JPH06225766A - 発現クローニング法 - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 蛋白質をコードしているヌクレオチド配列の
クローニング法およびそのためのキットを提供する。 【構成】 本方法は：ヌクレオチド配列およびヌクレオ
チド配列の連鎖部位に機能的に作用するように結合され
ている発現制御要素を含むベクターを含んでいる組換え
分子を作製し；組換え分子を多細胞生物由来の宿主細胞
内へ導入し；組換え分子が導入されている細胞のうち蛋
白質を特異的に検出する手段により蛋白質を発現してい
る細胞を同定し；蛋白質を発現している細胞を固体表面
に付着させ；および付着した細胞から組換え分子を回収
する工程を含んでいる。抗原をコードしているＤＮＡ配
列が入手可能な場合、抗原に対するその結合で抗体の特
異性を試験するためにもこの方法が使用できることを特
徴とする。本キットは、発現制御要素を含むベクター；
該ベクターに合致するアダプター；一対のベクターのプ
ライマー；容器；細胞固定化剤；および標識された抗体
からなることを特徴とする。
クローニング法およびそのためのキットを提供する。 【構成】 本方法は：ヌクレオチド配列およびヌクレオ
チド配列の連鎖部位に機能的に作用するように結合され
ている発現制御要素を含むベクターを含んでいる組換え
分子を作製し；組換え分子を多細胞生物由来の宿主細胞
内へ導入し；組換え分子が導入されている細胞のうち蛋
白質を特異的に検出する手段により蛋白質を発現してい
る細胞を同定し；蛋白質を発現している細胞を固体表面
に付着させ；および付着した細胞から組換え分子を回収
する工程を含んでいる。抗原をコードしているＤＮＡ配
列が入手可能な場合、抗原に対するその結合で抗体の特
異性を試験するためにもこの方法が使用できることを特
徴とする。本キットは、発現制御要素を含むベクター；
該ベクターに合致するアダプター；一対のベクターのプ
ライマー；容器；細胞固定化剤；および標識された抗体
からなることを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般的には遺伝物質の操
作に関し、特にＤＮＡ配列のクローニングおよび抗体の
スクリーニングのための方法およびキットに関する。
作に関し、特にＤＮＡ配列のクローニングおよび抗体の
スクリーニングのための方法およびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝に基づいていることが既知のまたは
疑われるヒトの疾患を理解する１つの基本的方法は関与
する遺伝子を確認することである。遺伝に基づく多くの
疾患（癌を含む）に関係する遺伝子を同定およびクロー
ン化する多くの努力がなされてきた。これらの遺伝子の
確認は疾患の過程の理解の助けとなるだけでなく新しい
診断および治療様式の開発を容易にする。
疑われるヒトの疾患を理解する１つの基本的方法は関与
する遺伝子を確認することである。遺伝に基づく多くの
疾患（癌を含む）に関係する遺伝子を同定およびクロー
ン化する多くの努力がなされてきた。これらの遺伝子の
確認は疾患の過程の理解の助けとなるだけでなく新しい
診断および治療様式の開発を容易にする。
【０００３】遺伝子のタンパク質生成物への抗体が唯一
の利用可能な“ハンドル”である未知の遺伝子のクロー
ニングの仕事は労力を用し、時間がかかる。基本的には
２つの方法が開発されてきた。１つは蛋白質を精製する
ために抗体を使用し、次に配列を決定し、そのアミノ酸
配列に基づいた縮重オリゴヌクレオチド混合物を合成す
る。オリゴヌクレオチドはファージｃＤＮＡまたはゲノ
ムライブラリーのスクリーニングのためのプローブとし
て使用され、標的遺伝物質を単離する。別の方法は標的
遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーの蛋白質生成物を発
現するために発現系を用いる。続いて陽性クローンを同
定するために抗体が使用される。原核生物プロモーター
を持つファージベクターは古典的な例であり、フィルタ
ー上のファージプラークレプリカが抗体で染色され、こ
のフィルターが次に細菌培養プレートからの陽性プラー
クを捜し出すための鋳型として使用される。問題とする
挿入物を持つファージＤＮＡが続いて回収される。
の利用可能な“ハンドル”である未知の遺伝子のクロー
ニングの仕事は労力を用し、時間がかかる。基本的には
２つの方法が開発されてきた。１つは蛋白質を精製する
ために抗体を使用し、次に配列を決定し、そのアミノ酸
配列に基づいた縮重オリゴヌクレオチド混合物を合成す
る。オリゴヌクレオチドはファージｃＤＮＡまたはゲノ
ムライブラリーのスクリーニングのためのプローブとし
て使用され、標的遺伝物質を単離する。別の方法は標的
遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーの蛋白質生成物を発
現するために発現系を用いる。続いて陽性クローンを同
定するために抗体が使用される。原核生物プロモーター
を持つファージベクターは古典的な例であり、フィルタ
ー上のファージプラークレプリカが抗体で染色され、こ
のフィルターが次に細菌培養プレートからの陽性プラー
クを捜し出すための鋳型として使用される。問題とする
挿入物を持つファージＤＮＡが続いて回収される。
【０００４】細菌真核生物発現クローニング系が首尾よ
く作り上げられた。例えば、Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ
３２９：８４０［１９８７］を参照されたい。この系は
細胞表面分子クローニングのために開発され、その主エ
ピトープが糖質部分を含んでいるような原核生物系で発
現された蛋白質を認識しない抗体が入手可能である場合
に特に有用である。シトメガロウイルス／ヒト免疫不全
ウイルス（“ＣＭＶ／ＨＩＶ”）プロモーターを含むＣ
ＤＭ８と称される非常に効率の良いベクターがＳｅｅｄ
および共同研究者により構成された。さらに、このベク
ターを含むサルウイルス４０（“ＳＶ４０”）由来物は
ＣＯＳサル細胞株のような任意のＳＶ４０Ｔ／ｔ含有宿
主細胞中で増殖させた場合、これらのエピソームを細胞
当り１０5コピーまで複製することを可能にした。
く作り上げられた。例えば、Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ
３２９：８４０［１９８７］を参照されたい。この系は
細胞表面分子クローニングのために開発され、その主エ
ピトープが糖質部分を含んでいるような原核生物系で発
現された蛋白質を認識しない抗体が入手可能である場合
に特に有用である。シトメガロウイルス／ヒト免疫不全
ウイルス（“ＣＭＶ／ＨＩＶ”）プロモーターを含むＣ
ＤＭ８と称される非常に効率の良いベクターがＳｅｅｄ
および共同研究者により構成された。さらに、このベク
ターを含むサルウイルス４０（“ＳＶ４０”）由来物は
ＣＯＳサル細胞株のような任意のＳＶ４０Ｔ／ｔ含有宿
主細胞中で増殖させた場合、これらのエピソームを細胞
当り１０5コピーまで複製することを可能にした。
【０００５】Ｓｅｅｄクローニング戦略は以下の工程を
含んでいる：１）ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェ
クションまたはプロトプラスト融合によりＣＤＭ８で構
成されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ細胞内へ導入す
る、２）細胞の単層を除去することにより陽性細胞を
“えり分け”細胞膜上に正しいｃＤＮＡを発現している
細胞が培養皿上の抗体により捕捉されるように抗体で被
覆された培養皿にそれらを暴露し、３）えり分けた細胞
からプラスミドＤＮＡを回収し、それを細菌宿主ＭＣ１
０６１／ｐ３の形質転換に使用して増殖させ増幅する。
えり分けられた細胞は問題とするクローンについて決し
て１００％純粋ではないので、回収されたプラスミドの
みが抗体により認識される蛋白質生成物を発現するまで
前記の過程を繰り返す必要がある。
含んでいる：１）ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェ
クションまたはプロトプラスト融合によりＣＤＭ８で構
成されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ細胞内へ導入す
る、２）細胞の単層を除去することにより陽性細胞を
“えり分け”細胞膜上に正しいｃＤＮＡを発現している
細胞が培養皿上の抗体により捕捉されるように抗体で被
覆された培養皿にそれらを暴露し、３）えり分けた細胞
からプラスミドＤＮＡを回収し、それを細菌宿主ＭＣ１
０６１／ｐ３の形質転換に使用して増殖させ増幅する。
えり分けられた細胞は問題とするクローンについて決し
て１００％純粋ではないので、回収されたプラスミドの
みが抗体により認識される蛋白質生成物を発現するまで
前記の過程を繰り返す必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ｃＤＮＡライブラリー
中のあまり発現されない標的遺伝子をクローン化するに
は最低１０5の独立したコピーが標的の発現を確かにす
るために必要とされる。細胞えり分けおよびプラスミド
回収の方法における本質的な低い効率はｃＤＮＡライブ
ラリーの大きな最初のプールを要求する。また、細菌に
戻してのプラスミドの形質転換も同様に低回収工程であ
り１０００コピーのうちの約１つの効率と推定される。
総合的には、抗体えり分け法は蛋白質の精製および配列
決定を避ける事ができるが、いまだ労力を必要とし、時
間もかかりおよび費用もかかるものである。
中のあまり発現されない標的遺伝子をクローン化するに
は最低１０5の独立したコピーが標的の発現を確かにす
るために必要とされる。細胞えり分けおよびプラスミド
回収の方法における本質的な低い効率はｃＤＮＡライブ
ラリーの大きな最初のプールを要求する。また、細菌に
戻してのプラスミドの形質転換も同様に低回収工程であ
り１０００コピーのうちの約１つの効率と推定される。
総合的には、抗体えり分け法は蛋白質の精製および配列
決定を避ける事ができるが、いまだ労力を必要とし、時
間もかかりおよび費用もかかるものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】一般的には、本発明は
