JPH0622746A - 微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法 - Google Patents
微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法Info
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- JPH0622746A JPH0622746A JP4159776A JP15977692A JPH0622746A JP H0622746 A JPH0622746 A JP H0622746A JP 4159776 A JP4159776 A JP 4159776A JP 15977692 A JP15977692 A JP 15977692A JP H0622746 A JPH0622746 A JP H0622746A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】微生物（細菌）含有培地の凍結乾燥物の製造時
に使用する培地中に投与する添加剤の検討を行い、該微
生物（細菌）を凍結乾燥し、その後、その凍結乾燥物が
数年間に渡り、比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の
遮光防湿状態）にて、生存能や生殖能を確実に保証する
ためだけでなく、常温下（通常の大気中の室内条件下）
にて、該凍結乾燥物を市販可能製品に処理できるような
微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法を提供する
こと。 【構成】微生物含有培地として、炭水化物：ゼラチン：
アスコルビン酸をその乾燥重量比、１６：１：０．１〜
１６：１：１にて混合したものを用い、この培地を凍結
乾燥して凍結乾燥物を製造する。
に使用する培地中に投与する添加剤の検討を行い、該微
生物（細菌）を凍結乾燥し、その後、その凍結乾燥物が
数年間に渡り、比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の
遮光防湿状態）にて、生存能や生殖能を確実に保証する
ためだけでなく、常温下（通常の大気中の室内条件下）
にて、該凍結乾燥物を市販可能製品に処理できるような
微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法を提供する
こと。 【構成】微生物含有培地として、炭水化物：ゼラチン：
アスコルビン酸をその乾燥重量比、１６：１：０．１〜
１６：１：１にて混合したものを用い、この培地を凍結
乾燥して凍結乾燥物を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、凍結乾燥した状態で数
年間保存した後も生存能，生殖能を有する細菌で、特に
アシト゛フィルス(Acidophilus)の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidob
acterium) の菌株、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌
株における微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法
に関するものである。
年間保存した後も生存能，生殖能を有する細菌で、特に
アシト゛フィルス(Acidophilus)の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidob
acterium) の菌株、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌
株における微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、種々の医薬品、血液製剤、酵素製
品、実験材料等で、長期に渡って保存が必要な場合の一
方法として、凍結乾燥法が使用されている。前記凍結乾
燥を行うにあたっては、湿度、温度、及び大気中の酸素
による生存能・生殖能の劣化をできるだけ抑えるため、
凍結乾燥前の微生物含有培地中に種々の補助剤、分散
剤、保護剤、担体等の添加剤が投与され、その凍結乾燥
物を低温は勿論、常温による保存に対しても安全性保存
が可能なように工夫されている。
品、実験材料等で、長期に渡って保存が必要な場合の一
方法として、凍結乾燥法が使用されている。前記凍結乾
燥を行うにあたっては、湿度、温度、及び大気中の酸素
による生存能・生殖能の劣化をできるだけ抑えるため、
凍結乾燥前の微生物含有培地中に種々の補助剤、分散
剤、保護剤、担体等の添加剤が投与され、その凍結乾燥
物を低温は勿論、常温による保存に対しても安全性保存
が可能なように工夫されている。
【０００３】一方、近年、食物の消化の補助的役割を果
たす大腸菌、バクテリオイデス、ユウバクテリウム、ビ
フィズス菌、乳酸桿菌等の腸内細菌を、ヨーグルト等の
乳酸製品に配合して健康維持食品を製造することが一般
化しつつあり、前記健康維持食品の製造に当たり、使用
する微生物（細菌）を好条件にて凍結乾燥できることが
考えられている。
たす大腸菌、バクテリオイデス、ユウバクテリウム、ビ
フィズス菌、乳酸桿菌等の腸内細菌を、ヨーグルト等の
乳酸製品に配合して健康維持食品を製造することが一般
化しつつあり、前記健康維持食品の製造に当たり、使用
する微生物（細菌）を好条件にて凍結乾燥できることが
考えられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところが、高度に感受
性が相違する数種類の微生物（細菌）を同培地にて凍結
乾燥をするに際しては、そのための前記凍結乾燥前の微
生物含有培地中に投与する種々の補助剤、分散剤、保護
剤、担体等の添加剤の条件が問題となる。
性が相違する数種類の微生物（細菌）を同培地にて凍結
乾燥をするに際しては、そのための前記凍結乾燥前の微
生物含有培地中に投与する種々の補助剤、分散剤、保護
剤、担体等の添加剤の条件が問題となる。
【０００５】本発明は、前記問題点を鑑みてなされたも
のであり、前記凍結乾燥物の製造時に使用する微生物含
有培地中に投与する添加剤の検討を行い、前記微生物
（細菌）を凍結乾燥し、その後、その凍結乾燥物が数年
間に渡り、比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の遮光
防湿状態）にて、生存能や生殖能を確実に保証するため
だけでなく、常温下（通常の大気中の室内条件下）に
て、該凍結乾燥物を市販可能製品に処理できるような微
生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法を提供するこ
