JPH0622766A - 生成ステロイド受容体のエクスプレッション ベクタ、ステロイド受容体キメラ、ステロイド受容体のためのスクリーニング アッセイ及び合成受容体と受容体ベクタを用いるアッセイ - Google Patents

生成ステロイド受容体のエクスプレッション ベクタ、ステロイド受容体キメラ、ステロイド受容体のためのスクリーニング アッセイ及び合成受容体と受容体ベクタを用いるアッセイ

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JPH0622766A
JPH0622766A JP3015764A JP1576491A JPH0622766A JP H0622766 A JPH0622766 A JP H0622766A JP 3015764 A JP3015764 A JP 3015764A JP 1576491 A JP1576491 A JP 1576491A JP H0622766 A JPH0622766 A JP H0622766A
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ピー．マクダネル ドナルド
Bert W O'malley
ダブリュ．オゥマリィ バート
Orla M Conneely
エム．コネリィ オーラ
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 生物的受容体で生産したエクスプレッション
ベクタの作成、このベクタのトランスクリプショナル
活性をアッセイに用いるリポータベクタの作成、及びス
テロイド受容体の配位同定のアッセイの開発。 【構成】 ユビキチンのカルボキシル６アミノ酸を持つ
リンカと内部制限部位を合成しそして合成リンカをクロ
ーニングして核外遺伝子を形成する。リポータ ベクタ
はステロイド ホルモン受容体に対しアンタゴニストと
して使用される。キメラは未知受容体の機能の同定アッ
セイに使用される。エクスプレッション核外遺伝子から
合成した受容体を使用しそして受容体ベクタを使用した
生物的化合物により臨床及び実験室的アッセイである。 【効果】 アゴニストのアッセイ及びステロイド受容体
の配位同定、コンプレックス マトリックス内の生物的
コンパウンドの検出アッセイが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は1990年１月16日出願さ
れたアメリカ特許出願第464,837号：発明の名称「生成
ステロイド受容体のエクスプレッション ベクタ、ステ
ロイド受容体キメラ及びステロイド受容体のためのスク
リーニング アッセイ」のＣＩＰ出願に係る。
【０００２】この発明は一般的には、ステロイド、ホル
モン受容体、ステロイド受容体配位子のスクリーニング
アッセイ、キメリック受容体のためのスクリーニング
アッセイと、ステロイド受容体結合の量及び効率を決定
するためのアッセイと、未知受容体、アゴニスト、受容
体のアンタゴニストの固定と、受容体又は受容体ベクタ
の合成に用いるアッセイに関する。
【０００３】
【従来の技術】ステロイド ホルモンはトランスクリプ
ショナル結合点のポテント（potent）モジュレータ（mo
dulator）であり、微分（differentiation）、ホームオ
スタシス（homeostasis）及び開発と組合わせられるコ
ンプレックス方法を調整する。これらの分子の作用メカ
ニズムは、指定内部セルラ（intracellular）受容体に
エフエクタ分子を結合するのに関連する。そのような結
合は受容体の構造を換え、ターゲット遺伝子の通常のレ
ジオン内において指定承認部位のための親和性を増大す
る。この方法において、ステロイドはセル表現型内で変
化するのをリードするプログラムの結合点を指向する。
【０００４】ステロイド受容体ファミリの幾つかのメン
バはクローンされ、それらの機能的ドメインは一般に全
裂される。機能的ドメインは高度に保護されたＤＮＡ結
合ドメインを含み、ホルモン結合ドメインは蛋白質の優
勢なカルボキシル端末にかかっており、アミノ端末レジ
オンの長さを受容体の特殊性の調整の役目をするように
変える。このドメイン組織は受容体のモジュラー組織を
示し、各々は異った機能的エンテイテイを含む。この説
明はエストロゲンのＤＮＡ結合レジオンがグルココルチ
コイド（glucocorticoid）受容体のＤＮＡ結合レジオン
と置換されることができる。このキメリック受容体はエ
ストロゲン従属マナーにおけるグルココルチコイド応答
遺伝子を調整する。さらに分子は関係ずけられねばなら
ぬことがなく、例えばイーストＧａｌ４蛋白質のＤＮＡ
結合レジオンがエストロゲン受容体及びステロイド従属
トランスクリプション因子として機能する。
【０００５】ＤＮＡ結合ドメインは正確にマップされ、
受容体内にある66アミノ酸レジオンに限定される。この
レジオンはアミノ酸レベルにおいて高度に保護され、典
型的には受容体は40〜50％無関連を示す。全アミノ酸よ
りすぐれた相似性がこのレジオンにおける不変性システ
インの位置的保護である。そのすぐれた点はこの保護性
にあり、それは蛋白質がトランスクリプション因子又は
結合配位子である直接プルーフなしでステロイド受容体
スーパーファミリーのメンバとしてのシステイン モチ
ーフを含む分子を分類することを許す。
【０００６】受容体の保護されたＤＮＡ結合ドメインを
含むＤＮＡシーケンスを用いて、幾つかの群はこのスー
パーファミリーの他のメンバに対応する同定クローンを
もっている。これらのただ２つの分子のための配位子
は、スロイド（thyroid）ホルモン及びレチノイク（ret
inoic）酸と同定された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、ス
テロイド ホルモン受容体を生成するエイスプレッショ
ン ベクタの開発である。この発明の付加的な目的は、
受容体エイスプレッション ベクタのトランスクリプシ
ョナル活性をアッセイするのに用いられる一連のリポー
タ ベクタの構築である。この発明の他の目的は、一連
のキメリック（chimeric）受容体エクスプレッションの
開発である。この発明の他の付加的な目的は、アゴニス
ト及びアンタゴニストを計測するためのアッセイの開発
である。この発明の他の目的は、新規なステロイド受容
体の配位子を同定するためのアッセイの開発である。こ
の発明の付加的な目的は、生物質サンプル内の生物的コ
ンパウンドを検査するためのラジオ受容体アッセイを改
良することである。この発明のさらに他の目的は、受容
体システムを使用することによるコンプレックス マト
リックス内の生物的コンパウンドのための検出アッセイ
である。
【０００８】前記の目的を達成するために、この発明の
１つの特徴に関連して、生物的作用ベクタを生成するエ
イスプレッション ベクタを作る方法を提供し、この方
法はユビキチン（ubiquitin）のカルボキシルアミノ酸
及び内部制限部位をもつリンカを合成する工程、核外遺
伝子を形成するために前記合成リンカをクローニンする
工程、内部制限部位をもつ制限エンドヌクレアーゼ（en
donuclease）をもつ前記核外遺伝子を消化する工程、前
記核外遺伝子の制限部位に受容体をコード化するｃＤＮ
Ａを加入する工程とを有する。
【０００９】この発明の１つの実施例において、イース
トがサッカロミセス属及びアスペルギルス属の群から選
ばれ、ステロイド受容体ｃＤＮＡがエストロゲン受容
体、アンドロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及びプロゲ
ステロン受容体の群から選ばれることがわかる。
【００１０】この発明の付加的な特徴は、リポート ベ
クタがイースト イソ-１-シトクロームＣと、前記助触
媒にヒューズした構造的遺伝子とを有することであり、
前記構造的遺伝子はβ-ガラクトシダーゼ及びガラクト
キナーゼの群から選ばれる。
【００１１】この発明の他の特徴は、受容体アゴニスト
又はアンタゴニスト トランスクリプション アッセイ
が、適当なメディア内でイースト ストレンを生長する
工程と、試用アゴニスト又はアンタゴニストを付加する
工程と、生長結果を試験する工程とを有することであ
る。
【００１２】提示した実施例において、受容体ベクタは
β-ガラクトシダーゼを構造的遺伝子として含み、メデ
ィアは５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルβ-Ｄ-ガラ
クトピラノシド（galactopyranoside)，β-ガラクトシ
ダーゼ基質、ＣｕＳＯ4及び寒天又はガラクトキナーゼ
を構造的遺伝子として含むことができ、メディアは約３
％グリセリン、約２％エタノール、寒天、ＣｕＳＯ4及
び約0.1％ ２-デオキシ-Ｄ-ガラクトースを含むことが
