JPH06217771A

JPH06217771A - アルカリ性バチルス−プロテアーゼ、その製法及びこのアルカリ性バチルス−プロテアーゼを含有する洗浄、清浄又は食器洗浄用の組成物

Info

Publication number: JPH06217771A
Application number: JP5133268A
Authority: JP
Inventors: Roman Vetter; フェターロマン; Detlef Wilke; ヴィルケデトレフ; Bernhard Moeller; メーラーベルンハルト; Martina Mueller; ミュラーマルティナ; Ingo Muecke; ミュッケインゴ; Meike Takenberg; ターケンベルクマイケ; Gerhard Konieczny-Janda; コニーツニー−ヤンダゲルハルト
Original assignee: Solvay Enzymes GmbH and Co KG
Current assignee: Chr Hansen GmbH
Priority date: 1992-06-04
Filing date: 1993-06-03
Publication date: 1994-08-09
Also published as: MX9303257A; US5346822A; FI932538L; KR100279867B1; KR940000574A; US5478742A; DE59310348D1; DE4218448A1; ES2204897T3; FI932538A7; EP0572992A1; CA2097523C; ATE247706T1; DK0572992T3; CA2097523A1; EP0572992B1; AR248166A1; FI932538A0; PT572992E

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】洗剤及び清浄剤組成物用の添加剤として適当
である新規アルカリ性バチルス−プロテアーゼ及びその
製法の提供。【構成】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７、又はこ
のプロテアーゼに関する遺伝情報を有する形質転換され
た微生物を培養することにより得られる。【効果】他の洗剤成分との組合せにおいて相容性であ
り、非常に良好なタンパク質汚れ洗浄作用を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス・プミルス(B
acillus pumilus)からのアルカリ性プロテアーゼ、それ
らの使用及びこれらのプロテアーゼの使用法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルカリ性プロテアーゼは、殊に、洗剤
産業において、有利な使用を伴う、価値ある産業生成物
である。それというのも、これらは、タンパク質を含有
する汚れを除去するからである。効果的であるために
は、これらのプロテアーゼは、洗浄条件下（ｐＨ値、温
度）で、タンパク質分解活性を有するだけでなく、これ
らは、更に、他の洗剤成分、すなわち他の酵素、界面活
性剤、基質（ビルダー）、漂白剤、漂白剤活性物質及び
他の添加剤及び助剤との組合せにおいて、相容性である
べきである。殊に、プロテアーゼは、これらの洗剤成分
に対する十分な安定性及びそれらの存在下で十分な洗浄
作用を有するべきである。

【０００３】技術水準のアルカリ性プロテアーゼは、従
来、殊に、アルカリ性プロテアーゼを製造し、かつ培地
中に分泌する、バチルス種、例えばバチルス・アルカロ
フィルス(Bacillus alcalophilus)、バチルス・ズブチ
ルス(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファ
シエンス(Bacillus amyloliquefaciens)及びバチルス・
リヘニホルミス(Bacillus licheniformis)の培養により
得られる。

【０００４】これらのアルカリ性プロテアーゼに関し
て、技術水準で、所望の特性を有する新規アルカリ性プ
ロテアーゼを得るための既に多くの努力が試みられた。
従って、一連の自然及び合成的（遺伝子工学的）に変化
したアルカリ性及び高アルカリ性プロテアーゼは、既に
公知である。それにもかかわらず、洗浄特性に関して殊
に有利な特性を有する、新たなアルカリ性プロテアーゼ
の需要があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、有利な特性を
有する、新規の価値あるアルカリ性プロテアーゼを製造
することが課題であった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】さて、意外にも、バチル
ス・プルミルスＤＳＭ５７７７又はこのプロテアーゼに
関する遺伝情報を有する形質転換された微生物の培養に
より得られるアルカリ性バチルス−プロテアーゼは、約
ｐＨ８．０〜１１．５のアルカリ性ｐＨ範囲内の至適ｐ
Ｈ及び約５０〜６０℃の範囲内の至適温度を有する、有
利な特性を有し、かつ非常に良好な洗浄作用を示すこと
が分かった。

【０００７】本発明のアルカリ性プロテアーゼは、バチ
ルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロテアーゼのア
ミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、特に８０％以
上、殊に９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有
することが有利である。ここで、相同性のもとに、バチ
ルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロテアーゼのア
ミノ酸配列に対する、本発明のプロテアーゼの該アミノ
酸配列の非常に近い近縁性が分かる。相同性を測定する
ために、それぞれ、バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７
からのプロテアーゼのアミノ酸配列及びそれと比較すべ
きプロテアーゼのアミノ酸配列の相当する断片を、アミ
ノ酸配列間の最大の一致を生じるように、互いに一致さ
せ、その際、個々のアミノ酸の欠失又は挿入に起因する
相違を考慮し、かつ配列断片の相当する置き換えにより
調整する。バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプ
ロテアーゼの１種の配列中に含有されるアミノ酸の全数
に対する、配列中のここで互いに一致するアミノ酸（相
同位置）の数は、その際、％で相同性を示す。配列中の
例外は、アミノ酸の変異、挿入、欠失によっても、条件
付けられる。

【０００８】本発明のプロテアーゼは、バチルス・プミ
ルスＤＳＭ５７７７の培養によるか、又はバチルス・プ
ミルスＤＳＭ５７７７からの本発明によるプロテアーゼ
の１種に関する遺伝情報を例えば発現ベクター中に有す
る、形質転換された微生物バチルスの培養によって得ら
れる。

【０００９】ＨＰＬＣ（＝高圧液体クロマトグラフィ
ー）を用いる、バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７の培
養液の培養液上澄の除去は、バチルス・プミルスＤＳＭ
５７７７から、異なる特性を有する少なくとも２種のプ
ロテアーゼが得られることを示す。

【００１０】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からの
本発明の有利なプロテアーゼの１種は、次の特性を有す
るアルカリ性バチルス−プロテアーゼである：（１）作用：タンパク質及びペプチドの分解（２）至適ｐＨ：ｐＨ値約１０．５〜１１．０（３）ｐＨ安定性：ｐＨ値５９．７〜１０．８で、酵素
は、完全に安定であることが明らかである（４）至適温度：約６０℃ （５）温度安定性：４５℃までの温度で１５分間プロテ
アーゼをインキュベートすることにより、プロテアーゼ
は実質的にその活性において影響を受けず；約５０℃で
１５分間インキュベート後に、プロテアーゼの残留活性
は、少なくとも９０％である。

【００１１】もう１つのバチルス・プミルスＤＳＭ５７
７７からの本発明の有利なプロテアーゼは、次の特性を
有する；（１）作用：タンパク質及びペプチドの分解（２）至適ｐＨ：ｐＨ値約８．５〜９（３）ｐＨ安定性：ｐＨ値５．５〜１０．５で、酵素
は、完全に安定であることが明らかである（４）至適温度：約５０℃ （５）温度安定性：４０℃までの温度で１５分間プロテ
アーゼをインキュベートすることにより、プロテアーゼ
は実質的にその活性において影響を受けず；約４５℃で
１５分間インキュベート後に、プロテアーゼの残留活性
は、少なくとも９５％である。