（一つの態様において）蛋白質をコードしているヌクレ
オチド配列の発現クローニング法を特色としている。
（一つの態様において）蛋白質をコードしているヌクレ
オチド配列の発現クローニング法を特色としている。
【０００８】発現クローニング法は以下の工程を含んで
いる：問題とするヌクレオチド配列および前記ヌクレオ
チド配列の結合部位に機能的に作用するように取り付け
られた発現制御要素を含むベクターを含んでいる組換え
分子を作製し；培養皿中の多細胞生物に由来する宿主細
胞内へ組換え分子を導入し；固定された宿主細胞中の蛋
白質発現細胞を、蛋白質を特異的に検出する手段により
同定し；および付着した細胞から組換え分子を回収す
る。
いる：問題とするヌクレオチド配列および前記ヌクレオ
チド配列の結合部位に機能的に作用するように取り付け
られた発現制御要素を含むベクターを含んでいる組換え
分子を作製し；培養皿中の多細胞生物に由来する宿主細
胞内へ組換え分子を導入し；固定された宿主細胞中の蛋
白質発現細胞を、蛋白質を特異的に検出する手段により
同定し；および付着した細胞から組換え分子を回収す
る。
【０００９】本発明において“同定する”とは検出手段
と細胞を接触させる過程を意味し、蛋白質を発現してい
る細胞の位置を示す必要はない。必要に応じ、同定工程
および付着工程の実施の順序を逆転させてもよい。また
遠心分離により固体表面へ蛋白質を発現している宿主細
胞を付着させてもよい。もしくは、細胞はそれ自身表面
へ接着するであろうという事実を利用して同じ目的を達
成させてもよい。付着は培養皿の底表面またはガラスス
ライド（以下に詳細に説明するがマトリックスで被覆さ
れていてもいなくてもよい）または他の適当な容器また
は支持体へであろう。
と細胞を接触させる過程を意味し、蛋白質を発現してい
る細胞の位置を示す必要はない。必要に応じ、同定工程
および付着工程の実施の順序を逆転させてもよい。また
遠心分離により固体表面へ蛋白質を発現している宿主細
胞を付着させてもよい。もしくは、細胞はそれ自身表面
へ接着するであろうという事実を利用して同じ目的を達
成させてもよい。付着は培養皿の底表面またはガラスス
ライド（以下に詳細に説明するがマトリックスで被覆さ
れていてもいなくてもよい）または他の適当な容器また
は支持体へであろう。
【００１０】上記の方法の１つの実施態様においては付
着した細胞は同定工程の前に固定され（即ち、細胞膜を
半透性にするため）、それにより検出可能な手段の固定
宿主細胞内への流入を可能にし、一方組換え分子および
蛋白質の流出を防止する。固定は化学試薬の使用のよう
な適当な方法により実現できる。好適にはアセトンが固
定化剤として使用される。
着した細胞は同定工程の前に固定され（即ち、細胞膜を
半透性にするため）、それにより検出可能な手段の固定
宿主細胞内への流入を可能にし、一方組換え分子および
蛋白質の流出を防止する。固定は化学試薬の使用のよう
な適当な方法により実現できる。好適にはアセトンが固
定化剤として使用される。
【００１１】上記の方法において検出手段は抗体または
蛋白質に特異的に結合したリガンドであり、蛍光性基、
酵素または放射性同位元素に結合されているものが好適
である。
蛋白質に特異的に結合したリガンドであり、蛍光性基、
酵素または放射性同位元素に結合されているものが好適
である。
【００１２】上記の方法の別の好適な実施態様におい
て、組換え分子が導入される宿主細胞は同定工程前にコ
ラーゲンで被覆された培養皿のようなマトリックス上で
培養される。
て、組換え分子が導入される宿主細胞は同定工程前にコ
ラーゲンで被覆された培養皿のようなマトリックス上で
培養される。
【００１３】上記の方法において回収された組換え分子
中のヌクレオチド配列は濃厚化されていることが望まれ
る。ヌクレオチド配列およびベクター間の結合部位に隣
接する一対のベクタープライマーを使用したＰＣＲ増幅
により濃厚化が達成されるであろう。
中のヌクレオチド配列は濃厚化されていることが望まれ
る。ヌクレオチド配列およびベクター間の結合部位に隣
接する一対のベクタープライマーを使用したＰＣＲ増幅
により濃厚化が達成されるであろう。
【００１４】好適には上記の方法で作製された組換え分
子は宿主細胞中で複製できる。発現ベクターＣＤＭ８は
そのような組換え分子の構成に使用できる。また、本方
法で使用される宿主細胞がＣＯＳ細胞であるのが好適で
ある。
子は宿主細胞中で複製できる。発現ベクターＣＤＭ８は
そのような組換え分子の構成に使用できる。また、本方
法で使用される宿主細胞がＣＯＳ細胞であるのが好適で
ある。
【００１５】宿主細胞中で発現されるべき蛋白質はグリ
コシル化蛋白質のように翻訳後に修飾されてもよい。
コシル化蛋白質のように翻訳後に修飾されてもよい。
【００１６】別の態様において、本発明は抗体の蛋白質
への結合の特異性を試験する方法を特色としている（そ
の蛋白質をコードしているヌクレオチド配列が入手可能
な場合）。試験法は以下の工程を含んでる：そのヌクレ
オチド配列およびヌクレオチド配列の結合部位に機能的
に作用するように取り付けられている発現制御要素を含
むベクターを含んでいる組換え分子を調製し；多細胞生
物に由来する宿主細胞内へ組換え分子を導入し；組換え
分子が導入されている宿主細胞中の蛋白質を発現してい
る細胞を検出可能なように標識されている抗体で検出
し、抗体の蛋白質への結合の特異性を決定する。必要に
応じおよび適当な場合、組換え分子が導入される宿主細
胞は宿主細胞内への検出可能な手段の流入を可能にする
ために前に示した方法で（本発明の発現クローニング法
に関する本文を参照されたい）同定工程の前に固定され
てもよいことに注意されたい。また、抗体の特異的結合
が試験される抗原蛋白質は宿主細胞により翻訳後に修飾
される（例えばグリコシル化）蛋白質であろう。
への結合の特異性を試験する方法を特色としている（そ
の蛋白質をコードしているヌクレオチド配列が入手可能
な場合）。試験法は以下の工程を含んでる：そのヌクレ
オチド配列およびヌクレオチド配列の結合部位に機能的
に作用するように取り付けられている発現制御要素を含
むベクターを含んでいる組換え分子を調製し；多細胞生
物に由来する宿主細胞内へ組換え分子を導入し；組換え
分子が導入されている宿主細胞中の蛋白質を発現してい
る細胞を検出可能なように標識されている抗体で検出
し、抗体の蛋白質への結合の特異性を決定する。必要に
応じおよび適当な場合、組換え分子が導入される宿主細
胞は宿主細胞内への検出可能な手段の流入を可能にする
ために前に示した方法で（本発明の発現クローニング法
に関する本文を参照されたい）同定工程の前に固定され
てもよいことに注意されたい。また、抗体の特異的結合
が試験される抗原蛋白質は宿主細胞により翻訳後に修飾
される（例えばグリコシル化）蛋白質であろう。
【００１７】本発明にさらに含まれるのはヌクレオチド
配列の発現クローニングのためのまたはヌクレオチド配
列によりコードされている蛋白質への抗体の結合特異性
を試験するためのキットである。キットは以下の品目を
提供する：発現制御要素を含むベクター；ベクターと合
致するアダプター；一対のベクタープライマー；その内
部の底表面がマトリックスで被覆されているまたは被覆
がない培養皿；細胞固定化剤；および酵素、蛍光性基ま
たは同位元素が結合されている抗体。抗体はイムノアッ
セイにおいて第２の抗体として働くことに注目された
い。前に記載したように、固定化剤は細胞の処理に使用
されるであろうしそれにより細胞の膜を検出可能な手段
（抗体から成り、キットにより提供される）を透過可能
にする。
配列の発現クローニングのためのまたはヌクレオチド配
列によりコードされている蛋白質への抗体の結合特異性
を試験するためのキットである。キットは以下の品目を
提供する：発現制御要素を含むベクター；ベクターと合
致するアダプター；一対のベクタープライマー；その内
部の底表面がマトリックスで被覆されているまたは被覆
がない培養皿；細胞固定化剤；および酵素、蛍光性基ま
たは同位元素が結合されている抗体。抗体はイムノアッ
セイにおいて第２の抗体として働くことに注目された
い。前に記載したように、固定化剤は細胞の処理に使用
されるであろうしそれにより細胞の膜を検出可能な手段
（抗体から成り、キットにより提供される）を透過可能
にする。
【００１８】必要に応じ、前記のキットはさらに２つの
品目を含んでいてもよい：プラスミド−含有細胞からの
プラスミド抽出のために使用できる消化緩衝液（組成物
の例は下記を参照されたい）；およびマトリックス被覆
の一部をその残りから除去または分離する装置。例とし
てはマトリックスの一部を除去するために使用できるゲ
ージ針が提供されるかもしれない。もしくは、いわゆる
“クローニング リング”が提供され、それによりマト
リックスの特定の領域内で増殖した細胞のＤＮＡ抽出過
程を開始できるであろう。
品目を含んでいてもよい：プラスミド−含有細胞からの
プラスミド抽出のために使用できる消化緩衝液（組成物
の例は下記を参照されたい）；およびマトリックス被覆
の一部をその残りから除去または分離する装置。例とし
てはマトリックスの一部を除去するために使用できるゲ
ージ針が提供されるかもしれない。もしくは、いわゆる
“クローニング リング”が提供され、それによりマト
リックスの特定の領域内で増殖した細胞のＤＮＡ抽出過
程を開始できるであろう。
【００１９】本発明の別のキット実施態様では発現ベク
ターを提供する発現クローニングキットを含んでいる：
ベクターに合致するアダプター；一対のベクタープライ
マー；その内部底表面がマトリックスで被覆されている
どんな被覆もない培養皿；細胞固定剤；酵素基質が結合
される吸着シート；酵素が結合される抗体；基質の一部
をその残りから除去または分離するための装置。酵素含
有吸着シートを除いて、キット中の他の品目は前記のキ
ットと同じである。
ターを提供する発現クローニングキットを含んでいる：
ベクターに合致するアダプター；一対のベクタープライ
マー；その内部底表面がマトリックスで被覆されている
どんな被覆もない培養皿；細胞固定剤；酵素基質が結合
される吸着シート；酵素が結合される抗体；基質の一部
をその残りから除去または分離するための装置。酵素含
有吸着シートを除いて、キット中の他の品目は前記のキ
ットと同じである。
【００２０】ここで使用される術語“ベクター”は宿主