できる。
【００１３】この発明の付加的実施例は、キメラ受容体
を作る方法であって、公知の受容体からＤＮＡ結合ドメ
インを制限されたエンドヌクレアーゼで削る工程と、未
知の受容体内のＤＮＡ結合ドメインにおいてコンパチブ
ル制限部位を導入する工程と、前記コンパチブル制限部
位において未知の受容体からＤＮＡ結合ドメインを削る
工程と、前記未知の受容体にコンパチブル制限部位にお
いて公知のＤＮＡ結合ドメインを加入する工程とを有す
る。
【００１４】他の目的、特徴及び利点は、添付図面を参
照して説明されるこの発明の実施例についての下記の説
明から明らかとなる。
【００１５】図面は寸法を知るために必要なものではな
く、この発明の特徴を明瞭にし、正確に理解されるよう
にということで寸法は誇張され、線図的となっている。
ここに記載されるこの発明の種々の置換及び改変が、こ
の発明の範囲及び精神から逸脱することなく行われうる
ことは、当業者にとって明らかである。
【００１６】ここで使用されている制限エンドヌクレア
ーゼ（endnuclease）という用語はシーケンス指定部位
でＤＮＡを割裂する酵素を意味し、それによってダブル
ストランド破断を創生する。
【００１７】ここで使用されている「制限部位」という
用語は、制限エンドヌクレアーゼのシーケンス指定割裂
部位を意味する。
【００１８】ここで使用されている「コンパチブル制限
部位」という用語は、制限エンドヌクレアーゼの指定割
裂部位を意味し、エンドヌクレアーゼは加入される分子
と同じである。例えばもし加入される分子がＥｃｏＲ１
制限部位をもつと、ベクタ内のコンパチブル制限部位は
ＥｃｏＲ１部位となる。当業者は制限酵素が用いられる
ことにより、多くのコンパチブル制限部位があることを
容易に承認する。
【００１９】ここで使用されている「トランスフォーミ
ング」という用語は、遺伝的伝達のメカニズムを意味
し、これによつてドナーから抽出されたＤＮＡは、ドナ
ー及び受納者内でそれらの特性に関し、受納者内に永久
的な遺伝的変更を誘導する。例えば遺伝子と協力するエ
クスプレッション ベクタの使用は、イーストのストレ
イン中にエクスプレッション ベクタを供給する。
【００２０】ここで使用されている「キメラ」という用
語は、２つの異った受容体の遺伝的シーケンスの核融に
よって形成されるＤＮＡのストランドを意味する。例え
ばステロイド受容体はＤＮＡ結合ドメインと、ホルモン
結合ドメインの両者によって構成され、キメラ受容体内
でＤＮＡ結合ドメインは、一つの受容体からの遺伝子コ
ードで構成され、ホルモン結合ドメインは他の受容体か
らの遺伝子コードで構成される。これらの２つのドメイ
ンはキメラ受容体を形成するためにヒユーズされる。ド
メインは異った種又は種内で異った受容体から形成され
る。
【００２１】ここで使用されている「超活性受容体」と
いう用語は、トランスクリプションを活性化する能力を
増大した改変受容体を意味する。
【００２２】ここで使用されている「挿入」という用語
は、酵素Ｔ４ＤＮＡ重合体もしくは損傷の修復に用いら
れ、又はＤＮＡの３´又は５´端部の突出に用いられる
ときの活性を意味する。
【００２３】ここで使用されている「ミラー（Miller）
ユニツト」という用語は、レベルの相対的測定及び制御
の相対的調整を意味する。受容体のトランスクリプショ
ナル作用の効果又は特定のアゴニスト又はアンタゴニス
トの能力を測定することである。
【数１】
【００２４】ここで使用されている「生物的供試体」と
いう用語は、ヒト又は非ヒト組織から収集された細胞組
織又は分泌液を意味する。例えば血、涙、汗、尿、排泄
物、組織生検又は細胞組織スピナル（spinal）流体のよ
うな臨床サンプルである。それは細胞組織培養流体又は
成長メジアムのような研究所サンプルであることができ
る。当業者は各種の供試体を使用することができること
を容易に理解することができる。
【００２５】ここで使用されている「ラベル」という用
語は、混合物内の分子の同定を助けるために分子に取付
けられた化学的又は要素を意味する。例えばラベルは、
アイソトープ、螢光体、ケミルミネッサ、酵素及び抗体
を含むことができる。
【００２６】ここで使用されている「生物的コンパウン
ド」という用語は、インテレスト（interest）の化学的
コンパウンドを意味する。例えばホルモン、ステロイ
ド、ビタミン等である。
【００２７】一連のエクスプレッション ベクタは、イ
ースト内の哺乳動物のステロイド受容体をエクスプレス
するように発展した。受容体はユビキチン（ubiquiti
n）核融合によってイースト内に生成される。ユビキチ
ン分子はホスト処理酵素によって、コー-トランスレー
ショナリィ（co-translationally）に除去され、このよ
うにして非核融合組替え型受容体を除く。
【００２８】生物的作用受容体を生成するエクスプレッ
ション ベクタを作る方法であって、ユビキチンのカル
ボキシル６アミノ酸及び内部制限部位を有するリンカを
合成する工程と、核外遺伝子を形成するために前記合成
リンカをクローンする工程と、前記内部制限部位をもつ
制限エンドヌクレアーゼ相容性をもつ前記核外遺伝子消
化する工程と、前記核外遺伝子の相容性制限部位への受
容体をｃＤＮＡコードを加入する工程と、前記受容体ｃ
ＤＮＡ核外遺伝子にイーストを変える工程とを有する。
【００２９】イーストを成長することにより、指定受容
体は合成される。当業者は標準生化学技術を用いて容易
に隔離して、合成された受容体を精製することができ
る。
【００３０】この方法を用いることによって、ヒトエス
トロゲン受容体、アンドロゲン受容体、プロゲステロン
受容体、ビタミンＤ受容体のためのエクスプレッション
ベクタが開発された。ヒト、鶏又は兎受容体が開発さ
れた。
【００３１】エクスプレッション ベクタの特定の実施
例はヒトビタミンＤ受容体のエクスプレッションのため
のＹＥｐＶ１、ヒトエストロゲン受容体エクスプレッシ
ョンのエクスプレッションのためのＹＥｐＶ２、ヒトア
ンドロゲン受容体エクスプレッションのためのＹＥｐＡ
Ｒ１、鶏プロゲステロン受容体エクスプレッションのた
めのＹＥｐＰ２（β形）、鶏プロゲステロンのエクスプ
レッションのためのＹＥｐＰ８（Ａ形）、ヒトプロゲス
テロンのエクスプレッションのためのＹＥｐＨＰＲ１
（Ａ形）、ヒトプロゲステロンのエクスプレッションの
ためのＹＥｐＨＰＲ２（Ｂ形）、スロイド受容体のエク
スプレッションのためのＹＥｐＨＴＲ１（β形）、スロ
イド受容体のエクスプレッションのためのＹＥｐＨＴＲ
２（α形）、レチノイク（retinoic）酸の受容体のエク
スプレッションのためのＹＥｐＲＡＲ，ＣＯＵＰ蛋白質
のエクスプレッションのためのＹＥｐＣＯＵＰ、鶏ビタ
ミンＤ受容体のエクスプレッションのためのＹＥｐＶ９
及び兎ビタミンＤ受容体のエクスプレッションのための
ＹＥｐＶ10を含んで作られた。
【００３２】エクスプレッション ベクタによって生成
された受容体の生物学的-生化学的特性は、陽性又は広
範囲の受容体として述べられた特性と同等であるように
みえる。
【００３３】各種のイースト ストレインはトランスフ
ォームすることができるが、この実施例ではサッカロミ
セス属及びアルペルギルス属が用いられる。
【００３４】一連の受容体ベクタ（核外遺伝子）は、イ
ースト内の受容体のトランスクリプショナル活性をアッ
セイするために構築される。これらの個々の再構築ユニ
ットは、それらのステロイド アゴニステイック アン
タゴニステイック作用のためのコンパウンドをスクリー
ンし、評価するのに有効である。したがって再構築され
たトランスクリプショナル ユニットは、活性コンパウ
ンドにセイステロイド先駆者を転換することができる同
定方法に用いられることができる。
【００３５】リポータ ベクタは構造的遺伝子にヒュー
ズされたイースト アイソ-１-シトクロームＣ基部助触
媒要素を含み、前記構造的遺伝子はβ-ガラクトシター
ゼ、ガラクトキナーゼ及びＵＲＡ３の群から選ばれる。
【００３６】提示された実施例において、ベクタは受容
体応答要素のための加入部位をさらに含む。付加的な実
施例は受容体応答要素を含む。
【００３７】トランスクリプショナル活性のインジケー
タとして、β-ガラクトシターゼを含むベクタは親ベク
タｐＣ２から誘導され、ガラクトキナーゼを含むベクタ
はＹＣｐＲ１ベクタから誘導される。提示された実施例
において、構造的遺伝子はＥ．ｃｏｌｉから創生され
る。
【００３８】この発明の付加実施例はアゴニスト又はア
ンタゴニスト トランスクリプション アッセイは、適
当なメディア内でリポータ ベクタを成長する工程、試
用アゴニスト又はアンタゴニストを付加する工程、成長
結果を試験する工程を含む。リポータ ベクタはβ-ガ
ラクトシターゼ、ガラクトキナーゼ又はＵＲＡ３防御シ
ステムに基くことができる。どのような防御システムが
