JPH0622752A - ストレプトバリシンｃの製造方法 - Google Patents
ストレプトバリシンｃの製造方法Info
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- JPH0622752A JPH0622752A JP4301646A JP30164692A JPH0622752A JP H0622752 A JPH0622752 A JP H0622752A JP 4301646 A JP4301646 A JP 4301646A JP 30164692 A JP30164692 A JP 30164692A JP H0622752 A JPH0622752 A JP H0622752A
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 医薬品として有益なストレプトバリシンＣの
生産性をより高める。 【構成】 ストレプトマイセス・スペクタビリスの野性
株に突然変異を誘発させて得られた高生産性菌株を培養
し、該培養体から多数のコロニーを成長させ、無胞子性
のコロニーを選別することを特徴とするストレプトバリ
シンの高生産性菌株の選別方法およびその方法により得
られた高生産性菌株。 【効果】 突然変異株から容易に、かつ短期間で選別さ
れる高生産性菌株は、ストレプトバリシン、中でも特に
ストレプトバリシンＣについて特異的に高い生産性を有
するので、ストレプトバリシンＣの分離製造が極めて容
易になる。
生産性をより高める。 【構成】 ストレプトマイセス・スペクタビリスの野性
株に突然変異を誘発させて得られた高生産性菌株を培養
し、該培養体から多数のコロニーを成長させ、無胞子性
のコロニーを選別することを特徴とするストレプトバリ
シンの高生産性菌株の選別方法およびその方法により得
られた高生産性菌株。 【効果】 突然変異株から容易に、かつ短期間で選別さ
れる高生産性菌株は、ストレプトバリシン、中でも特に
ストレプトバリシンＣについて特異的に高い生産性を有
するので、ストレプトバリシンＣの分離製造が極めて容
易になる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ストレプトマイセス・
スペクタビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｔ
ａｂｉｌｉｓ）の高性能菌株の選別方法、選別された高
生産性菌株の培養体、および、ストレプトバリシンＣ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｉｃｉｎ Ｃ）の製造方法に関
する。
スペクタビリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｔ
ａｂｉｌｉｓ）の高性能菌株の選別方法、選別された高
生産性菌株の培養体、および、ストレプトバリシンＣ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｖａｒｉｃｉｎ Ｃ）の製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】米国特許第３，１１６，２０２号には、
いくつかのストレプトバリシンとそれらの製造方法が記
載されている。そこに記載された内容によると、ストレ
プトマイセス・スペクタビリス（ＮＲＲＬ２４９４）
（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）は、
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，及びＥの５タイプのストレプトバリシ
ンを生成すること、および、ストレプトバリシンの抗結
核抗生物質としての使用が記載されている。しかしなが
ら、この生成物質は、このような目的に広く使われては
いない。上記の特許の第３例には、粗生成物が１００％
純粋であったと仮定して、発酵培地に２１ｍｇ／ｌのス
トレプトバリシンが蓄積したことが開示されている。し
かし、この開示には、この粗混合体中のストレプトバリ
シンＣの量または割合は、まったく示されていない。
いくつかのストレプトバリシンとそれらの製造方法が記
載されている。そこに記載された内容によると、ストレ
プトマイセス・スペクタビリス（ＮＲＲＬ２４９４）
（Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）は、
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，及びＥの５タイプのストレプトバリシ
ンを生成すること、および、ストレプトバリシンの抗結
核抗生物質としての使用が記載されている。しかしなが
ら、この生成物質は、このような目的に広く使われては
いない。上記の特許の第３例には、粗生成物が１００％
純粋であったと仮定して、発酵培地に２１ｍｇ／ｌのス
トレプトバリシンが蓄積したことが開示されている。し
かし、この開示には、この粗混合体中のストレプトバリ
シンＣの量または割合は、まったく示されていない。
【０００３】より最近の試みとしては、抗ウィルス剤ま
たは抗癌剤を得るため、ストレプトバリシンＣを化学的
に変性することにより新規な抗生物質を得ようとするも
のがある（Ｋ．Ｏｎｄｅｒａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒａｎ
ａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１９８６年２
月、１４７〜１５４ページ、および、Ｋ．Ｏｎｏｄｅｒ
ａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ、１９８９年５月、７７９〜７８７ページ、
参照）。
たは抗癌剤を得るため、ストレプトバリシンＣを化学的
に変性することにより新規な抗生物質を得ようとするも
のがある（Ｋ．Ｏｎｄｅｒａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒａｎ
ａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１９８６年２
月、１４７〜１５４ページ、および、Ｋ．Ｏｎｏｄｅｒ
ａら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒａｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ、１９８９年５月、７７９〜７８７ページ、
参照）。
【０００４】これらの誘導体は、ストレプトバリシンＣ
のみを利用しており、したがって、ストレプトバリシン
Ｃを選択的に生成する方法を必要とする。１９８５年５
月のオノデラら（Ｋ．Ｏｎｏｄｅｒａ ｅｔ ａｌ．）
の上記論文によれば、アップジョン社（Ｕｐｊｏｈｎ
Ｃｏ．）により提供されたストレプトバリシン複合体に
もっとも多量に含まれている成分であるストレプトバリ
シンＣの収率は、約２０％であった（１５１〜１５２ペ
ージ参照）。
のみを利用しており、したがって、ストレプトバリシン
Ｃを選択的に生成する方法を必要とする。１９８５年５
月のオノデラら（Ｋ．Ｏｎｏｄｅｒａ ｅｔ ａｌ．）
の上記論文によれば、アップジョン社（Ｕｐｊｏｈｎ
Ｃｏ．）により提供されたストレプトバリシン複合体に
もっとも多量に含まれている成分であるストレプトバリ
シンＣの収率は、約２０％であった（１５１〜１５２ペ
ージ参照）。
【０００５】ラインハートらによるバイオケミストリー
誌の論文によれば（Ｋ．Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｎ
ｏ．５，１９７４，ｐｐ．８６１〜８６７）、プロバイ
ダー（Ｕｐｊｏｈｎ １１５６０−３）から得たストレ
プトバリシン類の混合体中のストレプトバリシンＣの含
有量は、約１０〜２０％であった。このことは、米国特
許第３，１１６，２０２号の第３例の発酵培地中のスト
レプトバリシンＣ含有量が約２から４ｍｇ／ｌであった
ことを示唆している。これらの量や濃度は、ストレプト
バリシンＣ誘導体の今後の開発には、十分ではない。
誌の論文によれば（Ｋ．Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｎ
ｏ．５，１９７４，ｐｐ．８６１〜８６７）、プロバイ
ダー（Ｕｐｊｏｈｎ １１５６０−３）から得たストレ
プトバリシン類の混合体中のストレプトバリシンＣの含
有量は、約１０〜２０％であった。このことは、米国特
許第３，１１６，２０２号の第３例の発酵培地中のスト
レプトバリシンＣ含有量が約２から４ｍｇ／ｌであった
ことを示唆している。これらの量や濃度は、ストレプト
バリシンＣ誘導体の今後の開発には、十分ではない。
【０００６】Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥタイプの混合物を