細胞内へ導入されることができる小さな環状の染色体外
ＤＮＡ分子を意味し、術語“発現ベクター”は少くとも
１つの発現制御要素（プロモーターまたはエンハンサー
またはスプライスおよびポリアデニル化信号を含むプロ
モーターのような）を含み、それに機能的に作用するよ
うに結合されたヌクレオチド配列を発現できるベクター
を意味する。言い換えると、“機能的に作用するように
結合された”とは少くとも１つの発現制御要素の作用に
より配列の転写が可能なように発現ベクターおよびコー
ドしているＤＮＡ配列が結合されていることを意味して
いる。挿入物およびベクターが継ぎ合わされている２つ
の点は“連鎖部位”と呼ばれている。
細胞内へ導入されることができる小さな環状の染色体外
ＤＮＡ分子を意味し、術語“発現ベクター”は少くとも
１つの発現制御要素（プロモーターまたはエンハンサー
またはスプライスおよびポリアデニル化信号を含むプロ
モーターのような）を含み、それに機能的に作用するよ
うに結合されたヌクレオチド配列を発現できるベクター
を意味する。言い換えると、“機能的に作用するように
結合された”とは少くとも１つの発現制御要素の作用に
より配列の転写が可能なように発現ベクターおよびコー
ドしているＤＮＡ配列が結合されていることを意味して
いる。挿入物およびベクターが継ぎ合わされている２つ
の点は“連鎖部位”と呼ばれている。
【００２１】術語“ヌクレオチド配列”は入手可能なＤ
ＮＡ断片も、適当な方法により作製されたＤＮＡ断片も
含まれるつもりであり、ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ
断片に制限されない。術語“蛋白質をコードしているヌ
クレオチド配列”は翻訳されるおよび翻訳されない領域
の両方を含んでいる。
ＮＡ断片も、適当な方法により作製されたＤＮＡ断片も
含まれるつもりであり、ｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡ
断片に制限されない。術語“蛋白質をコードしているヌ
クレオチド配列”は翻訳されるおよび翻訳されない領域
の両方を含んでいる。
【００２２】“ベクタープライマー”により何が意味さ
れているかというと、発現ベクターおよびＤＮＡ配列の
間の連鎖部位に隣接するベクター配列に該当する一対の
オリゴヌクレオチドであり、ＰＣＲ増幅のようなＤＮＡ
配列挿入物の濃厚化においてプライマーとして使用可能
である。
れているかというと、発現ベクターおよびＤＮＡ配列の
間の連鎖部位に隣接するベクター配列に該当する一対の
オリゴヌクレオチドであり、ＰＣＲ増幅のようなＤＮＡ
配列挿入物の濃厚化においてプライマーとして使用可能
である。
【００２３】本発明の記載に使用される他の術語は以下
出てきた時に定義または説明されるであろう。
出てきた時に定義または説明されるであろう。
【００２４】本発明のクローニング法に従うと、回収さ
れるべき細胞は回収が非常に効率的にいくように回収前
にはっきり同定される。さらに、回収細胞中の所望のＤ
ＮＡ配列を濃厚化するためにＰＣＲ増幅が使用される場
合、標的配列の回収はＤＮＡ抽出収率（本発明に従うと
収率は高い）およびＰＣＲ法の性能によってのみ制限さ
れる。さらに、トランスフェクトされた細胞が固定され
る場合細胞内蛋白質をコードするＤＮＡ配列を単離する
ために本クローニング法が使用できる。
れるべき細胞は回収が非常に効率的にいくように回収前
にはっきり同定される。さらに、回収細胞中の所望のＤ
ＮＡ配列を濃厚化するためにＰＣＲ増幅が使用される場
合、標的配列の回収はＤＮＡ抽出収率（本発明に従うと
収率は高い）およびＰＣＲ法の性能によってのみ制限さ
れる。さらに、トランスフェクトされた細胞が固定され
る場合細胞内蛋白質をコードするＤＮＡ配列を単離する
ために本クローニング法が使用できる。
【００２５】本発明の他の特色および利点は好適な実施
態様の以下の説明および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。
態様の以下の説明および特許請求の範囲から明らかにな
るであろう。
【００２６】一般クローニング法 我々は所望の組換え分子の抽出のため陽性と同定された
細胞（即ち、標的ＤＮＡ配列を含んでいる細胞）の回収
段階に先立ってトランスフェクトされた細胞が容器（例
えば培養皿またはガラススライド）に付着される発現ク
ローニング法を開発した。我々の方法は細胞表面蛋白
質、分泌された蛋白質または細胞内蛋白質をコードする
ヌクレオチド配列のクローン化に使用することができ
る。細胞内蛋白質をコードしている配列がクローン化さ
れる場合、プラスミドおよび発現された蛋白質は細胞内
に残り一方、検出基（例えば発現された蛋白質に対する
蛍光標識抗体など）は細胞内へはいっていけるように、
アセトン固定化剤などによりトランスフェクトされた細
胞の細胞膜は半透過性にされる。
細胞（即ち、標的ＤＮＡ配列を含んでいる細胞）の回収
段階に先立ってトランスフェクトされた細胞が容器（例
えば培養皿またはガラススライド）に付着される発現ク
ローニング法を開発した。我々の方法は細胞表面蛋白
質、分泌された蛋白質または細胞内蛋白質をコードする
ヌクレオチド配列のクローン化に使用することができ
る。細胞内蛋白質をコードしている配列がクローン化さ
れる場合、プラスミドおよび発現された蛋白質は細胞内
に残り一方、検出基（例えば発現された蛋白質に対する
蛍光標識抗体など）は細胞内へはいっていけるように、
アセトン固定化剤などによりトランスフェクトされた細
胞の細胞膜は半透過性にされる。
【００２７】例示の目的で本発明の１つの実施態様を表
わすクローニング法のダイアグラムが図１に示されてい
る。クローニング法のより詳細な説明は以下に示されて
いる。
わすクローニング法のダイアグラムが図１に示されてい
る。クローニング法のより詳細な説明は以下に示されて
いる。
【００２８】１．ｃＤＮＡライブラリーの作製 ハイブリダイゼーションまたは抗体結合のような利用可
能な検出法により問題とするｍＲＮＡ種またはそのコー
ドしている蛋白質を含んでいると同定された標的源（組
織または培養細胞）からポリＡ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が
単離される。常法を用い逆転写酵素により単離されたｍ
ＲＮＡからｃＤＮＡが発生される。概して、代表的なｃ
ＤＮＡライブラリーを確立するために１−５μｇのｍＲ
ＮＡが使用される。
能な検出法により問題とするｍＲＮＡ種またはそのコー
ドしている蛋白質を含んでいると同定された標的源（組
織または培養細胞）からポリＡ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が
単離される。常法を用い逆転写酵素により単離されたｍ
ＲＮＡからｃＤＮＡが発生される。概して、代表的なｃ
ＤＮＡライブラリーを確立するために１−５μｇのｍＲ
ＮＡが使用される。
【００２９】２．発現ベクターへの連結 次にｃＤＮＡはＳｅｅｄ ｅｔ ａｌ．（Ｓｅｅｄ，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２９：８４０［１９８７］、ここに引例
として含まれている）により開発されたｐＣＤＭ８ベク
ターのような発現ベクターに連結される。本発明のクロ
ーニング法の効率を増加させるため、高い複製および発
現率を持つベクターが好適である。
ａｔｕｒｅ ３２９：８４０［１９８７］、ここに引例
として含まれている）により開発されたｐＣＤＭ８ベク
ターのような発現ベクターに連結される。本発明のクロ
ーニング法の効率を増加させるため、高い複製および発
現率を持つベクターが好適である。
【００３０】連結効率を懸念して、特定の制限部位を含
む設計されたアダプター（短いオリゴヌクレオチド）が
最初にｃＤＮＡに連結され、続いて合致する制限部位を
持つ発現ベクターへ連結された。例えば、ＢｓｔＸＩア
ダプターおよびｐＣＤＭ８発現ベクターは互いに合致し
ておりこの目的に使用できる。これらの材料はＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｒｏ，ＣＡか
ら市販品として入手可能である。ライブラリー中の標的
配列の比を増加させるため、対応するメッセンジャーＲ
ＮＡの予想される大きさの範囲に基づいたサブ−ライブ
ラリーの作製が望まれるであろう。このことはｃＤＮＡ
をアガロースゲル上で分画し、大きさによる位置に基づ
いてゲルスライスを切り出してｃＤＮＡを回収すること
により達成できる。
む設計されたアダプター（短いオリゴヌクレオチド）が
最初にｃＤＮＡに連結され、続いて合致する制限部位を
持つ発現ベクターへ連結された。例えば、ＢｓｔＸＩア
ダプターおよびｐＣＤＭ８発現ベクターは互いに合致し
ておりこの目的に使用できる。これらの材料はＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｒｏ，ＣＡか
ら市販品として入手可能である。ライブラリー中の標的
配列の比を増加させるため、対応するメッセンジャーＲ
ＮＡの予想される大きさの範囲に基づいたサブ−ライブ
ラリーの作製が望まれるであろう。このことはｃＤＮＡ
をアガロースゲル上で分画し、大きさによる位置に基づ
いてゲルスライスを切り出してｃＤＮＡを回収すること
により達成できる。
【００３１】３．ＤＮＡ導入 ｃＤＮＡライブラリーまたはサブ−ライブラリーのプラ
スミドＤＮＡは本分野では既知の種々の技術（例えばト
ランスフェクション）により宿主細胞内へ導入される。
エレクトロポレーション，プロトプラスト融合、ＤＥＡ
Ｅデキストランまたはリン酸カルシウムによる方法によ
りトランスフェクションが実施できる。主たる基準はＤ
ＮＡ導入の効率が高いことおよび導入後の細胞の生存度
が維持されるべきことである。
スミドＤＮＡは本分野では既知の種々の技術（例えばト
ランスフェクション）により宿主細胞内へ導入される。
エレクトロポレーション，プロトプラスト融合、ＤＥＡ
Ｅデキストランまたはリン酸カルシウムによる方法によ
りトランスフェクションが実施できる。主たる基準はＤ
ＮＡ導入の効率が高いことおよび導入後の細胞の生存度
が維持されるべきことである。
【００３２】哺乳類、昆虫または植物のような多細胞生
物に由来する宿主細胞が本発明で使用される。好適に
は、宿主細胞は標的とされたＤＮＡ配列によりコードさ