【００１２】本発明のバチルス−プロテアーゼは、アル
カリ性までのｐＨ値を有し、かつ低い温度、殊に６０℃
までの温度で使用するのがよい、洗剤−及び清浄剤組成
物等用の添加剤として適当である。従って、本発明は、
洗剤−、清浄剤−又は食器用洗剤組成物における、本発
明のアルカリ性バチルス−プロテアーゼの使用にも関す
る。ここで、これらは、他の慣例の酵素、殊に他のプロ
テアーゼの存在下でも有利に使用することができる。本
発明のアルカリ性プロテアーゼの殊に有利な使用は、殊
に約６０℃までの低い使用温度、特に約３０〜６０℃の
使用温度のための洗剤−、清浄剤−又は食器用洗剤組成
物でのその使用に関する。

【００１３】更に、本発明は、少なくとも１種の本発明
のアルカリ性プロテアーゼを含有する洗剤−、清浄剤−
及び食器用洗剤組成物を包含する。これらの使用目的の
ために、本発明は、それを用いてタンパク質を含有する
汚れを有利に除去することができる、有利な特性を有す
る新規アルカリ性プロテアーゼの群を提供する。卵黄を
含有する汚れも、血液及び牛乳を含有する汚れも、同様
に良好に取り除くことができる。洗剤処方物中に通常含
有されている成分による影響は、本発明のプロテアーゼ
の洗浄作用において、実質的に確認されない。

【００１４】本発明によるプロテアーゼは、洗剤処方物
及び清浄処方物中で、例えば粉末洗剤処方物中で、単独
又は必要に応じて一緒に組み合わせて、場合により技術
水準の洗剤プロテアーゼ及び清浄プロテアーゼ、又はこ
れらの組成物中で慣例の他の酵素、例えばプロテアー
ゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアー
ゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ等と組み合わせ
て使用することができる。本発明のプロテアーゼは、洗
剤処方物及び清浄処方物中に、洗剤酵素のために自体慣
例の量、殊に３重量％（全組成物の乾燥物質に対して）
までの量、特に０．２〜１．５重量％の量で使用する。

【００１５】既に前記した洗剤酵素以外に、本発明の洗
剤及び清浄剤は、技術水準で自体慣例の全ての洗剤内容
物、例えば界面活性剤、漂白剤又は基質（ビルダー）、
並びに洗剤の処方のための他の慣例の助剤を、自体慣例
の量で含有していてもよい。助剤には、例えば次のもの
が属する；強化剤、酵素安定剤、汚れ担持剤及び／又は
相容化剤、錯体形成剤及びキレート形成剤、石鹸泡調節
剤及び添加剤、例えば光学的明化剤、混濁化剤、腐食防
止剤、帯電防止剤、染料、殺菌剤、漂白剤活性剤、過酸
漂白剤前駆物質。

【００１６】典型的な模範的組成物中の、こうして得ら
れた本発明の洗剤処方物は、、乾燥物質に対して、次の
ものを含有する：ａ）界面活性剤又は界面活性剤混合物少なくとも５重量
％、例えば１０〜５０重量％ｂ）ビルダー又はビルダー混合物４０重量％までｃ）漂白剤又は漂白剤混合物、特に過ホウ酸塩、例えば
過ホウ酸ナトリウム−四水和物又は過ホウ酸ナトリウム
−一水和物４０重量％までｄ）少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ３重量％ま
でｅ）他の成分、例えば助剤等１００重量％まで。

【００１７】このような洗剤処方物は、自体慣例の方法
で処方することができる。更に、本発明のプロテアーゼ
は、例えば顆粒、プリル(Prill)又はペレットの形で、
場合により表面被覆を施こし、洗剤処方物の他の成分
と、自体公知の方法で混合してもよい。

【００１８】更に、本発明のプロテアーゼは、自体慣例
の液体洗剤処方物で使用するために非常に適当である。

【００１９】本発明のアルカリ性プロテアーゼは、バチ
ルス・プミルスＤＳＭ５７７７又は本発明のプロテアー
ゼの遺伝情報を含有する微生物を培養し、次いで、培養
液上澄から、形成されたアルカリ性プロテアーゼを単離
することにより得られる。その際、培養液上澄からのア
ルカリ性プロテアーゼの単離は、自体公知の方法で、細
胞を濾過又は遠心分離により除去し、プロテアーゼを膜
濾過又は沈殿により濃縮し、精製し、場合により単離
し、かつ所望の使用に導くことにより実施される。

【００２０】本発明のプロテアーゼを製造及び入手する
ために、例えばバチルス・プミルス株ＤＳＭ５７７７そ
れ自体、又は本発明のプロテアーゼに関する遺伝情報
を、例えば発現ベクター中に含有する形質転換されたバ
チルス・プミルス株を使用することができる。

【００２１】大工業的に製造するために、殊に、生成簡
易化及び−最適化の理由から、並びに収率調節のため
に、その中に先ず、形質転換により、本発明のプロテア
ーゼ及びその発現に関する必要な遺伝情報を組み込んだ
他の微生物、殊にバチルス株も、本発明のプロテアーゼ
の製造及び入手のために使用することができる。

【００２２】従って、本発明は、プロテアーゼ発現のた
めに必要なＤＮＡ−配列を有し、かつ前記本発明のアル
カリ性プロテアーゼのアミノ酸配列を暗号化するような
ＤＮＡ−配列を有する発現ベクターを含有する、形質転
換された微生物を用いる本発明のアルカリ性プロテアー
ゼの製法にも関する。本発明により形質転換された微生
物を前記のようにして培養し、かつ培地からアルカリ性
プロテアーゼを単離する。本発明のプロテアーゼを製造
及び入手するために、形質転換された有利な微生物は、
バチルス種、例えばバチルス・ズブチリス、バチルス・
アルカロフィルス、バチルス・リヘニホルミス又はバチ
ルス・アミロリケファシエンスである。本発明の形質転
換された微生物は、殊に、１９９０年２月９日に、番号
ＤＳＭ５７７７で、ドイツ微生物寄託局(Deutschen Sam
mlung von Mikroorganismen，ドイツ連邦共和国）にお
いて寄託されたバチルス・プミルスからのアルカリ性プ
ロテアーゼに関する遺伝情報を含有する、発現ベクター
を用いて形質転換されていることを示す。従って、同様
に、本発明は、１９９２年２月２３日に、番号ＤＳＭ６
８７９及びＤＳＭ６８８０で寄託された微生物、並びに
前記した本発明のプロテアーゼの遺伝情報を含有する、
これらの微生物から単離可能なプラスミドも包含する。