用いられるかにより、結果がえられる。例えばもしガラ
クトキナーゼが用いられると、成長の有無がアゴニスト
又はアンタゴニストが提供されるか否かを決定するのに
重要である。適当がホルモン自身によってセルの死をリ
ードする。他方もしβ-ガラクトシターゼが用いられる
と、その結果は色変化によって測定される。ホルモンが
ないと白色がでる。もしホルモンがあると、色はブルー
となる。もしＵＲＡ３防御システムが用いられると、セ
ルは５-フロォロ（Flouro）-オロティク（orotic）酸の
存在のもとで殺される。このようにしてβ-ガラクトシ
ターゼ、ガラクトキナーゼ又はＵＲＡ３防御システムの
いずれが用いられるかにより、このアッセイシステムは
群体の成長又は色を試験することによって、アゴニスト
及びアンタゴニストの存在、不存在、効率及び有効性を
決定することができる。
【００３９】キメラ受容体を作る方法であって、公知の
受容体からＤＮＡ結合ドメインを制限されたエンドヌク
レアーゼで削除する工程と、未知の受容体中にＤＮＡ結
合ドメインにおいてコンパチブル制限部位を導入する工
程と、前記コンパチブル制限部位において、未知の受容
体からＤＮＡ結合ドメインを削除する工程と、公知のＤ
ＮＡ結合ドメインにコンパチブル制限部位置において前
記未知の受容体を加入する工程とを有する方法。
【００４０】もし公知ＤＮＡ結合ドメインが内部制限部
位をもたないならば、この方法はさらに公知のＤＮＡ結
合ドメインを受容体から削る前に、公知のＤＮＡ結合ド
メイン内に制限部位を導入する工程を含むことができ
る。公知のＤＮＡ結合ドメイン内に導入される制限部位
は、公知のＤＮＡ結合ドメイン内に、又は導入された制
限部位で内部制限部位にコンパチブルでなければならな
い。このようにしてＤＮＡ結合ドメインが未知の受容体
から削られるとき、公知の結合ドメインがコンパチブル
制限部位のために、加入されることができる。
【００４１】ひとたびキメラが作られると、未知の受容
体配位子の同定のためのアッセイが用いられることがで
きる。このアッセイはキメラ受容体を生長させ、キメラ
受容体の未知の部分をスクリーンするため適当なアゴニ
ストを付加し、未知のＤＮＡ受容体結合ドメインの応答
を計測する。
【００４２】ＤＮＡ結合ドメインは、受容体を結合する
ピューテーティブ（putative）アゴニストの量により応
答する。もし結合が生じないならば応答がなく、もしア
ゴニストが結合するとＤＮＡ結合ドメインは質的に応答
する。このようにしてこのアッセイは、未知の配位子の
感度及び選択性を決定するために、広範囲のケミカルを
スクリーンするのに用いられることができる。
【００４３】第２型のキメラがまた開発され、超活性受
容体の導入を許す。この場合バイラル（viral）ＶＰ16
蛋白質の限定された活性ドメインは、ワイルドタイプの
受容体のＮＨ２端末に加入される。
【００４４】この発明の他の特徴は、生物学的コンパウ
ンドのためのアッセイを改良するにある。生物的供試体
における生物学的コンパウンドを計測するためのアッセ
イであって、請求項１のエクスプレッション ベクタに
よって合成されている生物学的作用受容体に適当なラベ
ルド生物学的コンパウンドを予めラベルし、予めラベル
ドされた受容体の前記供試体のサンプルを付加し、前記
供試体内の生物的コンパウンドの量を決定するため前記
供試体中の生物学的コンパウンドによって、置換された
ラベルドコンパウンドの量を計測する。前記のアッセイ
においてラベルはラジオアイソトープである。
【００４５】この発明の他の実施例は、生物学的供試体
内の生物学的コンパウンドを測定するためのキットであ
って、前記したエクスプレッション ベクタから合成さ
れた生物学的活性受容体をもつコンテナを含む。このキ
ットはさらに生物学的に活性受容体に結合するためのラ
ジオ-ラベルド コンパウンドを含むことができる。他
の実施例において、キットはさらに標準的カーブを創生
す制御サンプルを含むことができる。
【００４６】この発明の他の実施例は、受容体と前記し
たリポータ ベクタとを用いる生物学的コンパウンドの
ためのアッセイである。生物学的供試体内の生物学的コ
ンパウンドを測定するためのアッセイは、生物学的に活
性受容体及びリポータ ベクタを含むイースト セルを
成長する工程を含み、リポータ ベクタはβ-ガラクト
シターゼ及びガラクトキナーゼを含む群から選ばれた構
造的遺伝子にヒューズされたイースト イソ-１-シトク
ロームＣの基部助触媒要素をもち、イーストセルに供試
体のサンプルを付加する工程と、構造的遺伝子の蛋白質
生成物の活性を測定することによって、供試体内の生物
学的コンパウンドの量を決定する工程とを有する。
【００４７】特定の実施例においては、受容体はエスト
ロゲン受容体であり、構造的遺伝子はβ-ガラクトシタ
ーゼである。
【００４８】アッセイの他の特定の実施例は、キメリッ
ク受容体又は超活性受容体を用いることを含む。超活性
受容体はその読み取りフレーム内に含まれたヘルペス
シンプレックス ＶＰ16蛋白質の活性ドメインをもつエ
ストロゲン受容体を含む。キメリック受容体はエストロ
ゲン応答要素及び非エストロゲン配位子結合ドメインを
含むことが好ましい。結合ドメインは生物学的コンパウ
ンド インテレストにたいして指定される。
【００４９】前記の受容体に付加して、改良されたアッ
セイ又は受容体アッセイが、コーチゾン、プレドニゾン
（prednisone）、プレドニゾロン（prednisolone）及び
アルドステロン（aldosterone）受容体と用いられるこ
とができる。
【００５０】この発明の他の実施例は、ＤＮＡ結合を検
出するためのリポータであって、ＤＮＡに結合するトラ
ンスクリプションのためのシーケンス及び生物学的に活
性受容体からの応答要素のためのシーケンスを含む。２
つのシーケンス（トランスクリプション因子及び応答要
素）が蛋白質にヒューズされ、この蛋白質は因子及び要
素に結合され、同時にヒューズされたシーケンスを占め
ることができない。このようにしてシーケンスはともに
接近していなければならない。提示実施例において、ト
ランスクリプション因子シーケンスから少なくとも１つ
のヌクレオチドベースが応答要素シーケンスとオーバー
ラップする。このようにして、このリポータがアッセイ
に用いられるとき、トランスクリプション因子のための
配位子又は応答要素のための配位子のいずれかが結合さ
れるが、同時に結合されることがない。ＤＮＡ及び応答
要素を結合するトランスクリプション因子が用いられる
ことができるが、好ましい実施例はＧＡＬ４，ＧＣＮ
４，ｙＡＰ１及びＡＣＥ１の群から選ばれた結合蛋白質
応答因子及びエストロゲン受容体、アンドロゲン受容
体、ビタミンＤ受容体、プロゲステロン受容体、コーチ
ゾン受容体、プレドニゾン受容体、プレドニゾロン受容
体、アルドステロン受容体、レチノイク酸受容体及び甲
状線受容体の群から選ばれた応答要素を含む。
【００５１】生物学的コンパウンドのためのアッセイに
おいて、ヒューズされたシーケンス受容体及び生物学的
活性受容体がセルに加入される。例えばサッカロミセス
属又はアスペルギルス。テストされる生物学的コンパウ
ンドが成長しているセルに付加される。それからトラン
スクリプショナル活性の量が測定される。トランスクリ
プショナル活性の量は生物学的供試体内において、生物
学的コンパウンドの量に比例する。
【００５２】トランスクリプション又はトランスクリプ
ションの阻害量を測定することによって、アッセイはさ
らにアゴニスト及び活性受容体又はトランスクリプショ
ン受容体を結合する蛋白質を検出するために展張される
ことができる。アッセイは公知又は未知のトランスクリ
プション因子及び生物学的活性受容体を防御し、発見す
るために用いられることができる。
【００５３】１実施例は未知のトランスクリプション因
子を同定する方法である。この方法において、公知の生
物学的に活性の受容体及びリポータは、セルに加入され
るためにヒューズされる未知のトランスクリプション因
子を含む。セルは適当なメディアの内部で成長する。つ
いで生物学的に活性の受容体に結合するコンパウンドが
付加され、試用蛋白質がトランスクリプション因子を同
定するために付加される。合成的トランスクリプショナ
ル活性が未知のトランスクリプション因子の同定を決定
するために試験される。
【００５４】他の実施例は未知の受容体を同定する方法
である。この実施例において未知の受容体及びリポータ
はセルに付加される公知のトランスクリプション因子及
び未知の受容体を含む。セルは適当なメディアの内部で
成長する。試用コンパウンドが生物学的に活性の受容体
を同定するために、成長するセルに付加される。合成的
トランスクリプショナル活性が受容体を同定するために
試験される。
【００５５】下記の例が開示のために提供され、それは
