JPH06217774A - 新規アルギン酸分解酵素、その製造方法およびこれを用いたポリマンヌロン酸の製造方法 - Google Patents
新規アルギン酸分解酵素、その製造方法およびこれを用いたポリマンヌロン酸の製造方法Info
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- JPH06217774A JPH06217774A JP5036889A JP3688993A JPH06217774A JP H06217774 A JPH06217774 A JP H06217774A JP 5036889 A JP5036889 A JP 5036889A JP 3688993 A JP3688993 A JP 3688993A JP H06217774 A JPH06217774 A JP H06217774A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、アルギン酸を分解する新規な酵素を
提供することを目的とする。 【構成】本発明の３種類の酵素は、１）アルギン酸分子
中のポリＧおよびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分
を切断せず、反応の至適ｐＨが7.5〜8.0の範囲であり、
ｐＨ５〜９で安定である、２）ポリＧ、ポリＭＧおよび
ポリＭ部分のいずれをも切断し、反応の至適ｐＨが6.5
であり、ｐＨ５〜９で安定である、および３）ポリＧお
よびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分を切断せず、
反応の至適ｐＨが8.0であり、ｐＨ４〜９で安定であ
る、ことをそれぞれ特徴とする。本発明はまた、これら
の酵素の精製方法およびこれらの酵素を用いてアルギン
酸からポリマンヌロン酸を製造する方法を提供する。
提供することを目的とする。 【構成】本発明の３種類の酵素は、１）アルギン酸分子
中のポリＧおよびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分
を切断せず、反応の至適ｐＨが7.5〜8.0の範囲であり、
ｐＨ５〜９で安定である、２）ポリＧ、ポリＭＧおよび
ポリＭ部分のいずれをも切断し、反応の至適ｐＨが6.5
であり、ｐＨ５〜９で安定である、および３）ポリＧお
よびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分を切断せず、
反応の至適ｐＨが8.0であり、ｐＨ４〜９で安定であ
る、ことをそれぞれ特徴とする。本発明はまた、これら
の酵素の精製方法およびこれらの酵素を用いてアルギン
酸からポリマンヌロン酸を製造する方法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アルギン酸分解酵素の
粗酵素標品から単離された新規アルギン酸分解酵素、お
よびその単離方法に関する。さらに本発明は、このアル
ギン酸分解酵素を用いてアルギン酸からポリマンヌロン
酸を製造する方法に関する。
粗酵素標品から単離された新規アルギン酸分解酵素、お
よびその単離方法に関する。さらに本発明は、このアル
ギン酸分解酵素を用いてアルギン酸からポリマンヌロン
酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルギン酸は、食品工業、化粧品、染
色、繊維、水処理などに広く利用されており、さらに、
その分解物に植物の生長促進や、人体の腸内における有
用細菌であるビフィズス菌の増殖活性等の生理活性を有
することが明らかにされている（特開昭６３−２１４１
２０）。近年、自然界に見いだされる多糖類の分解物に
様々な生理活性のあることが発見されており、例えば、
キチン、キトサン等の分解物およびペクチンの分解物に
抗菌活性のあることが認められている。したがって、ア
ルギン酸の分解生成物にもさらに有用な生理活性を持つ
化合物が含まれることが期待されており、アルギン酸の
オリゴ糖および食物繊維としての利用の研究開発も盛ん
に行われている（特開平２−３０３４６８、特開平２−
３１２５４２）。
色、繊維、水処理などに広く利用されており、さらに、
その分解物に植物の生長促進や、人体の腸内における有
用細菌であるビフィズス菌の増殖活性等の生理活性を有
することが明らかにされている（特開昭６３−２１４１
２０）。近年、自然界に見いだされる多糖類の分解物に
様々な生理活性のあることが発見されており、例えば、
キチン、キトサン等の分解物およびペクチンの分解物に
抗菌活性のあることが認められている。したがって、ア
ルギン酸の分解生成物にもさらに有用な生理活性を持つ
化合物が含まれることが期待されており、アルギン酸の
オリゴ糖および食物繊維としての利用の研究開発も盛ん
に行われている（特開平２−３０３４６８、特開平２−
３１２５４２）。
【０００３】アルギン酸はグルロン酸およびマンヌロン
酸が−1,4−結合したポリマーであり、ポリグルロン酸
（以下ポリＧという）、ポリマンヌロン酸（以下ポリＭ
という）、グルロン酸マンヌロン酸交互に連なるポリマ
ー（以下ポリＭＧという）の３つのブロックからなる共
重合体である。
酸が−1,4−結合したポリマーであり、ポリグルロン酸
（以下ポリＧという）、ポリマンヌロン酸（以下ポリＭ
という）、グルロン酸マンヌロン酸交互に連なるポリマ
ー（以下ポリＭＧという）の３つのブロックからなる共
重合体である。
【０００４】アルギン酸類は一般に高粘度で難分解性で
あるため、これらの用途に用いる場合、あるいはその後
処理や廃液処理に際し、アルギン酸類を分解し低分子化
する工業的技術の確立が希求されている。
あるため、これらの用途に用いる場合、あるいはその後
処理や廃液処理に際し、アルギン酸類を分解し低分子化
する工業的技術の確立が希求されている。
【０００５】アルギン酸を分解して得られるポリＭは、
現在、アルギン酸の構造研究および抗腫瘍効果の研究に
用いられている。さらに、食物繊維性食品や保湿効果を
有する化粧品、または医薬品の基材としての用途が期待
されているが、従来のポリＭの製造法が非常に複雑なた
め、工業的に生産された例はなく、これらの用途の研究
も十分には行われていない。
現在、アルギン酸の構造研究および抗腫瘍効果の研究に
用いられている。さらに、食物繊維性食品や保湿効果を
有する化粧品、または医薬品の基材としての用途が期待
されているが、従来のポリＭの製造法が非常に複雑なた
め、工業的に生産された例はなく、これらの用途の研究
も十分には行われていない。
【０００６】従来アルギン酸の分解方法としては、酸、
アルカリを用いる方法、あるいは熱および圧力を用いる
方法があるが、前者は製品の品質低下や機器の腐食の問
題、さらには中和剤の必要性とその後処理等の問題があ
り、工業的には極めて不利な方法であり、一方後者も分
解時間が長くかかり、設備費も高くなるためコストのか
かる方法であった。
アルカリを用いる方法、あるいは熱および圧力を用いる
方法があるが、前者は製品の品質低下や機器の腐食の問
題、さらには中和剤の必要性とその後処理等の問題があ
り、工業的には極めて不利な方法であり、一方後者も分
解時間が長くかかり、設備費も高くなるためコストのか
かる方法であった。
【０００７】これらの方法に対し、近年アルギン酸分解
酵素を用いるアルギン酸の酵素分解法が開発された。酵
素分解法は、上記方法に比べ穏やかな条件で分解を行う
ことができ、安全性および装置の腐食の点でより優れた
方法ということができる。アルギン酸を分解する酵素と
しては、基質特異性の異なる複数の酵素が知られてお
り、ポリＧ、ポリＭＧおよびポリＭのブロックのいずれ
かに作用しうる酵素およびこれらの複数のブロックに作