れている型の蛋白質を発現しない。しかしながら、
（１）もし陽性細胞を同定するために使用される抗体が
組換え蛋白質（即ち、組換え分子中の挿入物によりコー
ドされている蛋白質）にのみ結合し、天然の宿主蛋白質
に結合しないならば、または（２）もし、宿主蛋白質の
発現レベルが組換え蛋白質のそれよりもはるかに低いな
らば、そのような発現も許容できる。
物に由来する宿主細胞が本発明で使用される。好適に
は、宿主細胞は標的とされたＤＮＡ配列によりコードさ
れている型の蛋白質を発現しない。しかしながら、
（１）もし陽性細胞を同定するために使用される抗体が
組換え蛋白質（即ち、組換え分子中の挿入物によりコー
ドされている蛋白質）にのみ結合し、天然の宿主蛋白質
に結合しないならば、または（２）もし、宿主蛋白質の
発現レベルが組換え蛋白質のそれよりもはるかに低いな
らば、そのような発現も許容できる。
【００３３】培養皿がコラーゲンで被覆されていること
が好適である。そのような被覆は、次の処理のための皿
からの陽性細胞の除去を便利にする。コラーゲンは細胞
増殖のための優れたマトリックスとして働くので好適で
ある。また、その粘性のため針などの取り出しが容易で
あり、それに結合または付着している細胞の回収を容易
にする。さらに、コラーゲンは標的ＤＮＡ配列を含む細
胞の同定に使用されるイムノアッセイを妨害しない。細
胞増殖のためのマトリックスとして使用できる他の物質
としてはアガロースが挙げられる。
が好適である。そのような被覆は、次の処理のための皿
からの陽性細胞の除去を便利にする。コラーゲンは細胞
増殖のための優れたマトリックスとして働くので好適で
ある。また、その粘性のため針などの取り出しが容易で
あり、それに結合または付着している細胞の回収を容易
にする。さらに、コラーゲンは標的ＤＮＡ配列を含む細
胞の同定に使用されるイムノアッセイを妨害しない。細
胞増殖のためのマトリックスとして使用できる他の物質
としてはアガロースが挙げられる。
【００３４】もしくは、酵素結合免疫吸着検査法（“Ｅ
ＬＩＳＡ”）が問題とする細胞の同定に使用されるなら
ばトランスフェクトされた細胞はマルチ−ウェルプレー
トに乗せられる。
ＬＩＳＡ”）が問題とする細胞の同定に使用されるなら
ばトランスフェクトされた細胞はマルチ−ウェルプレー
トに乗せられる。
【００３５】４．陽性細胞の同定 特に細胞内蛋白質をコードしているＤＮＡ配列がクロー
ン化されるものである場合、皿上で増殖しているトラン
スフェクトされた細胞は最初に適当な固定化剤で処理す
るのが好適である（例えば冷アセトンに１０分間浸し、
続いて風乾する）。適した化学試薬はホルムアルデヒ
ド、エタノール、グリセリルアルデヒドまたはホルマリ
ンである。固定化剤の選択において最も重要な基準のう
ちの２つは、それが発現抗原蛋白質のエピトープを破壊
しないことおよび、陽性細胞の同定および細胞内へ導入
されたＤＮＡの回収を妨害しないことである。
ン化されるものである場合、皿上で増殖しているトラン
スフェクトされた細胞は最初に適当な固定化剤で処理す
るのが好適である（例えば冷アセトンに１０分間浸し、
続いて風乾する）。適した化学試薬はホルムアルデヒ
ド、エタノール、グリセリルアルデヒドまたはホルマリ
ンである。固定化剤の選択において最も重要な基準のう
ちの２つは、それが発現抗原蛋白質のエピトープを破壊
しないことおよび、陽性細胞の同定および細胞内へ導入
されたＤＮＡの回収を妨害しないことである。
【００３６】間接免疫蛍光法（“ＩＦ”）が陽性細胞の
同定に使用することができ、それは第２抗体試薬として
の同じ種の正常血清での保護、特異抗原に対する非標識
第１の抗体との最初のインキュベーション、続いての蛍
光標識（例えばＦＩＴＣ）が結合された第２の抗体（第
１の抗体の化学種およびイムノグロブリンの組に向か
う）とのインキュベーションの工程を含んでいる。もし
くは、アビジン−ビオチン−蛍光法を使用してもよい。
ここに引例として含まれているＨａｒｌｏｗ，Ｅおよび
Ｌａｎｅ，Ｏ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，１９
８８を参照されたい。抗体反応性細胞は蛍光顕微鏡によ
る観察で同定でき、陽性に同定された細胞の領域は培養
皿の底に注意深く印を付ける。
同定に使用することができ、それは第２抗体試薬として
の同じ種の正常血清での保護、特異抗原に対する非標識
第１の抗体との最初のインキュベーション、続いての蛍
光標識（例えばＦＩＴＣ）が結合された第２の抗体（第
１の抗体の化学種およびイムノグロブリンの組に向か
う）とのインキュベーションの工程を含んでいる。もし
くは、アビジン−ビオチン−蛍光法を使用してもよい。
ここに引例として含まれているＨａｒｌｏｗ，Ｅおよび
Ｌａｎｅ，Ｏ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ Ｐｒｅｓｓ，１９
８８を参照されたい。抗体反応性細胞は蛍光顕微鏡によ
る観察で同定でき、陽性に同定された細胞の領域は培養
皿の底に注意深く印を付ける。
【００３７】前記のごとくＥＬＩＳＡもまた陽性細胞の
同定に使用でき、手動かまたは自動化プレート読み取り
機（光電光度計の一種）を使用する。類似の酵素結合ア
ッセイが酵素基質で前もって浸漬されたまたは被覆され
ているニトロセルロースシートまたはろ紙のような吸着
シートを用いることより使用できる。そのようなシート
は細胞に対して置かれた場合染色される。染色されたレ
プリカシートは標的細胞の位置決定に使用できる。この
方法は分泌された蛋白質をコードしているＤＮＡ配列の
クローニングに最も適している。酵素結合アッセイに適
した酵素にはアルカリ性ホスファターゼ、グリコースオ
キシダーゼおよびルシフェラーゼが含まれる。
同定に使用でき、手動かまたは自動化プレート読み取り
機（光電光度計の一種）を使用する。類似の酵素結合ア
ッセイが酵素基質で前もって浸漬されたまたは被覆され
ているニトロセルロースシートまたはろ紙のような吸着
シートを用いることより使用できる。そのようなシート
は細胞に対して置かれた場合染色される。染色されたレ
プリカシートは標的細胞の位置決定に使用できる。この
方法は分泌された蛋白質をコードしているＤＮＡ配列の
クローニングに最も適している。酵素結合アッセイに適
した酵素にはアルカリ性ホスファターゼ、グリコースオ
キシダーゼおよびルシフェラーゼが含まれる。
【００３８】32Ｐのごとき同位元素もまた陽性細胞の検
出に使用できる。その高い感度のため、この検出法は組
換え分子が低い複製または発現レベルしか持っていない
場合に特に適している。
出に使用できる。その高い感度のため、この検出法は組
換え分子が低い複製または発現レベルしか持っていない
場合に特に適している。
【００３９】５．細胞からのプラスミドＤＮＡの回収 トランスフェクトされた細胞がコラーゲンゲルまたはマ
トリックス上で培養された場合、コラーゲン層に切れ目
を入れるための小さなゲージの皮下用針を用いて陽性と
同定された細胞が取り出せ、そのような細胞を含む印を
付けられたコラーゲン片を集める。コラーゲン断片は典
型的には５０−１００の細胞を含んでおり、無菌の微小
遠心管に移す。管に消化緩衝液１０μｌ（即ち、細胞か
らＤＮＡを抽出するために使用される溶液；例えば５０
ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トウィーン２
０および２００ｎｇ／ｍｌの蛋白分解酵素Ｋ）を加え、
細胞からＤＮＡを放出させるために５５℃で３時間イン
キュベーションを行う。簡単な遠心分離後プラスミドを
含む上澄液を次の処理にかける。
トリックス上で培養された場合、コラーゲン層に切れ目
を入れるための小さなゲージの皮下用針を用いて陽性と
同定された細胞が取り出せ、そのような細胞を含む印を
付けられたコラーゲン片を集める。コラーゲン断片は典
型的には５０−１００の細胞を含んでおり、無菌の微小
遠心管に移す。管に消化緩衝液１０μｌ（即ち、細胞か
らＤＮＡを抽出するために使用される溶液；例えば５０
ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トウィーン２
０および２００ｎｇ／ｍｌの蛋白分解酵素Ｋ）を加え、
細胞からＤＮＡを放出させるために５５℃で３時間イン
キュベーションを行う。簡単な遠心分離後プラスミドを
含む上澄液を次の処理にかける。
【００４０】陽性細胞を取り出す別の方法がある。例え
ば、陽性の細胞に対しトリプシン溶液に前もって浸漬し
たろ紙の小片を置くことができる。トリプシン処理され
たら、ＤＮＡ抽出を行うため細胞はたやすく紙で取り出
すことができる。
ば、陽性の細胞に対しトリプシン溶液に前もって浸漬し
たろ紙の小片を置くことができる。トリプシン処理され
たら、ＤＮＡ抽出を行うため細胞はたやすく紙で取り出
すことができる。
【００４１】もしくは、細胞を消化緩衝液で処理でき、
その間細胞は培養皿またはマルチウェルプレートに残っ
ている。前者の場合、両端が開放されている小さなガラ
スシリンダーである細胞培養クローニングリング（Ｂｅ
ｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ，Ｖｉｎｃｌａｎｄ，ＮＪ）が使
用できる。特に、所望の細胞が内部にくるように培養皿
上にスクリーニングリングを置き、消化緩衝液をこの隔
離された領域に入れ、最後に混合物は次の処理のために
リングから出して試験管内へ移す。
その間細胞は培養皿またはマルチウェルプレートに残っ
ている。前者の場合、両端が開放されている小さなガラ
スシリンダーである細胞培養クローニングリング（Ｂｅ
ｌｌｃｏ Ｇｌａｓｓ，Ｖｉｎｃｌａｎｄ，ＮＪ）が使
用できる。特に、所望の細胞が内部にくるように培養皿
上にスクリーニングリングを置き、消化緩衝液をこの隔
離された領域に入れ、最後に混合物は次の処理のために
リングから出して試験管内へ移す。
【００４２】６．ＤＮＡ挿入物の増幅 陽性と同定された細胞からのプラスミドＤＮＡは適当な
方法により濃厚化できる。例えば、通常の方法を適用で
きる。即ち、プラスミドＤＮＡによる細菌宿主細胞の形
質転換、形質転換された細胞の増殖およびそれらからの
プラスミドＤＮＡの単離。
方法により濃厚化できる。例えば、通常の方法を適用で
きる。即ち、プラスミドＤＮＡによる細菌宿主細胞の形
質転換、形質転換された細胞の増殖およびそれらからの
プラスミドＤＮＡの単離。