とを課題としている。
のであり、前記凍結乾燥物の製造時に使用する微生物含
有培地中に投与する添加剤の検討を行い、前記微生物
（細菌）を凍結乾燥し、その後、その凍結乾燥物が数年
間に渡り、比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の遮光
防湿状態）にて、生存能や生殖能を確実に保証するため
だけでなく、常温下（通常の大気中の室内条件下）に
て、該凍結乾燥物を市販可能製品に処理できるような微
生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法を提供するこ
とを課題としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するために、次の技術的手段を講じる。
決するために、次の技術的手段を講じる。
【０００７】即ち、凍結乾燥の数年後も生存能・生殖能
を有することが可能な細菌、特にアシト゛フィルス(Acidophilu
s)の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidobacterium) の菌株、エ
シェリヒアコリ(Escherichia coli) の菌株における微生物含有
培地の凍結乾燥物に関し、前記微生物含有培地として、
炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重量
比、１６：１：０．１〜１６：１：１にて混合したもの
を用い、この培地を凍結乾燥することで凍結乾燥物を製
造し、その凍結乾燥物が長期に渡って安定性保存できる
ようにしたことを特徴としている。
を有することが可能な細菌、特にアシト゛フィルス(Acidophilu
s)の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidobacterium) の菌株、エ
シェリヒアコリ(Escherichia coli) の菌株における微生物含有
培地の凍結乾燥物に関し、前記微生物含有培地として、
炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重量
比、１６：１：０．１〜１６：１：１にて混合したもの
を用い、この培地を凍結乾燥することで凍結乾燥物を製
造し、その凍結乾燥物が長期に渡って安定性保存できる
ようにしたことを特徴としている。
【０００８】前記高度に異なる感受性を有する細菌を懸
濁し、凍結乾燥して、通常の温度及び湿度下で処理する
ことが可能となると共に、８°Ｃ以下の冷房内の乾燥状
態で、少なくとも３年以上、高度の安定性（生存能や生
殖能の補償）を保持できるようにするため、前記凍結乾
燥物の凍結乾燥前の微生物含有培地中に種々の補助剤、
分散剤、保護剤、担体等の添加剤が投入される。
濁し、凍結乾燥して、通常の温度及び湿度下で処理する
ことが可能となると共に、８°Ｃ以下の冷房内の乾燥状
態で、少なくとも３年以上、高度の安定性（生存能や生
殖能の補償）を保持できるようにするため、前記凍結乾
燥物の凍結乾燥前の微生物含有培地中に種々の補助剤、
分散剤、保護剤、担体等の添加剤が投入される。
【０００９】本発明では、その添加剤の検討を行い、主
に補助剤、或いは保護剤として作用する炭水化物，ゼラ
チン，アスコルビン酸を適宜乾燥重量比にて組み合わ
せ、下記に示す実施例１〜１５の培地を使用して凍結乾
燥物を作製し、更にその凍結乾燥物の長期保存安定性を
凍結乾燥直後の単位当たりのコロニー形成数（ＣＦＵ／
ｇ）と数年後のコロニー形成数（ＣＦＵ／ｇ）との比較
により調べ、該凍結乾燥物中の細菌の生存率（％）にて
安定性保持力を判断した。
に補助剤、或いは保護剤として作用する炭水化物，ゼラ
チン，アスコルビン酸を適宜乾燥重量比にて組み合わ
せ、下記に示す実施例１〜１５の培地を使用して凍結乾
燥物を作製し、更にその凍結乾燥物の長期保存安定性を
凍結乾燥直後の単位当たりのコロニー形成数（ＣＦＵ／
ｇ）と数年後のコロニー形成数（ＣＦＵ／ｇ）との比較
により調べ、該凍結乾燥物中の細菌の生存率（％）にて
安定性保持力を判断した。
【００１０】
【作用】本発明の凍結乾燥物は微生物含有培地中の補助
剤、或いは保護剤として、炭水化物，ゼラチン，アスコ
ルビン酸を乾燥重量比で１６：１：０．１〜１６：１：
１にて投入しているので、それらの相互作用によって、
この凍結乾燥物は、低温下（４〜８°Ｃ）は勿論、常温
下においても、湿度、温度、及び大気中の酸素による生
存能や生殖能の劣化を充分に抑制し、長期的に安全性保
存が可能となる。
剤、或いは保護剤として、炭水化物，ゼラチン，アスコ
ルビン酸を乾燥重量比で１６：１：０．１〜１６：１：
１にて投入しているので、それらの相互作用によって、
この凍結乾燥物は、低温下（４〜８°Ｃ）は勿論、常温
下においても、湿度、温度、及び大気中の酸素による生
存能や生殖能の劣化を充分に抑制し、長期的に安全性保
存が可能となる。
【００１１】
【実施例】以下、本発明の凍結乾燥物及びその製造方法
の実施例について表及びグラフに基づき説明する。尚、
実施例１〜１５で使用した培地の一覧表を表１に記す。
の実施例について表及びグラフに基づき説明する。尚、
実施例１〜１５で使用した培地の一覧表を表１に記す。
【００１２】
【表１】
【００１３】本実施例で使用した細菌はアシト゛フィルス(Acido
philus)の一種であるラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus
gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidobacterium) の
一種であるヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobacterium lon
gum)の菌株、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株の３
種である。
philus)の一種であるラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus
gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidobacterium) の
一種であるヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobacterium lon
gum)の菌株、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株の３
種である。
【００１４】《実施例１》先ず、各々の細菌を細菌培養
液(I) （全乳、或いは粉乳と適当な栄養剤から構成され
ている。）中で各々の細菌が定常成長相になるまで培養
