地は卵管細胞のような動物細胞からな
る培地の芝培養の使用を必要としない。生物培地はそれ
らが胚に有害であり、検出、特徴化及び除去するのが難
かしい微生物又はトレース要因を含む欠点が時々ありう
る。

【００２２】ＣＲ１培地の主成分の例はヘミカルシウム
Ｌ−乳酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、重炭酸ナ
トリウム、小量の脂肪酸遊離ウシ血清アルブミンを含
む。追加的に、所定の量の必須及び非必須アミノ酸は培
地に加えられてよい。アミノ酸を有するＣＲ１は略語
「ＣＲ１ａａ」で知られている。 ＣＲ１培地は望ましくは下記の量の下記の成分を含む： 塩化ナトリウム − １１４．７ｍＭ 塩化カリウム − ３．１ｍＭ 重炭酸ナトリウム − ２６．２ｍＭ ヘミカルシウムＬ−乳酸塩 − ５ ｍＭ 脂肪酸遊離ＢＳＡ − ３ｍｇ／ｍｌ調整された培地 裸化ウシ卵母細胞を成熟させる為、維持培地は調整され
なければならない。ここで用いられるような用語「調整
された」は裸化ウシ卵母細胞に対して望ましい環境を提
供するよう維持培地の卵細胞の作用を示す。略２日の培
地を調整する期間中、卵細胞を維持培地にある様にする
ことで、培地及び細胞は裸化ウシ卵母細胞の成熟を支持
する。ウシ卵母細胞が裸化され、即ち卵細胞が取除かれ
るので、卵母細胞の量はここに記載の処理で決定されう
る。

【００２３】所望の調整処理は下記の如くである。卵細
胞は注入器に取付けられたマイクロピペット（内径１８
０−２１０μｍ）の首部を通ってＣＥＯをピペットする
ことにより卵母細胞から機能的にはがされる。卵細胞は
落ち、裸化卵母細胞は維持培地から取除かれる。卵細胞
は更に、マイクロピペット（内径２０−３０μｍ）の首
部を通ってそれらをピペットすることにより機械的に分
けられる。

【００２４】卵母細胞から卵細胞をはがす他の方法は略

【００２５】

【数１】

【００２６】分間略１ｍｌのＣＥＯ培地を渦流させるこ
とで細胞を取除くことを含む。或いは細胞は公知の技術
である超音波技術で機械的にはがされうる。細胞は又細
胞培養の技術で公知の方法によりトリプシン又はコウゲ
ナーゼのような適宜の酵素の適用により酵素的にはがさ
れる。分離された細胞を有する培地は円錐管の５ｍｌの
維持培地中に置かれる。細胞は下記の手順により２度洗
浄され：管は１５分間３０００ｒｐｍで遠心される。上
澄みは捨てられ、５ｍｌの新しい培地が管の底の細胞の
ペレットに加えられる。

【００２７】２度目の洗浄の後に得られたペレットは１
×１０⁷ 細胞／ｍｌの最終濃度に維持培地で再懸濁され
る。５０μｌ懸滴が細胞懸濁から作られ、パラフィン油
で覆われ、１次細胞培養層を形成するよう２−４日間培
養器（培養状態：空気中５％ＣＯ₂ 、３９℃、湿潤大
気）に置かれる。１次細胞培養層はほとんど元の組織か
らの卵細胞からなる層として画成される。これらの細胞
は生体内卵細胞と同じ機能特性を有する。２日後、裸化
ウシ卵母細胞の成熟の為懸滴が用いられる。

【００２８】１つの実施例において、本発明は下記の如
く動作しうる：ＣＥＯは屠殺ウシ卵巣からの小さい腔卵
胞から収集される。ＣＥＯは維持培地に置かれ、囲む卵
細胞からはがされる。取除手順の説明はこの適用におい
てほかで詳細に示される。裸化卵母細胞は次にヘペス緩
衝タイロード培地で２度洗浄され、卵細胞単層が形成さ
れるより２日早く準備された、調整培地点滴に置かれ
る。卵母細胞は略１０−２４時間、望ましくは略１２−
２２時間、より望ましくは略１６−２０時間、最も望ま
しくは略１６時間３９℃で空気中５％ＣＯ₂ 、最大湿度
で成熟される。