この発明を限定するものではない。これらの例において
全パーセンテージが固体にとって重量により、流体にと
って容積により、全温度は注なしで摂氏温度である。
【００５６】〔例１〕 エクスプレッション ベクタＹ
ＥｐＶ１の構造及びその生物学的-生化学的特性 エクスプレッション ベクタＹＥｐＶ１は、ヒトビタミ
ンＤ受容体の合成を指向し、下記のように構築される。
合成リンカが合成されて、ユビキチンのカルボキシル６
アミノ酸を含み、内部ＥｃｏＲ１部位を含む。このリン
カはｐＧＥＭ４のＥｃｏＲ１-Ｋｐｎ１内にクローンさ
れる。合成核外遺伝子ｐＧ42はビタミンＤ受容体のＥｃ
ｏＲ１および2.0Ｋｂ ＥｃｏＲ１-ＥｃｏＲ１破片で消
化され、ｃＤＮＡが部位に加入される。正しいオリエン
テーション（orientation）において、これは受容体へ
ユビキチンのインフレーム（inframe）核融合を含む。
核外遺伝子ＢＣｐVIを生成する。ついでの増幅、ＡｆII
I-ＫｐｎＩ破片が削られ、ＹＥｐ42の対応部位にサブク
ローン（subcloned）される。合成核外遺伝子はＹＥｐ
Ｖ１とよばれる。この合成核外遺伝子は増幅され、精製
され、リチュームアセテート トランスフォーメーショ
ン方法を用いてサッカロミセス属サービサエ（cerevisa
e）をトランスフォームするのに用いられる。トランス
フォーマント（transformant）はトリプトファン栄養素
要求性によって選ばれる。
【００５７】組替え受容体は２％グルコースで補足した
最小メディアにおいて、トランスフォーマントを成長す
ることによって生成される。つぎの日セルは10-フォル
ド（fold）に薄められ、600ｎＭで視覚密度1.0に生長す
ることを許す。受容体の生成は100μＭ ＣｕＳＯ4を付
加することによって開始される。セルは付加的な２時間
の間生長することが許され、遠心分離と氷冷却ＴＫＯ
（10ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣ１ ｐＨ 7.5，５ｍＭ ＤＴ
Ｔ）で２度洗浄することによって収穫される。最終ペレ
ットは450μｌ ＴＫＯに再サスペンドされ、セルは３
分の１の量のガラスビーズが入っている遠心分離管内に
おいて、１秒間３回渦巻くことによって分離される。４
回目の渦巻はついで３Ｍ ＫＣＬの50μｌの付加によっ
て行われ、核から受容体を抜き取るのを確実にする。細
胞破片が12,000ｇで10分間遠心分離することによって除
去される。浮遊物が発見され、全蛋白質が測定される。
サイトソルが急速に分析される。
【００５８】サッカロミセス属セレビサエ（cerevisa
e）ストレインＦ762は、ＹＥｐＶ１でトランスフォーム
され、受容体合成は0.5及び100μＭ ＣｕＳＯ4がメデ
ィアに付加された条件のもとで試験される。組替え受容
体からのサイトソルは、ビタミンＤ受容体（図３）のた
めの単クロール抗体を用いるウエスタンイムノブロッテ
イングによって分析される。レーン（lane）１，２，
３，４は、ＹＥｐＶ１でトランスファーされた２つの独
立したクローンから抽出された10μＧ及び１μＧの全蛋
白質を示す。システム内において受容体のインデューシ
ビリティ（inducibility）は、イムノブロットによって
計量される。ＣｕＳＯ4（非誘導セル）なしで、受容体
に対応しためんえき性物質が防御が可能ではない。しか
しながらＣｕＳＯ4の量を増大することによって、ヒト
ビタミンＤ受容体は47ｋＤａの分子量で完全な蛋白質種
として防御される。
【００５９】組替え受容体のホルモン結合特性の分析が
図４に示されている。受容体エキスプレッション核外遺
伝子でトランスフォームされたセルからのサイトソルに
おいて、高い類似サチュラブル（saturable）結合部位
が防御される（図４）。非トランスフォームドすなわち
ワイルドタイプのセルからのサイトソルは、ビタミンＤ
の特定結合を示す。この種の親和力は、ワイルドタイプ
の哺乳類受容体のために他によって観測されたものと同
様であり、哺乳類受容体の親和力の流れの見積と同様で
ある。受容体のＤＮＡ結合特性は子牛胸線ＤＮＡセルロ
ーズ クロマトグラフィーを用いて試験された。サイト
ソルはトリシェーテッド（tritiated）されたホルモン
でラベルされ、ＤＮＡセルローズ コラム（図４Ｂ）に
付加される。ついで低塩バッファで洗浄し、バウンド蛋
白質がＫＣ１の直線状勾配でエルート（eluted）され
た。示されたプロフイルはワイルドタイプの受容体でに
調和して、0.22Ｍ ＫＣ１において放射能のピークをエ
ルートする。このようにして組替え受容体の生化学特性
はワイルドタイプの受容体と同じである。
【００６０】〔例２〕 非ヒューズ ストロイド受容体
の構造 これとは別にステロイド受容体は、非ヒューズ形態で生
成される。非ヒューズ受容体はワイルドタイプのＡＴＧ
又はエストロゲン受容体の場合のようにアミノ酸シーケ
ンスを同定する変更ＤＮＡシーケンスが用いられるが、
もっと効率的なトランスレーション開始をも許す。
【００６１】ヒトエストロゲン受容体ｃＤＮＡはＳＰ６
助触媒に隣接したｃＤＮＡの５´端部のようなｐＧＥＭ
３のＥｃｏＲＩ部位に加入された。５´非トランスレー
テッド レジオンはＴｈｔIII及びＢａＭＨＩでこの核
外遺伝子の隔離によって除去された。ＮｃｏＩ部位を含
むオリゴヌクレオチド及び光学的トランスレーション開
始のために必要なシーケンスが核外遺伝子に加入され
た。この核外遺伝子のＮｃｏＩ-ＥｃｏＲＩ破片は精製
されて、74ポリメラーゼとともに充填され、ベクタＲＣ
４のＥｃｏＲＩの切断されて充填された部位に鈍端が結
さつされた。この核外遺伝子はＣＵＰ１助触媒及びＣＹ
Ｃ１端部シーケンスを含む低コピー核外遺伝子である。
さらにそれはイーストにおける核外遺伝子（図２）の生
長反応を許すＴＲＰ１ ＡＲＳ及びＣＥＮ３シーケンス
を含む。
【００６２】このベクタの高コピー等価物が、この核外
遺伝子のＢａｍＨＩ-ＣｌａＩ破片を精製し、Ｔ４ポリ
マラーゼ端部に充填し、ＳｍａｌフォスフォターゼＹｅ
Ｐ351又は352核外遺伝子に破片を加入することによって
構築される。
【００６３】このベクタはモジュールであって、イース
ト助触媒、選択可能なマーカ又は集積ベクタへの変更を
許す。他の受容体ｃＤＮＡｓはエストロゲン受容体で容
易に置換される。
【００６４】組替え受容体は例１で述べたトランスフォ
ーマットを生長することによって生成される。組替え受
容体からのサイトソルはビタミンＤ受容体（図３）のた
めに指定された単クローン抗体を用いて、ウェスターン
イムノブロッティングによって分析された。レーン
５，７，６，８はＹＥｐＶ３をもつ非ヒューズドトラン
スフォーメーションからの10μＧ及び１μＧ蛋白質を含
む。このシステム内において受容体のインデュシビリテ
ィは、イムノブロットによって精製された。ＣｕＳＯ4
（非誘導セル）の不在下において、受容体に対応する非
めんえき性物質が防御される。しかし増大した量のＣｕ
ＳＯ4を付加することにより、ヒトビタミンＤ受容体は
分子量47ｋＤａの無傷蛋白質種として防御された。
【００６５】〔例３〕 ヒューズ及び非ヒューズ トラ
ンスフォーメーションの比較 例１，２のトランスフォーメーションからのサイトソル
は、ウェスターン イムノブロット（図３Ａ）によって
初期的に分析された。この場合両ベクタシステムはほぼ
同量の合成を指向した。しかし核融合蛋白質（図３Ａ、
レーン１-４）として生成された受容体は、非ヒューズ
状態（図３Ａ、レーン５-８）で生成されたものより良
質であり、後者は蛋白質加水分解より低下させられる。
鶏ビタミンＤ受容体の公知の量のめんえき反応信号の比
較に基き、われわれはこれらのストレインがほぼ0.2％
の可溶性蛋白質又はセルごとに約150,000分子と等価の
受容体を生成すると見積る。これは腸のような受容体が
豊富な組織としてみられるものより50〜100の高水準を
示す。小めんえき性帯がセルからトランスフォームされ
たＹＥｐＶ１からのサイトソル内の受容体の上部で防御
された。われわれはこれは非割裂核融合蛋白質の反応に
より、ＹＥｐＶ３（図３Ａ、レーン５-８）でランスフ
ォームされたセルからのサイトソルに明らかでないの
で、ホストによる改変によるのではないと考える。
【００６６】ＣＵＰ１助触媒は銅イオンによって調整さ
れるので、イースト セル内の受容体の制御エクスプレ
ッションに用いられる。ＣＵＰ１助触媒を含むこれらの
ベクタは100μＭの銅硫酸塩を付加することによって受
容体を生成することができる。
【００６７】さらにＣＵＰ１システムは過剰エクスプレ
ス状態において、明らかな通常の表現型を示す受容体の
わずかな突然変異を防御するのに用いられる。このシス
テムのインデュシビリティが図３にみられ、ここでセル
は銅なしで、５μｍ及び10μｍの銅硫酸塩の存在で生長
する。