【００２３】本発明方法において使用される、本発明に
より包含される形質転換された微生物を入手するために
は、次のように行なうことができる；ａ）先ず、バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプ
ロテアーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも７０
％、有利には８０％以上、殊に９０％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を有するアルカリ性プロテアーゼを製
造する適当なバクテリア株から、プロテアーゼを暗号化
するＤＮＡ−配列（すなわちプロテアーゼの構造遺伝
子）を単離し、ｂ）場合により、プロテアーゼの更なる同定のために、
このＤＮＡ−配列のヌクレオチド連続を測定し、ｃ）次いで、単離したＤＮＡ−配列を用いて、発現ベク
ターを製造し、かつｄ）得られた発現ベクターを、引き続きアルカリ性プロ
テアーゼの製造に使用することができる適当な微生物中
で形質転換する。

【００２４】前記方法による本発明のアルカリ性プロテ
アーゼを単離及び入手するための方法工程、並びにこの
際に得られた、部分的に本発明の目的物を同様に示す、
プロテアーゼ遺伝子を有するＤＮＡ−配列もしくはＤＮ
Ａ−挿入形の中間体、ベクター、殊に発現ベクター及び
形質転換された微生物について、次に詳述する。

【００２５】本発明のアルカリ性プロテアーゼのアミノ
酸配列を暗号化する構造遺伝子は、自体公知の一般的方
法により得ることができる。ここで、例えば、バチルス
・プミルスＤＳＭ５７７７（「ドナーバチルス(Donor-B
acillus)」）から、染色体ＤＮＡを、自体公知の方法に
より単離し、かつ適当な制限エンドヌクレアーゼを用い
て部分的に加水分解する。

【００２６】ドナーＤＮＡの得られた制限断片を、ゲル
電気泳動又はショ糖密度勾配遠心分離により、大きさに
応じて分離し、かつ次いで、所望の大きさの断片を、適
当なベクター−ＤＮＡを用いて組換えることができる。
有利には、ベクターとして、使用した宿主生物中に組み
込まれた異種−ＤＮＡの発現が可能であるプラスミドを
使用する。例中に記載のように、プラスミドｐＵＢ１１
０から、ポリリンカー部位の導入により得られた、例え
ば、ｐＵＢ１３１の呼称を有するプラスミドを使用する
ことができる。

【００２７】さて、前記のようにして得られた、イン・
ビトロで組換えられたＤＮＡを、適当な宿主細胞、例え
ばここで使用したバチルス・ズブチリスＰＳＬ１株中に
導入することができる。形質転換細胞、すなわち組換え
ＤＮＡを取り込んだ宿主細胞は、ベクター−ＤＮＡ上の
公知のマーカー（例えばネオマイシン耐性）を用いて選
択することができる。これらの抗生物質耐性形質転換細
胞下に、増加したプロテアーゼを分泌するようなクロー
ンを探すことができる。このような形質転換細胞下に、
本発明によるプロテアーゼを分泌する状態にあるこれら
のクローンを単離することができる。引き続き、肯定的
なクローンから、これらの形質転換細胞中に導入された
プラスミド−ＤＮＡを単離する。

【００２８】これらのプラスミドは、公知の制限部位を
有するベクター−ＤＮＡの他に、バチルス・プミルスＤ
ＳＭ５７７７からの本発明のアルカリ性プロテアーゼに
望ましい構造、及び場合により他の、しかしながらドナ
ー−バチルスからの不必要なＤＮＡ−配列を有してい
る。例えば、このようなプロテアーゼ−含有プラスミド
は、ｐＰＰ４６及びｐＰＰ４１５の呼称を有するプラス
ミドである。プラスミドｐＰＰ４６は、７．６ｋＢ（＝
キロベース）の大きさを有し、かつバチルス・プミルス
ＤＳＭ５７７７からの本発明のプロテアーゼＰ４６を暗
号化する。プラスミドｐＰＰ４１５は、６．２ｋＢの大
きさを有し、かつバチルス・プミルスＤＳＭ５７７７か
らの本発明のプロテアーゼＰ４１５を暗号化する。

【００２９】これらのプラスミドの相当するアルカリ性
プロテアーゼの発現可能性は、バクテリア、殊に前記種
類のバチルス種をこれらのプラスミドを用いて形質転換
し、かつこうして得られた形質転換細胞を培養し、かつ
プロテアーゼ活性に関して検査して、調査することがで
きる。更に、得られた形質転換細胞は、本発明のアルカ
リ性プロテアーゼの製造及び入手のためにも培養するこ
とができ、その際、次いで、更に前記した本発明による
アルカリ性プロテアーゼを得ることができる。

【００３０】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からの
本発明のプロテアーゼは、有利な特徴ですぐれている。
これらは、アルカリ性ｐＨ値で、高い安定性を有する。
本発明のプロテアーゼの至適ｐＨは、洗剤−及び清浄剤
組成物中で使用するために適当な、ｐＨ約８．０〜１
１．５の範囲にある。更に、本発明のプロテアーゼは、
約５０〜６０℃の範囲の至適温度を有する。更に、これ
らは、石鹸水(Waschlauge)中でも良好な安定性を示す。
温度６０℃まででのその好適な活性に基づいて、本発明
のバチルス−プロテアーゼは、殊に、低い温度、殊に６
０℃まで、特に３０〜６０℃で使用すべきである清浄組
成物及び洗剤組成物中での使用に適当である。本発明の
プロテアーゼを含有するこのような洗剤組成物及び清浄
剤組成物は、除去すべきタンパク質汚れに関して、有利
な洗浄作用を示す。

【００３１】

【実施例】次の例は、本発明を、例示した典型的態様に
おいて明らかにするものであるが、本発明は、その範囲
内に限定されない。

【００３２】特に記載のない限り、マニアティス(Mania
tis)等（マニアティス等＝T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.S
ambrook,“Molecular Cloning,A Laboratory Manual",C
oldSpring Harbor Laboratory,1982)において記載され
ている一般的な方法により作業した。

【００３３】使用した種々の制限エンドヌクレアーゼ
は、技術水準に属し、かつ市場で入手することができ
る。この公知の制限エンドヌクレアーゼの使用時にそれ
ぞれ必要な反応−、補因子−及びその他の条件は、同様
に公知である。例えば、ＤＮＡ約１μｇの量のために、
１単位（＝１Ｕ＝ユニット）の制限エンドヌクレアーゼ
を、緩衝液約２０μｌ中で使用することができる。通
常、３７℃で約１時間の十分なインキュベーション時間
を厳守するが、インキュベーション条件は、得られる結
果に適応させることができる。制限エンドヌクレアーゼ
とのインキュベーション後に、タンパク質を、抽出（例
えばフェノール及びクロロホルムを用いる）により除去
し、かつ切断されたＤＮＡを単離（例えばエタノールで
の沈殿により水性フラクションから）し、かつ更なる使
用に供給する。

【００３４】場合により、制限エンドヌクレアーゼを用
いるＤＮＡ又はベクターの切断に、アルカリ性ホスファ
ターゼを用いる末端５′−リン酸基の加水分解（脱リン
酸化）を続けることができる。例中で、５′−末端の脱
リン酸化を行なう場合、これらは、自体公知の方法で行
なった。脱リン酸化の実施及びそれに必要な試薬に関す
る他の記載は、マニアティス(Maniatis)等（１３３〜１
３４頁）を引用することができる。