用しうる酵素がある。本明細書においては、ポリＧ、ポ
リＭＧを切断するがポリＭを切断しない酵素をＧ-ase、
ポリＭ、ポリＭＧを切断するがポリＧを切断しない酵素
をＭ-ase、およびポリＧ、ポリＭＧ、およびポリＭのい
ずれをも切断する酵素をＭＧ-aseとそれぞれ称する。
酵素を用いるアルギン酸の酵素分解法が開発された。酵
素分解法は、上記方法に比べ穏やかな条件で分解を行う
ことができ、安全性および装置の腐食の点でより優れた
方法ということができる。アルギン酸を分解する酵素と
しては、基質特異性の異なる複数の酵素が知られてお
り、ポリＧ、ポリＭＧおよびポリＭのブロックのいずれ
かに作用しうる酵素およびこれらの複数のブロックに作
用しうる酵素がある。本明細書においては、ポリＧ、ポ
リＭＧを切断するがポリＭを切断しない酵素をＧ-ase、
ポリＭ、ポリＭＧを切断するがポリＧを切断しない酵素
をＭ-ase、およびポリＧ、ポリＭＧ、およびポリＭのい
ずれをも切断する酵素をＭＧ-aseとそれぞれ称する。
【０００８】アルギン酸分解酵素を生産する微生物とし
ては、フラボバクテリウム属菌、エンテロバクター属菌
（特開平３−９４６７５）、シュウドモナス属菌（特開
昭５９−１４３５９７）およびアルテロモナス属菌（特
開昭６３−２１４１９２）等が知られている。アルギン
酸の分解には通常これらの微生物培養液から調製された
粗酵素標品、すなわち複数の酵素の混合物が用いられて
いるため、反応の特異性が低い。従って、反応の特異性
を高め、反応の制御を容易にするために、かかる粗酵素
標品から基質特異性の明らかなアルギン酸分解酵素を単
離する安価な方法の開発が求められている。
ては、フラボバクテリウム属菌、エンテロバクター属菌
（特開平３−９４６７５）、シュウドモナス属菌（特開
昭５９−１４３５９７）およびアルテロモナス属菌（特
開昭６３−２１４１９２）等が知られている。アルギン
酸の分解には通常これらの微生物培養液から調製された
粗酵素標品、すなわち複数の酵素の混合物が用いられて
いるため、反応の特異性が低い。従って、反応の特異性
を高め、反応の制御を容易にするために、かかる粗酵素
標品から基質特異性の明らかなアルギン酸分解酵素を単
離する安価な方法の開発が求められている。
【０００９】一方、ポリＭの製造方法としては、従来、
アルギン酸の酸加水分解法が知られている。この方法
は、アルギン酸を薄酸で100°Cにおいて加水分解した
後、ｐＨ2.85においてポリＧを沈殿除去し、さらにｐＨ
を1.5まで下げてポリＭを得るという方法である。しか
し、操作が複雑で、かつ、熟練を要するため、工業的な
生産方法として用いることは困難である。
アルギン酸の酸加水分解法が知られている。この方法
は、アルギン酸を薄酸で100°Cにおいて加水分解した
後、ｐＨ2.85においてポリＧを沈殿除去し、さらにｐＨ
を1.5まで下げてポリＭを得るという方法である。しか
し、操作が複雑で、かつ、熟練を要するため、工業的な
生産方法として用いることは困難である。
【００１０】これに対し、上述のＧ-aseをアルギン酸に
作用させると、ポリマンヌロン酸のみを調製することが
できる。しかし、従来、工業的に得られるＧ-aseを温和
な条件下でアルギン酸に作用させ、その後ｐＨ分画を行
うことによりポリＭの製造を可能とした例は知られてい
ない。
作用させると、ポリマンヌロン酸のみを調製することが
できる。しかし、従来、工業的に得られるＧ-aseを温和
な条件下でアルギン酸に作用させ、その後ｐＨ分画を行
うことによりポリＭの製造を可能とした例は知られてい
ない。
【００１１】従って、アルギン酸からポリＭを工業的に
製造する、安価で簡便な方法の開発が求められている。
製造する、安価で簡便な方法の開発が求められている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】以上のことから本発明
は、工業的に得られるアルギン酸分解酵素の粗酵素標品
からＧ-aseおよびＭＧ-aseをそれぞれ単離し、その諸性
質を明らかにすることを目的とする。また本発明は、こ
れらの酵素を安価に収率よく精製する方法を開発するこ
とを目的とする。さらに本発明は、得られた酵素を用い
てアルギン酸からポリマンヌロン酸およびオリゴマンヌ
ロン酸を製造する方法を開発することを目的とする。
は、工業的に得られるアルギン酸分解酵素の粗酵素標品
からＧ-aseおよびＭＧ-aseをそれぞれ単離し、その諸性
質を明らかにすることを目的とする。また本発明は、こ
れらの酵素を安価に収率よく精製する方法を開発するこ
とを目的とする。さらに本発明は、得られた酵素を用い
てアルギン酸からポリマンヌロン酸およびオリゴマンヌ
ロン酸を製造する方法を開発することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究した結果、特定の条件下で
陽イオン交換樹脂を用いることによって、粗酵素標品か
ら２種類のＧ-aseおよびＭＧ-aseアルギン酸分解酵素を
それぞれ単離精製しうることを見いだし、本発明を完成
した。
的を達成するために鋭意研究した結果、特定の条件下で
陽イオン交換樹脂を用いることによって、粗酵素標品か
ら２種類のＧ-aseおよびＭＧ-aseアルギン酸分解酵素を
それぞれ単離精製しうることを見いだし、本発明を完成
した。
【００１４】本発明は、アルギン酸分解酵素の粗酵素標
品から単離された３種類の酵素およびその製造方法を提
供するものである。第１および第２の酵素はＧ-ase（本
明細書中においては区別のためにそれぞれＧ-ase(１)、
Ｇ-ase(２)と称する）であり、第３の酵素はＭＧ-aseで
ある。これらの酵素は、フラボバクテリウム属菌を培養
して工業的に得られるアルギン酸分解酵素の粗酵素標品
を、まずリン酸緩衝液に対して透析し、次にこれを陽イ
オン交換樹脂カラムを用いて分画し、さらにクロマトフ
ォカシングカラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過に
よって精製して得ることができる。
品から単離された３種類の酵素およびその製造方法を提
供するものである。第１および第２の酵素はＧ-ase（本
明細書中においては区別のためにそれぞれＧ-ase(１)、
Ｇ-ase(２)と称する）であり、第３の酵素はＭＧ-aseで
ある。これらの酵素は、フラボバクテリウム属菌を培養
して工業的に得られるアルギン酸分解酵素の粗酵素標品
を、まずリン酸緩衝液に対して透析し、次にこれを陽イ
オン交換樹脂カラムを用いて分画し、さらにクロマトフ
ォカシングカラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過に
よって精製して得ることができる。
【００１５】本発明において用いるアルギン酸分解酵素
の粗酵素標品は、フラボバクテリウム属菌を培養して得
られる。フラボバクテリウム属菌としては、例えばフラ
ボバクテリウム マルチボラムＫ−１１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１１３３８）を用いることができる。フラボバクテリ
ウム マルチボラムＫ−１１の菌学的性質およびこの菌
を培養して工業的に得られるアルギン酸分解酵素（ナガ
セ生化学工業（株）製）の性質については、特開平４−
１４１０９０および特開平４−１６９１８９にそれぞれ
記載されている。
の粗酵素標品は、フラボバクテリウム属菌を培養して得
られる。フラボバクテリウム属菌としては、例えばフラ
ボバクテリウム マルチボラムＫ−１１（ＦＥＲＭ Ｐ
−１１３３８）を用いることができる。フラボバクテリ
ウム マルチボラムＫ−１１の菌学的性質およびこの菌