【００６８】〔例４〕 β-ガラクトピラニシド及びガ
ラクトシターゼ ベクタ β-ガラクトピラニシド及びガラクトシターゼ ベクタ
が図５に線図的に示されている。ＹＲＰ(Ａ)及びＹＲＰ
(Ｂ)ベクタは、エンハンサーレス助触媒を含み、トラン
スクリプショナリィに不活性である。ＹＲＰ(Ａ)及びＹ
ＲＰ(Ｂ)はシス要素アッセイ エンハンサー特性におか
れる−250において、ユニークなＸｈｏ１部位を含む。
各受容体のためのターゲット核外遺伝子を開発するため
に、異種の助触媒上にステロイド応答性を授けることが
示された指定シーケンスがプロゲステロン、アンドロゲ
ン、グルココルチコイド、ビタミンＤ及びエストロゲン
に応答してリポータ核外遺伝子を創成するｐＣ２（β-
ガライトピラニシド）又はＹＣｐＲ１（ガラクトシター
ゼ）におかれた、リポータはエクスプレッションベクタ
を含むセル内に導入され、コートランスフォーマントは
ウラシル及びトリプトファン栄養素要求性によって選別
された。
【００６９】プロゲステロン応答シーケンス及びβ-ガ
ラクトピラニシド遺伝子を含むリポータＹＲｐＰ１が、
鶏プロゲステロン受容体のトランスクリプショナル作用
を計量するのに用いられた。エクスプレッション及びリ
ポータ核外遺伝子を含むイーストは、２％グルコーズを
もつ補足的な最小メディア内で徹夜で生長した。つぎの
日これらのセルは100,000セル／ｍｌの密度で10ｍｌｓ
の新鮮なメディアを接種するのに用いられた。これらの
４組の管は(ａ)付加物なし、(ｂ)＋100μＭＣｕＳＯ4、
(ｃ)＋0.1μＭプロゲステロン、(ｄ)＋100μＭ ＣｕＳ
Ｏ4、0.1μＭプロゲステロンを接種された。セルがｍｉ
ｄ-ｌｏｇフェーズに到達すると、遠心分離法によって
収獲された。セルはガラスビーズを用いて溶解され、サ
イトソルは遠心分離によって類別された。蛋白質のアリ
コート（１-100μｇ）がミラー方法によりβ-ガラクト
シダーゼ作用のためにアッセイされ、ユニット／ｍｇ蛋
白質としてエクスプレットされた。その結果はつぎのと
おりである。 制御 +CuSO4 +Prog +CuSO4,+Prog ミラー ユニット ＜500 ＜500 ＜500 50,000
【００７０】このアッセイにおいて、プロゲステロン受
容体は、リポータ トランズジーン100-フォルドのエク
スプレッションを上方に調節することができる。他のデ
ータは１μＭ ＣｕＳＯ4がこのトランスクリプション
ユニットを最大半分活性化するのに充分である。ステ
ロイド受容体の量を調節する能力は、他を超えたＣＵＰ
助触媒の主な利点である。同様の結果が他のステロイド
受容体に対して観察された。例えばヒトビタミンＤ受容
体のエクスプレッションのためのＹＥｐＶ１、ヒトエス
トロゲン受容体のエクスプレッションのためのＹＥｐＥ
２、ヒトアンドロゲン受容体のエクスプレッションのた
めのＹＥｐＡＲ１、鶏プロゲステロン受容体（β型）の
エクスプレッションのためのＹＥｐＰ２、鶏プロゲステ
ロン（Ａ型）のエクスプレッションのためのＹＥｐＰ
８、ヒトプロゲステロン（Ａ型）のエクスプレッション
のためのＹＥｐＨＰＲ１、ヒトプロゲステロン（Ｂ型）
のエクスプレッションのためのＹＥｐＨＴＲ１、スロイ
ド受容体（α型）のエクスプッションのためのＹＥｐＨ
ＴＲ２、レチノイク酸受容体のエクスプレッションのた
めのＹＥｐＲＡＲ、ＣＯＵＰ蛋白質のエクスプレッショ
ンのためのＹＥｐＣＯＵＰ、鶏ビタミンＤ受容体のエク
スプレッションのためのＹＥｐＶ９、ねずみビタミンＤ
のエクスプレッションのためのＹＥｐＶ10。このベース
上に２つの急速スクリーニング プロトコルが受容体ア
ゴニスト及びアンタゴニストを同定するために開発され
た。
【００７１】〔例５〕 β-ガラクトシダーゼ トラン
スクリプション アッセイ 受容体アゴニスト又はアンタゴニストをスクリーンする
直接プレート法が開発された。ベーシック アッセイ
プレートは、選択的なメディア〔ｐＨ7.0にバッファさ
れ、Ｘ-ＧＡＬ（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル
β-Ｄ-ガラクトフラノシド）、β-ガラクタトシダーゼ
基質、１Ｍ ＣｕＳＯ4及び硬化剤としての２％寒天を
含む〕。プレートへの他の付加物は試験されるのがなに
かによる。例えば適当な場合はアゴニスト又はアンタゴ
ニストが付加される。このアッセイの計画は図６にその
アウトラインが示される。付加因子がない場合には、受
容体及びリポータを含むコロニーが生長し、白くみえ
る。もしホルモンがあると、コローは青くみえる。ホル
モンがないが、ポテンシャル ステロイド アゴニスト
があると、セルは青色をもち、その強度はアゴニストの
効力を反映する。ホルモン及び推定上のステロイド ア
ンタゴニストがある場合、コロニーは白くみえ、その強
度は阻害の程度を反映する。
【００７２】〔例６〕 ガラクトキナーゼ トランスク
リプション アッセイ スクリーニングのアッセイは２-デオキシ-Ｄ-ガラクト
ース／ガラクトキナーゼ アッセイの何れかである。イ
ースト ストレインが寒天中において、ガラクトキナー
ゼのエクスプレッションは生長することが必要である。
この特徴はステロイド アゴニストとして作用する物質
に試用でき又ポジティブマナーにおいて受容体にもたら
された突然変異を同定することができる。このシステム
は又ステロイド アンタゴニストの検索に使用できるし
又ネガティブマナーの受容体機能によりもたらされた突
然変異の固定もできる。グルコース又はガラクトース以
外の糖源及び２-デオキシ-Ｄ-ガラクトース化合物を含
む糖源によりなるメディア中でストレインを生長させる
ことによって行う。この選択はガラクトキナーゼのホス
ホリレート ２-デオキシ-Ｄ-ガラクトースへの能力を
基にしている。そして細胞障害化合物に変換する。実験
プラントは最小メディア、３％グリセロール及び２％エ
タノールを炭素源とし、２％寒天、１μＭ ＣｕＳＯ4
及び0.1％２-デオキシ-Ｄ-ガラクトースを含んでいる。
この実験に加える他のものは、例えば、アゴニスト及び
アンタゴニストが加えられる。このスクリーンの計画の
アウトラインを図７に示す。ホルモンの存在で、セルは
死ぬであろう、ホルモンの不存在でそしてアゴニストの
存在でセルは死ぬであろう。死の割合は供試化合物によ
る刺激の程度に関係する。ホルモンの存在においてそし
てアンタゴニストの存在において、セルは生存するであ
ろう、そして生存の程度はアンタゴニストの制止性に関
係する。
【００７３】〔例７〕 受容体リガンド確認のためのキ
メラの使用 受容体キメラはプロゲステロン受容体とレガンドが確認
されなかった数種の受容体分子で構成されている、キメ
ラを作成する計画の大要は第８図に示す。１つの例にお
いて、特定の制限位置は鶏プロゲステロン受容体のＤＮ
Ａ結合ドメインの範囲に導入される、そして適合しうる
位置は検討すべき分子中に導入される、キメラのシーケ
ンスは結合点を交差していることが確認される、そして
完全なｃＤＮＡは先に述べたようにイーストエクスプレ
ッションベクタ中に挿入される。これらはエクスプレッ
ション核外遺伝子はプロゲステロン リポータ 核外遺
伝子を含む細胞中に導入される。供試化合物の不存在に
おいては、リポータは活性化しない。天然物はこれらの
キメラの活性剤を確認することでスクリーニングされ
る、プロゲステロン又はエストロゲン受容体のＤＮＡ結
合レジオンに未知のリガンドを持つ受容体のホルモン結
合ドメインを融合することは行うことができる。得られ
た分子はプロゲステロン回答リポータ遺伝子に調整され
る分子のスクリーンを記載したリポータシステムに結合
して使用することができる。これらの構成されたキメラ
の始めはプロゲステロン受容体のＤＮＡ結合レジオンで
ある、そしてトランスクリプション ファクターはＣＯ
ＵＰのカルギキシル レジオンである。ＣＯＵＰファク
ターはステロイド受容体族の一員でありそしてエストロ
ゲン受容体に密接に関係がある。受容体キメラのＤＮＡ
結合レジオンの構成及び他の受容体のホルモン結合は機
能的分子を作成し結合することができる。ステロール特
にこれらのキメラはカルボキシ端末により支持される。
【００７４】〔例８〕 ヒト エストロゲン受容体を超
活性受容体への変換 ステロイド受容体のトランスクリプションの活性化の機
構は明確ではないが、受容体のトランスクリプションの
活性化の能力と蛋白質中の酸性活性レジオンの存在とは
関係があることは明らかである。受容体中の酸性レジオ
ンの数の増加によって受容体の発生能力を増加される。
最高の結果は単純ヘルペスＶＰ16蛋白質の酸性活性化ド
メインをステロイド受容体のコーディング レジオンに
挿入することにより得られる。第９図に示されるよう
に、これはエストロゲンのイーストエクスプレッション
ベクタＮｏｔ１を持つＹＥｐＥ２、の消化によってヒト