【００３５】部分的な加水分解とは、制限エンドヌクレ
アーゼによるＤＮＡの不完全な消化を意味する。その
際、反応条件は、ＤＮＡ−基質において、数個の、しか
しながら全てではない、使用した制限エンドヌクレアー
ゼのための認識部位において切断されるように選択す
る。

【００３６】例えば、制限エンドヌクレアーゼでのＤＮ
Ａの処理後に、一定のＤＮＡ−断片を入手及び単離する
ために、生じたＤＮＡ−断片を、自体公知の方法で、ゲ
ル電気泳動（例えばアガロースゲル上で）により分離
し、次いで、分子量に関して（公知の分子量を有する対
照標準−ＤＮＡ−断片との比較により測定）同定し、か
つ望ましいＤＮＡ−断片を、相当するゲル域から分離し
た。

【００３７】連結反応は、自体公知の条件下で、例えば
連結すべきＤＮＡ−断片０．５μｇ当たりＴ４−ＤＮＡ
−リガーゼ約１０単位有する緩衝液中で実施することが
できる（例えば、Maniatis et al.１４６頁参照）。

【００３８】微生物中へのＤＮＡの取り込みが形質転換
と理解されているので、従って、ＤＮＡは、微生物中で
複製もしくは表現されうる。バチルス種に関しては、例
えばアナゴノストポルス(Anagnostopolous)等(1961、J.B
acteriol.81:746-791)による方法が適当である。

【００３９】次の例中で、酵素安定性の記載の際に、次
のものを意味する：「完全に安定」は、残留活性少なく
とも９０％、「安定」は、残留活性少なくとも８０％。

【００４０】ここで使用した例１及び明細書中に記載の
バチルス・プミルス株を、自然界から単離し、かつドイ
ツ微生物寄託局（ＤＳＭ）において、番号ＤＳＭ５７７
７で１９９０年２月７日に寄託した。例３中に記載した
プラスミドｐＰＰ４６で形質転換されたＢ．ズブチリス
ＰＳＬ１株を、番号ＤＳＭ６８７９で、かつ例３中に記
載したプラスミドｐＰＰ４１５で形質転換されたＢ．ズ
ブチリスＰＳＬ１株を、番号ＤＳＭ６８８０で、ドイツ
微生物寄託局において、１９９２年１月２２日に寄託し
た。使用した他の微生物、例えばバチルス・スブティル
スＰＳＬ１（バチルス・ジェネティック・ストック・セ
ンター(Bacillus Genetic Stock Center)１Ａ５１０）
又はバチルスＢＤ３６６（バチルス・ジェネティック・
ストック・センター１Ｅ６）は、市販で入手することが
できる。

【００４１】図に関する説明：図１及び図２：バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７から
の、プロテアーゼＰ４６（図１）及びＰ４１５（図２）
の至適温度。

【００４２】図３及び図４：バチルス・プミルスＤＳＭ
５７７７からの、プロテアーゼＰ４６（図３）及びＰ４
１５（図４）の温度安定性。

【００４３】図５及び図６：バチルス・プミルスＤＳＭ
５７７７からの、プロテアーゼＰ４６（図５）及びＰ４
１５（図６）の至適ｐＨ。

【００４４】図７及び図８：バチルス・プミルスＤＳＭ
５７７７からの、プロテアーゼＰ４６（図７）及びＰ４
１５（図８）のｐＨ安定性。ｐＨ値を調節するために、
ｐＨ範囲ｐＨ５〜ｐＨ７のために０．１Ｍリン酸緩衝
液、ｐＨ範囲ｐＨ７〜ｐＨ９のために０．１Ｍトリス−
ＨＣｌ−緩衝液及びｐＨ範囲ｐＨ９〜ｐＨ１２．１のた
めに０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ−緩衝液を使用した。

【００４５】図９：酵素用量に依存する、試験織物Ｍ−
ＰＣでのプロテアーゼＰ４１５の洗浄作用（デルタＲ＝
反射差）。

【００４６】図１０：酵素用量に依存する、試験織物Ｅ
Ｙ−ＰＣでのプロテアーゼＰ４１５の洗浄作用（デルタ
Ｒ＝反射差）。

【００４７】図１１：酵素用量に依存する、試験織物で
のプロテアーゼＰ４１５の洗浄作用（デルタＲ＝反射
差）。

【００４８】例１自然界からのバチルス・プミルスの単離及びその同定バチルス・プミルス株を自然界から単離し、ドイツ微生
物寄託局において番号ＤＳＭ５７７７で寄託した。

【００４９】これは、バチルス属のグラム陽性の、胞子
形成好気性微生物である。細胞−及びコロニー形態の記
載を次に示し、生化学反応及び一定の生育条件での反応
を表１中に記載した。

【００５０】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７：丸ま
った角を有する棒状バクテリア。グラム反応（グラム染
色、ＫＯＨ−試験）は、陽性である。ＴＹ−寒天（後記
参照）上で、コロニーは、３７℃で２日後に、直径３．
２〜４．２ｍｍを有し、染色されていて、かつ平らから
波形までの縁を有する。しばしば、コロニー上に、小滴
形成(Troepfchenbildung)も認められる；コロニーは、
光沢性か、又は乾燥してしわが多い。細胞は、ＴＹ−寒
天上で、０．８〜０．９μｍ×１．２〜２．８μｍの大
きさを有し、かつ一般的に単独細胞として、又は２又は
３個連鎖して存在している。胞子は、卵型であり、中央
からサブターミナル(subterminal)までにある。株は、
進んで胞子形成を行なう。

【００５１】ＴＹ−寒天：酵母抽出物５ｇＭｇＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏ８．７５ｇＭｎＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ０．０１６ｇ寒天１６ｇ２回蒸留水１０００ｍｌまでｐＨ７．０±０．３。

【００５２】第１表中で記載した試験(Bergeys Manual
of Systematic Bacteriology,Vol.2,1121-1125,P.H.A.S
neath,ed.,Williams及びWilins、バルチモア−ロンドン
−ロスアンジェルス−シドニー、1986)の実施後に分か
った結果に基づいて、バチルス・プミルス種に分類する
ことができる。単離したＤＳＭ５７７７株は、少ない特
徴（フォゲス−プロスカウエル試験、Ｖ−Ｐ−培養液の
ｐＨ及び卵黄レシチナーゼの形成並びに７％ＮａＣｌで
の生育に関して）においてのみ、そこでバチルス・プミ
ルスに関して記載した符号と異なっている。