する。
液(I) （全乳、或いは粉乳と適当な栄養剤から構成され
ている。）中で各々の細菌が定常成長相になるまで培養
する。
【００１５】次に、前記細菌が含有された培養液２５０
０ml中に、乳糖、ゼラチン、アスコルビン酸の組み合わ
せによる添加剤(II)を混合して懸濁培地（微生物含有培
地）を作製する。
０ml中に、乳糖、ゼラチン、アスコルビン酸の組み合わ
せによる添加剤(II)を混合して懸濁培地（微生物含有培
地）を作製する。
【００１６】前記添加剤(II)の作製方法は、先ず、８０
０g の乳糖(DAB 9) を１５００mlの精製水(DAB 9) 中で
加熱しながら溶解し、その液中にブルーム２００のゼラ
チン(DAB 9) ５０g を加熱（３７°Ｃで）しながら溶解
する。
０g の乳糖(DAB 9) を１５００mlの精製水(DAB 9) 中で
加熱しながら溶解し、その液中にブルーム２００のゼラ
チン(DAB 9) ５０g を加熱（３７°Ｃで）しながら溶解
する。
【００１７】一方、２３g のアスコルビン酸(DAB 9) を
２４０mlの精製水(DAB 9) 中で溶解し、１０％重量／容
積の水酸化ナトリウム５g を用いて中性化（ｐＨ６．０
以上）し、このアスコルビン酸の中和液を前記乳糖とゼ
ラチンの混合溶液に加え、３種混合液を作製し、この混
合液を添加剤(II)として使用する。
２４０mlの精製水(DAB 9) 中で溶解し、１０％重量／容
積の水酸化ナトリウム５g を用いて中性化（ｐＨ６．０
以上）し、このアスコルビン酸の中和液を前記乳糖とゼ
ラチンの混合溶液に加え、３種混合液を作製し、この混
合液を添加剤(II)として使用する。
【００１８】次に、前記微生物含有培地を一定圧力下に
て凍結乾燥し、凍結乾燥物を作製する。
て凍結乾燥し、凍結乾燥物を作製する。
【００１９】更に、前記凍結乾燥によって得られた凍結
乾燥物を、例えばメッシュサイズ0.75mmの乾式粒子用篩
にて、通常の室内条件下で粉砕し、次いで、粉砕された
種々の凍結乾燥物をジャイロホイールミキサー内で混合
均質化し、例えば硬質ゼラチンのプラグ−オン型カプセ
ル中に充填してカプセル剤とする。
乾燥物を、例えばメッシュサイズ0.75mmの乾式粒子用篩
にて、通常の室内条件下で粉砕し、次いで、粉砕された
種々の凍結乾燥物をジャイロホイールミキサー内で混合
均質化し、例えば硬質ゼラチンのプラグ−オン型カプセ
ル中に充填してカプセル剤とする。
【００２０】そして、該カプセル剤の形にて、前記凍結
乾燥物を低温（４°Ｃ〜８°Ｃ）、常温（２０°Ｃ〜２
５°Ｃ）、高温（３０°Ｃ及び４０°Ｃ）にそれぞれ設
定された貯蔵室（勿論湿度一定、遮光状態）中で３年以
上保存し、その後、保存安定性試験を行うことにする。
ただし、継続試験を行う故、保存途中で貯蔵室より取り
出すカプセル剤がいくつも存在する。
乾燥物を低温（４°Ｃ〜８°Ｃ）、常温（２０°Ｃ〜２
５°Ｃ）、高温（３０°Ｃ及び４０°Ｃ）にそれぞれ設
定された貯蔵室（勿論湿度一定、遮光状態）中で３年以
上保存し、その後、保存安定性試験を行うことにする。
ただし、継続試験を行う故、保存途中で貯蔵室より取り
出すカプセル剤がいくつも存在する。
【００２１】前記保存安定性試験は、微生物学における
通常の方法を用い、特定期間それぞれの条件下に保存さ
れた凍結乾燥物を貯蔵室から取り出し、一定の実験培地
にて希釈して希釈系列をつくり、それぞれゲル状の実験
培地上で適当期間培養し、その後、単位当たりのコロニ
ー形成数（ＣＦＵ／ｇ）をカウントする。この数を対数
目盛りにてプロットすることで微生物（細菌）の指数関
数的生存率が換算され、この結果から細菌の生存能・生
殖能の劣化を知ることができ得る。
通常の方法を用い、特定期間それぞれの条件下に保存さ
れた凍結乾燥物を貯蔵室から取り出し、一定の実験培地
にて希釈して希釈系列をつくり、それぞれゲル状の実験
培地上で適当期間培養し、その後、単位当たりのコロニ
ー形成数（ＣＦＵ／ｇ）をカウントする。この数を対数
目盛りにてプロットすることで微生物（細菌）の指数関
数的生存率が換算され、この結果から細菌の生存能・生
殖能の劣化を知ることができ得る。
【００２２】尚、コントロールとして、凍結乾燥直後
（保存日数０日）に前記保存安定性試験を前記のように
行ったものを用いる。
（保存日数０日）に前記保存安定性試験を前記のように
行ったものを用いる。
【００２３】《実施例２》本実施例では、上記実施例１
の乳糖に代えて、ショ糖を用いた。その他の操作につい
ては実施例１と同様である。
の乳糖に代えて、ショ糖を用いた。その他の操作につい
ては実施例１と同様である。
【００２４】《実施例３》本実施例では、上記実施例１
の８００g の乳糖に代えて、３００g の乳糖と５００g
のショ糖との混合物を用いた。その他の操作については
実施例１と同様である。
の８００g の乳糖に代えて、３００g の乳糖と５００g
のショ糖との混合物を用いた。その他の操作については
実施例１と同様である。
【００２５】《実施例４》本実施例では、上記実施例１
の８００g の乳糖に代えて、３００g の乳糖と５００g
の粉乳との混合物を用いた。その他の操作については実
施例１と同様である。
の８００g の乳糖に代えて、３００g の乳糖と５００g
の粉乳との混合物を用いた。その他の操作については実
施例１と同様である。
【００２６】《実施例５》本実施例では、上記実施例１
の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないもの
を用いた。従って、水酸化ナトリウムを用いての中性化
処理も必要ないものとされる。その他の操作については
実施例１と同様である。
の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないもの
を用いた。従って、水酸化ナトリウムを用いての中性化
処理も必要ないものとされる。その他の操作については
実施例１と同様である。
【００２７】《実施例６》本実施例では、上記実施例１
の添加剤として、ゼラチンを投入していないものを用い
た。その他の操作については実施例１と同様である。
の添加剤として、ゼラチンを投入していないものを用い
た。その他の操作については実施例１と同様である。
【００２８】《実施例７》本実施例では、上記実施例１
の添加剤として、アスコルビン酸及びゼラチンを投入し
ていないものを用い、しかも８００g の乳糖に代えて、
３００g の乳糖と５００g の粉乳との混合物を用いた。
アスコルビン酸を投入してないので、水酸化ナトリウム
を用いての中性化処理も必要ないものとされる。その他
の操作については実施例１と同様である。
の添加剤として、アスコルビン酸及びゼラチンを投入し
ていないものを用い、しかも８００g の乳糖に代えて、
３００g の乳糖と５００g の粉乳との混合物を用いた。
アスコルビン酸を投入してないので、水酸化ナトリウム
