JPH06217780A - 神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターおよびこの蛋白の使用 - Google Patents
神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターおよびこの蛋白の使用Info
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- JPH06217780A JPH06217780A JP4258867A JP25886792A JPH06217780A JP H06217780 A JPH06217780 A JP H06217780A JP 4258867 A JP4258867 A JP 4258867A JP 25886792 A JP25886792 A JP 25886792A JP H06217780 A JPH06217780 A JP H06217780A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、ヒト神経特異エノラーゼ
（ＮＳＥ）を遺伝子操作によって安価にそして大量に供
給する技術を提供することである。 【構成】 本発明は、ヒトγ−エノラーゼをコードする
ＤＮＡを、発現ベクターｐＫＫ２３３−２のｔａｃプロ
モーターの下流に挿入したＮＳＥ蛋白発現ベクターであ
る。更に、本発明はこのベクターを発現させて得られる
蛋白、この蛋白の免疫原、標識物、標準品としての利用
におよぶものである。 【効果】 本発明によって得られるＮＳＥ蛋白は、天然
のものと同一の免疫学的性質を持つため、免疫測定に必
要な原料を本発明によって安価に大量に供給することが
可能となる。
（ＮＳＥ）を遺伝子操作によって安価にそして大量に供
給する技術を提供することである。 【構成】 本発明は、ヒトγ−エノラーゼをコードする
ＤＮＡを、発現ベクターｐＫＫ２３３−２のｔａｃプロ
モーターの下流に挿入したＮＳＥ蛋白発現ベクターであ
る。更に、本発明はこのベクターを発現させて得られる
蛋白、この蛋白の免疫原、標識物、標準品としての利用
におよぶものである。 【効果】 本発明によって得られるＮＳＥ蛋白は、天然
のものと同一の免疫学的性質を持つため、免疫測定に必
要な原料を本発明によって安価に大量に供給することが
可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作によって得ら
れる神経特異エノラーゼならびに得られたエノラーゼ蛋
白の免疫測定における使用に関する。
れる神経特異エノラーゼならびに得られたエノラーゼ蛋
白の免疫測定における使用に関する。
【０００２】
【従来技術】エノラーゼは２−ホスホグリセリン酸と２
−ホスホエノールピルビン酸との間を触媒する解糖系酵
素として知られており、その分子構造としては分子量約
４４〜４７ｋＤの３種類のサブユニットα、β、γより
なる二量体で現在５種類のアイソザイムの存在が明らか
になっている。これらのうち、γ−サブユニットを含む
アイソザイムγγは神経細胞に特異的に存在することか
ら神経特異エノラーゼ（以下ＮＳＥと省略）と呼ばれて
いる。
−ホスホエノールピルビン酸との間を触媒する解糖系酵
素として知られており、その分子構造としては分子量約
４４〜４７ｋＤの３種類のサブユニットα、β、γより
なる二量体で現在５種類のアイソザイムの存在が明らか
になっている。これらのうち、γ−サブユニットを含む
アイソザイムγγは神経細胞に特異的に存在することか
ら神経特異エノラーゼ（以下ＮＳＥと省略）と呼ばれて
いる。
【０００３】近年ＮＳＥは特定の腫瘍や癌のマーカーと
なることが知られており、ＮＳＥの免疫測定は特に臨床
経過のモニターの用途においてすでに実用化されてい
る。
なることが知られており、ＮＳＥの免疫測定は特に臨床
経過のモニターの用途においてすでに実用化されてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＮＳＥ免疫原や標準品
は脳組織から精製されるが、その精製操作は繁雑で効率
も悪く、特にヒトの脳から抽出精製しなければならない
ため原料の供給に難がある。ウシの脳を原料として利用
することも可能であるが、ＮＳＥのアミノ酸配列のヒト
とウシとの間の相違等によって好ましい結果が得られな
い。
は脳組織から精製されるが、その精製操作は繁雑で効率
も悪く、特にヒトの脳から抽出精製しなければならない
ため原料の供給に難がある。ウシの脳を原料として利用
することも可能であるが、ＮＳＥのアミノ酸配列のヒト
とウシとの間の相違等によって好ましい結果が得られな
い。
【０００５】ＮＳＥのような希少な蛋白物質を遺伝子操
作によって多量に安価に得ることが一般に行われている
が、ヒトのＮＳＥについてはまだ報告されていない。
作によって多量に安価に得ることが一般に行われている
が、ヒトのＮＳＥについてはまだ報告されていない。
【０００６】また、たとえ遺伝子構造が決定されたとし
ても、これを微生物によって発現させて得られる蛋白は