を培養して工業的に得られるアルギン酸分解酵素（ナガ
セ生化学工業（株）製）の性質については、特開平４−
１４１０９０および特開平４−１６９１８９にそれぞれ
記載されている。
【００１６】次に、粗酵素標品から本発明のアルギン酸
分解酵素を精製する方法について説明する。
分解酵素を精製する方法について説明する。
【００１７】まずアルギン酸分解酵素混合物を、濃度が
５mM以下、ｐＨが５〜７の適当な緩衝液に溶解し、同緩
衝液に対して透析する。好ましくは緩衝液のｐＨは６〜
6.5であり、例えば１mMのリン酸緩衝液（ｐＨ６〜6.5）
を用いることができる。
５mM以下、ｐＨが５〜７の適当な緩衝液に溶解し、同緩
衝液に対して透析する。好ましくは緩衝液のｐＨは６〜
6.5であり、例えば１mMのリン酸緩衝液（ｐＨ６〜6.5）
を用いることができる。
【００１８】この標品を同緩衝液で平衡化した陽イオン
交換樹脂カラムに吸着させる。陽イオン交換樹脂カラム
としては、一般的に蛋白質の分離精製に用いられる樹脂
であればどれを用いてもよいが、疎水度が比較的高いと
言われている、CM-TOYOPEARL650M（（株）東ソー社製）
等のイオン交換樹脂が好ましい。
交換樹脂カラムに吸着させる。陽イオン交換樹脂カラム
としては、一般的に蛋白質の分離精製に用いられる樹脂
であればどれを用いてもよいが、疎水度が比較的高いと
言われている、CM-TOYOPEARL650M（（株）東ソー社製）
等のイオン交換樹脂が好ましい。
【００１９】この陽イオン交換カラム処理によって、非
吸着画分を回収することにより、本発明のポリグルロン
酸分解酵素Ｇ-ase(２)を得ることができる。
吸着画分を回収することにより、本発明のポリグルロン
酸分解酵素Ｇ-ase(２)を得ることができる。
【００２０】また、吸着させた後、適当な溶出系を用い
て、目的とする酵素Ｇ-ase(１)およびＭＧ-aseを含む画
分をそれぞれ得ることができる。溶出液系としては、酵
素の吸着に用いた緩衝液から順次イオン強度の強い緩衝
液をカラムに通すことで酵素蛋白質を分画することがで
きる。また緩衝液のｐＨを順次上げていくことでも分離
することができる。とくに同緩衝液中の０〜0.5ＭＮaＣ
lの直線濃度勾配によって溶出することが好ましい。
て、目的とする酵素Ｇ-ase(１)およびＭＧ-aseを含む画
分をそれぞれ得ることができる。溶出液系としては、酵
素の吸着に用いた緩衝液から順次イオン強度の強い緩衝
液をカラムに通すことで酵素蛋白質を分画することがで
きる。また緩衝液のｐＨを順次上げていくことでも分離
することができる。とくに同緩衝液中の０〜0.5ＭＮaＣ
lの直線濃度勾配によって溶出することが好ましい。
【００２１】Ｇ-ase(１)またはＭＧ-aseを含む画分はさ
らに、次の方法により精製する。
らに、次の方法により精製する。
【００２２】Ｇ-ase(１)を含む画分をそれぞれ脱塩後濃
縮し、10倍希釈のポリバッファー９６−ＨＣl（ｐＨ7.
0）で透析した後、25mMエタノールアミン−ＨＣl（ｐＨ
9.6）で平衡化されたカラムにのせ、10倍希釈のポリバ
ッファー９６−ＨＣl（ｐＨ7.0）で溶出する。分画され
た酵素画分は、ポリバッファーを含むため、ゲル濾過法
によりこれを除く。ＭＧ-aseを含む画分についても、同
様にして精製することができる。
縮し、10倍希釈のポリバッファー９６−ＨＣl（ｐＨ7.
0）で透析した後、25mMエタノールアミン−ＨＣl（ｐＨ
9.6）で平衡化されたカラムにのせ、10倍希釈のポリバ
ッファー９６−ＨＣl（ｐＨ7.0）で溶出する。分画され
た酵素画分は、ポリバッファーを含むため、ゲル濾過法
によりこれを除く。ＭＧ-aseを含む画分についても、同
様にして精製することができる。
【００２３】以上の方法により、本発明のＧ-aseおよび
ＭＧ-aseの精製酵素標品をそれぞれ得ることができる。
ＭＧ-aseの精製酵素標品をそれぞれ得ることができる。
【００２４】本発明のＧ-aseおよびＭＧ-aseの理化学的
性質を以下に述べる。
性質を以下に述べる。
【００２５】Ｇ-ase(１) １．作用 アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアーゼ的に分解
し、主に不飽和ウロン酸残基をもつオリゴ糖を生成す
る。
し、主に不飽和ウロン酸残基をもつオリゴ糖を生成す
る。
【００２６】２．基質特異性 ポリＧ、ポリＭＧに対し、区別なく働く。
【００２７】基質特異性は以下の方法に従って測定し
た。基質としては、１％ポリＭ（Ｍ％88.5）、１％ポリ
Ｇ（Ｇ％92.2）および１％ポリＭＧ（Ｍ％57.1）溶液
（pＨ8.0）を用いた。この基質と本発明による酵素を1
0：１で混合し、反応液を一定時間ごとに300μlずつサ
ンプリングし、ＴＢＡ反応により生成物を定量した。対
照としては、100°C、５分間加熱失活した粗酵素液を用
いた。サンプル200μlに0.025ＮのＨＩＯ4を含む0.125
Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液0.25mlを加えて20分間静置し、サンプ
ルの過ヨウ素酸酸化を行った。これに２％の亜ヒ酸ナト
リウムを含む0.5ＮのＨＣl溶液を加えて２分間静置する
ことにより反応を停止させ、その後、0.3％のチオバル
ビツール酸溶液を２ml加えて100°Cの湯浴中で10分間加
熱し、縮合反応を行った。赤色を呈した反応液は、放冷
後、吸光度計により548nmでの吸光度を測定した。ただ
し吸光度が0.8を越える場合には、酵素反応液を適当に
希釈し、ＴＢＡ反応での吸光度が0.8以下になるように
して測定した。
た。基質としては、１％ポリＭ（Ｍ％88.5）、１％ポリ
Ｇ（Ｇ％92.2）および１％ポリＭＧ（Ｍ％57.1）溶液
（pＨ8.0）を用いた。この基質と本発明による酵素を1
0：１で混合し、反応液を一定時間ごとに300μlずつサ
ンプリングし、ＴＢＡ反応により生成物を定量した。対
照としては、100°C、５分間加熱失活した粗酵素液を用
いた。サンプル200μlに0.025ＮのＨＩＯ4を含む0.125
Ｎ Ｈ2ＳＯ4溶液0.25mlを加えて20分間静置し、サンプ
ルの過ヨウ素酸酸化を行った。これに２％の亜ヒ酸ナト
リウムを含む0.5ＮのＨＣl溶液を加えて２分間静置する
ことにより反応を停止させ、その後、0.3％のチオバル
ビツール酸溶液を２ml加えて100°Cの湯浴中で10分間加
熱し、縮合反応を行った。赤色を呈した反応液は、放冷
後、吸光度計により548nmでの吸光度を測定した。ただ
し吸光度が0.8を越える場合には、酵素反応液を適当に
希釈し、ＴＢＡ反応での吸光度が0.8以下になるように
して測定した。
【００２８】また分解生成物については、ＴＬＣで生成
物の変化を追跡した（展開溶媒はｎ−ブタノール：ギ
酸：水＝４：６：１）。
物の変化を追跡した（展開溶媒はｎ−ブタノール：ギ
酸：水＝４：６：１）。
【００２９】結果は図１ＡおよびＢに示される。図１Ａ
およびＢより、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポ
リＭには働かないことが示される。不飽和ウロン酸残基
を有するオリゴ糖の生成は、３時間でほぼ終了する。ポ
リＧに働かせると、不飽和ウロン酸を含むグルロン酸の
オリゴ糖（２〜４糖）が得られる。
およびＢより、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポ
リＭには働かないことが示される。不飽和ウロン酸残基
を有するオリゴ糖の生成は、３時間でほぼ終了する。ポ
リＧに働かせると、不飽和ウロン酸を含むグルロン酸の
オリゴ糖（２〜４糖）が得られる。
【００３０】３．作用ｐＨおよび安定ｐＨ（アルギン酸