【００２９】この成熟時間に続いて、卵母細胞は第１の
極体の存在に対して顕微鏡的に（４０×）検査される。
第１の極体をリリースした卵母細胞は次に受精用の主た
る候補と考えられる。卵母細胞は４８時間公知の技術の
変形タイロード培地で受精され、更なる発育の為培養培
地に置かれる。ＣＥＯの成熟 裸化卵母細胞発育に対抗する如くＣＥＯ発育の速度は黄
体形成ホルモンを維持培地に加えることにより大きく高
められることも分かった。黄体形成ホルモンは脳下垂体
の頬部により分泌された糖タンパク質である。雌では、
ホルモンは発情均質の生成でグラーフ卵胞の成熟を促進
し、排卵及び黄体腺の形成に必須である。この発明の
為、用語「黄体形成ホルモン」又は「ＬＨ」はＬＨ活性
を有する化合物を示す。かる化合物は自然に得られたＬ
Ｈ、人の胎盤からの人の絨毛ゴナドトロピン（ＨＣＧ）
及びＬＨ活性を表わす合成化合物を含む。

【００３０】培地は卵母細胞発育の速度を高めるよう十
分な黄体形成ホルモンだけを必要とする。従って、黄体
形成ホルモンは２μｇ／ｍｌ乃至１０μｇ／ｍｌ、望ま
しくは略５μｇ／ｍｌの量の調整培地に含まれうる。下
記の例を参照する。例は本発明に対してなにも限定する
ものではなく、本発明の最もよい方法の説明をするもの
である。

【００３１】例 例１ 本例の目的は調整培地を有する体細胞（キュミュラス）
単層が裸化卵母細胞の成熟を支持するかどうかをテスト
することであった。ＣＥＯは屠殺ウシ卵巣からの小さい
腔卵胞から収集された。

【００３２】１．ＣＥＯは成熟培地（１０％ＦＣＳ、焦
性葡萄酸塩、ゲンタミシン、５μｇ／ｍｌ ＬＨ及び１
μｇ／ｍｌエストラジオールで補充されたＴＣＭ１９
９）に置かれる。 ２．卵母細胞は卵細胞（ＮＯ）なく手ではがされ、ＴＣ
Ｍ１９９−ホルモンに置かれる。 ３．ＮＯは調整培地（卵細胞により２日間調整された維
持培地）に置かれる。調整培地は卵細胞を洗浄し、それ
らを維持培地の５０マイクロリットル懸滴に懸濁させ、
２日間培地を調整するようそれらが単層を形成するのを
可能にすることで準備された。

【００３３】全ての処理の卵母細胞は２１時間、３９℃
で５％ＣＯ₂ の最大湿度の空気でパラフィン油状態下の
５０マイクロリットル懸滴（１０卵母細胞／懸滴）で成
熟された。成熟の後、全ての卵母細胞は第１の極体の存
在に対して検査された。卵母細胞は４８時間変形タイロ
ード培地で受精され、更なる発育の為ＣＲ１ａａに置か
れた。

【００３４】この実験の結果を下記の表１に示す。

【００３５】

【表１】

【００３６】ＰＩ＝後受精；ＢＵ＝胞胚；ＣＬＶ＝卵
割、ａ，ｂ，ｃは異なる上付き差分（Ｐ＜０．０５）を
有する意味する。用語「卵割」（ＣＬＶ）は受精された
後少なくとも一度分割された卵母細胞の数を定義する。
第１の処理でのＣＥＯの８２％は卵割を有し、一方第２
の処理（ＮＯ単一層）での２６％だけが卵割される。し
かし、（卵単層を有する）第３の処理での８３％は卵割
される。