もとの蛋白のアミノ酸配列のみが同一となっているにす
ぎない。天然の蛋白では更に糖鎖の付加等により構造の
変化、そして構造変化にともなう活性の変化等が観察さ
れる。
ても、これを微生物によって発現させて得られる蛋白は
もとの蛋白のアミノ酸配列のみが同一となっているにす
ぎない。天然の蛋白では更に糖鎖の付加等により構造の
変化、そして構造変化にともなう活性の変化等が観察さ
れる。
【０００７】本発明は、ヒトＮＳＥの免疫測定に有用な
ＮＳＥ蛋白を遺伝子操作により精製し、そのようなＮＳ
Ｅ蛋白から得られる抗体、標識物等を安価にかつ大量に
供給することを課題とする。
ＮＳＥ蛋白を遺伝子操作により精製し、そのようなＮＳ
Ｅ蛋白から得られる抗体、標識物等を安価にかつ大量に
供給することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の前記課題は大腸
菌発現ベクターｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータの
下流にヒト神経特異エノラーゼのγサブユニット（以下
ヒトγ−エノラーゼと省略）をコードするＤＮＡを挿入
してなる神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターによって
達成される。
菌発現ベクターｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータの
下流にヒト神経特異エノラーゼのγサブユニット（以下
ヒトγ−エノラーゼと省略）をコードするＤＮＡを挿入
してなる神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターによって
達成される。
【０００９】本発明のＮＳＥ蛋白発現ベクターは、公知
の方法によって構築することができる。
の方法によって構築することができる。
【００１０】このベクターによって公知の方法で大腸菌
を形質転換させ、蛋白を回収、精製してＮＳＥ蛋白を得
ることができる。
を形質転換させ、蛋白を回収、精製してＮＳＥ蛋白を得
ることができる。
【００１１】得られた蛋白は天然のＮＳＥと同じように
免疫原、標識物、標準品として利用することができる。
免疫原、標識物、標準品として利用することができる。
【００１２】
【作用】前記構成により、本発明の技術によって発現さ
せたＮＳＥ蛋白は、天然のヒトＮＳＥ蛋白と同一の免疫
学的性質を示し、免疫測定用の免疫原、標識物、標準品
として利用することができる。以下実施例に基づき本発
明を更に詳細に説明する。
せたＮＳＥ蛋白は、天然のヒトＮＳＥ蛋白と同一の免疫
学的性質を示し、免疫測定用の免疫原、標識物、標準品
として利用することができる。以下実施例に基づき本発
明を更に詳細に説明する。
【００１３】
１．ヒトＮＳＥ蛋白発現ベクターの構築 大腸菌用発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア
ＬＫＢバイオテクノロジー社）に、ヒトγ−エノラーゼ
ｃＤＮＡを挿入してヒトＮＳＥ蛋白発現ベクターを構築
した。
ＬＫＢバイオテクノロジー社）に、ヒトγ−エノラーゼ
ｃＤＮＡを挿入してヒトＮＳＥ蛋白発現ベクターを構築
した。
【００１４】１ー１．ヒトγ−エラノーゼのｃＤＮＡ まずヒト脳組織１ｇを、１０ｍｌの下記Ｄ溶液中でテフ
ロンホモジナイザーによりホモジナイズした。次いで２
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌ、水飽和フェノ
ール１０ｍｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール
（４９：１）２ｍｌを加えて１０秒間激しく振とうし
た。１５分間氷冷してから１００００ｒｐｍで２０分間
遠心し、上清に１００％イソプロパノールを加えて−２
０℃で１時間放置した。１００００ｒｐｍで２０分間遠
心してＲＮＡを沈澱させ、７５％のエタノールで洗浄後
乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ）１．０ｍｌに溶解した。 Ｄ溶液： ４Ｍグアニジウム・チオシアネート ２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０） ０．５％サルコシル ０．１Ｍ２−メルカプトエタノール
ロンホモジナイザーによりホモジナイズした。次いで２
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌ、水飽和フェノ
ール１０ｍｌ、クロロホルム／イソアミルアルコール
（４９：１）２ｍｌを加えて１０秒間激しく振とうし
た。１５分間氷冷してから１００００ｒｐｍで２０分間
遠心し、上清に１００％イソプロパノールを加えて−２
０℃で１時間放置した。１００００ｒｐｍで２０分間遠
心してＲＮＡを沈澱させ、７５％のエタノールで洗浄後
乾燥し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐ
Ｈ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ）１．０ｍｌに溶解した。 Ｄ溶液： ４Ｍグアニジウム・チオシアネート ２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０） ０．５％サルコシル ０．１Ｍ２−メルカプトエタノール
【００１５】このＲＮＡ溶液から、オリゴ（ｄＴ）セル
ロース・スパンカラム（クローンテック社製）を用いて
常法によりｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは１／１
０容量の２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．０）および２．５
倍量の冷エタノール（−２０℃）を加えて混和し、−７
０℃で保存した。
ロース・スパンカラム（クローンテック社製）を用いて
常法によりｍＲＮＡを得た。得られたｍＲＮＡは１／１
０容量の２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．０）および２．５
倍量の冷エタノール（−２０℃）を加えて混和し、−７
０℃で保存した。
【００１６】ｃＤＮＡの合成にはｃＤＮＡ合成キット
（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）を利用
した。ｍＲＮＡ３μｇをＲＮａｓｅ活性を含まない精製
水２０μｌに溶かし、６５℃で１０分間加温後、ＤＴＴ
溶液１μｌを添加した。オリゴ（ｄＴ）プライマーとリ
バース・トランスクリプターゼによる１次反応（３７
℃、１時間）に続いて、ＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラ
ーゼＩを加えて１２℃で１時間反応後、更に２２℃で１
時間反応させてｃＤＮＡを合成した。
（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）を利用
した。ｍＲＮＡ３μｇをＲＮａｓｅ活性を含まない精製
水２０μｌに溶かし、６５℃で１０分間加温後、ＤＴＴ
溶液１μｌを添加した。オリゴ（ｄＴ）プライマーとリ
バース・トランスクリプターゼによる１次反応（３７
℃、１時間）に続いて、ＲＮａｓｅＨとＤＮＡポリメラ
ーゼＩを加えて１２℃で１時間反応後、更に２２℃で１
時間反応させてｃＤＮＡを合成した。
【００１７】 １−２．ヒトγ−エノラーゼｃＤＮＡの増幅 １−１で合成したヒト脳の全ｃＤＮＡから、下記配列１
に示すプライマーを用いたＰＣＲ法によりヒトγ−エノ
ラーゼＤＮＡのみを増幅した。このプライマーによって
増幅されたＤＮＡは、両端にＥｃｏＲＩ認識部位を持
つ。ＥｃｏＲＩ認識部位を配列中に（）で囲んで示し
た。 配列１； ＮＳＥ５’プライマー：５’−ＴＴＴ（ＧＡＡＴＴＣ）
ＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’ ＮＳＥ３’プライマー：５’−ＣＣＣ（ＧＡＡＴＴＣ）
ＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＧ
Ａ−３’
に示すプライマーを用いたＰＣＲ法によりヒトγ−エノ
ラーゼＤＮＡのみを増幅した。このプライマーによって
増幅されたＤＮＡは、両端にＥｃｏＲＩ認識部位を持
つ。ＥｃｏＲＩ認識部位を配列中に（）で囲んで示し
た。 配列１； ＮＳＥ５’プライマー：５’−ＴＴＴ（ＧＡＡＴＴＣ）
ＧＡＴＧＴＣＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’ ＮＳＥ３’プライマー：５’−ＣＣＣ（ＧＡＡＴＴＣ）
ＴＴＡＴＣＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＧＧ
Ａ−３’
【００１８】合成した全ｃＤＮＡ１０ｎｇをＰＣＲ用緩
衝液５０μｌに溶解し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
ＲＯＭＥＧＡ社製）４単位を加えて反応液とした。反応
はＤＮＡ増幅装置（Thermal Programmer Ｂ−６４１；
倉敷紡績社製）を用いて、９５℃で４０秒、５５℃で４
０秒、７２℃で５５秒のサイクルを３０サイクル行っ
た。反応中は等量のミネラルオイルを重層して試料の蒸
発を防いだ。 ＰＣＲ用緩衝液： ５０ｍＭＫＣ１ １０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８） １．５ｍＭＭｇＣ１2 ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．２μＭ各ＮＳＥプライマー ０．２ｍＭｄＮＴＰｓ
衝液５０μｌに溶解し、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
ＲＯＭＥＧＡ社製）４単位を加えて反応液とした。反応
はＤＮＡ増幅装置（Thermal Programmer Ｂ−６４１；