を用いての中性化処理も必要ないものとされる。その他
の操作については実施例１と同様である。
【００２９】《実施例８》本実施例では、上記実施例１
の８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代えて、２７０
g の乳糖と１７g のゼラチンを用いた。その他の操作に
ついては実施例１と同様である。
の８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代えて、２７０
g の乳糖と１７g のゼラチンを用いた。その他の操作に
ついては実施例１と同様である。
【００３０】《実施例９》本実施例では、上記実施例１
の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないもの
を用い、しかも８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代
えて、微量の乳糖とゼラチンを用いた。アスコルビン酸
を投入してないので、水酸化ナトリウムを用いての中性
化処理も必要ないものとされる。その他の操作について
は実施例１と同様である。
の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないもの
を用い、しかも８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代
えて、微量の乳糖とゼラチンを用いた。アスコルビン酸
を投入してないので、水酸化ナトリウムを用いての中性
化処理も必要ないものとされる。その他の操作について
は実施例１と同様である。
【００３１】《実施例１０》本実施例では、上記実施例
１の８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代えて、１６
００g の乳糖と１００g のゼラチンを用いた。その他の
操作については実施例１と同様である。
１の８００g の乳糖と５０g のゼラチンに代えて、１６
００g の乳糖と１００g のゼラチンを用いた。その他の
操作については実施例１と同様である。
【００３２】《実施例１１》本実施例では、上記実施例
１の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないも
のを用い、しかも８００g の乳糖と５０g のゼラチンに
代えて、１６００gの乳糖と１００g のゼラチンを用い
た。アスコルビン酸を投入してないので、水酸化ナトリ
ウムを用いての中性化処理も必要ないものとされる。そ
の他の操作については実施例１と同様である。
１の添加剤として、アスコルビン酸を投入していないも
のを用い、しかも８００g の乳糖と５０g のゼラチンに
代えて、１６００gの乳糖と１００g のゼラチンを用い
た。アスコルビン酸を投入してないので、水酸化ナトリ
ウムを用いての中性化処理も必要ないものとされる。そ
の他の操作については実施例１と同様である。
【００３３】《実施例１２》本実施例では、ラクトハ゛チルス カ
゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株と、ヒ゛フィト゛ハ゛クテ
リウム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株について
は、実施例５で用いた添加剤、即ち、実施例１の添加剤
にアスコルビン酸を投入していないもの（勿論、水酸化
ナトリウムを用いての中性化処理も必要ない。）を用
い、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株については、
実施例１で用いた添加剤を用いた。その他の操作につい
ては実施例１と同様である。
゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株と、ヒ゛フィト゛ハ゛クテ
リウム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株について
は、実施例５で用いた添加剤、即ち、実施例１の添加剤
にアスコルビン酸を投入していないもの（勿論、水酸化
ナトリウムを用いての中性化処理も必要ない。）を用
い、エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株については、
実施例１で用いた添加剤を用いた。その他の操作につい
ては実施例１と同様である。
【００３４】《実施例１３》本実施例では、ラクトハ゛チルス カ
゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウ
ム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株、エシェリヒア コリ
(Escherichia coli)の菌株の３種を混合して、前記実施
例１で用いた培地にて懸濁液を作製した。その他の操作
については実施例１と同様である。
゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウ
ム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株、エシェリヒア コリ
(Escherichia coli)の菌株の３種を混合して、前記実施
例１で用いた培地にて懸濁液を作製した。その他の操作
については実施例１と同様である。
【００３５】《実施例１４》本実施例では、前記３種の
菌株を混合して、前記実施例５で使用した培地にて懸濁
液を作製した。その他の操作については実施例１と同様
である。
菌株を混合して、前記実施例５で使用した培地にて懸濁
液を作製した。その他の操作については実施例１と同様
である。
【００３６】《実施例１５》本実施例では、細菌培養液
(I) として、全乳、或いは粉乳を投入していないものを
用い、該培養液(I) に下記方法にて作製した添加剤(II)
を混合し、懸濁培地（微生物含有培地）を作製した。そ
の他の操作については実施例１と同様で、プラグ−オン
型カプセル中には前記凍結乾燥物を２００mg充填させて
保存した。
(I) として、全乳、或いは粉乳を投入していないものを
用い、該培養液(I) に下記方法にて作製した添加剤(II)
を混合し、懸濁培地（微生物含有培地）を作製した。そ
の他の操作については実施例１と同様で、プラグ−オン
型カプセル中には前記凍結乾燥物を２００mg充填させて
保存した。
【００３７】前記添加剤(II)は、先ず、１２００g の乳
糖(DAB 9) を２３００mlの精製水(DAB 9) 中で加熱しな
がら溶解し、その液中にブルーム２００のゼラチン(DAB
9)７５g を加熱（２５°Ｃ〜３７°Ｃで）しながら溶
解する。
糖(DAB 9) を２３００mlの精製水(DAB 9) 中で加熱しな