【００４３】好適にはクローニング部位に隣接するベク
ター配列に対応する一対のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして使用するＰＣＲ（酵素的増幅法）をＤＮＡ挿
入物の特異的濃厚化に使用できる。
ター配列に対応する一対のオリゴヌクレオチドをプライ
マーとして使用するＰＣＲ（酵素的増幅法）をＤＮＡ挿
入物の特異的濃厚化に使用できる。
【００４４】ＰＣＲ法が使用される場合、プライマーと
してのオリゴヌクレオチドの選択基準には以下の点が含
まれる：（１）約５０％のＧ−Ｃ含量および１８−３０
塩基対の大きさを持つ、（２）可能な限りクローニング
部位に近接する、および（３）ベクター中に望まれる制
限部位を保存している。
してのオリゴヌクレオチドの選択基準には以下の点が含
まれる：（１）約５０％のＧ−Ｃ含量および１８−３０
塩基対の大きさを持つ、（２）可能な限りクローニング
部位に近接する、および（３）ベクター中に望まれる制
限部位を保存している。
【００４５】また、１つ以上のＰＣＲ生成物が検出され
る場合、単一のｃＤＮＡがクローン化されプライマーの
少くとも１つが選択された領域以外の領域にハイブリダ
イズしているかまたは２つまたはそれ以上のｃＤＮＡが
取り出されたかである。前者の場合もし必要ならまたは
望まれるならば異なった組のプライマーが使用でき、試
験できる。後者の場合、即ち得られたＤＮＡ断片が単一
集団でない場合、これらの断片はベクター中に戻して結
合でき、ｃＤＮＡクローンをさらに濃厚化させ分離する
ために前記工程３−６が繰り返されるであろう。
る場合、単一のｃＤＮＡがクローン化されプライマーの
少くとも１つが選択された領域以外の領域にハイブリダ
イズしているかまたは２つまたはそれ以上のｃＤＮＡが
取り出されたかである。前者の場合もし必要ならまたは
望まれるならば異なった組のプライマーが使用でき、試
験できる。後者の場合、即ち得られたＤＮＡ断片が単一
集団でない場合、これらの断片はベクター中に戻して結
合でき、ｃＤＮＡクローンをさらに濃厚化させ分離する
ために前記工程３−６が繰り返されるであろう。
【００４６】さらに、５’末端に付加された余分の塩基
対（繰り返しのＰＣＲ増幅および連結の結果）が標的遺
伝子の発現に影響する場合、付加的塩基が消化されなく
なることを可能にし、ベクターに関して増幅される挿入
物の一方向への配向を可能にするであろう制限部位を取
り込むようにアダプターを修正できる。
対（繰り返しのＰＣＲ増幅および連結の結果）が標的遺
伝子の発現に影響する場合、付加的塩基が消化されなく
なることを可能にし、ベクターに関して増幅される挿入
物の一方向への配向を可能にするであろう制限部位を取
り込むようにアダプターを修正できる。
【００４７】必要に応じ、“３ＳＲ”（自己持続性配列
複製）系と称されている別の酵素的増幅法もまた使用す
ることができる。３ＳＲ系のための試薬キットはＢａｒ
ｔｅｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｓｓａｑｕｈ
ＷＡから入手可能である。
複製）系と称されている別の酵素的増幅法もまた使用す
ることができる。３ＳＲ系のための試薬キットはＢａｒ
ｔｅｌｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｓｓａｑｕｈ
ＷＡから入手可能である。
【００４８】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡ挿入
物のクローニング Ｅｃｔｏ−ＡＴＰaseをコードしているＤＮＡ配列、
ａ．ｋ．ａ．“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ”は最近単離
され特徴付けられた。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４４０８［１９８９］を参照
されたい。Ｌｉｎおよび共同研究者は細胞−ＣＡＭ １
０５ＬＦ構築物（図３Ａ）の作製にｐＣＯＭ８（図２）
を使用し、２つの制限部位、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ
（図２において各々アステリスクにより示されている）
内へ細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡ（図３Ａで濃
くした線）を挿入した。
物のクローニング Ｅｃｔｏ−ＡＴＰaseをコードしているＤＮＡ配列、
ａ．ｋ．ａ．“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ”は最近単離
され特徴付けられた。Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４４０８［１９８９］を参照
されたい。Ｌｉｎおよび共同研究者は細胞−ＣＡＭ １
０５ＬＦ構築物（図３Ａ）の作製にｐＣＯＭ８（図２）
を使用し、２つの制限部位、ＸｂａＩおよびＰｓｔＩ
（図２において各々アステリスクにより示されている）
内へ細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡ（図３Ａで濃
くした線）を挿入した。
【００４９】我々は本発明のクローニング法の効率およ
び感度を示すための出発物質として図３の構築物を使用
した。
び感度を示すための出発物質として図３の構築物を使用
した。
【００５０】６０ｍｍ培養皿上５−８時間ＬＩＰＯＦＥ
ＣＴＮTM−開始法（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）により１０μｇの細胞−ＣＡＭ
１０５ＬＦプラスミドが５×１０5ＣＯＳ細胞（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，アクセス番号１
６５０）をトランスフェクトするのに使用され、５×１
０3細胞／μｇプラスミドの高さの効率比であった。細
胞は続いて１０％ウシ胎児血清を含む培地にまかれ、一
夜インキュベートした。１２−２４時間後、細胞を１：
２に分割し、コラーゲン被覆培養皿に入れ、さらに２４
−３６時間インキュベートした。コラーゲンはラット尾
の腱から調製され、“ラット尾コラーゲン”として知ら
れているものである。調製方法はＳｉｒａｃａ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７４：２８３−２８７［１９７７］を参照された
い。もしくは、“Ｖｉｔｒｏｇｅｎ”の商品名のウシ腱
コラーゲンのようなコラーゲンの市販製造品がＦｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡを含
む供給元から入手可能である。
ＣＴＮTM−開始法（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ
Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）により１０μｇの細胞−ＣＡＭ
１０５ＬＦプラスミドが５×１０5ＣＯＳ細胞（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，アクセス番号１
６５０）をトランスフェクトするのに使用され、５×１
０3細胞／μｇプラスミドの高さの効率比であった。細
胞は続いて１０％ウシ胎児血清を含む培地にまかれ、一
夜インキュベートした。１２−２４時間後、細胞を１：
２に分割し、コラーゲン被覆培養皿に入れ、さらに２４
−３６時間インキュベートした。コラーゲンはラット尾
の腱から調製され、“ラット尾コラーゲン”として知ら
れているものである。調製方法はＳｉｒａｃａ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７４：２８３−２８７［１９７７］を参照された
い。もしくは、“Ｖｉｔｒｏｇｅｎ”の商品名のウシ腱
コラーゲンのようなコラーゲンの市販製造品がＦｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡを含
む供給元から入手可能である。
【００５１】コラーゲン被覆培養皿上で増殖しているト
ランスフェクトされた細胞は間接免疫蛍光アッセイにか
けられる前に冷アセトン中で固定され次に放置して風乾
された。使用されたモノクローナル抗体は我々の実験室
で発生させた（方法はここに引例として含まれているＭ
ｏｗｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１
３：４７［１９９１］を参照されたい）。第２の試薬は
Ｖｅｃｔｏｒ ＬａｂＩｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡ）より購入された。各々のプラスミドのトラン
スフェクトされたコピーは宿主細胞中で１０5のコピー
まで複製できおよび各々のコピーは挿入ｃＤＮＡの高レ
ベルの発現を導く強力なプロモーターを含んでいるので
免疫蛍光染色による単一陽性細胞の認識が可能であっ
た。抗体−反応性細胞は蛍光顕微鏡による観察により同
定された（図５）。対照として、トランスフェクトされ
ていない細胞も蛍光染色され、顕微鏡で観察された（図
６）。陽性細胞に対応する領域は培養皿の底に注意深く
印を付けられた。
ランスフェクトされた細胞は間接免疫蛍光アッセイにか
けられる前に冷アセトン中で固定され次に放置して風乾
された。使用されたモノクローナル抗体は我々の実験室
で発生させた（方法はここに引例として含まれているＭ
ｏｗｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１
３：４７［１９９１］を参照されたい）。第２の試薬は
Ｖｅｃｔｏｒ ＬａｂＩｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡ）より購入された。各々のプラスミドのトラン
スフェクトされたコピーは宿主細胞中で１０5のコピー
まで複製できおよび各々のコピーは挿入ｃＤＮＡの高レ
ベルの発現を導く強力なプロモーターを含んでいるので
免疫蛍光染色による単一陽性細胞の認識が可能であっ
た。抗体−反応性細胞は蛍光顕微鏡による観察により同
定された（図５）。対照として、トランスフェクトされ
ていない細胞も蛍光染色され、顕微鏡で観察された（図