倉敷紡績社製）を用いて、９５℃で４０秒、５５℃で４
０秒、７２℃で５５秒のサイクルを３０サイクル行っ
た。反応中は等量のミネラルオイルを重層して試料の蒸
発を防いだ。 ＰＣＲ用緩衝液： ５０ｍＭＫＣ１ １０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８） １．５ｍＭＭｇＣ１2 ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．２μＭ各ＮＳＥプライマー ０．２ｍＭｄＮＴＰｓ
【００１９】増幅したＤＮＡ断片は、１％アガロースゲ
ル電気泳動により約１．３ｋｂであることが確認され
た。またその量はおよそ５μｇであった。更に各種制限
酵素によるマッピングを試みたところ、公知のヒトγ−
エノラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，ｐ４１３−４１７，１９８
８）と一致することが確認された。
ル電気泳動により約１．３ｋｂであることが確認され
た。またその量はおよそ５μｇであった。更に各種制限
酵素によるマッピングを試みたところ、公知のヒトγ−
エノラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，ｐ４１３−４１７，１９８
８）と一致することが確認された。
【００２０】 １−３．ヒトＮＳＥ蛋白発現ベクターの構築 １−２で増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（ベーリンガ
ー・マンハイム社製，以下特に断らない限り制限酵素は
同社製のものを用いた）で消化し、同じくＥｃｏＲＩで
消化したプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に連結し
た。
ー・マンハイム社製，以下特に断らない限り制限酵素は
同社製のものを用いた）で消化し、同じくＥｃｏＲＩで
消化したプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３に連結し
た。
【００２１】得られたプラスミドベクターを塩化カルシ
ウム処理法により大腸菌（ＪＭ１０９）に導入し形質転
換させた。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）加ＬＢ寒天
培地で選択した形質転換体のプラスミドを精製し、ｐＫ
Ｋ２２３−３よりも高分子量のプラスミドを持つ菌株を
選別し、更にその中からヒトγ−エノラーゼｃＤＮＡ断
片が正方向に組込まれているプラスミドを各種制限酵素
を用いた解析により選択し、最終的にヒトＮＳＥ蛋白発
現ベクターｐＨＴＫ５０３を得た（図１：ベクターのマ
ップ）。
ウム処理法により大腸菌（ＪＭ１０９）に導入し形質転
換させた。アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）加ＬＢ寒天
培地で選択した形質転換体のプラスミドを精製し、ｐＫ
Ｋ２２３−３よりも高分子量のプラスミドを持つ菌株を
選別し、更にその中からヒトγ−エノラーゼｃＤＮＡ断
片が正方向に組込まれているプラスミドを各種制限酵素
を用いた解析により選択し、最終的にヒトＮＳＥ蛋白発
現ベクターｐＨＴＫ５０３を得た（図１：ベクターのマ
ップ）。
【００２２】２．ヒトＮＳＥ蛋白の発現と精製 ｐＨＴＫ５０３を持つ大腸菌を２．６ｌのＬＢ培地に接
種した。対数増殖期まで培養した後にｔａｃプロモータ
ーの誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（和光純薬工業社製、以下ＩＰＴＧと略
す）を０．３ｍＭとなるように添加し、ヒトＮＳＥ蛋白
の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間培養を続け、
遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞（湿重量
約８ｇ）を緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理して細胞を破
砕した後、遠心分離（約２７０００Ｇ）により上清を分
取した。
種した。対数増殖期まで培養した後にｔａｃプロモータ
ーの誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド（和光純薬工業社製、以下ＩＰＴＧと略
す）を０．３ｍＭとなるように添加し、ヒトＮＳＥ蛋白
の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間培養を続け、
遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞（湿重量
約８ｇ）を緩衝液Ａに懸濁し、超音波処理して細胞を破
砕した後、遠心分離（約２７０００Ｇ）により上清を分
取した。
【００２３】緩衝液Ａ： １５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９） ５ｍＭＭｇＳ０4 ０．１ｍＭＥＤＴＡ