がら溶解し、その液中にブルーム２００のゼラチン(DAB
9)７５g を加熱（２５°Ｃ〜３７°Ｃで）しながら溶
解する。
【００３８】一方、１３g のアスコルビン酸(DAB 9) を
２５０mlの精製水(DAB 9) 中で溶解し、３g の水酸化ナ
トリウムを用いて中性化（ｐＨ６．０以上）し、このア
スコルビン酸の中和液を前記乳糖とゼラチンの混合溶液
に加え、３種を混合することで作製する。
２５０mlの精製水(DAB 9) 中で溶解し、３g の水酸化ナ
トリウムを用いて中性化（ｐＨ６．０以上）し、このア
スコルビン酸の中和液を前記乳糖とゼラチンの混合溶液
に加え、３種を混合することで作製する。
【００３９】次に、前記実施例１〜１５における、保存
安定性試験の結果を詳述する。
安定性試験の結果を詳述する。
【００４０】実施例１〜４及び実施例７の結果を下記表
２で示す。尚、表は保存年数３年での結果であり、保存
温度の条件はそれぞれ低温（４°Ｃ）、常温（室温
下）、高温（３０°Ｃ）である。
２で示す。尚、表は保存年数３年での結果であり、保存
温度の条件はそれぞれ低温（４°Ｃ）、常温（室温
下）、高温（３０°Ｃ）である。
【００４１】
【表２】
【００４２】前記表２から考察されるように、細菌培養
液：炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重
量比、８：１６：１：０．５にて混合した微生物含有培
地（実施例１，２，３）の３年間保存後の生存率は大変
高く、特に４°Ｃでのラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus
gasseri) の菌株と、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobac
terium longum)の菌株の生存率は８０％に及ぶものであ
る。
液：炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重
量比、８：１６：１：０．５にて混合した微生物含有培
地（実施例１，２，３）の３年間保存後の生存率は大変
高く、特に４°Ｃでのラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus
gasseri) の菌株と、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobac
terium longum)の菌株の生存率は８０％に及ぶものであ
る。
【００４３】また、前記炭水化物として乳糖を単独で用
いたり（実施例１）、ショ糖を単独で用いたり（実施例
２）、或いは乳糖とショ糖を混合して用いた（実施例
３）ものの生存率は高いが、粉乳を用いた（実施例４）
ものではあまり生存率は高くはならず、また、ゼラチン
やアスコルビン酸を使用しない（実施例７）と生存率は
かなり低下することがわかる。
いたり（実施例１）、ショ糖を単独で用いたり（実施例
２）、或いは乳糖とショ糖を混合して用いた（実施例
３）ものの生存率は高いが、粉乳を用いた（実施例４）
ものではあまり生存率は高くはならず、また、ゼラチン
やアスコルビン酸を使用しない（実施例７）と生存率は
かなり低下することがわかる。
【００４４】次に、実施例５、６及び実施例８、９の結
果を下記表３で示す。尚、表は保存年数１、２、３年後
での結果であり、保存温度の条件はそれぞれ低温（４°
Ｃ〜８°Ｃ）、常温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）、高温（３
０°Ｃ）である。
果を下記表３で示す。尚、表は保存年数１、２、３年後
での結果であり、保存温度の条件はそれぞれ低温（４°
Ｃ〜８°Ｃ）、常温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）、高温（３
０°Ｃ）である。
【００４５】
【表３】
【００４６】前記表３から考察されるように、炭水化
物，ゼラチン，アスコルビン酸のいずれが欠けても生存
率は低くなり（実施例５，６，９）、また、前記実施例
１〜３と３年後のデータのみを比較するとわかるよう
に、その微生物含有培地の乾燥重量比が適当でない（実
施例８）と生存率、特に室温や高温での生存率はかなり
低下するといえる。
物，ゼラチン，アスコルビン酸のいずれが欠けても生存
率は低くなり（実施例５，６，９）、また、前記実施例
１〜３と３年後のデータのみを比較するとわかるよう
に、その微生物含有培地の乾燥重量比が適当でない（実
施例８）と生存率、特に室温や高温での生存率はかなり
低下するといえる。
【００４７】次に、実施例１０及び実施例１１の結果を
下記表４で示す。尚、表はエシェリヒア コリ(Escherichia col
i) の菌株での結果のみであり、保存年数１，２，３年
後での実験結果であり、その保存温度の条件は低温（４
°Ｃ〜８°Ｃ）、室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）である。
下記表４で示す。尚、表はエシェリヒア コリ(Escherichia col
i) の菌株での結果のみであり、保存年数１，２，３年
後での実験結果であり、その保存温度の条件は低温（４
°Ｃ〜８°Ｃ）、室温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）である。
【００４８】
【表４】
【００４９】前記表４から考察されるように、エシェリヒア コ
リ(Escherichia coli) の菌株は、炭水化物：ゼラチンの
乾燥重量比を１６：１にて混合したもの（実施例１０）
であれば、細菌培養液に対して炭水化物とゼラチンの割
合が多くなった方（細菌培養液：炭水化物：ゼラチンが
２：１６：１程度）が、その生存率は高い（低温保存で
は３年間不動の１００％）ことがいえる。
リ(Escherichia coli) の菌株は、炭水化物：ゼラチンの
乾燥重量比を１６：１にて混合したもの（実施例１０）
であれば、細菌培養液に対して炭水化物とゼラチンの割
合が多くなった方（細菌培養液：炭水化物：ゼラチンが
２：１６：１程度）が、その生存率は高い（低温保存で
は３年間不動の１００％）ことがいえる。
【００５０】また、前記エシェリヒア コリ(Escherichia coli)
の菌株は、アスコルビン酸にかなり左右され、該アスコ
ルビン酸を使用しない培地（実施例１１）での保存は生
存率が極端に低下することもわかる。
の菌株は、アスコルビン酸にかなり左右され、該アスコ
ルビン酸を使用しない培地（実施例１１）での保存は生
存率が極端に低下することもわかる。
【００５１】次に、実施例１２〜実施例１４の結果を下
記表５で示す。尚、表は保存年数１、２、３年後での結
果であり、保存温度の条件は低温（４°Ｃ〜８°Ｃ）、