エストロゲン受容体が得られる、Ｔ４-ポリメラーゼ
で端末において満たしそしてＶＰ16蛋白質のＲｓａｌ-
Ｓａｌｌ破片を満たした状態で結紮する。受容体を適宜
の配位に挿入した後ＶＰ16活性ドメイン読み枠を有する
キメラ受容体を得る。広い形のエストロゲン受容体及び
変形受容体の比較をエストロゲン応答リポートを用いる
イーストで作った。 対 照 ＋ＣｕＳＯ4 ＋Ｅ２ ＋ＣｕＳＯ4＋Ｅ２ ＥＲ 447 473 5760 4344 スーパーＥＲ ＜50 4133 1999 23,999 スーパー エストロゲン受容体は明らかに５倍以上リポ
ータのトランスクリプションの最高割合に上げた。最も
重要なことは、このシステムのバックグラウンドを相当
落して、そのためスクリーンの感度を上昇させたもので
ある。同様な結果は、他のステロイド受容体で得ること
ができる、例えばヒト ビタミンＤ受容体のエクスプレ
ッションのための例えばＹＥｐＶ１，ヒト エストロゲ
ン受容体のエクスプレッションのためのＹＥｐＥ２，ヒ
ト アンドロゲン受容体のエクスプレッションのための
ＹＥｐＡＲ１，鶏プロゲステロン受容体のエクスプレッ
ションのためのＹＥｐＰ２，鶏プロゲステロン（Ａ型）
のエクスプレッションのためのＹＥｐＰ８Ａ，ヒト プ
ロゲステロン（Ａ型）のエクスプレッションのためのＹ
ＥｐＨＰＲ１，チロイド受容体（Ｂ型）のエクスプレッ
ションのためのＹＥｐＨＲ２，チロイド受容体（α型）
のエクスプレッションのためのＹＥｐＨＴＲ２，レチオ
ン酸受容体のエクスプレッションのためのＹＥｐＲＡ
Ｒ，ＣＯＵＰ蛋白質（Ｂ型）のエクスプレッションのた
めのＹＥｐＣＯＵＰ，鶏ビタミンＤ受容体のエクスプレ
ッションのためのＹＥｐＶ９，鼠 ビタミンＤ受容体の
エクスプレッションのためのＹＥｐＶ10。
【００７５】〔例９〕 ステロイドの改善された臨床上
のアッセイ ステロイドをラジオイムノアッセイによる臨床又は実験
室標本の状態で通常計られる。これらのアッセイはステ
ロイドの特殊エピトップに対する抗体の能力による。し
かしながら２，３のステロイド、例えばビタミンＤ，チ
ロイドホルモン及びレチノイドは前駆体、活性代謝及び
分解生成物が抗原的に類似しているからこれらの化合物
間を識別することはできない。この場合ラジオ-レセプ
タアッセイによりステロイドの測定が一層正確になる。
ステロイドとその類似受容体の結合の特性は血清のよう
な複合された試料の特有のリガンドを識別することがで
きる。このアッセイは前に標識した特別の受容体とラジ
オ活性ステロイドとよりなり、そして複合混合物中のラ
ジオ-不活性ステロイドの能力をラジオ-リガンドの現出
により評価する。標準カーブはラジオ-不活性ステロイ
ドの既知の量を用い試料のリガンドの厳密な濃縮物の評
価を行う。このような試験例は1,25（ＯＨ）2Ｄ3のラジ
オ-レセプタアッセイである。このリガンドは鶏ビタミ
ンＤ受容体からラジオ-標1,25（ＯＨ）2Ｄ3現出能力に
より測定する。この受容体はこれを放棄するために分離
は難しい、そしてそのプロテアーゼに敏感であることの
ため取扱いが難かしい。この特殊のアッセイの改善は鶏
大腸受容体をヒト ビタミンＤ受容体に置き換え本発明
のイーストエクスプレッションシステムで作成した。こ
の受容体は室温で少くとも１週貯蔵しても安定で生物活
性は落ちない。本発明の遺伝子組替えを用いて行ったラ
ジオ-レセプタアッセイの他の例はチロキシン又はレチ
ノイドのアッセイである。
【００７６】〔例１０〕 ステロイド受容体及び受容体
キメラシステムを使用して複合試料中のリガンドの濃度
の評価 ステロイド受容体及び受容体キメラは特異的にステロイ
ドホルモンに応答する。ホルモンの応答の特異性は分子
のカルボキシル端末により決定される。これらの応答シ
ステムは複合体標本中のステロイドの濃度のアッセイに
使用することができる。この方法はラジオイミノムノア
ッセイ又はラジオ-レセプタアッセイにおいて生物的活
性ステロイド リガンドの測定のみ及び変形された又は
不活性基質並びに中間体代謝物に対しては特異的に評価
しない利点を有する。この方法の一つの例はエストロゲ
ンの定量アッセイである。エストロゲン受容体と受容体
ベクタの両者を含むイースト細胞を選ばれたメディア中
で一夜生長する。次の日臨床用又は実験用試料の希釈液
にイースト細胞を加える。対照はエストロゲンの既知量
を培養して行う。細胞を30℃にし、更に４時間置く、そ
の時細胞を取り出しそしてβ-ガラクトシダーゼ酵素生
成物のレベルを測定する。標準カーブはステロイドの知
られた濃度から得られた値を用い構成する、そしてこの
グラフから外挿法により未知試料中のエストロゲン濃度
を決定する。この方法の有効性はこのシステムのバック
グラウンド並びに感度による。この理由により、試験の
適用はスーパーエストロゲン受容体例えば、その読み枠
中に含まれているヘルペス単純ＶＰ16蛋白質の活性ドメ
インを持ったエストロゲンの使用に求められる。受容体
のモジュラーの性質により一つの受容体のドメインに結
合したリガンドはエストロゲン受容体のそれに置き換え
て用いることができる。これらのキメラ受容体はドメイ
ンに結合したリガンドと類似のリガンドの付加応答のエ
ストロゲン応答要素を含む活性受容体である。例えば、
ビタミンＤ3はビタミンＤ3受容体のＣ-端末ドメインを
含むエストロゲン受容体キメラのエクスプレッションの
時アッセイすることができる。この方法において、各受
容体の応答システムを発展させる必要はない、そしてキ
メラ受容体は一層感度のよいアッセイが必要である場合
に使用することができる。
【００７７】〔例１１〕 核外遺伝子の構成 エクスプレッションベクタＹＥｐＥ10は下のような構造
である：ヒト エストロゲン受容体核外遺伝子（ＰＧＥ
Ｍ35ｈＥＲ）はＢａｍＨ１及びＴＴＨIII１で消化され
る。イースト ユビキチンの端末６アミノ酸でコード化
されそして又ＡＦＬ11及びＮｃｏｌ位を含む結合子は消
化された核外遺伝子と結紮される。このベクタのＡＦＬ
11-Ｋｐｎ１破片は精製されそしてエクスプレッション
ベクタＹＥｐＶ１（例１）イーストの対応するレジオン
にクローンされる、核外遺伝子ＹＥｐＥ２が得られる。
元のｈＥＲｃＤＮＡは点突然変異を含むことでリポート
されたから、この欠点はこのＹＥｐＥ２のＡＳＰ718-Ｓ
ｍａｌ破片をｃＤＮＡ広い型からの類似破片と置換する
ことで修正される。得られた広い型のｈＥＲエクスプレ
ッション核外遺伝子はＹＥｐＥ10と呼ぶ。この核外遺伝
子のインテグラティブ バージョンはこの核外遺伝子の
ＢａｍＨ１-Ｍｌｕ１破片のクローイングによりベクタ
ＰＹＳＫ152の類似位置に構成される。イースト ゲノ
ムの結合はｌｅｕ２シーケンス中の特殊なＢｓｔＥII位
に核外遺伝子を線状にすることにより行う。
【００７８】〔例１２〕 リポータ 核外遺伝子の構造 リポータ 核外遺伝子は又構成される。親ベクタはＰＣ
２である。核外遺伝子はＨｉｎｄIII及びＢｇIII位をＸ
ｈｏｌ位に挿入することにより変形される、このように
ミニ-クローニング カセットを含むベクタＰＣ３を作
る。オリゴヌクレオチドはＢａｍＨ１端で構成されそし
て単又は複コピーとして核外遺伝子ＰＣ3に挿入された
ものである。挿入されたオリゴヌクレオチドの数は制限
分析で決定されそして配位はシーケンスにより確認され
る。特に使用されるオリゴヌクレオチドのシーケンスは
次の通りである。： ＧＡＬ４ＥＲＥ ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧ ＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣ ＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧ ＡＣＣ ＧＡＬ４ＨＳＥＲＥ ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＧ ＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣ ＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣ ＴＣＧ
【００７９】〔例１３〕 トランスクリプション アッ
セイ リポータエクスプレッション核外遺伝子含有細胞及びリ
ポータは選ばれたメディア中一夜生長する。この培地は
100,000細胞／mlの濃度で新しい接種メディアとして使
用する。実験においてはＧＡＬ４の活性化を必要とする
には、ガラクトースをグルコースの代わりに炭素源とし
て使用する。エストロゲン及びナホキシジンをそれぞれ
２ｘ10▲上付−７▼Ｍ及び２ｘ10▲上付−６▼Ｍ加え
る。硫化銅をエストロゲン受容体の合成を励起させるた
め種々の濃度で加える。細胞が600ｎｍで1.0の光学濃度