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図２Ａに酵素反応の至適pＨが7.5であることが示され、
図２Ｂに安定ｐＨが示される。図２Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ５
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図２Ａに酵素反応の至適pＨが7.5であることが示され、
図２Ｂに安定ｐＨが示される。図２Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ５
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
【００３１】４．作用温度および温度安定性 図３Ａに示すように、酵素反応の至適温度は40°Cであ
り、各種温度でpＨ６で１時間処理の酵素の残存活性
は、40°C以下では、60％以上であった。60°Cでほぼ失
活した（図３Ｂ）。温度安定性は比較的高いと思われ
る。
り、各種温度でpＨ６で１時間処理の酵素の残存活性
は、40°C以下では、60％以上であった。60°Cでほぼ失
活した（図３Ｂ）。温度安定性は比較的高いと思われ
る。
【００３２】５．阻害剤および金属塩の影響 阻害剤による影響は、本酵素をそれぞれ１mM濃度の各種
阻害剤で処理したときの残存活性を測定し、未処理の酵
素の活性に対する相対値で表わした。表１に示すよう
に、EDTA、PCMB、MIA、TNBS、NBSでそれぞれ阻害が見ら
れた。MIAとNBSで強く阻害されたことから、本酵素の活
性には、ＳＨ基およびトリプトファン残基が関与してい
ると思われる。またEDTAの存在下で活性がなくなること
から、本酵素は金属酵素である。また、金属塩の影響に
ついては、酵素をEDTAによって15分間処理した後、各種
金属塩を濃度２mMとなるように加えて活性の賦活を調べ
た。ほとんどの２価金属で活性の賦活が見られた。塩化
カドミウム、塩化水銀、塩化バリウム、塩化コバルトに
ついては、活性の賦活効果はなかった。
阻害剤で処理したときの残存活性を測定し、未処理の酵
素の活性に対する相対値で表わした。表１に示すよう
に、EDTA、PCMB、MIA、TNBS、NBSでそれぞれ阻害が見ら
れた。MIAとNBSで強く阻害されたことから、本酵素の活
性には、ＳＨ基およびトリプトファン残基が関与してい
ると思われる。またEDTAの存在下で活性がなくなること
から、本酵素は金属酵素である。また、金属塩の影響に
ついては、酵素をEDTAによって15分間処理した後、各種
金属塩を濃度２mMとなるように加えて活性の賦活を調べ
た。ほとんどの２価金属で活性の賦活が見られた。塩化
カドミウム、塩化水銀、塩化バリウム、塩化コバルトに
ついては、活性の賦活効果はなかった。
【００３３】
【表１】 表１ Ｇ-ase活性に及ぼす阻害剤および金属塩の影響 酵素活性（％） 阻害剤 ＥＤＴＡ １３.３ ＰＣＭＢ ３２.６ ＭＩＡ ５.８１ ＴＮＢＳ ３０.９ ＮＢＳ ０ 金属塩 ＮiＣl2 ７３ ＭnＣl2 １４６ ＣaＣl2 １１６ ＣdＣl2 ７５ ＣuＣl2 ８２ ＰbＣl2 ８２ ＺnＣl2 ３６ ＡlＣl3 ９１ ＨgＣl2 ９ ＦeＳＯ4 ９９ ＦeＣl3 １２０ ＢaＣl2 ４ ＭgＣl2 ７１ ＣoＣl2 １３ ６．本酵素の分子量 本酵素の分子量の測定は、HPLCゲル濾過（カラムはProt
ein Pak300 ×２ Waters社製で、0.1Mリン酸緩衝液（p
Ｈ７）、流速0.5ml/mim、検出は280nmにおける吸光度）
およびSDS-PAGEにより行った。
ein Pak300 ×２ Waters社製で、0.1Mリン酸緩衝液（p
Ｈ７）、流速0.5ml/mim、検出は280nmにおける吸光度）
およびSDS-PAGEにより行った。
【００３４】HPLCゲル濾過による分析では、本酵素の分
子量は、41,000であった。また、SDS-PAGEによる分析で
は、本酵素の分子量は、43,000であった。これにより本
酵素は単量体と思われた（図４）。
子量は、41,000であった。また、SDS-PAGEによる分析で
は、本酵素の分子量は、43,000であった。これにより本
酵素は単量体と思われた（図４）。
【００３５】７．本酵素の等電点 等電点電気泳動法により、本酵素の等電点を測定した
（LKB Ampholine PAGE plate ｐＨ3.5〜9.5、Isoelectr
ic Focusing Calibration Kit（ファルマシア社
製））。本酵素の等電点は、8.7であった（図５）。
（LKB Ampholine PAGE plate ｐＨ3.5〜9.5、Isoelectr
ic Focusing Calibration Kit（ファルマシア社
製））。本酵素の等電点は、8.7であった（図５）。
【００３６】８．本酵素のアミノ酸組成 本酵素のアミノ酸組成を表２に示す。
【００３７】アミノ酸組成の分析は日立アミノ酸アナラ
イザー835型-50を用いて行った。サンプルは、加水分解
用ガラス試験管に精製酵素700μgを加え、さらに６ＮＨ
Ｃlを0.5ｍｌ加え、脱気後封管し、110°C、24時間酸加
水分解を行った。その後、エバポレーターで塩酸を除去
した後、蒸留水を加えて溶解し、アミノ酸アナライザー
を用いてアミノ酸組成を分析した。
イザー835型-50を用いて行った。サンプルは、加水分解
用ガラス試験管に精製酵素700μgを加え、さらに６ＮＨ
Ｃlを0.5ｍｌ加え、脱気後封管し、110°C、24時間酸加
水分解を行った。その後、エバポレーターで塩酸を除去
した後、蒸留水を加えて溶解し、アミノ酸アナライザー
を用いてアミノ酸組成を分析した。
【００３８】
【表２】 表２ Ｇ-ase(１)のアミノ酸組成 アミノ酸 モル％ ＡＳＰ １２.４ ＴＨＲ １０.２ ＳＥＲ １２.２ ＧＬＵ ７.１ ＧＬＹ １５.２ ＡＬＡ ５.９ ＶＡＬ ８.９ ＭＥＴ − ＩＬＥ ５.６ ＬＥＵ ８.０ ＴＹＲ ０.７ ＰＨＥ ３.３ ＬＹＳ ６.７ ＨＩＳ １.０ ＡＲＧ ２.９Ｇ-ase(２) １．作用 アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアーゼ的に分解
し、不飽和ウロン酸残基をもつオリゴ糖を生成する。
し、不飽和ウロン酸残基をもつオリゴ糖を生成する。
【００３９】２．基質特異性 ポリＧ、ポリＭＧに対し働き、ポリＭには働かない。
【００４０】基質特異性は、上述と同様にして測定し
た。結果は図６ＡおよびＢに示される。図６ＡおよびＢ
より、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポリＭには
働かないことが示された。ポリＧ、ポリＭＧからは不飽
和ウロン酸を含むオリゴ糖が得られ、ポリＧに働かせる
と、不飽和ウロン酸を含むグルロン酸のオリゴ等が得ら
れる。
た。結果は図６ＡおよびＢに示される。図６ＡおよびＢ
より、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポリＭには
働かないことが示された。ポリＧ、ポリＭＧからは不飽
和ウロン酸を含むオリゴ糖が得られ、ポリＧに働かせる
と、不飽和ウロン酸を含むグルロン酸のオリゴ等が得ら
れる。
【００４１】３．作用ｐＨおよび安定ｐＨ（アルギン酸
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図７Ａに酵素反応の至適pＨが8.0であることが示され、
図７Ｂに安定ｐＨが示される。図７Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ４