生成するストレプトバリシン生成菌株の発酵培地からス
トレプトバリシンＣを分離するより効率的な方法が、特
願平２−１４２８５号および特願平２−１４２８６号出
願に記載されている。（また、Ｈ．Ｗａｎｇ，Ａｎｎａ
ｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，４３１，１９８３，ｐｐ，３１３〜３２
１を参照のこと。）これらの方法においては、一般に入
手可能なストレプトバリシン生成菌株（ＡＴＣＣ２７４
６５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）は、非イオン性吸
着剤の存在下において、フマル酸またはその水溶性塩を
任意に添加して、培養される。これらの方法を使用し
て、発酵培地より分離されるストレプトバリシンＣの量
を増大させることが可能であった。それにもかかわら
ず、この化合物の商業的な製造及び適切な開発のために
は、より高い生産性が必要とされている。
生成するストレプトバリシン生成菌株の発酵培地からス
トレプトバリシンＣを分離するより効率的な方法が、特
願平２−１４２８５号および特願平２−１４２８６号出
願に記載されている。（また、Ｈ．Ｗａｎｇ，Ａｎｎａ
ｌｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ，４３１，１９８３，ｐｐ，３１３〜３２
１を参照のこと。）これらの方法においては、一般に入
手可能なストレプトバリシン生成菌株（ＡＴＣＣ２７４
６５、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）は、非イオン性吸
着剤の存在下において、フマル酸またはその水溶性塩を
任意に添加して、培養される。これらの方法を使用し
て、発酵培地より分離されるストレプトバリシンＣの量
を増大させることが可能であった。それにもかかわら
ず、この化合物の商業的な製造及び適切な開発のために
は、より高い生産性が必要とされている。
【０００７】１９９０年１０月２３日に出願された米国
特許出願第０７／６０１，８７５号および第０７／６０
１，８７７号には、発酵培地からストレプトバリシンＣ
を生成し、さらにそれを発酵培地から分離する際の効率
を上げるための方法が開示されている。これは、非イオ
ン性吸着剤の存在下で、例えばビーズの生成下で、発酵
させること、さらに発酵培地の比重を調製することで、
発酵培地から生成されたビーズを分離することにより達
成される。
特許出願第０７／６０１，８７５号および第０７／６０
１，８７７号には、発酵培地からストレプトバリシンＣ
を生成し、さらにそれを発酵培地から分離する際の効率
を上げるための方法が開示されている。これは、非イオ
ン性吸着剤の存在下で、例えばビーズの生成下で、発酵
させること、さらに発酵培地の比重を調製することで、
発酵培地から生成されたビーズを分離することにより達
成される。
【０００８】また、１９９０年１０月２３日に出願され
た米国特許出願第０７／６０１，８７６号には、発酵培
地からストレプトバリシンＣを選択的に生成し、結果的
にストレプトバリシンＣを分離する方法と、ストレプト
バリシンＣについて高生産性菌であるストレプトマイセ
ス属に属する天然の突然変異菌株を選択する方法が開示
されている。この方法により得られた高生産性菌株は、
約６００〜７００ｍｇ／ｌの相当量のストレプトバリシ
ンを生成した。この菌株は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所においてブタペスト条約に基づく微工
研条寄第３４６０号として寄託されている。ストレプト
バリシンＣについての高生産性菌株は、ストレプトマイ
セス・スペクタビリスを培養すること、及び胞子を形成
しない無胞子性のコロニーを分離することによって、ス
トレプトマイセス・スペクタビリスから選択される。こ
れらの選択されたコロニーは分離され、培養されて、ス
トレプトバリシンの生産能力についてテストされる。そ
れから、最も高く望ましい生産能力を有する（ひとつま
たはいくつかの）コロニーを、フマル酸およびその水溶
性塩よりなる群から選ばれた化合物と吸着性ポリマービ
ーズとを含有する栄養培地で発酵させる。そして、生成
されたストレプトバリシンＣは通常の方法により回収さ
れる。
た米国特許出願第０７／６０１，８７６号には、発酵培
地からストレプトバリシンＣを選択的に生成し、結果的
にストレプトバリシンＣを分離する方法と、ストレプト
バリシンＣについて高生産性菌であるストレプトマイセ
ス属に属する天然の突然変異菌株を選択する方法が開示
されている。この方法により得られた高生産性菌株は、
約６００〜７００ｍｇ／ｌの相当量のストレプトバリシ
ンを生成した。この菌株は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所においてブタペスト条約に基づく微工
研条寄第３４６０号として寄託されている。ストレプト
バリシンＣについての高生産性菌株は、ストレプトマイ
セス・スペクタビリスを培養すること、及び胞子を形成
しない無胞子性のコロニーを分離することによって、ス
トレプトマイセス・スペクタビリスから選択される。こ
れらの選択されたコロニーは分離され、培養されて、ス
トレプトバリシンの生産能力についてテストされる。そ
れから、最も高く望ましい生産能力を有する（ひとつま
たはいくつかの）コロニーを、フマル酸およびその水溶
性塩よりなる群から選ばれた化合物と吸着性ポリマービ
ーズとを含有する栄養培地で発酵させる。そして、生成
されたストレプトバリシンＣは通常の方法により回収さ
れる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来より
高い収量で発酵培地からストレプトバリシンＣを選択的
に製造する方法を発見した。より具体的には、本発明者
らは、ストレプトバリシンＣについて高生産性であるス
トレプトマイセス属に属する天然の突然変異菌株を選択
する、従来公知のものより優れた方法を発見した。
高い収量で発酵培地からストレプトバリシンＣを選択的
に製造する方法を発見した。より具体的には、本発明者
らは、ストレプトバリシンＣについて高生産性であるス
トレプトマイセス属に属する天然の突然変異菌株を選択
する、従来公知のものより優れた方法を発見した。
【００１０】本発明者らは、本発明によれば、最初にス
トレプトマイセス・スペクタビリスの天然の菌株を、ス
トレプトバリシンに対して耐性がある生物体を分離する
ような状態におくことにより、ストレプトバリシンＣの
高生産性菌株をストレプトマイセス・スペクタビリスか
ら容易にかつ短期間に選択することができることを発見
した。ストレプトバリシンに対して耐性のある生物体
に、次いで、突然変異、好ましくは紫外線照射による突
然変異を誘発させる。
トレプトマイセス・スペクタビリスの天然の菌株を、ス
トレプトバリシンに対して耐性がある生物体を分離する
ような状態におくことにより、ストレプトバリシンＣの
高生産性菌株をストレプトマイセス・スペクタビリスか
ら容易にかつ短期間に選択することができることを発見
した。ストレプトバリシンに対して耐性のある生物体
に、次いで、突然変異、好ましくは紫外線照射による突
然変異を誘発させる。
【００１１】しかし、その他のタイプの突然変異の処
理、例えば化学的処理による突然変異も利用できる。こ
れらの処置を施した生物体を培養して、胞子を形成しな
い〔無胞子性（ａｓｐｏｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）〕コロニ
ーを個別に発酵培養すると、菌株は種々のサイズと色の
ペレットを形成する。サイズおよび／または色の点で最
もばらつきの大きいペレットを有するバッチから、最小
のペレットまたは最も濃い色（通常は濃い赤色か深紅
色）を呈している（ひとつまたはいくつかの）ペレット
を分離する。本発明者らは、このペレットの菌株がスト
レプトバリシンについて高生産性である可能性が大きい
ことを発見した。
理、例えば化学的処理による突然変異も利用できる。こ
れらの処置を施した生物体を培養して、胞子を形成しな
い〔無胞子性（ａｓｐｏｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）〕コロニ
ーを個別に発酵培養すると、菌株は種々のサイズと色の
ペレットを形成する。サイズおよび／または色の点で最
もばらつきの大きいペレットを有するバッチから、最小
のペレットまたは最も濃い色（通常は濃い赤色か深紅
色）を呈している（ひとつまたはいくつかの）ペレット
を分離する。本発明者らは、このペレットの菌株がスト
レプトバリシンについて高生産性である可能性が大きい
ことを発見した。
【００１２】このペレットの菌株を、ストレプトバリシ
ンを生成するための発酵の状態に置く。これは、好まし
くは、フマル酸およびその水溶性塩よりなる群から選ば
れた化合物と、吸着性ポリマービーズとを含有する栄養
培地で行なわれ、生成されたストレプトバリシンは、通