【００２４】回収した上清を４０−８０％飽和の硫安で
塩析し、沈澱を緩衝液Ａに溶解して同じ緩衝液で透析し
た。不溶性成分を遠心分離で除去し、上清を緩衝液Ａで
平衡化したＤＥ５３セルロース（ワットマン社製）カラ
ム（２．５ｘ４５ｃｍ）にアプライした。緩衝液Ａで充
分に洗浄してから、０−０．６ＭのＮａＣｌ（緩衝液Ａ
中）リニア・グラジェントにより溶出した。
塩析し、沈澱を緩衝液Ａに溶解して同じ緩衝液で透析し
た。不溶性成分を遠心分離で除去し、上清を緩衝液Ａで
平衡化したＤＥ５３セルロース（ワットマン社製）カラ
ム（２．５ｘ４５ｃｍ）にアプライした。緩衝液Ａで充
分に洗浄してから、０−０．６ＭのＮａＣｌ（緩衝液Ａ
中）リニア・グラジェントにより溶出した。
【００２４】各フラクションを蛋白質濃度と酵素活性に
よって追跡し、ヒトＮＳＥを含む画分をプールして緩衝
液Ｂに対して透析後、ブルー・セファロースＣＬ−６Ｂ
（フアルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）カラム
（１．５ｘ５ｃｍ）にアプライした。ヒトＮＳＥはこの
カラムを通過するので、通過分画を４０％の硫酸アンモ
ニウムを含む緩衝液Ｂで平衡化した。ブチル−トヨパー
ル６５０（東ソー社製）カラム（１．５ｘ４０ｃｍ）に
アプライし、４０％−１０％硫酸アンモニウムのリニア
・グラジェントにより溶出した。各フラクションを蛋白
質濃度によって追跡し、ＮＳＥ蛋白含有フラクションを
プールして濃縮後、更に緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ
セファセール（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社製）カラム（１．５ｘ８ｃｍ）にアプライした。緩衝
液Ｂで洗浄し、ＮＳＥを０−０．４ＭのＮａＣｌ（緩衝
液Ｂ中）リニア・グラジェントにより溶出させた。蛋白
質濃度によって各フラクションを追跡し、ＮＳＥ蛋白含
有フラクションをプールした。
よって追跡し、ヒトＮＳＥを含む画分をプールして緩衝
液Ｂに対して透析後、ブルー・セファロースＣＬ−６Ｂ
（フアルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）カラム
（１．５ｘ５ｃｍ）にアプライした。ヒトＮＳＥはこの
カラムを通過するので、通過分画を４０％の硫酸アンモ
ニウムを含む緩衝液Ｂで平衡化した。ブチル−トヨパー
ル６５０（東ソー社製）カラム（１．５ｘ４０ｃｍ）に
アプライし、４０％−１０％硫酸アンモニウムのリニア
・グラジェントにより溶出した。各フラクションを蛋白
質濃度によって追跡し、ＮＳＥ蛋白含有フラクションを
プールして濃縮後、更に緩衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ
セファセール（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社製）カラム（１．５ｘ８ｃｍ）にアプライした。緩衝
液Ｂで洗浄し、ＮＳＥを０−０．４ＭのＮａＣｌ（緩衝
液Ｂ中）リニア・グラジェントにより溶出させた。蛋白
質濃度によって各フラクションを追跡し、ＮＳＥ蛋白含
有フラクションをプールした。
【００２６】緩衝液Ｂ： ５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４） ５ｍＭＭｇＳＯ4
【００２７】このような精製工程によって、ヒトＮＳＥ
蛋白約６ｍｇを得た。各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を図２に示す。ＤＥＡＥセファセール陰イオ
ン交換クロマトグラフィーを終えた段階で、ヒトＮＳＥ
蛋白を単一のバンドとして確認することができた。また
本発明によるヒトＮＳＥ蛋白は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
いて脳から精製された天然のＮＳＥと同一の分子量（約
４６ｋＤ）を示すこと、イオン交換クロマトグラフィー
において天然ＮＳＥと同じ塩濃度の０．２５Ｍの位置に
溶出されること、ゲル濾過においても天然ＮＳＥと同じ
分子量９０〜９５ｋＤの位置に溶出されることが確認さ
れた。
蛋白約６ｍｇを得た。各精製段階におけるＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を図２に示す。ＤＥＡＥセファセール陰イオ
ン交換クロマトグラフィーを終えた段階で、ヒトＮＳＥ
蛋白を単一のバンドとして確認することができた。また
本発明によるヒトＮＳＥ蛋白は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
いて脳から精製された天然のＮＳＥと同一の分子量（約
４６ｋＤ）を示すこと、イオン交換クロマトグラフィー
において天然ＮＳＥと同じ塩濃度の０．２５Ｍの位置に
溶出されること、ゲル濾過においても天然ＮＳＥと同じ