に達した時それらを取り出しβ-ガラクトシダーゼ生成
物のレベルを測る。
【００８０】〔例１４〕インビボにおけるＤＮＡ結合ア
ッセイ エストロゲン受容体が回文構造的シーケンス（ＥＲＥ）
13ｂｐを通して活性遺伝子トランスクリプションと結合
していることは知られている。ＥＲＥがＣＹＣ-１-β-
ｇａｌ機能ベクタ中のプロモータの上流に位置しそして
レセプタによる方法でエストロゲンに応答する受容体中
でサッカロミセス セルビシアエに転換する。エストロ
ゲン受容体とＥＲＥシーケンスのインビボにおける結合
の監視は干渉アッセイで行う。ＧＡＬ４（17ｍｅｒ）確
認されたシーケンスを含むオリゴヌクレオチド及びＥＲ
Ｅは１つの塩基により重複する２つの位に構成されてい
る。この場合ＥＲ又はＧＡＬ４のみは両分子の同じ位置
を占めないであろう。このシーケンスはイースト イソ
-１-サイトクロムＣ リポータ（ＰＣ3）のプロモータ
の中心の１，２又は３コピーである。これらの核外遺伝
子はイースト中に導入されそしてグルコース及びガラク
トースの存在下トランスクリプション活性を測定する。
その結果は〔表１〕に示すそしてリポータ ゲムのトラ
ンスクリプションがガラクトースで励起したことを現わ
す、そして活性はＧＡＬ部位の数として劇的に増加し
た。グルコース中で生長した時、トランスクリプション
活性は完全に抑制された。 〔表１〕 ＢＪ3505中ガラクトースによるＧＡＬ４／ＥＲＥ結合部位キメラの活性 構 成 トランスクリプション活性 結合位の名称＃ グルコース ガラクトース ＹＲｐＥＧ１ １ ＜50 860 ＹＲｐＥＧ２ ２ ＜50 2,350 ＹＲｐＥＧ３ ３ ＜50 16,500 これらの構造のエストロゲン応答はリポータ 核外遺伝
子とコ-形質転換イーストにより測定されるそしてエク
スプレッションベクタ イースト メタロチオネイン
プロモータ（ＣＵＰ１）のコントロール下の正真のヒト
エストロゲン受容体を含んでいる、これらの核外遺伝
子を含んでいる細胞は10▲上付−７▼Ｍエストラジオー
ルの存在又は不存在でグルコース中で生長する。その結
果は〔表２〕で示す。 〔表２〕 Ｂ53505／ＹＥｐＥ10中エストロゲンによるＧＡＬ４／ＥＲＥ結合部位キメラ の活性 構 成 トランスクリプション活性 結合位の名称＃ ＋エストラジオール −エストラジオール ＹＲｐＥＧ１ １ 360 ＜50 ＹＲｐＥＧ２ ２ 980 ＜50 ＹＲｐＥＧ３ ３ 2,320 ＜50 この場合においてトランスクリプションの活性によるホ
ルモンは核外遺伝子のＧＡＬ４／ＥＲＥ部位の数と関連
する。リポータＹＲｐＥＧ３はＧＡＬ４とエストロゲン
受容体から得られたトランスクリプション活性を確認す
るため更に検討するために選ばれる。
【００８１】〔例１５〕 エストロゲン受容体とＤＮＡ
の相互作用はホルモンによる 例14の干渉アッセイはエストロゲン受容体とホルモンの
不存在の類似ＥＲＥの結合の監視に使用される。この実
験での高コピーエストロゲン受容体エクスプレッション
核外遺伝子及びＹＲｐＥＧ３（ＧＡＬ４／ＥＲＥキメラ
応答要素を３コピー含んでいる）を含む細胞は10▲上付
−７▼Ｍエストラジオールの存在又は不存在下でガラク
トース中で生長しそして受容体レベルはメディア（０〜
100ｕＭ）に対し硫酸銅の濃度を上昇して加えることに
より励起する。結果は図１Ａに示す。低受容体濃度にお
いてホルモンの不存在はＧＡＬ４受容体が高トランスク
リプション活性（24,000 miller units，０％制止）を
現わした。このレベルは銅添加による細胞受容体の増加
された濃度の元世代を50％降下する。ホルモン結合分析
はこれらの条件下で受容体濃度は銅の不存在で蛋白質0.
22ｐMol／mg 100ｕＭＣｕＳＯ4の存在で1.28ｐMol／mg
と５倍に増加した。低受容体濃度（＜１μＭ ＣｕＳＯ
4）でＧＡＬ４活性は細胞をエストラジオールの存在中
で生長した時、約80％減少した。このように、受容体の
低濃度において分子はホルモンの不存在で制止コンプレ
ックスに維持される。類似の結果は実験がナホキシジ
ン、既知の抗-エストロゲンの存在中で行った時得られ
た。この抗-エストロゲンの添加はＧＡＬ４活性の同様
な制止をもたらし、応答成分に対するエストロゲン受容
体の結合を示すことを暗示する。このように、この抗-
エストロゲンの作用の機構は受容体のＤＮＡ結合形に形
質転換の次の工程を含まなければならない。これらのリ
ガンドで観察された各々のＧＡＬ４活性のエクスプレッ
ションの最終レベルはエストロゲン受容体による活性と
ＧＡＬ４活性の干渉とのバランスで現われる。
【００８２】〔例１６〕 受容体トランスクリプション
活性の測定 受容体のトランスクリプション活性は例15の細胞をグル
コース（図１Ｂ）中で生長する以外は同様の条件でアッ
セイした。グルコースの存在において、ＧＡＬ４のトラ
ンスクリプション活性は完全に抑制される何故ならＧＡ
Ｌ４蛋白質はその応答要素の結合能力をなくすからであ
る。これらの条件下でＧＡＬ４-ＥＲＥのエストロゲン
受容体活性は干渉なくして監視することができる。ＥＲ
Ｅ要素の最高活性はＣｕＳＯ4の最も低濃度で見られ
る。受容体の全ての濃度においてトランスクリプション
の活性は完全にホルモンによっている。これらの条件
下、ナホキシジンの部分アゴニスト活性はエストロゲン
の約20％であった。更に、銅、エストロゲン又はナホキ
シジンはＹＲｐＥＧ３自体の活性に直接影響がなかっ
た。
【００８３】〔例１７〕 ＧＡＬ４-ＥＲＥの感度のア
ッセイ ＧＡＬ４はポテント トランスアクチベータである、こ
れは低濃度のイースト中にある。従って、アッセイは分
子の大部分の行動は反射される、そして活性条件で受容
体活性の少量はこのアッセイでは歪ませることができな
い、この見地からエクスプレッション核外遺伝子Ｙｌｐ
Ｅ10は構成される。この核外遺伝子は１コピーとしての
ゲノムに構成しそして受容体の僅か10％生成物が高コピ
ーエクスプレッション核外遺伝子を用いて見られる。ホ
ルモン結合分析はエストロゲン受容体の濃度は銅の不存
在で25ｆmol／mg蛋白質、100μＭ ＣｕＳＯ4の存在で1
15ｆmoles／mg蛋白質に増加することを示す。リポータ
ＹＲｐＥＧ３は総合受容体エクスプレッション核外遺伝
子を含むイーストストレインに導入するそしてトランス
クリプション活性はグルコース及びガラクトース中で細
胞の生長を試験した。結果を第２図に示す。ガラクトー
スにおいて（図２Ａ）、ＧＡＬ４メディアトランスクリ
プションの30％減少は細胞を銅の濃度を増加しホルモン
の不存在で生長する時見られる。最も低い受容体の濃度
において、エストラジオール又はナホキシジンの何れか
の存在で、ＧＡＬ４活性は約90％減少した。エストロゲ
ンメディア制止の場合において、最も低い受容体の濃度
はその上に有効である。受容体濃度を上昇し更に制止効
力を有しない理由はエストロゲン受容体（図２Ｂ）によ
るメディアトランスクリプションの相補的作用によるも
のであろう。しかしながら、ナホキシジンの存在は受容
体の濃度の増加はＧＡＬ４トランスクリプション活性を
97％に減少しそしてナホキシジンのアゴニスト活性を反
映した。細胞がグリコース中で生長するには受容体の限
界を示す。100μＭ ＣｕＳＯ4においてさえ、受容体の
エストロゲンメディア活性は最高に近いことを観察し
た。このような条件においてナホキシジンによる受容体
トランスクリプションの活性が見られた。このように、
エストラジオールメディア活性は受容体の低レベルのみ
を必要としそしてＧＡＬ４-ＥＲＥアッセイの感度を示
した。この感度はガラクトース中ＹＲｐＥＧ３の最高活
性により全ての３つの応答が占められなければならない
ことを要求される結果と同様である（図２Ｂ）しかしな
がら、ＧＡＬ４結合に協調する性質は１つの位置の占め
る割合は理論的に85％活性が低下する（表１及び図２
Ａ）。
【００８４】〔例１８〕 エストロンの生物学的濃度の
ホルモンで励起したエストロゲン受容体結合 ボナ ファイド ホルモン応答上のイースト受容体のＧ
ＡＬ４制止アッセイを現わすため、実験はエクスプレッ
ション核外遺伝子 ＹｌｐＥ10を含む細胞を用いたエス
トロゲンの異なる濃度で繰り返し行った。結果は図３に
示す。これは、トランスクリプションの半-最大制止に
必要のホルモン量は活性に対する要求量と類似してい
る。ホルモンと受容体が観察された制止に対し応答性を
有する第２の事象に対抗するＧＡＬ４トランスクリプシ
ョン活性における干渉によることの検討と確認である。
【００８５】〔例１９〕 機能的エストロゲン応答要素
のＧＡＬ４活性の制止の要求 次の例はトランスクリプションの干渉がＤＮＡを有する
ホルモン受容体コンプレックスの直接の干渉によるもの
である、そしてＧＡＬ４ファンクションに要求されるト
ランスクリプションファクターのスケルチではないこと
を示す。この例においてＥＲＥオリゴヌクレオチドはハ