常の方法で回収される。
ンを生成するための発酵の状態に置く。これは、好まし
くは、フマル酸およびその水溶性塩よりなる群から選ば
れた化合物と、吸着性ポリマービーズとを含有する栄養
培地で行なわれ、生成されたストレプトバリシンは、通
常の方法で回収される。
【００１３】さらに本発明者らは、最も高く望ましい生
産能力を有するコロニーを、フマル酸またはその水溶性
塩が特に取り除かれた栄養培地で発酵させることによ
り、より高いストレプトバリシン生産能力が得られるこ
とを発見した。
産能力を有するコロニーを、フマル酸またはその水溶性
塩が特に取り除かれた栄養培地で発酵させることによ
り、より高いストレプトバリシン生産能力が得られるこ
とを発見した。
【００１４】ストレプトマイセス・スペクタビリスに、
まず、ストレプトバリシンに対して耐性のある生物体を
分離する処理を施す。これは、ストレプトバリシンＣを
含む無菌生理食塩水にストレプトマイセス・スペクタビ
リスのある菌株を混合することにより、通常達せられ
る。ストレプトバリシンＣの濃度は、生理食塩水１０ｍ
ｌ中に対して約０．１〜５．０ｍｇである。通常は原株
を、ストレプトバリシンＣ含有食塩水への注入に先立っ
て、無菌生理食塩水で希釈しておく。このストレプトバ
リシン濃度は重要ではない。だが、この希釈は、生物体
の全量の相当な減少を引き起こすのに十分であればよ
く、その後の処理に必要な生物体が残存するようにす
る。
まず、ストレプトバリシンに対して耐性のある生物体を
分離する処理を施す。これは、ストレプトバリシンＣを
含む無菌生理食塩水にストレプトマイセス・スペクタビ
リスのある菌株を混合することにより、通常達せられ
る。ストレプトバリシンＣの濃度は、生理食塩水１０ｍ
ｌ中に対して約０．１〜５．０ｍｇである。通常は原株
を、ストレプトバリシンＣ含有食塩水への注入に先立っ
て、無菌生理食塩水で希釈しておく。このストレプトバ
リシン濃度は重要ではない。だが、この希釈は、生物体
の全量の相当な減少を引き起こすのに十分であればよ
く、その後の処理に必要な生物体が残存するようにす
る。
【００１５】本発明によれば、この溶液をさらに培養す
るため、一定時間加温しておく。あるいは、微生物を培
地から分離し、次の使用時のため冷凍保存しておく。そ
の後、生成された培養体または、それから作られた冷凍
保存サンプルを、適切な生理食塩水またはそれに代わる
もので希釈し、寒天または他の適切な栄養培地のプレー
トに接種する。そして、塗布した原料を、突然変異を誘
発する状態におく。これは、放射線照射、化学的突然変
異誘発剤による処理などの適宜の突然変異の誘発方法に
より達成しうる。典型的な突然変異誘発剤は、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メチルメ
タンスルホン酸、エチルメタンスルホン酸、亜硝酸ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、
２−アミノプリンや５−ブロモウラシルなどの核酸塩基
類似体、そしてプロフラビン（２，８−アミノアクリジ
ン）などのアクリジン色素を含む。（突然変異の誘発方
法は、Ａｒｎｏｌｄ Ｌ．ＤｅｍａｉｎおよびＮａｄｉ
ｎｅ、Ａ．Ｓｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの、Ｒｉｃｈａｒ
ｄ Ｈ．Ｂａｌｔｚ、Ｍｕｎｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．に開示されてい
るので、参照のこと。）
るため、一定時間加温しておく。あるいは、微生物を培
地から分離し、次の使用時のため冷凍保存しておく。そ
の後、生成された培養体または、それから作られた冷凍
保存サンプルを、適切な生理食塩水またはそれに代わる
もので希釈し、寒天または他の適切な栄養培地のプレー
トに接種する。そして、塗布した原料を、突然変異を誘
発する状態におく。これは、放射線照射、化学的突然変
異誘発剤による処理などの適宜の突然変異の誘発方法に
より達成しうる。典型的な突然変異誘発剤は、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、メチルメ
タンスルホン酸、エチルメタンスルホン酸、亜硝酸ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、
２−アミノプリンや５−ブロモウラシルなどの核酸塩基
類似体、そしてプロフラビン（２，８−アミノアクリジ
ン）などのアクリジン色素を含む。（突然変異の誘発方
法は、Ａｒｎｏｌｄ Ｌ．ＤｅｍａｉｎおよびＮａｄｉ
ｎｅ、Ａ．Ｓｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの、Ｒｉｃｈａｒ
ｄ Ｈ．Ｂａｌｔｚ、Ｍｕｎｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．に開示されてい
るので、参照のこと。）
【００１６】上記の処理を施された生物体を、適当な温
度、例えば２７℃、またはコロニーの成長に適したその
他の温度において、４日間にわたり加温して、成長させ
る。これらのコロニーは、淡い黄色か白色の胞子におお
われた特異な外観を有している。しかし、比較的少数の
非対称形の無胞子性コロニーが観察される。これらの無
胞子性のコロニーは、特有の滑らかな表面を有するの
で、プレート上で裸眼によって観察することにより容易
に識別できる。一般的に生成されたやや赤味を帯びた色
素が胞子によってわかりにくくなることはない。非対称
形のコロニーは、胞子を形成するタイプと無胞子性のコ
ロニーのタイプの両方を含む。だが、無胞子性コロニー
は、プレート上で非対称形コロニーの形態を有する。
度、例えば２７℃、またはコロニーの成長に適したその
他の温度において、４日間にわたり加温して、成長させ
る。これらのコロニーは、淡い黄色か白色の胞子におお
われた特異な外観を有している。しかし、比較的少数の
非対称形の無胞子性コロニーが観察される。これらの無
胞子性のコロニーは、特有の滑らかな表面を有するの
で、プレート上で裸眼によって観察することにより容易
に識別できる。一般的に生成されたやや赤味を帯びた色
素が胞子によってわかりにくくなることはない。非対称
形のコロニーは、胞子を形成するタイプと無胞子性のコ
ロニーのタイプの両方を含む。だが、無胞子性コロニー
は、プレート上で非対称形コロニーの形態を有する。
【００１７】これら無胞子性コロニーを選択し、別に調
製した発酵培養バッチにおいて、それぞれ培養したとこ
ろ、生物体により、ペレット状ビーズが混合液中に生成
された。混合液の均一性は、バッチ毎に異っていた。全
てほぼ同サイズであるペレットを含むバッチは、均一の
ものとして分類される。サイズおよび／または色が様々
なペレットを含むバッチで、通常、淡い赤色から濃い赤
色を呈するものは、不均一のものとして分類された。
製した発酵培養バッチにおいて、それぞれ培養したとこ
ろ、生物体により、ペレット状ビーズが混合液中に生成
された。混合液の均一性は、バッチ毎に異っていた。全
てほぼ同サイズであるペレットを含むバッチは、均一の
ものとして分類される。サイズおよび／または色が様々
なペレットを含むバッチで、通常、淡い赤色から濃い赤
色を呈するものは、不均一のものとして分類された。
【００１８】不均一のバッチを選択して、さらにこのバ
ッチから最小および／または最も色の濃いペレットを選
択する。これは、単純なピペット操作により行なうこと
ができる。ストレプトバリシンの生成のための菌株を用
いることに先立って、精製のため、菌株を清浄にするこ
とが望ましい。これは、粒状にされた菌株を洗浄しおよ
び／または再塗布することにより可能である。菌株を再
塗布する時、色や対称性などが最も均一であるコロニー
を、純粋培養されているものとして選択する。このよう
に精製された菌株を以下に述べる発酵状態におく。ここ
では、高生産性菌株は、少なくとも約１０００ｍｇ／ｌ
相当のストレプトバリシンＣを生成するものを使ってい
る。
ッチから最小および／または最も色の濃いペレットを選
択する。これは、単純なピペット操作により行なうこと
ができる。ストレプトバリシンの生成のための菌株を用
いることに先立って、精製のため、菌株を清浄にするこ
とが望ましい。これは、粒状にされた菌株を洗浄しおよ
び／または再塗布することにより可能である。菌株を再
塗布する時、色や対称性などが最も均一であるコロニー
を、純粋培養されているものとして選択する。このよう
に精製された菌株を以下に述べる発酵状態におく。ここ
では、高生産性菌株は、少なくとも約１０００ｍｇ／ｌ
相当のストレプトバリシンＣを生成するものを使ってい
る。
【００１９】このようにして選択された変異菌株は、栄
養発酵培地を用いて、通常のやり方で培養することがで
きる。栄養分としては、スターチ、デキストリン、グル
コール、スクロース、ラクトースなどの資化性炭素源、
コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、植物性蛋白、カゼイン、麦芽エキス、乾燥酵母、大
豆粉などの有機窒素源、および／または硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸カリウムなどの無機窒素源
を含む。例えば、炭酸カルシウム、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、モリ
ブデン酸アンモニウムなどのミネラルまたはこれらの混
合物が存在していてもよい。
養発酵培地を用いて、通常のやり方で培養することがで
きる。栄養分としては、スターチ、デキストリン、グル
コール、スクロース、ラクトースなどの資化性炭素源、
コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、植物性蛋白、カゼイン、麦芽エキス、乾燥酵母、大
豆粉などの有機窒素源、および／または硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、硫酸カリウムなどの無機窒素源
を含む。例えば、炭酸カルシウム、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
亜鉛、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、モリ
ブデン酸アンモニウムなどのミネラルまたはこれらの混
合物が存在していてもよい。
【００２０】発酵培地はさらに、多孔性で比較的大きな
比表面積をもつ吸着剤ポリマービーズを含む。このよう
なポリマービーズは、当該技術分野ではよく知られてお
り、米国特許出願第０７／６０１，８７５号に記載され
ている。このようなポリマービーズは、例えば、スチレ
ン、ジビニルベンゼン、アクリル酸エステル、メタクリ
ル酸エステルなどの種々のモノマーを重合して、または
これらを共重合して得ることができる。
比表面積をもつ吸着剤ポリマービーズを含む。このよう
なポリマービーズは、当該技術分野ではよく知られてお
り、米国特許出願第０７／６０１，８７５号に記載され
ている。このようなポリマービーズは、例えば、スチレ
ン、ジビニルベンゼン、アクリル酸エステル、メタクリ
ル酸エステルなどの種々のモノマーを重合して、または
これらを共重合して得ることができる。
【００２１】商業的に入手可能なこのようなビーズの例
としては、ＨＰ−１０，ＨＰ−２０，ＨＰ−３０，ＨＰ
−４０，ＨＰ−５０（三菱化成工業株式会社製）および
ＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社
製）がある。これらのビーズは、すべてスチレン−ジビ
ニルベンゼン系共重合体である。アクリル系共重合体で
あるＸＡＤ−７（ローム・アンド・ハース社製）を用い
ることもできる。典型的には、これらのビーズは５０か
ら１，０００μｍの直径をもち、比表面積は、５０から
１，０００ｍ2 ／ｇの範囲にあり、比細孔容積は約０．
２から１．５ｍｌ／ｇの範囲にある。上記の商業製品の
うちもっとも望ましいのは、ＨＰ−２０およびＸＡＤ−
４である。
としては、ＨＰ−１０，ＨＰ−２０，ＨＰ−３０，ＨＰ
−４０，ＨＰ−５０（三菱化成工業株式会社製）および
ＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４（ローム・アンド・ハース社
製）がある。これらのビーズは、すべてスチレン−ジビ
ニルベンゼン系共重合体である。アクリル系共重合体で
あるＸＡＤ−７（ローム・アンド・ハース社製）を用い
ることもできる。典型的には、これらのビーズは５０か
ら１，０００μｍの直径をもち、比表面積は、５０から
１，０００ｍ2 ／ｇの範囲にあり、比細孔容積は約０．
２から１．５ｍｌ／ｇの範囲にある。上記の商業製品の
うちもっとも望ましいのは、ＨＰ−２０およびＸＡＤ−
４である。
【００２２】本発明の実施態様のひとつとして、発酵培
地はフマル酸および／またはその水溶性塩を含む。典型
的な塩としてフマル酸ナトリウム、フマル酸カリウム、
フマル酸ナトリウムカリウム、フマル酸モノナトリウ
ム、フマル酸モノカリウムなど、およびそれらの混合物
が含まれる。
地はフマル酸および／またはその水溶性塩を含む。典型
的な塩としてフマル酸ナトリウム、フマル酸カリウム、
フマル酸ナトリウムカリウム、フマル酸モノナトリウ
ム、フマル酸モノカリウムなど、およびそれらの混合物
が含まれる。
【００２３】だが、本発明者らが、ここに開示するよう
に、栄養培地からフマル酸またはその水溶性塩を取り出
し、除去して選択の手順を行うとき、２００ｍｇ／ｌを
超えるストレプトバリシンＣの収率を達成し得る。
に、栄養培地からフマル酸またはその水溶性塩を取り出
し、除去して選択の手順を行うとき、２００ｍｇ／ｌを
超えるストレプトバリシンＣの収率を達成し得る。
【００２４】発酵自体は、温度、培地のｐＨ値などを含
めて、通常の手順によって行なうことができる。上記に
おおよそ述べられた栄養培地の量を必要に応じて変える
ことができる。フマル酸あるいはその塩の量も、使用の
際に、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．
５〜５％（共に重量％）の量にすることができる。通
常、培地の成分を一般に発酵の始めに添加するが、発酵
が進む間も必要に応じて繰り返し添加することができ
る。
めて、通常の手順によって行なうことができる。上記に
おおよそ述べられた栄養培地の量を必要に応じて変える
ことができる。フマル酸あるいはその塩の量も、使用の
際に、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．
５〜５％（共に重量％）の量にすることができる。通
常、培地の成分を一般に発酵の始めに添加するが、発酵
が進む間も必要に応じて繰り返し添加することができ
る。
【００２５】発酵に好適なｐＨの条件は、約４．０〜
９．０であり、温度は約２０〜３７℃、好ましくは２０
〜３０℃である。発酵は、所望するストレプトバリシン
Ｃの量が蓄積されるまで、おおよそ４日〜２０日の間続
けられる。その間に、生成濃度を測定するため、定期的
に培地をサンプリングする。通常、これは、培地のサン
プルを取ること、例えば濾過やその他の手段によりビー
ズから培地を分離すること、サンプルの比重を調整する
こと、さらに有機溶媒を用いてビーズから生成物を抽出
することとにより行われる。サンプル中のストレプトバ
リシンＣの量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により測定される。一般的には、最大量の生成物が
得られたときに、発酵を止める。
９．０であり、温度は約２０〜３７℃、好ましくは２０
〜３０℃である。発酵は、所望するストレプトバリシン
Ｃの量が蓄積されるまで、おおよそ４日〜２０日の間続
けられる。その間に、生成濃度を測定するため、定期的
に培地をサンプリングする。通常、これは、培地のサン
プルを取ること、例えば濾過やその他の手段によりビー
ズから培地を分離すること、サンプルの比重を調整する
こと、さらに有機溶媒を用いてビーズから生成物を抽出
することとにより行われる。サンプル中のストレプトバ
リシンＣの量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により測定される。一般的には、最大量の生成物が
得られたときに、発酵を止める。
【００２６】抽出に用いることのできる有機溶媒は、メ
タノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エ
チルアセテート、塩化メチル、クロロホルムなど、およ
びそれらの混合物を含む。生成物中のストレプトバリシ
ン類からは、溶媒と水の勾配混合物を用いて、ストレプ
トバリシンＣを大まかに分離濃縮できる。もし必要であ
れば、溶媒を溜去して、残留物を少量の溶媒に懸濁させ
た後に濾過する。ｎ−ヘキサンといった溶媒を、粗スト
レプトバリシンを沈澱させるため加える。標準的なクロ
マトグラフィーと再結晶法、または大規模の高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ストレプトバリシン
の分離精製のために用いることができる。
タノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、エ
チルアセテート、塩化メチル、クロロホルムなど、およ
びそれらの混合物を含む。生成物中のストレプトバリシ
ン類からは、溶媒と水の勾配混合物を用いて、ストレプ
トバリシンＣを大まかに分離濃縮できる。もし必要であ
れば、溶媒を溜去して、残留物を少量の溶媒に懸濁させ
た後に濾過する。ｎ−ヘキサンといった溶媒を、粗スト
レプトバリシンを沈澱させるため加える。標準的なクロ
マトグラフィーと再結晶法、または大規模の高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、ストレプトバリシン