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図７Ａに酵素反応の至適pＨが8.0であることが示され、
図７Ｂに安定ｐＨが示される。図７Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ４
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
【００４２】ＭＧ-ase １．作用 アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアーゼ的に分解
し、不飽和ウロン酸もしくは不飽和ウロン酸残基をもつ
オリゴ糖を生成する。
し、不飽和ウロン酸もしくは不飽和ウロン酸残基をもつ
オリゴ糖を生成する。
【００４３】２．基質特異性 ポリＭ、ポリＧ、ポリＭＧに対し、区別なく働く。
【００４４】基質特異性は、上述と同様にして測定し
た。結果は図８ＡおよびＢに示される。図８ＡおよびＢ
より、ポリＭ、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポ
リＭには働かないことが示された。不飽和ウロン酸残基
を有するオリゴ糖の生成は、３時間でほぼ終了する。
た。結果は図８ＡおよびＢに示される。図８ＡおよびＢ
より、ポリＭ、ポリＧ、ポリＭＧに対してよく働き、ポ
リＭには働かないことが示された。不飽和ウロン酸残基
を有するオリゴ糖の生成は、３時間でほぼ終了する。
【００４５】このことにより、本酵素はアルギン酸を完
全に分解することができる。
全に分解することができる。
【００４６】３．作用ｐＨおよび安定ｐＨ（アルギン酸
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図９Ａに酵素反応の至適pＨが6.5であることが示され、
図９Ｂに安定ｐＨが示される。図９Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ５
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
ナトリウムＭ／Ｇ＝0.9３ 1.0％溶液に対して） 図９Ａに酵素反応の至適pＨが6.5であることが示され、
図９Ｂに安定ｐＨが示される。図９Ｂにおいて各種のp
Ｈで25°C、２時間処理した後の酵素の残存活性はpＨ５
〜９で60％以上であり、比較的広い範囲で安定であっ
た。
【００４７】４．作用温度および温度安定性 図１０Ａに示すように、酵素反応の至適温度は40°Cで
あり、各種温度でpＨ６で１時間処理の酵素の残存活性
は、40°C以下では、60％以上であった。60°Cでほぼ失
活した。（図１０Ｂ）。温度安定性は比較的高いと思わ
れる。
あり、各種温度でpＨ６で１時間処理の酵素の残存活性
は、40°C以下では、60％以上であった。60°Cでほぼ失
活した。（図１０Ｂ）。温度安定性は比較的高いと思わ
れる。
【００４８】５．阻害剤および金属塩の影響 阻害剤による影響は、本酵素をそれぞれ１mM濃度の各種
阻害剤で処理したときの残存活性を測定し、未処理の酵
素の活性に対する相対値で表わした。表１に示すよう
に、SDS、MIA、TNBS、NBSでそれぞれ阻害が見られた。M
IAとNBSで強く阻害されたことから、本酵素の活性に
は、ＳＨ基およびトリプトファン残基が関与していると
思われる。また、金属塩の影響については、酵素をEDTA
によって15分間処理した後、各種金属塩を濃度２mMとな
るように加えて活性の賦活を調べた。本酵素の活性は、
塩化水銀、塩化鉛など重金属で強く阻害された。
阻害剤で処理したときの残存活性を測定し、未処理の酵
素の活性に対する相対値で表わした。表１に示すよう
に、SDS、MIA、TNBS、NBSでそれぞれ阻害が見られた。M
IAとNBSで強く阻害されたことから、本酵素の活性に
は、ＳＨ基およびトリプトファン残基が関与していると
思われる。また、金属塩の影響については、酵素をEDTA
によって15分間処理した後、各種金属塩を濃度２mMとな
るように加えて活性の賦活を調べた。本酵素の活性は、
塩化水銀、塩化鉛など重金属で強く阻害された。
【００４９】
【表３】 表３ ＭＧ-ase活性に及ぼす阻害剤および金属塩の影響 酵素活性（％） 阻害剤 ＳＤＳ ３.０ ＭＩＡ ０.５ ＴＮＢＳ ４３.５ ＮＢＳ ２.５ 金属塩 ＮiＣl2 ７２ ＭnＣl2 ５７ ＣaＣl2 １２０ ＣdＣl2 ８８ ＣuＣl2 ７４ ＰbＣl2 １１ ＺnＣl2 ５３ ＡlＣl3 １２１ ＨgＣl2 ７ ＦeＳＯ4 ８１ ＦeＣl3 ９３ ＢaＣl2 ８２ ＭgＣl2 ７３ ＣoＣl2 ６８ ６．本酵素の分子量 本酵素の分子量の測定は、HPLCゲル濾過（カラム：Prot
ein Pak300 ×２ Waters社製、0.1Mリン酸緩衝液（pＨ
７）、流速0.5ml/mim、検出：280nmにおける吸光度）お
よびSDS-PAGEにより行った。
ein Pak300 ×２ Waters社製、0.1Mリン酸緩衝液（pＨ
７）、流速0.5ml/mim、検出：280nmにおける吸光度）お
よびSDS-PAGEにより行った。
【００５０】HPLCゲル濾過による分析では、本酵素の分
子量は、33,000であった。また、SDS-PAGEによる分析で
は、本酵素の分子量は、32,000であった。これにより本
酵素は単量体と思われた（図１１）。
子量は、33,000であった。また、SDS-PAGEによる分析で
は、本酵素の分子量は、32,000であった。これにより本
酵素は単量体と思われた（図１１）。
【００５１】７．本酵素の等電点 等電点電気泳動法により、本酵素の等電点を測定した
（LKB Ampholine PAGE plate ｐＨ3.5〜9.5、Isoelectr
ic Focusing Calibration Kit（ファルマシア社
製））。本酵素の等電点は、8.2であった（図１２）。
（LKB Ampholine PAGE plate ｐＨ3.5〜9.5、Isoelectr
ic Focusing Calibration Kit（ファルマシア社
製））。本酵素の等電点は、8.2であった（図１２）。
【００５２】８．本酵素のアミノ酸組成 本酵素のアミノ酸組成を表４に示す。
【００５３】アミノ酸組成の分析は上述の方法に従った
が、300μgの精製酵素を用いて行った。
が、300μgの精製酵素を用いて行った。
【００５４】
【表４】 表４ ＭＧ-aseのアミノ酸組成 アミノ酸 モル％ ＡＳＰ １３.８ ＴＨＲ ６.６ ＳＥＲ ８.９ ＧＬＵ １２.０ ＧＬＹ ９.３ ＡＬＡ ８.０ ＶＡＬ ４.４ ＭＥＴ １.４ ＩＬＥ ６.６ ＬＥＵ ５.１ ＴＹＲ ４.０ ＰＨＥ ５.８ ＬＹＳ ９.７ ＨＩＳ １６.６ ＡＲＧ ２.６ 次に、本発明の酵素を用いたポリＭおよびオリゴＭの製
造方法について説明する。
造方法について説明する。
【００５５】まず、アルギン酸を0.1ＭＮaＣlを含む水
もしくは適当な緩衝液に溶解し、37°Cに加温する。ｐ
Ｈを約８に調整した後、本発明のポリグルロン酸分解酵
素Ｇ-ase(２)を加え、37°Cで10〜24時間反応させる。
反応後、0.1ＮＨＣlを加えてｐＨ2.85とし、沈殿のない
ことを確認する。次に、ｐＨを1.5に下げて沈殿物を得
る。これを0.1ＭＮaＣlを含む希ＨＣlで２回洗浄した
後、水に懸濁し、希アルカリで中和する。ここに過剰量
のエタノールを滴下して沈殿物を得る。この沈殿物をエ
ーテルで脱水し、減圧下で乾燥してポリＭを得る。
もしくは適当な緩衝液に溶解し、37°Cに加温する。ｐ
Ｈを約８に調整した後、本発明のポリグルロン酸分解酵
素Ｇ-ase(２)を加え、37°Cで10〜24時間反応させる。