【００３７】卵割に関して第１と第３の処理の間に実質
的に差はないが、区別の為胞胚発育カラムを参照する。
第１の処理で卵割されたそれらの細胞のうち８日間で３
１％だけ胞胚が形成される。しかし第３の処理では５８
％胞胚が形成される。これらの結果は、２日間条件付け
られた培地を有する卵細胞単一層が裸化ウシ卵母細胞の
成熟を支持しうることを示唆している。更に、このシス
テムを用いると、極体の存在は卵母細胞発育可能性の指
標として用いられうる。

【００３８】例２ 本例の目的は最も高い胚発育胚子適応を有する卵母細胞
を決定することであった。卵母細胞は裸化卵母細胞（Ｎ
Ｏ）と卵丘エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）の成熟の
ため例１の手順により得られ成熟される。ＣＥＯは１６
時間ＴＣＭ−１９９ホルモンで成熟された。この時に、
それらは卵細胞から手ではがされる。それらは調整の開
始後、１６，２０及び２４時間で第１の極体（ＰＢ）の
存在に対し検査された。ＮＯは培養以前に卵細胞からは
がされ、ＴＣＣ−１９９ホルモンで卵単一層（２日旧
い）で成熟された。ＮＯは培養の始まりの後１６，２０
及び２４時間で第１の極体の存在に対し検査された。

【００３９】２４時間で、全ての卵母細胞は４８時間タ
イロード培地で受精された（夫々は異なる雄牛からの精
液で反復試験する）。この時に、少なくとも一度卵割さ
れた全ての卵母細胞は６乃至８日間胞胚段階中発育する
ＣＲ１ａａ培地に移される。結果は図１−４及び表２以
下に要約される。

【００４０】

【表２】

【００４１】ＰＢ−極体；ＮＦ−通常受精； ＣＬＶ−４８時間の卵割；ｄ８ＢＬ−８日胞胚。 結果は卵母細胞が卵細胞の有り（ＣＥＯ）又は無し（Ｎ
Ｏ）で成熟されるかどうかに依存するＰＢ射出のタイミ
ングに差があることを示唆する。ＣＥＯ群の卵母細胞の
大部分は１６時間でＰＢ射出し、一方ＮＯ群は２０時間
で最も高い割合のＰＢを示した。これらの卵母細胞のほ
とんどは２０時間の後成熟（７５％ＣＥＯ及び７２％Ｎ
Ｏ）で極体を有した。図２に示す如く、通常の受精はＣ
ＥＯ卵母細胞でわずかに高かった。

【００４２】卵割速度はたとえいつ極体が排出されたに
してもＮＯ群ではより高かった。卵割は１６時間卵母細
胞（８５％）で最も高く、卵母細胞が後でＰＢ排出する
よう遅くされる。これは図３に示される。図４に示す如
く、同じ傾向は８日胞胚発育の結果から明らかである。
従って、卵母細胞は早くＰＢ卵割し、両群（ＣＥＯ及び
ＮＯ）でより速い速度で発育すると考えられる。

【００４３】例３ 図１に示す如く、１６時間でのＣＥＯの大きい変化（Ｓ
Ｅ）は異なる反復試験で成熟中に用いられた異なる性腺
刺激ホルモンによると考えられる。この例はＣＥＯから
のＰＢ射出に異なる性腺刺激ホルモンの効果を決定する
よう発育された。