の分離精製のために用いることができる。
【００２７】
【実施例】以下の実施例および比較例により本発明を説
明する。 実施例１ ストレプトバリシンＣに対して耐性のある菌株の調
製 原料となるストレプトマイセス・スペクタビリスＡＴＣ
Ｃ２７４６５の濃度が約６×１０6 微生物数／ｍｌであ
る分散溶液を、１：１０００の割合で無菌生理食塩水に
より希釈した。この希釈溶液を１ｍｌを、２．０ｍｇの
ストレプトバリシンＣを含んだ無菌生理食塩水９ｍｌと
混合した。この溶液を、１日の間、２７℃に保った。
（数種類の濃度のストレプトバリシンＣ溶液を試したと
ころ、培地成長を支持できる最も高い濃度として２ｍｇ
の濃度を選択した。）
明する。 実施例１ ストレプトバリシンＣに対して耐性のある菌株の調
製 原料となるストレプトマイセス・スペクタビリスＡＴＣ
Ｃ２７４６５の濃度が約６×１０6 微生物数／ｍｌであ
る分散溶液を、１：１０００の割合で無菌生理食塩水に
より希釈した。この希釈溶液を１ｍｌを、２．０ｍｇの
ストレプトバリシンＣを含んだ無菌生理食塩水９ｍｌと
混合した。この溶液を、１日の間、２７℃に保った。
（数種類の濃度のストレプトバリシンＣ溶液を試したと
ころ、培地成長を支持できる最も高い濃度として２ｍｇ
の濃度を選択した。）
【００２８】該溶液を、下記の組成を持つ無菌の種培地
１００ｍｌに接種した。 種培地： 加水分解カゼイン １２．５ｇ／ｌ （Ｎ−Ｚ Ａｍｉｎ Ａ） グルコース ６．２５ｇ／ｌ 酵素分解大豆エキス ６．２５ｇ／ｌ （ｓｏｙｔｏｎｅ） Ｋ2 ＨＰＯ4 １．５６ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 １．５６ｇ／ｌ
１００ｍｌに接種した。 種培地： 加水分解カゼイン １２．５ｇ／ｌ （Ｎ−Ｚ Ａｍｉｎ Ａ） グルコース ６．２５ｇ／ｌ 酵素分解大豆エキス ６．２５ｇ／ｌ （ｓｏｙｔｏｎｅ） Ｋ2 ＨＰＯ4 １．５６ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 １．５６ｇ／ｌ
【００２９】上記の接種培地を回転震盪機（ｒｏｔａｒ
ｙ ｓｈａｋｅｒ）上において１７５ｒｐｍ、２７℃
で、４日間培養した。その後、この培養培地中の微生物
を遠心分離し、２０％グリセロール溶液で２０ｍｌに希
釈し、冷凍保存サンプルＮｏ．１を調製するため、凍ら
せた。
ｙ ｓｈａｋｅｒ）上において１７５ｒｐｍ、２７℃
で、４日間培養した。その後、この培養培地中の微生物
を遠心分離し、２０％グリセロール溶液で２０ｍｌに希
釈し、冷凍保存サンプルＮｏ．１を調製するため、凍ら
せた。
【００３０】 菌株の突然変異体の調製 上記の冷凍保存サンプルＮｏ．１を１：１０００で希釈
し、この希釈溶媒０．２ｍｌを、２５個の寒天プレート
のそれぞれに加えた。これらのプレートは、下記の接種
培地を１５ｍｌ含んでいる。 接種培地： 通常のブイヨン １８．０ｇ／ｌ グルコース ６．２５ｇ／ｌ 酵母エキス ２．０ｇ／ｌ 寒天 １５．０ｇ／ｌ ５個ずつのプレートのグループそれぞれを、０分、２
分、３分、４分および５分の間、紫外線照射に曝した。
１５ワットの殺菌ランプ（日立ＧＬ１５）で、プレート
上８０ｃｍの距離から照射した。
し、この希釈溶媒０．２ｍｌを、２５個の寒天プレート
のそれぞれに加えた。これらのプレートは、下記の接種
培地を１５ｍｌ含んでいる。 接種培地： 通常のブイヨン １８．０ｇ／ｌ グルコース ６．２５ｇ／ｌ 酵母エキス ２．０ｇ／ｌ 寒天 １５．０ｇ／ｌ ５個ずつのプレートのグループそれぞれを、０分、２
分、３分、４分および５分の間、紫外線照射に曝した。
１５ワットの殺菌ランプ（日立ＧＬ１５）で、プレート
上８０ｃｍの距離から照射した。
【００３１】さらに、これらのプレートを、２７℃で培
養した。２日後、それぞれのグループを検査して、それ
ぞれの紫外線照射の条件において生成されたコロニーの
総数は、以下の通りであった。 ０分間照射 １１５４ ２分間照射 １１１１ ３分間照射 ２４ ４分間照射 ３５ ５分間照射 ２２ さらに、これらのプレートを７日間培養した。紫外線光
を４分間照射したプレートから、無胞子性コロニーを選
択し、１００ｍｌのに記載の組成を持つ無菌の種培地
に接種した。
養した。２日後、それぞれのグループを検査して、それ
ぞれの紫外線照射の条件において生成されたコロニーの
総数は、以下の通りであった。 ０分間照射 １１５４ ２分間照射 １１１１ ３分間照射 ２４ ４分間照射 ３５ ５分間照射 ２２ さらに、これらのプレートを７日間培養した。紫外線光
を４分間照射したプレートから、無胞子性コロニーを選
択し、１００ｍｌのに記載の組成を持つ無菌の種培地
に接種した。
【００３２】この培養体を、さらに回転震盪機上で１７
５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。微生物を遠心分
離し、２０ｍｌのグリセロール２０％溶液で希釈し、こ
れを凍らせて冷凍保存サンプルＮｏ．２を調製した。
５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。微生物を遠心分
離し、２０ｍｌのグリセロール２０％溶液で希釈し、こ
れを凍らせて冷凍保存サンプルＮｏ．２を調製した。
【００３３】 前培養体の調製 冷凍保存サンプルＮｏ．２の０．５ｍｌを下記の組成を
持つ無菌の前培養培地１００ｍｌに接種した。 前培養培地： コーンデキストリン １０．０ｇ／ｌ 脱脂大豆粉末（ｋａｙ ｓｏｙ）１０．０ｇ／ｌ コーンスチープリカー １０．０ｇ／ｌ ビール酵母 ２．５ｇ／ｌ ＫＣｌ ３．０ｇ／ｌ ＣａＣＯ3 ４．０ｇ／ｌ このように接種された前培養培地を、回転震盪機上にお
いて１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。
持つ無菌の前培養培地１００ｍｌに接種した。 前培養培地： コーンデキストリン １０．０ｇ／ｌ 脱脂大豆粉末（ｋａｙ ｓｏｙ）１０．０ｇ／ｌ コーンスチープリカー １０．０ｇ／ｌ ビール酵母 ２．５ｇ／ｌ ＫＣｌ ３．０ｇ／ｌ ＣａＣＯ3 ４．０ｇ／ｌ このように接種された前培養培地を、回転震盪機上にお
いて１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。
【００３４】このようにして得られた前培養体の５ｍｌ
を、１００ｍｌの下記の組成を持つ無菌培養地Ｎｏ．１
に接種した。 本培養培地： グルコース ６０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ フマル酸モノナトリウム ２４．０ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７５） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオンＨＰ−２０； ５０％固体） この培養体を、回転震盪機上において１７５ｒｐｍ、２
７℃で、１１日間培養した。
を、１００ｍｌの下記の組成を持つ無菌培養地Ｎｏ．１
に接種した。 本培養培地： グルコース ６０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ フマル酸モノナトリウム ２４．０ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７５） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオンＨＰ−２０； ５０％固体） この培養体を、回転震盪機上において１７５ｒｐｍ、２
７℃で、１１日間培養した。
【００３５】比較のために、ＡＴＣＣ菌株２７４６５
と、微工研条寄第３４６０号の菌株を、同様の本培養培
地Ｎｏ．１を用いて、同様の条件の下で培養した。
と、微工研条寄第３４６０号の菌株を、同様の本培養培
地Ｎｏ．１を用いて、同様の条件の下で培養した。
【００３６】発酵を始めて１１日後、これら３種類の培
養体中のそれぞれストレプトバリシンＣの蓄積量をＨＰ
ＬＣで測定した。結果は以下の通りである。 冷凍保存サンプルＮｏ．２ ４４２ｍｇ／ｌ ＡＴＣＣ ２７４６５ ９８ｍｇ／ｌ 微工研条寄第３４６０号 ６０６ｍｇ／ｌ
養体中のそれぞれストレプトバリシンＣの蓄積量をＨＰ
ＬＣで測定した。結果は以下の通りである。 冷凍保存サンプルＮｏ．２ ４４２ｍｇ／ｌ ＡＴＣＣ ２７４６５ ９８ｍｇ／ｌ 微工研条寄第３４６０号 ６０６ｍｇ／ｌ
【００３７】 選択したコロニーの精製 冷凍保存サンプルＮｏ．２を、さらに次の方法で精製し
た。１００ｍｌの無菌の前培養培地に０．５ｍｌの冷凍
保存サンプルＮｏ．２を接種し、これを回転震盪機上で
１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。裸眼で観察
したところ、この培養体中に、深紅色から淡い茶色まで
の様々な色を有する、いくつかの小さいペレット中に微