反応後、0.1ＮＨＣlを加えてｐＨ2.85とし、沈殿のない
ことを確認する。次に、ｐＨを1.5に下げて沈殿物を得
る。これを0.1ＭＮaＣlを含む希ＨＣlで２回洗浄した
後、水に懸濁し、希アルカリで中和する。ここに過剰量
のエタノールを滴下して沈殿物を得る。この沈殿物をエ
ーテルで脱水し、減圧下で乾燥してポリＭを得る。
【００５６】このようにして得られたポリＭをＮＭＲに
より分析し、また、Ｍ／Ｇ（マンヌロン酸／グルロン
酸）比をＧＣスペクトル分析によって測定した。アルギ
ン酸分子中のＭ／Ｇ比は、モリス（E.R.Morris）らの方
法（Carbohydrate Research, 81 (1989) 305-314）に従
って計算した。その結果、本発明に従って得られたポリ
Ｍは、酸加水分解およびｐＨ分画法によって得られたポ
リＭ（ハウグ（Haug）らの方法（Acta Chemica Scandin
avia 21 (1967) 691-704）による）と同等の理化学的性
質を示すことが確認された。
より分析し、また、Ｍ／Ｇ（マンヌロン酸／グルロン
酸）比をＧＣスペクトル分析によって測定した。アルギ
ン酸分子中のＭ／Ｇ比は、モリス（E.R.Morris）らの方
法（Carbohydrate Research, 81 (1989) 305-314）に従
って計算した。その結果、本発明に従って得られたポリ
Ｍは、酸加水分解およびｐＨ分画法によって得られたポ
リＭ（ハウグ（Haug）らの方法（Acta Chemica Scandin
avia 21 (1967) 691-704）による）と同等の理化学的性
質を示すことが確認された。
【００５７】本発明の方法によれば、反応溶液中のアル
ギン酸の初期濃度を高くすることによって、ポリＭの調
製効率を高めることができる。例えば、以下の実施例５
に示されるように、アルギン酸の初期濃度を１％から１
０％まで変化させても、ポリＭの回収率はほとんど変化
しない。すなわち、本発明の方法は、反応に用いられる
装置のスケールアップをすることなく、大量のポリＭを
調製することができるという利点を有している。
ギン酸の初期濃度を高くすることによって、ポリＭの調
製効率を高めることができる。例えば、以下の実施例５
に示されるように、アルギン酸の初期濃度を１％から１
０％まで変化させても、ポリＭの回収率はほとんど変化
しない。すなわち、本発明の方法は、反応に用いられる
装置のスケールアップをすることなく、大量のポリＭを
調製することができるという利点を有している。
【００５８】得られたポリＭは、さらにＭ-aseまたはＭ
Ｇ-aseで処理することによって、オリゴＭを得ることが
できる。この反応には、Ｍ-ase活性を有しない周知のい
ずれのアルギン酸分解酵素を用いることができる。
Ｇ-aseで処理することによって、オリゴＭを得ることが
できる。この反応には、Ｍ-ase活性を有しない周知のい
ずれのアルギン酸分解酵素を用いることができる。
【００５９】
（実施例１） Ｇ-ase(１)の精製 12ｇの粗酵素を600mlの１mMリン酸緩衝液（pＨ6.6）に
溶解し、同緩衝液に対して透析した。遠心分離して沈殿
を除いた後、上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライし、流
速120ml/hr、０Ｍ〜0.5ＭＮaＣlのリニアグラジエント
溶出を行った。10mlずつ分画して分画番号19〜25を集め
た。限外濾過濃縮を行った後、1/10濃度polybuffer-Ｈ
Ｃl（pＨ７）で平衡化して、Chromatofocusingカラム
（φ1.3×30、Ethanolamine-ＨＣl（pＨ9.6）で平衡
化）にアプライした。溶出は、1/10濃度polybuffer-Ｈ
Ｃl（pＨ7.0）、流速30ml/hrで行い、この操作を２回行
った。５mlずつ分画して分画番号21〜23を集めた。これ
を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した後、0.24ＭＮa
Ｃlを含む40mMリン酸緩衝液（pＨ6.7）に溶解した。同
緩衝液で平衡化したUltrogel AcA-54ゲル濾過カラム
（φ1.6×85、bed vol.170ml）を用いて流速15ml/hrで
ゲル濾過した。３mlずつ分画して分画番号33〜38を集め
た。約18mgの酵素蛋白質を得た。回収率は17％、精製倍
率は17倍であった。
溶解し、同緩衝液に対して透析した。遠心分離して沈殿
を除いた後、上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライし、流
速120ml/hr、０Ｍ〜0.5ＭＮaＣlのリニアグラジエント
溶出を行った。10mlずつ分画して分画番号19〜25を集め
た。限外濾過濃縮を行った後、1/10濃度polybuffer-Ｈ
Ｃl（pＨ７）で平衡化して、Chromatofocusingカラム
（φ1.3×30、Ethanolamine-ＨＣl（pＨ9.6）で平衡
化）にアプライした。溶出は、1/10濃度polybuffer-Ｈ
Ｃl（pＨ7.0）、流速30ml/hrで行い、この操作を２回行
った。５mlずつ分画して分画番号21〜23を集めた。これ
を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した後、0.24ＭＮa
Ｃlを含む40mMリン酸緩衝液（pＨ6.7）に溶解した。同
緩衝液で平衡化したUltrogel AcA-54ゲル濾過カラム
（φ1.6×85、bed vol.170ml）を用いて流速15ml/hrで
ゲル濾過した。３mlずつ分画して分画番号33〜38を集め
た。約18mgの酵素蛋白質を得た。回収率は17％、精製倍
率は17倍であった。
【００６０】（実施例２） Ｇ-ase(２)の精製 12ｇの粗酵素を600ml、１mMリン酸緩衝液（pＨ6.6）に
溶解し、同緩衝液に対して透析した。遠心分離して沈殿
を除いた後、上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライして流
速120ml/hrで同緩衝液を流した。クロマトグラフィーは
280nmにおける吸光度が0.1以下になるまで行い、同樹脂
に対する非吸着画分を得た。得られた非吸着画分は、ポ
リＭに対して働かず、ポリＧ、ポリＭＧに対して働いた
ことからＧ-aseであることが示された（図７Ａおよび
Ｂ）。回収率は16.8％、精製倍率は0.25倍であった。
溶解し、同緩衝液に対して透析した。遠心分離して沈殿
を除いた後、上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライして流
速120ml/hrで同緩衝液を流した。クロマトグラフィーは
280nmにおける吸光度が0.1以下になるまで行い、同樹脂
に対する非吸着画分を得た。得られた非吸着画分は、ポ
リＭに対して働かず、ポリＧ、ポリＭＧに対して働いた
ことからＧ-aseであることが示された（図７Ａおよび
Ｂ）。回収率は16.8％、精製倍率は0.25倍であった。
【００６１】（実施例３） ＭＧ-aseの精製 12ｇの粗酵素を600ml、１mMリン酸緩衝液（pＨ6.6）に
溶解し、同緩衝液に対して透析した後、遠心分離して沈
殿を除いた。上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライし、流
速120ml/hr、０Ｍ〜0.5ＭＮaＣlのリニアグラジエント
溶出を行った。10mlずつ分画し、分画番号39〜46を集め
た。限外濾過濃縮を行った後、1/10濃度polybuffer-HCl
（pＨ７）で平衡化し、Chromatofocusingカラム（φ1.3
×30、Ethanolamine-HCl（pＨ9.6）で平衡化）にアプラ