【００４４】例２の卵母細胞を得て、成熟する処理は下
記の区別で続けられる。コンパクトな卵外被を有する単
に均等に粒状化された卵母細胞が成熟の為用いられる。
無傷卵複合体は５μｇ／ｍｌ羊で得られたＬＨ（関節
炎、糖尿病、消化及び腎臓病の国立研究所−国立衛生研
究所）（ＮＩＨ−０ＬＨ）（生物濃度：２．３ユニット
／ｍｇ）及び１μｇ／ｍｌエストラジオール（処理０Ｌ
Ｈ）又は２５μｇ／ｍｌ豚で得られたＦＳＨ（シャーリ
ング）（ＦＳＨ−Ｐ）及び１μｇ／ｍｌエストラジオー
ル（処理ＦＳＨ−Ｐ）で補充されたＴＣＭ−１９９で成
熟される。１６時間の成熟の後、卵母細胞は卵細胞から
手ではがされ、ＴＣＭ−１９９に置かれる。それらは１
６，２０及び２４時間で第１の極体の存在に対し検査さ
れる。２４時間の調整により極体を放出する卵母細胞は
研究（全ての卵母細胞の２３−２５％）には含まれな
い。全ての卵母細胞は２４時間グルコースのないＴＡＬ
Ｐで受精される。少なくとも一度（受精の後４８時間）
卵割された卵母細胞は更なる発育の為ＣＲ１ａａに置か
れる。データは２×３要因組合せで完全な任意配列法を
用いて分析される。各処理は反復された（ｎ＝４）。

【００４５】結果は下記の如く表３に要約される：

【００４６】

【表３】

【００４７】異なる上付きのａ，ｂ，ｃは異なる（ＰＣ
＜０．０５）。結果は成熟される場合完全に還元分裂し
た卵母細胞が卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨｐ）（１６時間
で２６．５％）の存在よりも黄体形成ホルモン（ＮＩＨ
−０ＬＨ）（１６時間で６６．０％）の存在の方がより
早いことを示した。本発明はここで図示され、説明され
た特定の構成及び装置に限定されず、請求範囲内にある
如くそのかかる変形例も包含することが分かる。

【図面の簡単な説明】

【図１】例２の卵エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）と
非卵エンクローズド卵母細胞（ＮＯ）用成熟期中１６，
２０及び２４時間でのパーセント極体出現を示す棒グラ
フである。

【図２】例２の卵エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）と
非卵エンクローズド卵母細胞（ＮＯ）用極体形成の１
６，２０及び２４時間の時間によるパーセント標準受精
を示す棒グラフである。

【図３】例２の卵エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）と
非卵エンクローズド卵母細胞（ＮＯ）用極体形成の１
６，２０及び２４時間の時間により分類された卵母細胞
のパーセント卵割を示す棒グラフである。