分子量９０〜９５ｋＤの位置に溶出されることが確認さ
れた。
【００２８】 ３．得られたＮＳＥ蛋白の免疫測定への応用 市販のＮＳＥ免疫測定キット（栄研化学社製）によって
本発明のＮＳＥ蛋白を測定し、天然のＮＳＥと免疫学的
反応性を比較した。測定操作はキットの指定に従った。
測定結果は図３に示すとおりであり、本発明のＮＳＥ
(recombinant)（図中点線で示す）と天然ＮＳＥ（stand
ard) （図中実線で示す）との相関が示されている。本
発明によるＮＳＥ蛋白は、天然のＮＳＥと同一の免疫学
的反応性を持つことが確認された。
本発明のＮＳＥ蛋白を測定し、天然のＮＳＥと免疫学的
反応性を比較した。測定操作はキットの指定に従った。
測定結果は図３に示すとおりであり、本発明のＮＳＥ
(recombinant)（図中点線で示す）と天然ＮＳＥ（stand
ard) （図中実線で示す）との相関が示されている。本
発明によるＮＳＥ蛋白は、天然のＮＳＥと同一の免疫学
的反応性を持つことが確認された。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、ＮＳＥの免疫測定に必
要な蛋白を安価に、かつ大量に供給することが可能とな
る。これまでに３００ｇのヒト脳を出発原料として１２
ｍｇのＮＳＥを精製した例が知られている（Shimizu,et
al.,Biochim. Biophys.Acta748,278 −284(1983) ）の
に対し、本発明では９ｇの菌体から約１０ｍｇのＮＳＥ
が回収されて、本発明の有用性は明らかである。
要な蛋白を安価に、かつ大量に供給することが可能とな
る。これまでに３００ｇのヒト脳を出発原料として１２
ｍｇのＮＳＥを精製した例が知られている（Shimizu,et
al.,Biochim. Biophys.Acta748,278 −284(1983) ）の
に対し、本発明では９ｇの菌体から約１０ｍｇのＮＳＥ
が回収されて、本発明の有用性は明らかである。
【００３０】しかも本発明で提供されるＮＳＥ蛋白は、
天然のＮＳＥとほとんど同一の免疫学的反応性を示す。
したがって、免疫測定のための免疫原、標識抗原、標準
品として利用することが可能である。
天然のＮＳＥとほとんど同一の免疫学的反応性を示す。
したがって、免疫測定のための免疫原、標識抗原、標準
品として利用することが可能である。
【図１】本発明におけるＮＳＥ発現ベクターのマップで
ある。
ある。
【図２】本発明によるＮＳＥ蛋白の各精製段階における
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】本発明のＮＳＥ蛋白を免疫測定した結果を示す
グラフである。
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (5)
- 【請求項１】 大腸菌発現ベクターｐＫＫ２２３−３の
ｔａｃプロモーターの下流にヒト神経特異エノラーゼの
γサブユニットをコードするＤＮＡを挿入したヒト神経
特異エノラーゼ蛋白発現ベクター - 【請求項２】 請求項１のベクターの発現産物から精製
されたヒト神経特異エノラーゼ蛋白。 - 【請求項３】 請求項２の蛋白を免疫原として得られる
抗体。 - 【請求項４】 請求項２の蛋白の標識物。
- 【請求項５】 請求項２の蛋白の標準品としての用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4258867A JPH06217780A (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターおよびこの蛋白の使用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4258867A JPH06217780A (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターおよびこの蛋白の使用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217780A true JPH06217780A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=17326142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4258867A Pending JPH06217780A (ja) | 1992-09-03 | 1992-09-03 | 神経特異エノラーゼ蛋白発現ベクターおよびこの蛋白の使用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06217780A (ja) |
-
1992
- 1992-09-03 JP JP4258867A patent/JPH06217780A/ja active Pending
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