【００５３】バチルス・プミルスは、広分布に存在する
生物であり、これは、培地上で種々の様相を有するコロ
ニーを形成する。

【００５４】第１表＊バチルス特徴 DSM5777 フ゜ミルス ────────────────────────────────── 細胞直径＞１μｍ − − 胞子形丸い − − 胞子嚢膨張した − − 副胞子(Parasporale)結晶 − − カタラーゼ＋＋嫌気的生育 − − フォゲス−プロスカウエル試験 − ＋Ｖ−Ｐ培養液のｐＨ＜６＋＞７＋グルコース上での酸形成＋＋Ｌ−アラビノース上での酸形成＋＋Ｄ−キシロース上での酸形成＋＋Ｄ−マンニトール上での酸形成＋＋グルコースとのガス形成 − − カゼインの加水分解＋＋ゼラチンの加水分解＋＋デンプンの加水分解 − − クエン酸塩の代謝＋＋プロピオン酸塩の代謝 − − チロシンの分解 − − フェニルアラニンの脱アミン化 − − 卵黄−レシチナーゼ＋ − 亜硝酸塩への硝酸塩還元 − − インドールの形成 − − ジヒドロキシアセトンの形成 − n.b. ＮａＣｌ−及びＫＣｌ−必要性 n.b. − アラントイン−又はウレエート−必要性 n.b. − ＮＢ中ｐＨ６．８で生育＋＋ＮＢ中ｐＨ５．７で生育＋＋ＮａＣｌ中での生育２％ n.b. ＋５％＋＋７％ − ＋１０％ − n.b. ５℃での生育 n.b. − １０℃での生育 n.b. ＋３０℃での生育＋＋４０℃での生育 n.b. ＋５０℃での生育 n.b. ｄ５５℃での生育 n.b. − ６５℃での生育 n.b. − リゾチームの存在下での生育＋ｄＨ₂＋ＣＯ₂又はＣＯでの独立栄養生物 n.b. − ＊ベルゲイズマニュアル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic B
acteriology,Vol.2,1123頁，P.H.A.Sneath,ed.,Willoam
us及びWilkins,バルチモア−ロンドン−ロスアンジェル
ス−シドニー，1986）によるＢ．プミルスの記載＋９０％以上肯定的 − ９０％以上否定的ｄ１１〜８９％肯定的ｎ．ｂ．未測定ＮＢ肉汁培養液例２プラスミドｐＵＢ１３１の製造バチルス・ズブチリスＢＤ３６６（ｐＵＢ１１０）株
（バチルス・ジェネティック・ストック・センター１Ｅ
６）から、Ｔ．Ｊ．グリクザン(Gryczan)等(1978,J.Bac
teriol.34:318-329)の方法により、プラスミドｐＵＢ１
１０を単離し、かつ引き続きマニアティス(Maniatis)等
（９３頁）により、セシウムクロリド−密度勾配遠心分
離により精製した。ベクターｐＵＢ１１０は、制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩのための１回
のみ生じる制限部位のみを含有し、マーカーとして、ネ
オマイシンに対する抗生物質耐性を暗号化するＤＮＡ−
配列を含有し、並びに複製のためにバチルス種で必要な
ＤＮＡ−配列（複製起点(origin of replication)）を
含有する。

【００５５】前記の得られたプラスミドｐＵＢ１１０
を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを用いて制限し、その
際、大きい断片と小さい断片が得られた。小さな断片７
９０ｂｐ（ｂｐ＝塩基対）を、ＥｃｏＲＩ／Ｂｇ１ＩＩ
−断片としてベクターＭ１３ｔｇ１３１から予め単離し
ておいた６７ｂｐの大きさのポリリンカーに変えた。従
って、こうして得られた呼称ｐＵＢ１３１を有するベク
ターは、約０．８ｋＢの大きさのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉ−断片を欠失し、かつポリクローニング部位を形成し
たｐＵＢ１１０の誘導体である。

【００５６】例３バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのアルカリ性プ
ロテアーゼＰ４６及びＰ４１５のクローニング例１の自然界単離物バチルス・プミルスＤＳＭ５７７
７から、サイトー(Saito)等の方法(1963、Biochim.Bioph
ys.Acta.72,619-629頁）により、染色体ＤＮＡを単離
し、かつ制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いて部
分的に加水分解した。制限断片を、電気泳動により、ア
ガロースゲル上で分離し、かつ３〜８ｋＢ（ｋＢ＝キロ
ベース）の大きさを有する断片を単離した。

【００５７】バチルスＤＳＭ５７７７からの単離したＤ
ＮＡ−断片を、プラスミドｐＵＢ１３１（例２中に記載
したようにして製造）のベクターＤＮＡと、イン・ビト
ロで新たに組合わせた。

【００５８】ここで、プラスミドｐＵＢ１３１を、先
ず、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用いて制限
し、かつ引き続き、子牛の腸からのアルカリ性ホスファ
ターゼを用いて脱リン酸化した。引き続き、制限及び脱
リン酸化したベクター−ＤＮＡ４μｍを、バチルスＤＳ
Ｍ５７７７からのＤＮＡ−断片２０μｇと共に、全量で
２００μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ中で、１６℃で２４
時間インキュベートした。

【００５９】イン・ビトロで新たに組合わされたＤＮＡ
を用いて、バチルス・ズブチリスＰＳＬ１（バチルス・
ジェネティック・ストック・センター１Ａ５１０）株の
プロトプラストを、チャン(S.Chang)及びコエン(N.Cohe
n)(1979,Mol.Gen.Genet.168,111-115頁)により記載され
た方法により形質転換された。形質転換細胞をネオマイ
シンを有する板上で選択し、かつ引き続き、スキムミル
ク寒天板上に移した。約１０００００の得られた

【００６０】

【外１】

【００６１】下に、それぞれのコロニーの周りのはっき
りとした暈(Hoefe)に基づいて、強化されたプロテアー
ゼ分泌体として同定することができる、数個のクローン
が見つかった。

【００６２】これらのクローンを、ネオマイシン１０μ
ｇ／ｍｌを有するＴＹ−培地（トリプトン１０ｇ、酵母
抽出物５ｇ、ＭｇＣｌ₂×２Ｈ₂Ｏ４．１ｍｇ及びＭｎＣ
ｌ₂×２Ｈ₂Ｏ１６ｍｇ、２回蒸留水１０００ｍｌまで）
中で２４時間培養した。培養液上澄中のプロテアーゼ
を、ＨＰＬＣ−カラム−ウルトロパーク(Ultropak)TSK
CM-2SW、２５０×４．６ｍｍ（ＬＫＢ社）上で分離し、
かつＵＶ−光線（２８０ｎｍ）を用いて検出した。連結
したフローインジェクション分析(Fliessinjektionsana
lyse)（基質：アセチルカゼイン；検出試薬：トリニト
ロベンゼンスルホン酸；４２０ｎｍで検出）は、タンパ
ク質分解活性を有するピークが他のタンパク質ピークと
は異なる可能性を与えた。宿主固有のプロテアーゼのみ
を強化して分泌するクローンの他に、宿主固有プロテア
ーゼの他に宿主以外のプロテアーゼも分泌するクローン
が見つかった。溶離時間に関連して、２種の異なる宿主
以外のプロテアーゼが同定され、これに、呼称Ｐ４６及
びＰ４１５を与えた。バチルス・プミルスＤＳＭ５７７
７の培養液上澄中で見つけられるプロテアーゼを分泌
し、かつ従って、このプロテアーゼの遺伝情報を含有す
るこれらのクローンからのプラスミドに、呼称ｐＰＰ４
６もしくはｐＰＰ４１５を与えた。プラスミドｐＰＰ４
６は、７．６ｋＢの大きさを有し、かつプラスミドｐＰ
Ｐ４１５は、６．２ｋＢの大きさを有する。プラスミド
ｐＰＰ４６を用いて形質転換されたＢ．ズブチリスＰＳ
Ｌ１株を、１９９２年１月２３日に、ドイツ微生物寄託
局において、番号ＤＳＭ６８７９で寄託した。プラスミ
ドｐＰＰ４１５で形質転換されたＢ．ズブチリスＰＳＬ
１株を、１９９２年１月２３日に、ドイツ微生物寄託局
において、番号ＤＳＭ６８８０で寄託した。