６）。陽性細胞に対応する領域は培養皿の底に注意深く
印を付けられた。
【００５２】陽性細胞は小さなゲージの皮下用針により
マトリックスと一緒に都合よく除去された。コラーゲン
断片は典型的には５０−１００の細胞を含んでおり、無
菌の微小遠心管へ移された。管へ１０μｌの消化緩衝液
（組成は前を参照されたい）を加え、続いて５５℃で３
時間インキュベートして細胞からＤＮＡを放出させた。
軽く遠心分離した後、プラスミドＤＮＡを含む上澄液を
ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
マトリックスと一緒に都合よく除去された。コラーゲン
断片は典型的には５０−１００の細胞を含んでおり、無
菌の微小遠心管へ移された。管へ１０μｌの消化緩衝液
（組成は前を参照されたい）を加え、続いて５５℃で３
時間インキュベートして細胞からＤＮＡを放出させた。
軽く遠心分離した後、プラスミドＤＮＡを含む上澄液を
ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【００５３】ＰＣＲのためのプライマーとして働くよう
に一対のオリゴヌクレオチド（我々によりＨｘおよびＮ
ｐと称された）がクローニング部位に隣接するＣＤＭ８
ベクター配列の領域に基づいて設計された。これらのプ
ライマーは以下の様である（５’末端から３’末端）： ＋鎖（“Ｈｘ”）： CCCACTGCTTAACTGGCTTATCGA (SEQ ID NO:1) −鎖（“Ｎｐ”）： GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC (SEQ ID NO:2)
に一対のオリゴヌクレオチド（我々によりＨｘおよびＮ
ｐと称された）がクローニング部位に隣接するＣＤＭ８
ベクター配列の領域に基づいて設計された。これらのプ
ライマーは以下の様である（５’末端から３’末端）： ＋鎖（“Ｈｘ”）： CCCACTGCTTAACTGGCTTATCGA (SEQ ID NO:1) −鎖（“Ｎｐ”）： GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC (SEQ ID NO:2)
【００５４】ＰＣＲサイクルは以下のごとく実施され
た：変性，９４℃，１分；アニーリング，６５℃，１
分；および伸長，７２℃，３分。ＰＣＲの生成物はアガ
ロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によ
り分析され（図７）、および続いて図４に示したプロー
ブを使用するサザンブロッティングより分析した（図
８）。
た：変性，９４℃，１分；アニーリング，６５℃，１
分；および伸長，７２℃，３分。ＰＣＲの生成物はアガ
ロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によ
り分析され（図７）、および続いて図４に示したプロー
ブを使用するサザンブロッティングより分析した（図
８）。
【００５５】図７および８に対し、アガロースゲルに用
いられた試料は以下のごとくである。レーン：１，ＤＮ
Ａ分子量マーカー；２，ＣＤＭ８からのＰＣＲ増幅生成
物；３，細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミドからのＰ
ＣＲ増幅生成物；４，レーン３の試料のＰｓｔＩ消化
物；５，レーン３の試料のＢａｍＨＩ消化物；６，取り
出された陽性細胞のＤＮＡからのＰＣＲ増幅生成物；
７，レーン６の試料のＰｓｔＩ消化物；８，レーン６の
試料のＢａｍＨＩ消化物；９，“鋳型なし”の対照物；
１０，“トランスフェクトされていない細胞”の対照
物；１１，細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ プラスミド；１
２，ＰＣＲ増幅λＤＮＡ。ＰＣＲ増幅が実施された場
合、プライマーＨｘおよびＮｓ(5' GCAGGCGCAGAACTGGTA
GGTAT 3',SEQ ID NO:3)が使用されているレーン２を除
いてプライマーＨｘおよびＮｐが使用された。
いられた試料は以下のごとくである。レーン：１，ＤＮ
Ａ分子量マーカー；２，ＣＤＭ８からのＰＣＲ増幅生成
物；３，細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミドからのＰ
ＣＲ増幅生成物；４，レーン３の試料のＰｓｔＩ消化
物；５，レーン３の試料のＢａｍＨＩ消化物；６，取り
出された陽性細胞のＤＮＡからのＰＣＲ増幅生成物；
７，レーン６の試料のＰｓｔＩ消化物；８，レーン６の
試料のＢａｍＨＩ消化物；９，“鋳型なし”の対照物；
１０，“トランスフェクトされていない細胞”の対照
物；１１，細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ プラスミド；１
２，ＰＣＲ増幅λＤＮＡ。ＰＣＲ増幅が実施された場
合、プライマーＨｘおよびＮｓ(5' GCAGGCGCAGAACTGGTA
GGTAT 3',SEQ ID NO:3)が使用されているレーン２を除
いてプライマーＨｘおよびＮｐが使用された。
【００５６】図３に示したごとくプライマーＨｘは２つ
の領域にハイブリダイズする、即ち、計画された１つの
クローニング部位に隣接する配列および細胞−ＣＡＭ
１０５ＬＦ挿入物の中央近くの予期されなかった配列
（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［前記文献］の番号付けシステム
を基準にすると７９８−８２１位）。このことはレーン
３および６でなぜ２つのバンドが観察されたかを説明す
るものであり、ＰＣＲ生成物に相当する上のものが完全
ｃＤＮＡ挿入物を包含している。レーン３−５は期待さ
れたレーン６−８のパターンと同一のものを示してお
り、本発明の方法によりクローン化されたｃＤＮＡは本
当に細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ挿入物であったことを示
している。
の領域にハイブリダイズする、即ち、計画された１つの
クローニング部位に隣接する配列および細胞−ＣＡＭ
１０５ＬＦ挿入物の中央近くの予期されなかった配列
（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ［前記文献］の番号付けシステム
を基準にすると７９８−８２１位）。このことはレーン
３および６でなぜ２つのバンドが観察されたかを説明す
るものであり、ＰＣＲ生成物に相当する上のものが完全
ｃＤＮＡ挿入物を包含している。レーン３−５は期待さ
れたレーン６−８のパターンと同一のものを示してお
り、本発明の方法によりクローン化されたｃＤＮＡは本
当に細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ挿入物であったことを示
している。
【００５７】このように本発明の方法はｃＤＮＡの発現
クローニングにおいて機能的に作用していることが決定
的に示された。
クローニングにおいて機能的に作用していることが決定
的に示された。
【００５８】抗体特異性の試験 本発明のクローニング法はまた抗原をコードしているＤ
ＮＡ配列が入手可能である場合蛋白質抗原への結合につ
いての抗体の特異性試験にも適用できる。そのような方
法はたとえ抗原が入手できない場合においても低価格で
抗体のスクリーニングおよび特異的抗体の選択に使用で
きるので科学的研究および商業利用の両方において非常
に重要である。スクリーニングされる抗体（例えばモノ
クローナル抗体）は問題とする抗原をコードしているＤ
ＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞
からの粗蛋白質調製試料を適当な動物に注射することに
より発生できる。
ＮＡ配列が入手可能である場合蛋白質抗原への結合につ
いての抗体の特異性試験にも適用できる。そのような方
法はたとえ抗原が入手できない場合においても低価格で
抗体のスクリーニングおよび特異的抗体の選択に使用で
きるので科学的研究および商業利用の両方において非常
に重要である。スクリーニングされる抗体（例えばモノ
クローナル抗体）は問題とする抗原をコードしているＤ
ＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞
からの粗蛋白質調製試料を適当な動物に注射することに
より発生できる。
【００５９】抗体試験またはスクリーニング法は以下の
通りである。最初にコードしているＤＮＡを含む発現ベ
クターが適当な宿主細胞内へ導入される。もし、発現さ
れた抗原が細胞内蛋白質である場合、好適には、アセト
ンのような適した固定化剤を用いて細胞膜を半透過性に
する。
通りである。最初にコードしているＤＮＡを含む発現ベ
クターが適当な宿主細胞内へ導入される。もし、発現さ
れた抗原が細胞内蛋白質である場合、好適には、アセト
ンのような適した固定化剤を用いて細胞膜を半透過性に
する。
【００６０】試験されるべき抗体は検出可能に標識した
後（例えば直接的または間接的に蛍光化合物、放射性同
位元素または適当な酵素と結合させる）発現された抗原
蛋白質の検出に使用される。陽性細胞の存在は試験され
るべき抗体が発現された抗原に特異的に結合しているこ
とを示している。
後（例えば直接的または間接的に蛍光化合物、放射性同
位元素または適当な酵素と結合させる）発現された抗原
蛋白質の検出に使用される。陽性細胞の存在は試験され
るべき抗体が発現された抗原に特異的に結合しているこ
とを示している。
【００６１】クローニング／アッセイ キット 前記の方法（即ち、ＤＮＡ配列の発現クローニングおよ
び抗体の試験／選択）のためのキットがこれらの方法の
実施を欲している人に便宜をはかるため提供できる。
び抗体の試験／選択）のためのキットがこれらの方法の
実施を欲している人に便宜をはかるため提供できる。
【００６２】そのようなクローニングキットにより、望
ましい検出抗体および適当な宿主細胞株または系統を手
に入れたいと思っている使用者が蛋白質をコードしてい
るヌクレオチド配列のクローニングの仕事を容易に始め
ることができる。同じ理由により抗体試験キットにより
問題とする抗原蛋白質をコードしているＤＮＡ配列が手
に入り次第、所望の抗体をスクリーニングすることが可
能である。
ましい検出抗体および適当な宿主細胞株または系統を手