生物の形成が見られた。この培地のおよそ５ｍｌをサン
プルとして、各ペレットの色とサイズと数を分析したと
ころ、次のように分類された。 深紅色ペレット 小 ３ 赤色ペレット 大 ９ 赤茶色ペレット 大 ７０ 淡い茶色ペレット 大 １５００ （小ペレットは、直径約０．１から０．３ｍｍ、大ペレ
ットは直径約０．３ｍｍ以上、ペレットの色は、例えば
深紅色といった深い赤色から、赤、赤茶色、淡い茶色に
わたっていた。）
た。１００ｍｌの無菌の前培養培地に０．５ｍｌの冷凍
保存サンプルＮｏ．２を接種し、これを回転震盪機上で
１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。裸眼で観察
したところ、この培養体中に、深紅色から淡い茶色まで
の様々な色を有する、いくつかの小さいペレット中に微
生物の形成が見られた。この培地のおよそ５ｍｌをサン
プルとして、各ペレットの色とサイズと数を分析したと
ころ、次のように分類された。 深紅色ペレット 小 ３ 赤色ペレット 大 ９ 赤茶色ペレット 大 ７０ 淡い茶色ペレット 大 １５００ （小ペレットは、直径約０．１から０．３ｍｍ、大ペレ
ットは直径約０．３ｍｍ以上、ペレットの色は、例えば
深紅色といった深い赤色から、赤、赤茶色、淡い茶色に
わたっていた。）
【００３８】以下の記載に示すように、高生産性菌株は
最も小さく、最も濃い色、例えば深紅色のペレット中に
生成される。
最も小さく、最も濃い色、例えば深紅色のペレット中に
生成される。
【００３９】色スペクトルの特徴を示す、これらのペレ
ットを、前培養体から選択し、無菌生理食塩水１０ｍｌ
で２度洗浄する。これらの選択し、洗浄したペレットの
それぞれを、上記の接種培地上に筋状に塗り付けること
により、この接種培地８ｍｌを含んだ寒天プレートに接
種する。こうして調製されたこれらのプレートを、２７
℃で、４日間培養した。
ットを、前培養体から選択し、無菌生理食塩水１０ｍｌ
で２度洗浄する。これらの選択し、洗浄したペレットの
それぞれを、上記の接種培地上に筋状に塗り付けること
により、この接種培地８ｍｌを含んだ寒天プレートに接
種する。こうして調製されたこれらのプレートを、２７
℃で、４日間培養した。
【００４０】幾何学的に対称形のコロニーを各プレート
から取り出し、これをに記載の無菌の種培地１００ｍ
ｌに接種した。この接種培地を、回転震盪機上で１７５
ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養し、一連の種培養体を生
成させた。各培養体の微生物を遠心分離にかけて分離さ
せ、冷凍保存サンプルとして、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ，Ｈに分けた。
から取り出し、これをに記載の無菌の種培地１００ｍ
ｌに接種した。この接種培地を、回転震盪機上で１７５
ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養し、一連の種培養体を生
成させた。各培養体の微生物を遠心分離にかけて分離さ
せ、冷凍保存サンプルとして、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，
Ｆ，Ｇ，Ｈに分けた。
【００４１】各５ｍｌの冷凍保存サンプルＡからＨを、
上記の無菌前培養地１００ｍｌに接種し、回転震盪機上
において、１７５ｒｐｍ、２７℃で３日間培養して、前
培養体を調製した。冷凍保存サンプルＡからＨまでの各
前培養体の５ｍｌを、１００ｍｌの下記の組成を持つ本
培養培地Ｎｏ．２に接種した。 本培養培地Ｎｏ．２ グルコール ９０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ フマル酸モノナトリウム ２４．０ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７５） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオン ＨＰ−２０； ５０％固体） これらの培養体のそれぞれを、回転震盪機上において１
７５ｒｐｍ、２７℃で１８日間培養した。
上記の無菌前培養地１００ｍｌに接種し、回転震盪機上
において、１７５ｒｐｍ、２７℃で３日間培養して、前
培養体を調製した。冷凍保存サンプルＡからＨまでの各
前培養体の５ｍｌを、１００ｍｌの下記の組成を持つ本
培養培地Ｎｏ．２に接種した。 本培養培地Ｎｏ．２ グルコール ９０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ フマル酸モノナトリウム ２４．０ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７５） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオン ＨＰ−２０； ５０％固体） これらの培養体のそれぞれを、回転震盪機上において１
７５ｒｐｍ、２７℃で１８日間培養した。
【００４２】また、比較例として、ＡＴＣＣ２７４６５
と微工研条寄第３４６０号の菌株についても、それぞれ
同様の条件の下で、同様の時間をかけて培養した。
と微工研条寄第３４６０号の菌株についても、それぞれ
同様の条件の下で、同様の時間をかけて培養した。
【００４３】１０個の培養体のそれぞれに蓄積されたス
トレプトバリシンＣをＨＰＬＣで測定したところ、表１
の結果が得られた。
トレプトバリシンＣをＨＰＬＣで測定したところ、表１
の結果が得られた。
【００４４】
【表１】
【００４５】表１からわかるように、冷凍保存サンプル
Ａ，ＢおよびＣにより生成されたストレプトバリシンＣ
濃度は、著しく大きい。これらＡ，ＢおよびＣのサンプ
ルは、実際に濃度が１０００ｍｇ／ｌを超えており、比
較例に用いた菌株のみならず他の冷凍保存サンプルの結
果と較べても、収量が大きい。
Ａ，ＢおよびＣにより生成されたストレプトバリシンＣ
濃度は、著しく大きい。これらＡ，ＢおよびＣのサンプ
ルは、実際に濃度が１０００ｍｇ／ｌを超えており、比
較例に用いた菌株のみならず他の冷凍保存サンプルの結
果と較べても、収量が大きい。
【００４６】冷凍保存サンプルＡ，ＢおよびＣのストレ
プトマイセス・スペクタビリス菌株は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約に基づ
き、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（郵便
番号３０５、茨城県筑波市東一丁目１０３）に、１９９
１年１０月９日付で、表２の内容で寄託されている。
プトマイセス・スペクタビリス菌株は、特許手続上の微
生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約に基づ
き、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（郵便
番号３０５、茨城県筑波市東一丁目１０３）に、１９９
１年１０月９日付で、表２の内容で寄託されている。
【００４７】
【表２】
【００４８】実施例２ １０個のフラスコに、上記の無菌前培養培地をそれぞれ
１００ｍｌ入れ、冷凍保存サンプルＡ０．５ｍｌをそれ
ぞれに接種し、回転震盪機上において１７５ｒｐｍ、７
℃で３日間培養して、前培養体１０００ｍｌを調製し
た。
１００ｍｌ入れ、冷凍保存サンプルＡ０．５ｍｌをそれ
ぞれに接種し、回転震盪機上において１７５ｒｐｍ、７
℃で３日間培養して、前培養体１０００ｍｌを調製し
た。
【００４９】こうして得られた前培養体の総量を、３０
リットルのジャー・ファーメンター中で、１８リットル
の無菌本培養培地Ｎｏ．２に接種した。この培養体を２
７℃、２５０ｒｐｍの攪拌の条件のもと、２０日間、１
／ｖ／ｖ／ｍの割合で空気を送り込みながら発酵させ
た。
リットルのジャー・ファーメンター中で、１８リットル
の無菌本培養培地Ｎｏ．２に接種した。この培養体を２
７℃、２５０ｒｐｍの攪拌の条件のもと、２０日間、１
／ｖ／ｖ／ｍの割合で空気を送り込みながら発酵させ
た。
【００５０】２０日目の最後に、ストレプトバリシンＣ
濃度を測定したところ１０６１ｍｇ／ｌであった。
濃度を測定したところ１０６１ｍｇ／ｌであった。
【００５１】ＨＰ−２０ビーズに蓄積したストレプトバ
リシンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 により抽出し、減圧によりＣＨ
2 Ｃｌ2 を取り除き、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させ
た。沈澱微生物中のストレプトバリシン含有量は、ＨＰ
ＬＣで測定したところ５２．６重量パーセントであっ
た。
リシンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 により抽出し、減圧によりＣＨ