【００６３】例４Ｂ．プミルスＤＳＭ５７７７からのアルカリ性プロテア
ーゼＰ４６及びＰ４１５の製造プラスミドｐＰＰ４６及びｐＰＰ４１５を、例３からの
Ｂ．ズブチリスＰＳＬ１（ｐＰＰ４６）及びＢ．ズブチ
リスＰＳＬ１（ｐＰＰ４１５）クローンから単離し、か
つドナー株Ｂ．プミルスＤＳＭ５７７７中に取り込ん
だ。形質変換を、プロトプラスト形質転換として、チャ
ン及びコエン（例３参照）の方法により行なった。引き
続き、５００ｍｌ振盪フラスコ中の前培養液（トリプト
ン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、ネオマイシ
ン１０ｍｇ、２回蒸留水１０００ｍｌまで）４０ｍｌ
に、Ｂ．プミルスＤＳＭ５７７７株（ｐＰＰ４６）又は
Ｂ．プミルスＤＳＭ５７７７株（ｐＰＰ４１５）の単独
コロニーを、寒天板から接種した。培養液を、３７℃で
１６時間及び２５０Ｕｐｍでインキュベートした。この
培養液１ｍｌを、５００ｍｌ振盪フラスコ中の主要培養
液（大豆粉末４０ｇ、ジャガイモ澱粉９０ｇ、ＮａＳＯ
₄１．５ｇ、ＭｎＣｌ₂３．５ｍｌ、ネオマイシン１０ｍ
ｇ及び２回蒸留水１０００ｍｌまで）４０ｍｌに接種し
た。主要培養液を、前培養液とその他は同じ条件下で、
３０時間及び３２０Ｕｐｍでインキュベートし、かつ３
０時間遠心分離した。

【００６４】上澄から、アルカリ性プロテアーゼを、Ｆ
ＰＬＣ（ＣＭセファロースＦＦ(Pharmacia)溶離緩衝液
０．０５ＭＮａ−酢酸塩ｐＨ６及び０．８ＭＮａ−
酢酸塩ｐＨ６）で精製するか、又は培養液上澄を、他の
実験のために直接使用することができる。

【００６５】例５バチルス・プミルスプロテアーゼの酵素特性の測定プロテアーゼの活性を、デルフト単位（ＤＵ）で測定し
た。１０００ＤＵは、２％（ｗ／ｗ）の酵素溶液１ｍｌ
の容量で、カゼインの分解により、０．４０００の吸光
差（１ｃｍ光路；２７５ｎｍ；空試料試験に対して測
定）を生じるタンパク質分解活性である。

【００６６】酵素特性、例えば至適温度、温度安定性、
至適ｐＨ及びｐＨ安定性を測定するために、例４中で、
バチルス・プミルス株ＤＳＭ５７７７（ｐＰＰ４６）及
びＤＳＭ５７７７（ｐＰＰ４１５）の培養により得られ
た培養液上澄を使用した。

【００６７】培養液上澄中に含有されるプロテアーゼの
至適温度を、４０〜７３℃の範囲内で測定した。結果
を、第２表並びに図１もしくは図２中に示す。

【００６８】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４６）からのプロテアーゼＰ４６の至適温度は、６０
℃（図１）である。

【００６９】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４１５）からのプロテアーゼＰ４１５の至適温度は、
５０℃（図２）である。

【００７０】第２表バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰＰ４６）及びＤＳＭ５７７７（ｐＰＰ４１５）からのアルカリ性プロテアーゼの至適温度アルカリ性プロテアーゼ温度（℃）に依存する活性（％）４０℃ ５０℃ ６０℃ ６５℃ ７３℃ ──────────────────────────────────── Ｐ４６ 34% 59% 100% 50% 16% Ｐ４１５ 56% 100% 45% 32% 10% 温度安定性を測定するために、プロテアーゼ含有上澄
を、種々異なる温度で１５分間インキュベートし、かつ
引き続き、残留活性を測定した。結果を、第３表並びに
図３及び図４中に記載する。

【００７１】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４６）からのプロテアーゼＰ４６は、５０℃まで安定
性（残留活性＞９０％）であり、５５℃で１５分間イン
キュベート後に更に５７．３％の残留活性を示す（図
３）。

【００７２】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４１５）からのプロテアーゼＰ４１５は、４５℃まで
安定性（残留活性＞９０％）であり、かつ５０℃で１５
分インキュベート後に更に７６．４％の残留活性を示す
（図４）。

【００７３】第３表温度種々の温度で１５分間インキュベート後［℃］のタンパク質分解残留活性（％）Ｐ４６Ｐ４１５ ──────────────────────────────────── ２０１００１００３０１００１００４０１００１００４５１００９６．９５０９０．９７６．４５５５７．３１．９６０２．３＜０．２６５＜０．２＜０．２バアチルス−プロテアーゼの至適ｐＨを測定するため
に、活性を種々異なるｐＨ値で測定した。ｐＨ値の測定
のために、ｐＨ範囲５〜７のホスフェート−（０．１
Ｍ）、のｐＨ範囲７．０〜９．０のトリス−ＨＣｌ−
（０．１Ｍ）及びｐＨ範囲９．０〜１３．０のグリシン
−ＮａＯＨ−緩衝液（０．１Ｍ）を使用した。活性測定
値を、第４表及び図５及び６中に記載する。

【００７４】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４６）からのアルカリ性プロテアーゼＰ４６の至適ｐ
Ｈは、ｐＨ１０．９である。ｐＨ１２．５で、活性は、
なおも＞８０％である（図５）。

【００７５】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４１５）からのアルカリ性プロテアーゼＰ４１５の至
適ｐＨは、ｐＨ８．６である（図６）。

【００７６】第４表アルカリ性プロテアーゼｐＨ値に依存するプロテアーゼ活性（％）ｐＨ 5.0 5.8 6.8 7.2 8.6 9.8 10.6 10.9 12.5 ──────────────────────────────────── Ｐ４６ 0 14 36 41 72 82 95 100 81 Ｐ４１５ 2 16 79 87 100 81 65 50 10 ｐＨ安定性を調べるために、プロテアーゼを種々異なる
ｐＨ値の緩衝液中で、４℃で２４時間インキュベートし
た。引き続き、プロテアーゼの残留活性を測定した。５
〜７．１のｐＨ範囲ためには、ホスフェート−緩衝液
（０．１Ｍ）、７．１〜９のｐＨ範囲のためには、トリ
ス−ＨＣｌ−緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−緩衝液）（０．１Ｍ）、９〜１２．１のｐＨ
範囲ためには、グリシン／ナトリウムヒドロキシド−緩
衝液（０．１Ｍ）を使用した。結果を図７及び図８中に
示す。