に入れたいと思っている使用者が蛋白質をコードしてい
るヌクレオチド配列のクローニングの仕事を容易に始め
ることができる。同じ理由により抗体試験キットにより
問題とする抗原蛋白質をコードしているＤＮＡ配列が手
に入り次第、所望の抗体をスクリーニングすることが可
能である。
【００６３】そのようなキットの製造は本分野ではよく
知られている。またそのようなキットの使用は前記のク
ローニングＤＮＡ配列のためのおよび抗体試験のための
方法の説明から明らかである。
知られている。またそのようなキットの使用は前記のク
ローニングＤＮＡ配列のためのおよび抗体試験のための
方法の説明から明らかである。
【００６４】他の実施態様は特許請求の範囲に含まれて
いる。
いる。
配列番号：１ 配列の長さ：２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCCACTGCTT AACTGGCTTA TCGA 24 配列番号：２ 配列の長さ：２４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTCACACCAC AGAAGTAAGG TTCC 24 配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCAGGCGCAG AACTGGTAGG TAT 23
【図１】本発明の１つの実施態様に従った方法のダイア
グラムである。
グラムである。
【図２】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡを含む構
築物（“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ 構築物”または
“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミド”）の製造に使
用されたベクター、ｐＣＤＭ８を示す制限地図である。
築物（“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ 構築物”または
“細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミド”）の製造に使
用されたベクター、ｐＣＤＭ８を示す制限地図である。
【図３】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡを含む構
築物を表わしており、ＰＣＲプライマーＨｘおよびＮｐ
のための２つの制限部位および３つの結合部位を示す制
限地図である。
築物を表わしており、ＰＣＲプライマーＨｘおよびＮｐ
のための２つの制限部位および３つの結合部位を示す制
限地図である。
【図４】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ構築物を鋳型として
およびＨｘおよびＮｐをプライマーとして使用する増幅
による２つのＰＣＲ生成物を表わしている制限地図であ
る。
およびＨｘおよびＮｐをプライマーとして使用する増幅
による２つのＰＣＲ生成物を表わしている制限地図であ
る。
【図５】トランスフェクトされた細胞の免疫蛍光アッセ
イの結果を示している２枚の写真である。（上：蛍光顕
微鏡；下：位相差顕微鏡）
イの結果を示している２枚の写真である。（上：蛍光顕
微鏡；下：位相差顕微鏡）
【図６】トランスフェクトされていない細胞の免疫蛍光
アッセイの結果を示している２枚の写真である。（上：
蛍光顕微鏡；下：位相差顕微鏡）
アッセイの結果を示している２枚の写真である。（上：
蛍光顕微鏡；下：位相差顕微鏡）
【図７】アガロースゲル電気泳動（エチジウムブロミド
で染色）の写真であり、陽性細胞からのＤＮＡのベクタ
ー開始挿入物増幅のＰＣＲ生成物を示している。
で染色）の写真であり、陽性細胞からのＤＮＡのベクタ
ー開始挿入物増幅のＰＣＲ生成物を示している。
【図８】図７のアガロースゲルのサザンブロット分析の
オートラジオグラフである。
オートラジオグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１月１７日
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１つの実施態様に従った方法のダイア
グラムである。
グラムである。
【図２】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡを含む構
築物（”細胞−ＣＡＭ１０５ＬＦ 構築物”または”細
胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミド”）の製造に使用さ
れたベクター、ｐＣＤＭ８を示す制限地図である。
築物（”細胞−ＣＡＭ１０５ＬＦ 構築物”または”細
胞−ＣＡＭ １０５ＬＦプラスミド”）の製造に使用さ
れたベクター、ｐＣＤＭ８を示す制限地図である。
【図３】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ ｃＤＮＡを含む構
築物をあらわしており、ＰＣＲプライマーＨｘおよびＮ
ｐのための２つの制限部位および３つの結合部位を示す
制限地図である。
築物をあらわしており、ＰＣＲプライマーＨｘおよびＮ
ｐのための２つの制限部位および３つの結合部位を示す
制限地図である。
【図４】細胞−ＣＡＭ １０５ＬＦ構築物を鋳型として
およびＨｘおよびＮｐをプライマーとして使用する増幅
による２つのＰＣＲ生成物を表している制限地図であ
る。
およびＨｘおよびＮｐをプライマーとして使用する増幅
による２つのＰＣＲ生成物を表している制限地図であ
る。
【図５】コラーゲン被覆培養皿上で増殖したトランスフ
ェクトされた細胞の蛍光免疫アッセイの結果得られた、
蛍光染色された細胞のパターンを蛍光顕微鏡および位相
差顕微鏡により観察した２枚の写真、すなわち培養皿と
いう基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡の蛍光パタ
ーンを示す２枚の写真（上：蛍光顕微鏡；下：位相差顕
微鏡）である。
ェクトされた細胞の蛍光免疫アッセイの結果得られた、
蛍光染色された細胞のパターンを蛍光顕微鏡および位相
差顕微鏡により観察した２枚の写真、すなわち培養皿と
いう基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡の蛍光パタ
ーンを示す２枚の写真（上：蛍光顕微鏡；下：位相差顕
微鏡）である。
【図６】コラーゲン被覆培養皿上で増殖したトランスフ
ェクトされていない細胞の蛍光免疫アッセイの結果得ら
れた、蛍光染色された細胞のパターンを蛍光顕微鏡およ
び位相差顕微鏡により観察した２枚の写真、すなわち培
養皿という基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡の蛍
光パターンを示す２枚の写真（上：蛍光顕微鏡；下：位
相差顕微鏡）である。
ェクトされていない細胞の蛍光免疫アッセイの結果得ら
れた、蛍光染色された細胞のパターンを蛍光顕微鏡およ
び位相差顕微鏡により観察した２枚の写真、すなわち培
養皿という基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡の蛍
光パターンを示す２枚の写真（上：蛍光顕微鏡；下：位
相差顕微鏡）である。
【図７】陽性細胞からのＤＮＡのベクター開始挿入物増
幅のＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動（エチジウ
ムブロミドで染色）の写真である。
幅のＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動（エチジウ
ムブロミドで染色）の写真である。
【図８】図７のアガロースゲル電気泳動パターンのサザ
ンブロット分析のオートラジオグラフ、すなわちＸ線写
真感光基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡のパター
ンを示す写真である。
ンブロット分析のオートラジオグラフ、すなわちＸ線写
真感光基板上に形成された微細かつ微妙な濃淡のパター
ンを示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナンシー・エル・トンプソン アメリカ合衆国ロード・アイランド州 02806，バーリントン，ミドル・ハイウェ イ 280 (72)発明者 ダグラス・シー・ヒクソン アメリカ合衆国ロード・アイランド州 02806，バーリントン，ボーデン・ストリ ート 35
Claims (30)
- 【請求項１】 蛋白質をコードしているヌクレオチド配
列のクローニング法であって、以下の工程からなる方
法：該ヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列の連
鎖部位に機能的に作用するように結合された発現制御要
素を含むベクターを含んでいる組換え分子を作製し；該
組換え分子を多細胞生物由来の宿主細胞内へ導入し；該
組換え分子が導入された該宿主細胞の中から該蛋白質を
特異的に検出する手段により（該検出手段は該蛋白質に
特異的に結合する抗体またはリガンドであり、蛍光性
基、酵素または放射性同位元素に結合されている）該蛋
白質を発現している細胞を同定し；該蛋白質を発現して
いる該細胞を固体表面へ付着させ；および該組換え分子
を該付着細胞から回収する。 - 【請求項２】 該同定工程の前に該組換え分子が導入さ
れた該宿主細胞を固定化する工程をさらに含み、それに
より、該組換え分子および該蛋白質の流出を防止しつ
つ、該検出手段を該宿主細胞内へ流入させる請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 該固定化工程が化学試薬による処理によ
り果たされる請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 該試薬がアセトンである請求項３に記載
の方法。 - 【請求項５】 該組換え分子が導入される該宿主細胞
が、該同定工程前に、その底面がマトリックスで被覆さ
れた容器中で培養される請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 該マトリックスがコラーゲンである請求