常温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）である。
記表５で示す。尚、表は保存年数１、２、３年後での結
果であり、保存温度の条件は低温（４°Ｃ〜８°Ｃ）、
常温（２０°Ｃ〜２５°Ｃ）である。
【００５２】
【表５】
【００５３】前記表５から考察されるように、前記実施
例１〜実施例１１でいえることは、ラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (L
actobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム
(Bifidobacterium longum)の菌株、エシェリヒア コリ(Escheric
hia coli) の菌株を混合した細胞培養液に前記添加剤を
加えて行った場合でも同様のことがいえ、特に、アスコ
ルビン酸は使用する細菌の感受性によって、感受性の小
さい細菌には少なく、感受性の大きい細菌は多くすれば
よいことがわかる。
例１〜実施例１１でいえることは、ラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (L
actobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム
(Bifidobacterium longum)の菌株、エシェリヒア コリ(Escheric
hia coli) の菌株を混合した細胞培養液に前記添加剤を
加えて行った場合でも同様のことがいえ、特に、アスコ
ルビン酸は使用する細菌の感受性によって、感受性の小
さい細菌には少なく、感受性の大きい細菌は多くすれば
よいことがわかる。
【００５４】従って、感受性の強いエシェリヒア コリ(Escheric
hia coli) の菌株を考慮し、アスコルビン酸の重量比を
全体に対して、０．１〜１．０の範囲内で適宜調節する
とよいことがいえる。
hia coli) の菌株を考慮し、アスコルビン酸の重量比を
全体に対して、０．１〜１．０の範囲内で適宜調節する
とよいことがいえる。
【００５５】次に、実施例１５の結果を図１で示す。
尚、図はラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の
菌株での結果であり、保存温度による生存率を比較した
グラフでで、保存年数１、２、３年後のものである。保
存温度の条件は低温（４°Ｃ）、常温（室温下）、高温
（３０°Ｃ及び４０°Ｃ）である。
尚、図はラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の
菌株での結果であり、保存温度による生存率を比較した
グラフでで、保存年数１、２、３年後のものである。保
存温度の条件は低温（４°Ｃ）、常温（室温下）、高温
（３０°Ｃ及び４０°Ｃ）である。
【００５６】図１からわかるように、細菌の種類によっ
ては、処理用菌株培地(I) に全乳、や粉乳を投入しない
方がその凍結乾燥物の生存率がよいものもあり、要は、
炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸の乾燥重量比が１
６：１：０．１〜１６：１：１（内部相中含有量）にて
投入された培地を用いれば、凍結乾燥して、長期保存し
ても、細菌の生存能・生殖能は低下しないことがわか
る。
ては、処理用菌株培地(I) に全乳、や粉乳を投入しない
方がその凍結乾燥物の生存率がよいものもあり、要は、
炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸の乾燥重量比が１
６：１：０．１〜１６：１：１（内部相中含有量）にて
投入された培地を用いれば、凍結乾燥して、長期保存し
ても、細菌の生存能・生殖能は低下しないことがわか
る。
【００５７】以上の実施例より、添加剤(II)の種類によ
る安定性試験の相違をまとめたグラフを図２で示す。
尚、図２はエシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株に対す
る結果であり、保存年数１〜２年の継続試験結果であ
る。
る安定性試験の相違をまとめたグラフを図２で示す。
尚、図２はエシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株に対す
る結果であり、保存年数１〜２年の継続試験結果であ
る。
【００５８】図２からわかるように、微生物含有培地と
して炭水化物、ゼラチン、アスコルビン酸の３種を添加
すると、その相互作用によって、凍結乾燥した数年後ほ
とんど不変の生存率を示すことになる。
して炭水化物、ゼラチン、アスコルビン酸の３種を添加
すると、その相互作用によって、凍結乾燥した数年後ほ
とんど不変の生存率を示すことになる。
【００５９】以上の結果より、高度に感受性が相違する
ラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛
フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株、
エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株を同培地にて凍結
乾燥をするに際して、その凍結乾燥物が数年間に渡り、
比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の遮光防湿状態）
にて、生存能や生殖能を確実に保証するためには、前記
凍結乾燥前の微生物含有培地中に投与する種々の補助
剤、分散剤、保護剤、担体等の添加剤(II)として、炭水
化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重量比、１
６：１：０．１〜１６：１：１にて投入すればよく、前
記炭水化物としては乳糖、ショ糖、或いは２種混合物を
用いることが特に好ましいことがわかった。
ラクトハ゛チルス カ゛ッセリー (Lactobacillus gasseri) の菌株、ヒ゛
フィト゛ハ゛クテリウム ロンク゛ム (Bifidobacterium longum)の菌株、
エシェリヒア コリ(Escherichia coli) の菌株を同培地にて凍結
乾燥をするに際して、その凍結乾燥物が数年間に渡り、
比較的単純な貯蔵条件下（８°Ｃ以下の遮光防湿状態）
にて、生存能や生殖能を確実に保証するためには、前記
凍結乾燥前の微生物含有培地中に投与する種々の補助
剤、分散剤、保護剤、担体等の添加剤(II)として、炭水
化物：ゼラチン：アスコルビン酸をその乾燥重量比、１
６：１：０．１〜１６：１：１にて投入すればよく、前
記炭水化物としては乳糖、ショ糖、或いは２種混合物を
用いることが特に好ましいことがわかった。
【００６０】また、上記添加剤(II)の条件を適宜調節す