2 Ｃｌ2 を取り除き、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させ
た。沈澱微生物中のストレプトバリシン含有量は、ＨＰ
ＬＣで測定したところ５２．６重量パーセントであっ
た。
【００５２】実施例３ 冷凍保存サンプルＡ１０ｍｌを、５リットルのジャー・
ファーメンター中で、無菌前培養培地３リットルに接種
した。この培養体を、２７℃、３００ｒｐｍの攪拌のも
とで、１．７５ｖ／ｖ／ｍの割合で空気を送りながら３
日間培養した。こうして得られた前培養体１００ｍｌ
を、さらに３０リットルのジャー・ファーメンター中
で、無菌本培養培地Ｎｏ．２の１８リットルに接種し、
２７℃、１５０ｒｐｍの攪拌のもとで、１ｖ／ｖ／ｍの
割合で、空気を送りながら１４日間発酵させた。１４日
目にストレプトバリシンＣの濃度を測定すると、１１４
１ｍｇ／ｌであった。
ファーメンター中で、無菌前培養培地３リットルに接種
した。この培養体を、２７℃、３００ｒｐｍの攪拌のも
とで、１．７５ｖ／ｖ／ｍの割合で空気を送りながら３
日間培養した。こうして得られた前培養体１００ｍｌ
を、さらに３０リットルのジャー・ファーメンター中
で、無菌本培養培地Ｎｏ．２の１８リットルに接種し、
２７℃、１５０ｒｐｍの攪拌のもとで、１ｖ／ｖ／ｍの
割合で、空気を送りながら１４日間発酵させた。１４日
目にストレプトバリシンＣの濃度を測定すると、１１４
１ｍｇ／ｌであった。
【００５３】ＨＰ−２０樹脂に蓄積したストレプトバリ
シンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、ＣＨ2 Ｃｌ2 を溜去し
た後、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させた。取り出したス
トレプトバリシンの総量中のストレプトバリシンＣの含
有量を、ＨＰＬＣで測定したところ５５．８重量％であ
った。
シンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、ＣＨ2 Ｃｌ2 を溜去し
た後、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させた。取り出したス
トレプトバリシンの総量中のストレプトバリシンＣの含
有量を、ＨＰＬＣで測定したところ５５．８重量％であ
った。
【００５４】実施例４ 冷凍保存サンプルＡと、ＡＴＣＣ２７４６５および微工
研条寄第３４６０号から調製した冷凍保存サンプルのそ
れぞれ０．５ｍｌを、別々に、下記の組成を持つ無菌前
培養培地１００ｍｌに接種した。 前培養培地： コーンデキストリン ２０．０ｇ／ｌ 脱脂大豆粉末 １０．０ｇ／ｌ コーンスチープリカー １０．０ｇ／ｌ ビール酵母 ２．５ｇ／ｌ ＫＣｌ ３．０ｇ／ｌ ＣａＣＯ3 ４．０ｇ／ｌ
研条寄第３４６０号から調製した冷凍保存サンプルのそ
れぞれ０．５ｍｌを、別々に、下記の組成を持つ無菌前
培養培地１００ｍｌに接種した。 前培養培地： コーンデキストリン ２０．０ｇ／ｌ 脱脂大豆粉末 １０．０ｇ／ｌ コーンスチープリカー １０．０ｇ／ｌ ビール酵母 ２．５ｇ／ｌ ＫＣｌ ３．０ｇ／ｌ ＣａＣＯ3 ４．０ｇ／ｌ
【００５５】これを、前培養体を作成するため、回転震
盪機上で１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。そ
の後、３つの前培養体のそれぞれ５ｍｌを、１００ｍｌ
の下記の組成を持つ無菌本培養培地Ｎｏ．３に接種し
た。 本培養培地Ｎｏ．３： グルコース １２０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７４） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオンＨＰ−２０； ５０％固体）
盪機上で１７５ｒｐｍ、２７℃で、３日間培養した。そ
の後、３つの前培養体のそれぞれ５ｍｌを、１００ｍｌ
の下記の組成を持つ無菌本培養培地Ｎｏ．３に接種し
た。 本培養培地Ｎｏ．３： グルコース １２０．０ｇ／ｌ 大豆粉 ２０．０ｇ／ｌ ビール酵母 １０．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／ｌ シリコンエマルジョン消泡剤 ２．０ｇ／ｌ （ＫＭ７４） ポリスチレン型吸着用ビーズ １００．０ｇ／ｌ （ダイアイオンＨＰ−２０； ５０％固体）
【００５６】本培養培地には、フマル酸も、その塩も用
いなかった。この培養体を、回転震盪機上で１７５ｒｐ
ｍ、２７℃で、１７日間発酵させた。３つの培養体のそ
れぞれの吸着用ビーズに蓄積したストレプトバリシンＣ
の濃度を、７日目と１７日目にＨＰＬＣで測定した。そ
の結果は表３のとおりであった。
いなかった。この培養体を、回転震盪機上で１７５ｒｐ
ｍ、２７℃で、１７日間発酵させた。３つの培養体のそ
れぞれの吸着用ビーズに蓄積したストレプトバリシンＣ
の濃度を、７日目と１７日目にＨＰＬＣで測定した。そ
の結果は表３のとおりであった。
【００５７】
【表３】
【００５８】このように、２０００ｍｇ／ｌを超えるス
トレプトバリシンＣの収率をこの菌株から得ることがで
きる。
トレプトバリシンＣの収率をこの菌株から得ることがで
きる。
【００５９】実施例５ 冷凍保存サンプルＡ１０ｍｌを、５リットルのジャー・
ファーメンター中で、先に述べた無菌前培養培地２リッ
トルに接種した。この培養体を、２７℃、３００ｒｐｍ
の攪拌のもと、３日間にわたり、１．７ｖ／ｖ／ｍの割
合で空気を送りながら培養した。
ファーメンター中で、先に述べた無菌前培養培地２リッ
トルに接種した。この培養体を、２７℃、３００ｒｐｍ
の攪拌のもと、３日間にわたり、１．７ｖ／ｖ／ｍの割
合で空気を送りながら培養した。
【００６０】こうして得られた前培養体１０００ｍｌ
を、３０リットルのジャー・ファーメンター中で、１８
リットルの無菌本培養体に接種した。この培養体を２７
℃、１５０ｒｐｍの攪拌のもと、２０日間、１ｖ／ｖ／
ｍの割合で空気を送りながら発酵させた。８日目に、ス
トレプトバリシンＣの濃度１０２１ｍｇ／ｌが、２０日
目には２３１０ｍｇ／ｌが測定された。
を、３０リットルのジャー・ファーメンター中で、１８
リットルの無菌本培養体に接種した。この培養体を２７
℃、１５０ｒｐｍの攪拌のもと、２０日間、１ｖ／ｖ／
ｍの割合で空気を送りながら発酵させた。８日目に、ス
トレプトバリシンＣの濃度１０２１ｍｇ／ｌが、２０日
目には２３１０ｍｇ／ｌが測定された。
【００６１】ＨＰ−２０ビーズに蓄積したストレプトバ
リシンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、ＣＨ2 Ｃｌ2 を溜去
した後に、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させた。ＨＰＬＣ
で測定したところストレプトバリシンＣの含有量は５
８．８重量％であった。
リシンを、ＣＨ2 Ｃｌ2 で抽出し、ＣＨ2 Ｃｌ2 を溜去
した後に、ｎ−ヘキサンを加えて沈澱させた。ＨＰＬＣ
で測定したところストレプトバリシンＣの含有量は５
８．８重量％であった。
【００６２】
【発明の効果】上述のように本発明によれば、ストレプ
トバリシンＣについて著しい高生産性を有するストレプ
トマイセス属に属する突然変異菌株を、容易にかつ短期
間に選択することができ、ストレプトバリシンＣの容易
な分離とストレプトバリシンＣのより高い収率とを可能
にする。したがって、ストレプトバリシンＣの商業製品
化、ストレプトバリシンＣのみならずその誘導体に関し
ての今後の研究開発に有効に利用することができる。
トバリシンＣについて著しい高生産性を有するストレプ
トマイセス属に属する突然変異菌株を、容易にかつ短期
間に選択することができ、ストレプトバリシンＣの容易
な分離とストレプトバリシンＣのより高い収率とを可能
にする。したがって、ストレプトバリシンＣの商業製品
化、ストレプトバリシンＣのみならずその誘導体に関し
ての今後の研究開発に有効に利用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 井上 要人 アメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、 サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイート ビー‐102 シンエツ バイオ インコーポレイティッド内 (72)発明者 山崎 元秀 アメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、 サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイート ビー‐102 シンエツ バイオ インコーポレイティッド内 (72)発明者 室伏 完治 アメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、 サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイート ビー‐102 シンエツ バイオ インコーポレイティッド内 (72)発明者 リチャード・ダブリュー・アーメントロー ト アメリカ合衆国、92121 カリフォルニア、 サン・ディエゴ、ラスク・ブールバード 6650、スイート ビー‐102 シンエツ バイオ インコーポレイティッド内