項５に記載の方法。 - 【請求項７】 回収工程後に該ヌクレオチド配列を濃厚
化する工程をさらに含んでいる請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 該ヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配
列および該ベクターの間の該連鎖部位に隣接する一対の
ベクタープライマーによる酵素的増幅により濃厚化され
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 該酵素的増幅がＰＣＲ増幅である請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１０】 該組換え分子が該宿主細胞中で複製で
きる請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 該ベクターがｐＣＤＭ８である請求項
１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 該宿主細胞がＣＯＳ細胞である請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１３】 該蛋白質が該宿主細胞により翻訳後修
飾される請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 該翻訳後修飾がグリコシル化である請
求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 該多細胞生物が哺乳類である請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１６】 該蛋白質を発現している該細胞が最初
に同定され、該同定後該固体表面に付着させられる請求
項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 該蛋白質を発現している該細胞が最初
に該固体表面に付着させられ、該付着後該蛋白質を特異
的に検出する手段により同定される請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１８】 蛋白質への結合における抗体の特異性
を試験する方法であって、以下の工程を含んでいる方
法：該蛋白質をコードしているヌクレオチド配列および
該ヌクレオチド配列に機能的に作用するように結合され
ている発現制御要素を含むベクターを含んでいる組換え
分子を作製し；該組換え分子を多細胞生物由来の宿主細
胞内へ導入し；および該組換え分子が導入された該宿主
細胞の中から、該蛋白質への結合における該抗体の特異
性を決定するために検出可能なように標識されている該
抗体で、該蛋白質を発現している細胞を検出する。 - 【請求項１９】 該同定工程の前に該組換え分子を導入
することにより、抗体が同定化宿主細胞に流入できるよ
うにした該宿主細胞の同定化の工程をさらに含む請求項
１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 該細胞の膜が化学試薬による処理によ
り半透過性にされる請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 該試薬がアセトンである請求項２０に
記載の方法。 - 【請求項２２】 該蛋白質が翻訳後修飾される請求項２
１に記載の方法。 - 【請求項２３】 該翻訳後修飾がグリコシル化である請
求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 該組換え分子が該宿主細胞中で複製可
能である請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２５】 該ベクターがｐＣＤＭ８である請求項
２４に記載の方法。 - 【請求項２６】 ヌクレオチド配列の発現クローニング
のための、または該ヌクレオチド配列によりコードされ
ている蛋白質に対する抗体の結合特異性を試験するため
のキットであって、以下のものを含んでいるキット：発
現制御要素を含むベクター；該ベクターに合致するアダ
プター；一対のベクタープライマー；容器；細胞固定化
剤；および酵素、蛍光性基または同位元素が結合されて
いる抗体。 - 【請求項２７】 該容器の内部の底の表面がマトリック
スで被覆されている請求項２６に記載のキット。 - 【請求項２８】消化緩衝液；および該マトリックス被覆
の一部をその残りから取出すかまたは単離するための手
段をさらに含む請求項２７に記載のキット。 - 【請求項２９】発現制御要素を含んでいるベクター；該
ベクターと合致するアダプター；一対のベクタープライ
マー；容器；細胞固定化剤；酵素基質が付着されている
吸着シート；該酵素が結合されている抗体；該マトリッ
クスの一部をその残りから取出すかまたは単離するため
の手段；および消化緩衝液を含む発現クローニングキッ
ト。 - 【請求項３０】 該容器の内部の底の表面がマトリック
スで被覆されている請求項２９に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74954591A | 1991-08-26 | 1991-08-26 | |
| US749545 | 1991-08-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225766A true JPH06225766A (ja) | 1994-08-16 |
Family
ID=25014196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4226945A Pending JPH06225766A (ja) | 1991-08-26 | 1992-08-26 | 発現クローニング法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0534619A2 (ja) |
| JP (1) | JPH06225766A (ja) |
| CA (1) | CA2075259A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9404513D0 (en) * | 1994-03-09 | 1994-04-20 | Medical Res Council | Method of cloning |
| US5587299A (en) * | 1994-04-20 | 1996-12-24 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Isolated nucleic acid molecule coding for fibroblast activation protein alpha and uses thereof |
| WO1996034112A1 (en) * | 1995-04-24 | 1996-10-31 | Chromaxome Corp. | Methods for generating and screening novel metabolic pathways |
| US5783431A (en) * | 1996-04-24 | 1998-07-21 | Chromaxome Corporation | Methods for generating and screening novel metabolic pathways |
| US6242211B1 (en) | 1996-04-24 | 2001-06-05 | Terragen Discovery, Inc. | Methods for generating and screening novel metabolic pathways |
| WO1999055886A1 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Genova Pharmaceuticals Corporation | Function-based gene discovery |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4656130A (en) * | 1985-03-14 | 1987-04-07 | Yissum Research Development Company | Collagen coated cell growth plates |
| EP0194626A3 (en) * | 1985-03-15 | 1988-05-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for transformation and direct selection of transformants in eucaryotic cells |
| JPS62266064A (ja) * | 1986-05-14 | 1987-11-18 | 株式会社 高研 | コラ−ゲン膜の製造方法 |
| SU1529119A1 (ru) * | 1987-04-20 | 1989-12-15 | Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии | Способ определени нейровирусов в спинномозговой жидкости |
-
1992
- 1992-08-04 CA CA 2075259 patent/CA2075259A1/en not_active Abandoned
- 1992-08-26 JP JP4226945A patent/JPH06225766A/ja active Pending
- 1992-08-26 EP EP92307795A patent/EP0534619A2/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0534619A2 (en) | 1993-03-31 |
| EP0534619A3 (ja) | 1994-04-06 |
| CA2075259A1 (en) | 1993-02-27 |
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