ることで、常温下（通常の大気中の室内条件下）でも市
販可能製品に処理できるようになり、この凍結乾燥物は
医薬品等の薬剤としても利用することができるようにな
る。
ることで、常温下（通常の大気中の室内条件下）でも市
販可能製品に処理できるようになり、この凍結乾燥物は
医薬品等の薬剤としても利用することができるようにな
る。
【００６１】
【発明の効果】本発明では、微生物含有培地の凍結乾燥
物を製造する際、その微生物含有培地として、炭水化
物，ゼラチン，アスコルビン酸をその乾燥重量比、１
６：１：０．１〜１６：１：１にて投入しているので、
それらの相互作用（主に炭水化物が補助剤、或いは保護
剤、ゼラチンが分散剤、アスコルビン酸が酸化防止剤と
して作用する）によって、この凍結乾燥物は、低温下は
勿論、常温、場合によっては高温下においても、湿度、
温度、及び大気中の酸素による生存能や生殖能の劣化を
充分に制御し、長期的な安全性保存が可能となる。従っ
て、この凍結乾燥物を薬剤に使用することも可能とな
る。
物を製造する際、その微生物含有培地として、炭水化
物，ゼラチン，アスコルビン酸をその乾燥重量比、１
６：１：０．１〜１６：１：１にて投入しているので、
それらの相互作用（主に炭水化物が補助剤、或いは保護
剤、ゼラチンが分散剤、アスコルビン酸が酸化防止剤と
して作用する）によって、この凍結乾燥物は、低温下は
勿論、常温、場合によっては高温下においても、湿度、
温度、及び大気中の酸素による生存能や生殖能の劣化を
充分に制御し、長期的な安全性保存が可能となる。従っ
て、この凍結乾燥物を薬剤に使用することも可能とな
る。
【図１】保存温度の違いによる安定性試験の結果を示す
グラフ。
グラフ。
【図２】凍結乾燥物の培地の違いによる安定性試験の結
果を示すグラフ。
果を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (14)
- 【請求項１】 生存能，生殖能を保持する細菌を含有す
る微生物含有培地の凍結乾燥物において、前記培地中
に、乾燥重量比が１６：１：０．１〜１６：１：１（内
部相中含有量）の炭水化物，ゼラチン，アスコルビン酸
の混合物が添加され、且つ該培地が凍結乾燥されている
ことを特徴とする微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項２】 前記細菌が、アシト゛フィルス(Acidophilus)の
菌株、ヒ゛フィト゛ハ゛クテリウム(Bifidobacterium) の菌株、エシェリヒ
ア コリ(Escherichia coli) の菌株であることを特徴とす
る請求項１記載の微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項３】 前記細菌の凍結乾燥物の微生物含有培地
は、乾燥重量比が８：１６：１：０．５（内部相中含有
量）の細菌培養液，炭水化物，ゼラチン，アスコルビン
酸の混合物であることを特徴とする請求項１又は請求項
２に記載の微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項４】 前記細菌の凍結乾燥物の微生物含有培地
は、乾燥重量比が２：１６：１：０．２（内部相中含有
量）の細菌培養液，炭水化物，ゼラチン，アスコルビン
酸の混合物であることを特徴とする請求項１又は請求項
２に記載の微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項５】 前記炭水化物は、一物質又は複数物質の
混合物からなることを特徴とする請求項１〜４のいずれ
かに記載の微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項６】 前記炭水化物が乳糖であることを特徴と
する請求項１〜５のいずれかに記載の微生物含有培地の
凍結乾燥物。 - 【請求項７】 前記炭水化物がショ糖であることを特徴
とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物含有培地
の凍結乾燥物。 - 【請求項８】 前記炭水化物が乳糖とショ糖の混合物で
あることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の
微生物含有培地の凍結乾燥物。 - 【請求項９】 炭水化物：ゼラチン：アスコルビン酸を
その乾燥重量比、１６：１：０．１〜１６：１：１にて
混合し、細菌培養液中に投入して微生物含有培地を作製
し、次いで該培地を凍結乾燥して製造することを特徴と
する微生物含有培地の凍結乾燥物の製造方法。 - 【請求項１０】 細菌培養液：炭水化物：ゼラチン：ア
スコルビン酸をその乾燥重量比、８：１６：１：０．５
にて混合し、微生物含有培地を作製し、次いで該培地を
凍結乾燥して製造することを特徴とする微生物含有培地
の凍結乾燥物の製造方法。 - 【請求項１１】 細菌培養液：炭水化物：ゼラチン：ア
スコルビン酸をその乾燥重量比、２：１６：１：０．２
にて混合し、微生物含有培地を作製し、次いで該培地を
凍結乾燥して製造することを特徴とする微生物含有培地
の凍結乾燥物の製造方法。 - 【請求項１２】 前記培地中の炭水化物は、一物質又は
複数物質の混合物であることを特徴とする請求項９〜１
１のいずれかに記載の微生物含有培地の凍結乾燥物の製
造方法。 - 【請求項１３】 前記培地中の炭水化物が、乳糖とショ
糖の混合物であることを特徴とする請求項９〜１２のい
ずれかに記載の微生物含有培地の凍結乾燥物の製造方
法。 - 【請求項１４】 前記請求項１〜請求項８のいずれかに
記載の微生物含有培地の凍結乾燥物を有効成分として含
有することを特徴とする薬剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4159776A JP2558203B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4159776A JP2558203B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622746A true JPH0622746A (ja) | 1994-02-01 |
| JP2558203B2 JP2558203B2 (ja) | 1996-11-27 |
Family
ID=15701020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4159776A Expired - Lifetime JP2558203B2 (ja) | 1992-06-18 | 1992-06-18 | 微生物含有培地の凍結乾燥物とその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2558203B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012021783A3 (en) * | 2010-08-13 | 2012-05-31 | Advanced Bionutrition Corporation | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