イした。溶出は、1/10濃度polybuffer-HCl（pＨ7.0）、
流速30ml/hrで行い、５mlずつ分画して分画番号29〜32
を集めた。これを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した
後、0.24ＭＮaＣlを含む40mMリン酸緩衝液（pＨ6.7）に
溶解した。同緩衝液で平衡化したUltrogel AcA-54ゲル
濾過カラム（φ1.6×85、bed vol.170ml）を用いて流速
15ml/hrでゲル濾過を行い、３mlずつ分画して分画番号3
5〜40を集めた。約５mgの酵素蛋白質を得た。回収率は
8.5％、精製倍率は30倍であった。
溶解し、同緩衝液に対して透析した後、遠心分離して沈
殿を除いた。上清を同緩衝液で平衡化したCM-TOYOPEARL
650Mカラム（φ2.6×38cm、約200ml）にアプライし、流
速120ml/hr、０Ｍ〜0.5ＭＮaＣlのリニアグラジエント
溶出を行った。10mlずつ分画し、分画番号39〜46を集め
た。限外濾過濃縮を行った後、1/10濃度polybuffer-HCl
（pＨ７）で平衡化し、Chromatofocusingカラム（φ1.3
×30、Ethanolamine-HCl（pＨ9.6）で平衡化）にアプラ
イした。溶出は、1/10濃度polybuffer-HCl（pＨ7.0）、
流速30ml/hrで行い、５mlずつ分画して分画番号29〜32
を集めた。これを蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した
後、0.24ＭＮaＣlを含む40mMリン酸緩衝液（pＨ6.7）に
溶解した。同緩衝液で平衡化したUltrogel AcA-54ゲル
濾過カラム（φ1.6×85、bed vol.170ml）を用いて流速
15ml/hrでゲル濾過を行い、３mlずつ分画して分画番号3
5〜40を集めた。約５mgの酵素蛋白質を得た。回収率は
8.5％、精製倍率は30倍であった。
【００６２】（実施例４） Ｇ-ase(２)によるポリＭの
製造 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ＝1.75）10ｇを0.1MNaCl
を含む蒸留水１ｌに溶解し、pＨを7.2に調整した。この
アルギン酸溶液を酵素を加える前に37°Cに加温した。
このアルギン酸溶液に実施例２で得られたＧ-ase(２)溶
液を325ml加えて、酵素反応を行わせた。この時の酵素
量は175.8単位であった。酵素の活性測定は1.0％アルギ
ン酸ナトリウム溶液と酵素液を１：１の割合で混合し、
37°Cで30分間反応を行い、100°Cで５分間処理して反
応を停止させた後、ＴＢＡ反応を用いて不飽和糖を定量
することにより行った。１単位は、１分間に１μmolの
β−ホルミルピルビン酸を生成する酵素量とした。
製造 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ＝1.75）10ｇを0.1MNaCl
を含む蒸留水１ｌに溶解し、pＨを7.2に調整した。この
アルギン酸溶液を酵素を加える前に37°Cに加温した。
このアルギン酸溶液に実施例２で得られたＧ-ase(２)溶
液を325ml加えて、酵素反応を行わせた。この時の酵素
量は175.8単位であった。酵素の活性測定は1.0％アルギ
ン酸ナトリウム溶液と酵素液を１：１の割合で混合し、
37°Cで30分間反応を行い、100°Cで５分間処理して反
応を停止させた後、ＴＢＡ反応を用いて不飽和糖を定量
することにより行った。１単位は、１分間に１μmolの
β−ホルミルピルビン酸を生成する酵素量とした。
【００６３】アルギン酸ナトリウム溶液のＧ-aseによる
処理は、24時間行った。酵素処理後、100°Cで10分間加
熱処理し、放冷後、0.1ＮＨＣlでpＨを2.85まで下げ
た。沈殿が生じないことを確認した後（ポリＧが存在し
た場合、沈殿が生じる）、さらに0.1ＮＨＣlを加えてp
Ｈを1.5に調整した。４°Cで一晩静置した後、遠心分離
によって沈殿を得た。得られた沈殿を0.1ＭＮaＣlを含
む希塩酸で洗浄した後、水に懸濁し、希アルカリで中和
した。この溶液75mlを200mlのエタノール中に滴下し、
沈殿物を得た。この沈殿物をエーテル処理により脱水
し、減圧下で乾燥した。
処理は、24時間行った。酵素処理後、100°Cで10分間加
熱処理し、放冷後、0.1ＮＨＣlでpＨを2.85まで下げ
た。沈殿が生じないことを確認した後（ポリＧが存在し
た場合、沈殿が生じる）、さらに0.1ＮＨＣlを加えてp
Ｈを1.5に調整した。４°Cで一晩静置した後、遠心分離
によって沈殿を得た。得られた沈殿を0.1ＭＮaＣlを含
む希塩酸で洗浄した後、水に懸濁し、希アルカリで中和
した。この溶液75mlを200mlのエタノール中に滴下し、
沈殿物を得た。この沈殿物をエーテル処理により脱水
し、減圧下で乾燥した。
【００６４】アルギン酸10ｇから２ｇのポリＭが得られ
た（Ｍ含量92％）。
た（Ｍ含量92％）。
【００６５】（実施例５） Ｇ-ase(２)によるポリＭの
製造におけるアルギン酸濃度の影響 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ＝0.94）を、アルギン酸
ナトリウム濃度がそれぞれ１％、３％、５％および10％
となるように、0.1MNaClを含む蒸留水に溶解し、溶液量
を25mlとした。0.01Ｎ ＮaＯＨを用いてこの溶液のpＨ
を7.0-8.0に調整し、酵素を加える前に37°Cに加温し
た。このアルギン酸溶液に実施例２で得られたＧ-ase
(２)溶液をアルギン酸ナトリウム１ｇあたり16Ｕとなる
ように加えた。酵素反応および反応溶液からのポリＭの
回収は、実施例４に記載の方法にしたがって行った。
製造におけるアルギン酸濃度の影響 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ＝0.94）を、アルギン酸
ナトリウム濃度がそれぞれ１％、３％、５％および10％
となるように、0.1MNaClを含む蒸留水に溶解し、溶液量
を25mlとした。0.01Ｎ ＮaＯＨを用いてこの溶液のpＨ
を7.0-8.0に調整し、酵素を加える前に37°Cに加温し
た。このアルギン酸溶液に実施例２で得られたＧ-ase
(２)溶液をアルギン酸ナトリウム１ｇあたり16Ｕとなる
ように加えた。酵素反応および反応溶液からのポリＭの
回収は、実施例４に記載の方法にしたがって行った。
【００６６】表５に、得られたポリＭの重量、回収率お
よびマンヌロン酸含有率を示す。
よびマンヌロン酸含有率を示す。
【００６７】
【表５】 アルギン酸ナトリウム ポリＭ重量 回収率 Ｍ含有率 初期濃度（％） ｍｇ ％ ％ １ ３３．３ １３．３ ９２．６０ ３ １０１．１ １３．５ ９０．６３ ５ １７８．７ １４．３ ８９．８９ １０ ３９３．６ １５．７ ９１．８０ 以上のことから、アルギン酸ナトリウムの初期濃度を高
くすることにより、装置のスケールアップをすることな
く、ポリＭの調製効率を高めることが可能であることが
示された。
くすることにより、装置のスケールアップをすることな
く、ポリＭの調製効率を高めることが可能であることが
示された。
【図１】図１ＡはＧ-ase(１)の基質特異性を示すグラフ
であり、図１ＢはＧ-ase(１)の基質特異性を示すＴＬＣ
の結果である。
であり、図１ＢはＧ-ase(１)の基質特異性を示すＴＬＣ
の結果である。
【図２】図２ＡはＧ-ase(１)の作用ｐＨを示すグラフで
あり、図２ＢはＧ-ase(１)の安定ｐＨを示すグラフであ
る。
あり、図２ＢはＧ-ase(１)の安定ｐＨを示すグラフであ