Claims (8)
- 【請求項１】 ストレプトマイセス・スペクタビリスの
高生産性菌株の選別方法において、 イ）ストレプトマイセス・スペクタビリスの野性株を、
ストレプトバリシンについて耐性のない生物体を除去
し、さらに突然変異を誘発する状態にして、 ロ）上記イ）のステップから得られたストレプトバリシ
ンについて耐性のある菌株を培養し、 ハ）上記ロ）のステップの培養体から多数のコロニーを
成長させ、無胞子性のコロニーを選別し、 ニ）別に調製した発酵混合液中で無胞子性のコロニーの
それぞれを培養して、各コロニーから菌株のペレットを
形成させ、 ホ）裸眼で視認できる最小のペレットを、不均一なペレ
ットをいくつか含む発酵混合物から選別する、各ステッ
プからなるストレプトマイセス・スペクタビリスの高生
産性菌株の選別方法。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス・スペクタビリスの
高生産性菌株の選別方法において、 イ）ストレプトマイセス・スペクタビリスの野性株を、
ストレプトバリシンに対して耐性のない生物体を除去
し、さらに突然変異を誘発する状態にし、 ロ）上記イ）のステップから得られたストレプトバリシ
ンに対して耐性のある菌株を培養し、 ハ）上記ロ）のステップの培養体から多数のコロニーを
成長させ、無胞子性のコロニーを選別し、 ニ）別に調製した発酵混合液中で無胞子性コロニーのそ
れぞれを培養して、各コロニーから菌株のペレットを形
成させ、 ホ）裸眼で視認できる最も濃い深紅色を呈しているペレ
ットを、不均一なペレットをいくつか含む発酵混合物か
ら選別する、 各ステップからなるストレプトマイセス・スペクタビリ
スの高生産性菌株の選別方法。 - 【請求項３】 野性株としてストレプトマイセス・スペ
クタビリスＡＴＣＣ２７４６５を用いて請求項１または
２に記載の方法により得られたストレプトマイセス・ス
ペクタビリスの高生産性菌株。 - 【請求項４】 微工研条寄第３５９８号、同第３５９９
号、または同第３５９７号であることを特徴とする請求
項３に記載のストレプトマイセス・スペクタビリスの高
生産性菌株。 - 【請求項５】 請求項１または２に記載の方法により得
られた高生産性菌株の生物的に純粋な培養体。 - 【請求項６】 微工研条寄第３５９８号、同第３５９９
号および同第３５９７号のストレプトマイセス・スペク
タビリスからなる群より選ばれたものを用いて得られた
請求項５に記載の生物学的に純粋な微生物培養体。 - 【請求項７】 吸着性ポリマービーズの存在下におい
て、資化性炭素源と、窒素源と、ミネラル類と、フマル
酸およびその水溶性塩とを含む水性栄養培地において請
求項３に記載の純粋培養体の菌株を発酵状態におくこと
を特徴とする高生産性のストレプトバリシンＣの製造方
法。 - 【請求項８】 吸着性ポリマービーズの存在下におい
て、フマル酸およびその水溶性塩からなる群より選ばれ
た化合物を実質的に含まず、かつ、資化性炭素源、窒素
源、ミネラル類を含む水性栄養培地において請求項３に
記載の高生産性菌株の発酵状態におくことを特徴とする
高生産性ストレプトバリシンＣの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/776,989 | 1991-10-16 | ||
| US07/776,989 US5208153A (en) | 1991-10-16 | 1991-10-16 | Process for producing streptovaricin c |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622752A true JPH0622752A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=25108944
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4301646A Pending JPH0622752A (ja) | 1991-10-16 | 1992-10-14 | ストレプトバリシンｃの製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5208153A (ja) |
| EP (1) | EP0538050B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0622752A (ja) |
| CA (1) | CA2080652A1 (ja) |
| DE (1) | DE69219720T2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5258291A (en) * | 1990-10-23 | 1993-11-02 | Shin-Etsu Bio. Inc. | Process for producing antibiotics |
| US6709845B1 (en) | 1999-07-02 | 2004-03-23 | Shin-Etsu Bio, Inc. | Production of modified polysaccharide S-7 |
| US6958039B2 (en) | 2003-05-02 | 2005-10-25 | Oculir, Inc. | Method and instruments for non-invasive analyte measurement |
| US6968222B2 (en) | 2003-05-02 | 2005-11-22 | Oculir, Inc. | Methods and device for non-invasive analyte measurement |
| US6975892B2 (en) | 2003-10-21 | 2005-12-13 | Oculir, Inc. | Methods for non-invasive analyte measurement from the conjunctiva |
| CN102977118B (zh) * | 2012-11-17 | 2015-06-10 | 浙江工业大学 | 一种作用革兰氏阳性菌的抗生素及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0646950B2 (ja) * | 1990-01-24 | 1994-06-22 | 理化学研究所 | ストレプトバリシンの製造方法 |
| JPH0636747B2 (ja) * | 1990-01-24 | 1994-05-18 | 理化学研究所 | ストレプトバリシンの製法 |
| US5114846A (en) * | 1990-10-23 | 1992-05-19 | Shin-Etsu Bio, Inc. | Process for producing streptovaricin |
-
1991
- 1991-10-16 US US07/776,989 patent/US5208153A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-10-14 JP JP4301646A patent/JPH0622752A/ja active Pending
- 1992-10-15 CA CA002080652A patent/CA2080652A1/en not_active Abandoned
- 1992-10-16 EP EP92309457A patent/EP0538050B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-16 DE DE69219720T patent/DE69219720T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69219720T2 (de) | 1997-10-23 |
| EP0538050A2 (en) | 1993-04-21 |
| CA2080652A1 (en) | 1993-04-17 |
| EP0538050B1 (en) | 1997-05-14 |
| US5208153A (en) | 1993-05-04 |
| DE69219720D1 (de) | 1997-06-19 |
| EP0538050A3 (ja) | 1994-05-04 |
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