【００７７】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４６）からのプロテアーゼＰ４６は、ｐＨ５．８〜
９．７の間で十分に、かつｐＨ９．７〜１０．８の間で
完全に安定であり；１２．０６で２４時間後に、なおも
３４％の残留活性が認められる（図７）。

【００７８】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７（ｐＰ
Ｐ４１５）からのプロテアーゼＰ４１５は、ｐＨ５．８
〜１０．４の間で完全に、かつｐＨ１０．４〜１０．８
の間で十分に安定である（図８）。

【００７９】例６プロテアーゼＰ４６の洗浄能力本発明のプロテアーゼＰ４６の作用を洗浄実験で測定し
た。

【００８０】例６ａ洗剤中の添加物として使用するために、本発明によるプ
ロテアーゼの洗浄能力を、試験織物ＥＹ−ＰＣ（ポリエ
ステル−綿−混合織物（固有の製造）上の卵黄／水彩絵
の具(Tusche)−汚れ）に関して、実験室用洗浄機（ポリ
カラー(Polycolor)型）中での洗浄実験により測定し
た。ここで、試験織物を、ゼオライト１８．４％、Ｎａ
₂ＣＯ₃７．３％、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩
４．８％、非イオン活性剤３．３％、石鹸３．３％、泡
止め剤０．１％、カルボキシメチルセルロース１．５
％、光学的明化剤０．１５％、ケイ酸二ナトリウム３．
５％、過ホウ酸塩２５％、ＴＡＥＤ１．５％及びＮａ₂
ＳＯ₄３０．８５％を含有する洗剤基礎処方物６ｇ／ｌ
と共に、本発明のプロテアーゼ（５０００ＤＵ／ｌ）の
添加後に、１５゜ｄＨの水を用いて洗浄した。洗浄液の
ｐＨ値は、ｐＨ１０．３であった。洗浄を、１５℃〜６
０℃の温度範囲で４５分間（２℃／ｍｉｎ；滞留時間２
２．５時間）洗浄した。

【００８１】酵素含有洗剤溶液は、水浴に関して、温度
プログラムに応じて調節した回転する試料容器中で、試
験織物に作用した。洗浄工程により、試験織物を水道水
で２回すすぎ、かつ引き続き、アイロン掛けした。

【００８２】洗浄作用を、洗浄した試験織物の反射を測
かることにより測定した。酵素により惹起される洗浄作
用は、酵素含有洗剤で洗浄した試験織物の高い反射力か
ら明らかになる。洗剤基礎処方物のみで洗浄した試験織
物においては、試験織物の反射に関して、４１の値が測
定された。洗剤基礎処方物へ本発明のプロテアーゼＰ４
６を添加する際には、試験織物の反射に関して、４５を
有する、明らかに高い値が測定された。

【００８３】例６ｂ本発明によるプロテアーゼＰ４６の洗浄作用の試験を例
６ａに記載したのと同様にして実施した。洗剤基礎処方
物は、市販の粉末全温度洗剤（ｐＨ１０．４）であっ
た。洗剤基礎処方物のための試験織物の反射の測定は、
４１の値を生じた。洗剤基礎処方物へ本発明のプロテア
ーゼＰ４６を添加する際には、４８の値を有する、試験
織物の明らかに高い反射が測定された。

【００８４】例６ｃ本発明の洗浄作用の試験を、例６ｂに記載したのと同様
にして実施した。しかしながら、試験織物として、血
液、牛乳及び水彩絵の具で汚したポリエステル−綿−混
合織物（ＥＭＰＡ１１７−連盟材料試験施設(Eidgenoes
sischen Materialpruefungsanstalt)、ST.Gallen、スイ
スから入手）を使用した。洗剤基礎処方物として、市販
の液体洗剤（ｐＨ７．５）４ｇ／ｌを使用した。温度範
囲１５〜４０℃で洗浄した（２℃／ｍｉｎ；滞留時間２
２．５ｍｉｎ）。

【００８５】本発明のプロテアーゼＰ４６の添加なしで
は、試験織物の反射に関して、５０の値、本発明のプロ
テアーゼＰ４６の添加時には、試験織物の反射に関し
て、６２の値が測定された。

【００８６】例６ｄ本発明のプロテアーゼＰ４６の洗浄作用の試験を、例６
ｃ中に記載したのと同様にして実施した。しかしなが
ら、試験織物として、卵黄及び水彩絵の具で汚したポリ
エステル−綿−混合織物を使用した。

【００８７】プロテアーゼＰ４６の添加なしでは、４１
の洗浄した試験織物の反射値が、洗剤基礎処方物への本
発明のプロテアーゼＰ４６の添加の際には、４５の値が
測定された。

【００８８】例６ｅ本発明のプロテアーゼＰ４６の洗浄作用の試験を、例６
ｄ中に記載したのと同様にして実施した。しかしなが
ら、試験織物として、牛乳及び水彩絵の具で汚したポリ
エステル−綿−混合織物を使用した。

【００８９】プロテアーゼＰ４６の添加なしでは、洗浄
した試験織物の反射に関して、４５の値が、洗剤基礎処
方物への本発明のプロテアーゼＰ４６の添加時には、５
２の値が測定された。

【００９０】例６ａ〜６ｅの結果は、本発明のプロテア
ーゼＰ４６の優れた洗浄能力を証明する。洗浄試験織物
の反射能は、洗剤基礎処方物への本発明のプロテアーゼ
の添加時に、明らかにより高く、このことが本発明のプ
ロテアーゼＰ４６の良好な洗浄能力の証拠である。

【００９１】例７プロテアーゼＰ４１５の洗浄能力本発明のプロテアーゼＰ４１５の洗浄作用の試験を、プ
ロテアーゼＰ４６に関して例６に記載したのと同様にし
て実施した。

【００９２】例７ａ２種の異なる試験織物（Ｍ−ＰＣ＝ポリエステル−綿−
混合織物上の牛乳／水彩絵の具−汚れ；ＥＹ−ＰＣ＝ポ
リエステル−綿−混合織物上の卵黄／水彩絵の具−汚
れ）上での酵素用量（ＤＵ／ｍｌ）に依存する洗浄作用
を試験した。洗剤基礎処方物として、市販のヨーロッパ
製液体洗剤を使用した。洗浄した試験織物の反射の測定
を、例６中に記載したようにして行なった。洗浄試験の
結果を、図９（Ｍ−ＰＣ）及び図１０（ＥＹ−ＰＣ）中
に示し、図中、プロテアーゼＰ４１５の添加なしで洗浄
した試験織物に対する本発明のプロテアーゼＰ４１５の
添加下で洗浄した試験織物の反射差を、酵素用量に依存
してプロットした。

【００９３】例７ｂ本発明のプロテアーゼＰ４１５の洗浄作用の試験を、例
７ａ中に記載したのと同様にして実施した。しかしなが
ら、洗剤基礎処方物として、市販のヨーロッパ製コンパ
クト洗剤（ｐＨ１０．３）を使用した。用量は、３ｇ／
ｌであった。洗浄試験の結果を、図１１中に反射差とし
て、酵素用量に依存して示す。