【図４】例２の卵エンクローズド卵母細胞（ＣＥＯ）と
非卵エンクローズド卵母細胞（ＮＯ）用極体排出の１
６，２０及び２４時間の時間により分類された卵母細胞
の８日胚盤胞形成を示す棒グラフである。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ．ウシ卵卵母細胞複合体を分離し； ｂ．複合体を維持培地に置き； ｃ．裸化ウシ卵母細胞を形成するよう卵母細胞から卵細
   胞を取除き； ｄ．単一層の卵細胞を含む調整培地で裸化ウシ卵母細胞
   を成熟させることからなる裸化牛卵母細胞成熟方法。
2. 【請求項２】 卵母細胞は略１０−２４時間調整培地で
   成熟される請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 卵母細胞は略１６−２０時間調整培地で
   成熟される請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 維持培地はハムＦ−１０＋１０％胎内小
   牛血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１
   ９９）＋１０％ＦＣＳ、タイロード−アルブシン−ラク
   タート−ピルベート（ＴＡＬＰ）、ダルベコ燐酸緩衝塩
   （ＰＢＳ）、イーグル及びホワイトン培地及びＣＲ１ａ
   ａからなる群から選択される請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 維持培地は血清補充、ピルベート及びゲ
   ンタミシンを含む請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 維持培地は胎内小牛血清を含む請求項４
   記載の方法。
7. 【請求項７】 略３９℃の温度で裸化ウシ卵牛細胞を調
   整培地で成熟させることからなり、調整培地は単一層の
   卵細胞を含む維持培地である請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 ａ．ウシ卵卵母細胞複合体を分離し； ｂ．複合体を維持培地に置き； ｃ．裸化ウシ卵母細胞を形成するよう卵母細胞から卵細
   胞を取除き； ｄ．単一層の卵細胞を含む調整培地で裸化ウシ卵母細胞
   を成熟させ； ｅ．裸化ウシ卵母細胞で第１の極体の存在を観察し； ｆ．段階ｅの観察に基きウシ卵母細胞を選択することか
   らなる遺伝操作方法用ウシ卵母細胞選択方法。
9. 【請求項９】 卵母細胞は略１０−２４時間調整培地で
   成熟される請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 卵母細胞は略１６−２０時間調整培地
    で成熟される請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】 複合体は卵細胞がそれから取除かれる
    前に略５時間維持培地に維持される請求項８記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 遺伝子操作方法は核移転、遺伝移転、
    胚クローニング及び遺伝移転による遺伝子交代を含む請
    求項８記載の方法。
13. 【請求項１３】 ａ．ウシ卵エンクローズド卵母細胞を
    分離し； ｂ．略１０−２４時間黄体形成ホルモンを含む維持培地
    で卵エンクローズド卵母細胞を成熟させ； ｃ．裸化ウシ卵母細胞を形成するよう卵母細胞から卵細
    胞を取除き； ｄ．裸化ウシ卵母細胞の第１の極体の存在を観察し； ｅ．段階ｄの観察に基いてウシ卵母細胞を選択すること
    からなる遺伝子操作方法用ウシ卵母細胞選択方法。
14. 【請求項１４】 卵母細胞は略１６−２０時間培地で成
    熟される請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 黄体形成ホルモンは略２μｇ／ｍｌ乃
    至１０μｇ／ｍｌの範囲の量で存在する請求項１３記載
    の方法。
16. 【請求項１６】 略５μｇ／ｍｌ黄体形成ホルモンが存
    在する請求項１３記載の方法。
17. 【請求項１７】 単一層の卵細胞を有する維持培地から
    なる裸化ウシ卵母細胞を成熟させる調整培地。
18. 【請求項１８】 維持培地はハムＦ−１０＋１０％胎内
    小牛血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−
    １９９）＋１０％ＦＣＳ、タイロード−アルブシン−ラ
    クタート−ピルベート（ＴＡＬＰ）、ダルベコ燐酸緩衝
    塩（ＰＢＳ）、イーグル及びホワイトン培地及びＣＲ１
    ａａからなる群から選択される請求項１７記載の調整培
    地。
19. 【請求項１９】 ａ．卵細胞を洗浄し； ｂ．維持培地で卵細胞単一層を形成するのに十分な時間
    卵細胞を維持培地で懸濁させることからなる裸化ウシ卵
    母細胞を試験管内で成熟させる調整培地形成方法。
20. 【請求項２０】 卵細胞は少なくとも略２日間維持培地
    で懸濁される請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 卵細胞は少なくとも略２−４日間維持
    培地で懸濁される請求項１９記載の方法。
22. 【請求項２２】 ａ．ウシ卵卵母細胞複合体を分離し； ｂ．複合体を維持培地に置き； ｃ．裸化ウシ卵母細胞を形成するよう卵母細胞から卵細
    胞を取除き； ｄ．単一層の卵細胞を含む調整培地で裸化ウシ卵母細胞
    を成熟させ； ｅ．裸化ウシ卵母細胞で第１の極体の存在を観察し； ｆ．段階ｅの観察に基きウシ卵母細胞を選択することか
    らなる遺伝操作方法用より高い品質のウシ卵母細胞を選
    択する方法。
23. 【請求項２３】 複合体は卵細胞がそれから取除かれる
    前に略５時間維持培地に維持される請求項２２記載の方
    法。
24. 【請求項２４】 卵母細胞は略１６−２０時間調整培地
    で成熟される請求項２２記載の方法。
25. 【請求項２５】 遺伝子操作方法は核移転、遺伝移転、
    胚クローニング及び遺伝移転による遺伝子交代を含む請
    求項２２記載の方法。