る。
【図３】図３ＡはＧ-ase(１)の作用温度を示すグラフで
あり、図３ＢはＧ-ase(１)の温度安定性を示すグラフで
ある。
あり、図３ＢはＧ-ase(１)の温度安定性を示すグラフで
ある。
【図４】図４は、Ｇ-ase(１)のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
分子量測定結果を示す。
分子量測定結果を示す。
【図５】図５は、Ｇ-ase(１)の等電点電気泳動法による
等電点測定結果を示す。
等電点測定結果を示す。
【図６】図６ＡはＧ-ase(２)の基質特異性を示すグラフ
であり、図６ＢはＧ-ase(２)の基質特異性を示すＴＬＣ
の結果である。
であり、図６ＢはＧ-ase(２)の基質特異性を示すＴＬＣ
の結果である。
【図７】図７ＡはＧ-ase(２)の作用ｐＨを示すグラフで
あり、図７ＢはＧ-ase(２)の安定ｐＨを示すグラフであ
る。
あり、図７ＢはＧ-ase(２)の安定ｐＨを示すグラフであ
る。
【図８】図８ＡはＭＧ-aseの基質特異性を示すグラフで
あり、図８ＢはＭＧ-aseの基質特異性を示すＴＬＣの結
果である。
あり、図８ＢはＭＧ-aseの基質特異性を示すＴＬＣの結
果である。
【図９】図９ＡはＭＧ-aseの作用ｐＨを示すグラフであ
り、図９ＢはＭＧ-aseの安定ｐＨを示すグラフである。
り、図９ＢはＭＧ-aseの安定ｐＨを示すグラフである。
【図１０】図１０ＡはＭＧ-aseの作用温度を示すグラフ
であり、図１０ＢはＭＧ-aseの温度安定性を示すグラフ
である。
であり、図１０ＢはＭＧ-aseの温度安定性を示すグラフ
である。
【図１１】図１１は、ＭＧ-aseのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量測定結果を示す。
る分子量測定結果を示す。
【図１２】図１２は、ＭＧ-aseの等電点電気泳動法によ
る等電点測定結果を示す。
る等電点測定結果を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアー
ゼ的に脱離分解する酵素であって、アルギン酸分子中の
ポリＧおよびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分を切
断せず、反応の至適ｐＨが7.5〜8.0の範囲であり、ｐＨ
５〜９で安定であることを特徴とする酵素。 - 【請求項２】アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアー
ゼ的に脱離分解する酵素であって、アルギン酸分子中の
ポリＧ、ポリＭＧおよびポリＭ部分のいずれをも切断
し、反応の至適ｐＨが6.5であり、ｐＨ５〜９で安定で
あることを特徴とする酵素。 - 【請求項３】アルギン酸分解酵素混合物から請求項１ま
たは２記載の酵素を単離する方法であって、フラボバク
テリウム属を培養して得られるアルギン酸分解酵素混合
物を、濃度５mM以下の、ｐＨ５〜７の緩衝液に対して透
析し、当該緩衝液で平衡化した陽イオン交換樹脂カラム
により分画する工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項４】アルギン酸に作用し、アルギン酸をリアー
ゼ的に脱離分解する酵素であって、アルギン酸分子中の
ポリＧおよびポリＭＧ部分を切断するがポリＭ部分を切
断せず、反応の至適ｐＨが8.0であり、ｐＨ４〜９で安
定であることを特徴とする酵素。 - 【請求項５】アルギン酸からポリマンヌロン酸を製造す
る方法であって、請求項１または４記載の酵素を用いる
ことを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5036889A JPH06217774A (ja) | 1992-12-04 | 1993-02-25 | 新規アルギン酸分解酵素、その製造方法およびこれを用いたポリマンヌロン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32528892 | 1992-12-04 | ||
| JP4-325288 | 1992-12-04 | ||
| JP5036889A JPH06217774A (ja) | 1992-12-04 | 1993-02-25 | 新規アルギン酸分解酵素、その製造方法およびこれを用いたポリマンヌロン酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217774A true JPH06217774A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=26375983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5036889A Withdrawn JPH06217774A (ja) | 1992-12-04 | 1993-02-25 | 新規アルギン酸分解酵素、その製造方法およびこれを用いたポリマンヌロン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06217774A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0987272A1 (en) * | 1998-07-21 | 2000-03-22 | Seiko Epson Corporation | Process for the manufacturing of polyguluronic acids |
| US6747015B2 (en) | 2000-02-03 | 2004-06-08 | Kbp Co., Ltd. | Low molecular weight polymannuronate |
| EP2065046A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-03 | Kao Corporation | Gip secretion inhibitor |
| CN104897835A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-09 | 江南大学 | 一种利用uplc-q-tof/ms技术快速测定寡聚古罗糖醛酸的方法 |
-
1993
- 1993-02-25 JP JP5036889A patent/JPH06217774A/ja not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0987272A1 (en) * | 1998-07-21 | 2000-03-22 | Seiko Epson Corporation | Process for the manufacturing of polyguluronic acids |
| US6747015B2 (en) | 2000-02-03 | 2004-06-08 | Kbp Co., Ltd. | Low molecular weight polymannuronate |
| EP2065046A1 (en) | 2007-11-30 | 2009-06-03 | Kao Corporation | Gip secretion inhibitor |
| CN104897835A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-09 | 江南大学 | 一种利用uplc-q-tof/ms技术快速测定寡聚古罗糖醛酸的方法 |
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