【００９４】例７ａ及び７ｂの結果は、本発明のプロテ
アーゼＰ４１５の優れた洗浄作用を示す。この際、非常
に僅かな用量でも、非常に良好な洗浄能力でありうる。
異なる種類のタンパク質汚れは、プロテアーゼＰ４１５
により、洗浄工程で、織物から有利に除去される。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４６の至適温度を示す。

【図２】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４１５の至適温度を示す。

【図３】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４６の温度安定性を示す。

【図４】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４１５の温度安定性を示す。

【図５】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４６の至適ｐＨを示す。

【図６】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４１５の至適ｐＨを示す。

【図７】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４６のｐＨ安定性を示す。

【図８】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７からのプロ
テアーゼＰ４１５のｐＨ安定性を示す。

【図９】試験織物Ｍ−ＰＣ（Ｍ−ＰＣ＝ポリエステル−
綿−混合織物上の牛乳／水彩絵の具−汚れ）での、ヨー
ロッパ製液体洗剤におけるプロテアーゼＰ４１５の洗浄
作用を、プロテアーゼＰ４１５の添加なしで洗浄した試
験織物に対する反射差（デルタＲ）として、酵素用量に
依存して示す。

【図１０】試験織物ＥＹ−ＰＣ（ＥＹ−ＰＣ＝ポリエス
テル−綿−混合織物上の卵黄／水彩絵の具−汚れ）で
の、ヨーロッパ製液体洗剤におけるプロテアーゼＰ４１
５の洗浄作用を、プロテアーゼＰ４１５の添加なしで洗
浄した試験織物に対する反射差（デルタＲ）として、酵
素用量に依存して示す。

【図１１】試験織物Ｍ−ＰＣ及びＥＹ−ＰＣでの、ヨー
ロッパ製コンパクト洗剤におけるプロテアーゼＰ４１５
の洗浄作用（デルタＲ＝反射差）を、酵素用量に依存し
て示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者デトレフヴィルケドイツ連邦共和国ヴェニヒゼンラントヴェール６ (72)発明者ベルンハルトメーラードイツ連邦共和国ハノーヴァー 61 リューネブルガーダム 28 (72)発明者マルティナミュラードイツ連邦共和国ハノーヴァー１ローンシュトラーセ 20 (72)発明者インゴミュッケドイツ連邦共和国バルシングハウゼンクニックシュトラーセ 63 アー (72)発明者マイケターケンベルクドイツ連邦共和国ハノーヴァー 81 ブランデンシュタインシュトラーセ 36 ベー (72)発明者ゲルハルトコニーツニー−ヤンダドイツ連邦共和国パテンゼンシェーネベルガーシュトラーセ 23

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７又は
このプロテアーゼに関する遺伝情報を有する形質転換さ
れた微生物を培養することにより得られる、約ｐＨ８．
０〜１１．５のｐＨ範囲に至適ｐＨを有し、かつ約５０
〜６０℃の範囲に至適温度を有する、アルカリ性バチル
ス−プロテアーゼ。
【請求項２】次の特性を有する、請求項１記載のアル
カリ性バチルス−プロテアーゼ；（１）作用：タンパク質及びペプチドの分解（２）至適ｐＨ：ｐＨ値約１０．５〜１１．０（３）ｐＨ安定性：ｐＨ値９．７〜１０．８で、酵素
は、完全に安定であることが明らかである（４）至適温度：約６０℃ （５）温度安定性：４５℃までの温度で１５分間プロテ
アーゼをインキュベートすることにより、プロテアーゼ
は実質的にその活性において影響を受けず；５０℃で１
５分間インキュベート後に、プロテアーゼの残留活性
は、少なくとも９０％である。
【請求項３】次の特性を有する、請求項１記載のアル
カリ性バチルス−プロテアーゼ；（１）作用：タンパク質及びペプチドの分解（２）至適ｐＨ：ｐＨ値約８．５〜９（３）ｐＨ安定性：ｐＨ値５．５〜１０．５で、酵素
は、完全に安定であることが明らかである（４）至適温度：約５０℃ （５）温度安定性：４０℃までの温度で１５分間プロテ
アーゼをインキュベートすることにより、プロテアーゼ
は実質的にその活性において影響を受けず；４５℃で１
５分間インキュベート後に、プロテアーゼの残留活性
は、少なくとも９５％である。
【請求項４】請求項１から３までのいずれか１項記載
のアルカリ性バチルス−プロテアーゼを含有する、洗
浄、清浄又は食器洗浄用の組成物。
【請求項５】アルカリ性バチルス−プロテアーゼを、
洗剤及び清浄剤中で慣例のプロテアーゼ、リパーゼ、ペ
クチナーゼ、アミラーゼ、ヌクレアーゼ、オキシドレダ
クターゼ及びセルラーゼの群からの酵素１種以上の存在
下で含有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】アルカリ性バチルス−プロテアーゼを、
第２のプロテアーゼの存在下で含有する、請求項５記載
の組成物。
【請求項７】請求項１から３までのいずれか１項記載
のアルカリ性バチルス−プロテアーゼ２個からの組合せ
を含有する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】請求項２記載のアルカリ性バチルス−プ
ロテアーゼと請求項３記載のアルカリ性バチルス−プロ
テアーゼとからの組合せを含有する、請求項６記載の組
成物。
【請求項９】アルカリ性バチルス−プロテアーゼを、
約６０℃までの低い使用温度用の処方物の形で含有す
る、請求項４から８までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】請求項１から３までのいずれか１項記
載のアルカリ性バチルス−プロテアーゼの製法におい
て、バチルス・プミルスＤＳＭ５７７７又は請求項１か
ら３のいずれか１項記載のプロテアーゼを含有する微生
物を培養し、かつ次いで、培養液上澄から、形成された
アルカリ性プロテアーゼを単離することを特徴とする、
アルカリ性バチルス−プロテアーゼの製法。
【請求項１１】微生物として、バチルス・ズブチルス
又はバチルス・アルカロフィルス又はバチルス・リヘニ
ホルミス又はバチルス・アミロリケファシエンス又はバ
チスル・プミルスを使用する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】遺伝情報を発現ベクター中に含有する
微生物を使用する、請求項１１項記載の方法。
【請求項１３】発現ベクターは、番号ＤＳＭ６８７９
で寄託した微生物又は番号ＤＳＭ６８８０で寄託した微
生物から単離可能なプラスミドである、請求項１２記載
の方法。
【請求項１４】番号ＤＳＭ６８７９及び番号ＤＳＭ６
８８０で寄託した微生物。
【請求項１５】番号ＤＳＭ６８７９で寄託した微生物
から単離可能な、請求項２記載のプロテアーゼに関する
遺伝情報を有するプラスミド。
【請求項１６】番号ＤＳＭ６８８０で寄託した微生物
から単離可能な、請求項３記載のプロテアーゼに関する
遺伝情報を有するプラスミド。