| US9623094B2 (en) | 2009-03-27 | 2017-04-18 | Advanced Bionutrition Corporation | Microparticulated vaccines for the oral or nasal vaccination and boostering of animals including fish |
| US9731020B2 (en) | 2010-01-28 | 2017-08-15 | Advanced Bionutrition Corp. | Dry glassy composition comprising a bioactive material |
| US9737578B2 (en) | 2005-12-28 | 2017-08-22 | Advanced Bionutrition Corp. | Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same |
| US10206421B2 (en) | 2010-01-28 | 2019-02-19 | Advanced Bionutrition Corp. | Stabilizing composition for biological materials |
| US10953050B2 (en) | 2015-07-29 | 2021-03-23 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry probiotic compositions for special dietary uses |
| US11214597B2 (en) | 2009-05-26 | 2022-01-04 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making |
| US12558395B2 (en) | 2015-07-29 | 2026-02-24 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry probiotic compositions for special dietary uses |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016001944A1 (ja) | 2014-06-30 | 2016-01-07 | 株式会社 スカイロボット | 太陽光発電パネルの洗浄装置 |
-
1992
- 1992-06-18 JP JP4159776A patent/JP2558203B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9737578B2 (en) | 2005-12-28 | 2017-08-22 | Advanced Bionutrition Corp. | Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same |
| US9623094B2 (en) | 2009-03-27 | 2017-04-18 | Advanced Bionutrition Corporation | Microparticulated vaccines for the oral or nasal vaccination and boostering of animals including fish |
| US11214597B2 (en) | 2009-05-26 | 2022-01-04 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making |
| US12559524B2 (en) | 2009-05-26 | 2026-02-24 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making |
| US9731020B2 (en) | 2010-01-28 | 2017-08-15 | Advanced Bionutrition Corp. | Dry glassy composition comprising a bioactive material |
| US10206421B2 (en) | 2010-01-28 | 2019-02-19 | Advanced Bionutrition Corp. | Stabilizing composition for biological materials |
| US10575545B2 (en) | 2010-01-28 | 2020-03-03 | Advanced Bionutrition Corp. | Stabilizing composition for biological materials |
| WO2012021783A3 (en) * | 2010-08-13 | 2012-05-31 | Advanced Bionutrition Corporation | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
| KR20140019766A (ko) * | 2010-08-13 | 2014-02-17 | 어드밴스드 바이오뉴트리션 코포레이션 | 생물학적 물질용 저장 안정화 건조 조성물 |
| US10953050B2 (en) | 2015-07-29 | 2021-03-23 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry probiotic compositions for special dietary uses |
| US12558395B2 (en) | 2015-07-29 | 2026-02-24 | Advanced Bionutrition Corp. | Stable dry probiotic compositions for special dietary uses |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2558203B2 (ja) | 1996-11-27 |
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