ーフ-サイトに唯一個のエストロゲン応答要素を含み、
第２のハーフ-サイトは同一組成のランダムシーケンス
により置換されているものを生成する。このオリゴヌク
レオチドは低親和性のエストロゲン受容体を結合してい
る。このオリゴヌクレオチドの４コピーは核外遺伝子Ｐ
Ｃ３に挿入されそして再構成（ＹＲｐＨＳＥＧ４）され
たものは総合されたエストロゲン受容体エクスプレッシ
ョン核外遺伝子を含むイースト細胞に形質変換する。こ
の結果を第４図に示す。このリポータはグルコースの存
在で高いトランスクリプション活性を示す。ホルモンの
不存在中の受容体濃度の増加はリポータの活性を18％減
少させる。このリポータを持って、制止ＧＡＬ４活性に
対するＥＲ：ナホキシジン コンプレックスの能力はＥ
Ｒ：エストラジオール コンプレックスより小である。
この結果は一貫して観察された、そしてこれら２つの受
容体-ＤＮＡコンプレックス中の質的に相違する反映で
ある。
【００８６】この結果はこの突然変異ＥＲＥに対するエ
ストロゲン受容体の親和性の減少を反映している。この
リポータをグルコース中で分析した場合トランスクリプ
ションの２〜３倍活性が観察される。これはインビボで
エストロゲン受容体が受容体のハーフ-サイトで相互反
応の可能性があることを示す。しかしながら、明らかに
リポータの活性はホルモン活性化受容体が全部のエスト
ロゲン応答要素に使用した場合に同様に拡張できるとは
云えない（図３Ａ）。本発明のアッセイにおいて観察さ
れたＧＡＬ４の制止によるホルモンがＥＲＥとエストロ
ゲン受容体の結合によるリガンドのためである、そして
スケルチは重要な役割は演じない。
【００８７】当業者は本発明が本目的を良好に実施でき
そして目的物を得られる、そして本明細書に記載された
分子、核外遺伝子、受容体、核外遺伝子、キメラ、生産
物、方法、アッセイ、工程及び技術は好適な具体例を代
表的のものである。本記載の変形及び他の使用は本発明
の精神又は特許請求の範囲の範囲による定義中の当該技
術の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】イーストにおいて生物的作用ステロイド受容体
を生成するのに用いられる計画の概略図である。示され
ているのは、ＣＰＰ１助触媒。ＣＹＣ１端末、ＴＲＰ１
選択マーカ、２μｂシーケンス及びユビキチン分子の場
所である。すべてのｃＤＮＡがエクスプレッション ベ
クタのＡＦＬ11-ＫＰＮ１部位に加入されている。
【図２】イースト内のフユーズされないステロイド受容
体を生成するための計画を示す。示されているのは、Ｃ
ＵＰ１助触媒、ＣＹＣ１端末、ＴＲＰ１選択マーカ及び
μｂシーケンスの場所である。ｃＤＮＡはエクスプレッ
ション ベクタのＮｃｏｌ-Ｋｐｎｌ部位に加入され
る。
【図３】ウエスタン イムノブロッティングによってみ
られるようなイースト内の組換え型ビタミンＤ受容体の
生成物を示す。
【図４】組換え型の機能的性質の分析を示す。組換え型
受容体を含むサイトソルは、彩色(Ａ)及びスキャットチ
ャード分析(Ｂ)によって分析された。実線サークル提示
全体結合、開放サークル指定結合及び開放方形非指定結
合。受容体のＤＮＡ結合性は子牛胸腺ＤＮＡセルローズ
クロマトグラフィ(Ｃ)によって分析された。開放サー
クルはトリチューム化したホルモン／受容体コンプレッ
クスの溶出プロフィルを示す。実線はバウンド受容体を
溶出するのに用いられるＫＣ１階調度を示す。
【図５】受容体のトランスクリプショナル作用をアッセ
イするのに用いられる２つの型のリポータ ベクタの線
図である。ＹＲＰ(Ａ)核外遺伝子は E. coli β-ガラク
ドシダーゼのための構造的遺伝子にヒューズされたイー
スト アイソ-１-シトロクローム Ｃ遺伝子の基部助触
媒要素を含む。ＹＲＰ(Ｂ)核外遺伝子は同様の助触媒要
素をもつが、 E. coli ガラクトキナーゼのための構造
的遺伝子にフユーズされる。各々の場合、ステロイド受
容体応答要素の加入部位がまた含まれる。
【図６】β-ガラクドシダーゼ トランスクリプション
アッセイを用いる隔離したステロイド受容体アゴニス
ト又はアンタゴニストに用いられる計画の線図である。
【図７】ガラクトキナーゼ トランスクリプション ア
ッセイを用いる隔離したステロイド受容体アゴニスト又
はアンタゴニストに用いられる計画の線図である。
【図８】プロゲステロン受容体をキメラに代えるのに用
いられる計画の線図である。
【図９】入類エストロゲン受容体を超作用受容体に代え
るのに用いられる線図である。
【図１０】ＹＲｐＥＧ３受容体のエストロゲン受容体に
あるＧＡＬ４のトランスクリプショナル作用を示す。
【図１１】ＹＲｐＥＧ３受容体にエストロゲン受容体の
低集中にあるＧＡＬ４のトランスクリプショナル作用を
示す。
【図１２】トランスクリプションの伝達された誘導ＧＡ
Ｌ４の阻害を示す。
【図１３】ＹＲｐＨＳＥＲＥ４受容体のエストロゲン受
容体の低集中におけるＧＡＬ４のトランスクリプショナ
ル作用を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4Ｂ 1/48 Ａ 6807−4Ｂ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ (72)発明者 バート ダブリュ．オゥマリィ アメリカ合衆国，77079 テキサス，ヒュ ーストン，ランブルウッド 629番地 (72)発明者 オーラ エム．コネリィ アメリカ合衆国，77030 テキサス，ヒュ ーストン，カービィ ドライブ ナンバー 17 7350番地

Claims (56)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物的作用受容体を生成するエクスプレ
    ッション ベクタを作る方法であって、ユビキチンのカ
    ルボキシル６アミノ酸及び内部制限部位を有するリンカ
    を合成する工程と、核外遺伝子を形成するために前記合
    成リンカをクローンする工程と、前記内部制限部位をも
    つ制限エンドヌクレアーゼ相容性をもつ前記核外遺伝子
    消化する工程と、前記核外遺伝子の相容性制限部位への
    受容体をｃＤＮＡコードを加入する工程と、前記受容体
    ｃＤＮＡ核外遺伝子にイーストを変える工程とを有す
    る。
  2. 【請求項２】 イーストはサッカロミセス属及びアスペ
    ルギルス属を含む群から選ばれる請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 請求項１の方法によって作られた変性イ
    ーストであって、受容体cDNAは発情物質受容体、男性ホ
    ルモン受容体、ビタミンＤ受容体、プロゲステロン受容
    体のためのｃＤＮＡコード化の群から選ばれる。
  4. 【請求項４】 ヒトビタミンＤ受容体のエクスプレッシ
    ョンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＶ１表
    現。
  5. 【請求項５】 ヒト発情物質受容体のエクスプレッショ
    ンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＥ２。
  6. 【請求項６】 ヒト男性ホルモン受容体のエクスプレッ
    ションのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＡＲ
    １。
  7. 【請求項７】 鶏プロゲステロン受容体のエクスプレッ
    ションのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＰ20
    （Ｂ型）。
  8. 【請求項８】 鶏プロゲステロン受容体のエクスプレッ
    ションのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＰ80
    （Ａ型）。
  9. 【請求項９】 ヒトプロゲステロンのエクスプレッショ
    ンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＨＰＲ
    １。
  10. 【請求項１０】 ヒトプロゲステロン（Ｂ型）のエクス
    プレッションのためのエクスプレッション ベクタＹＥ
    ｐＨＰＲ２。
  11. 【請求項１１】 甲状線受容体（Ｂ型）のエクスプレッ
    ションのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＨＴ
    Ｒ１。
  12. 【請求項１２】 甲状線受容体（α型）のエクスプレッ
    ションのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＨＴ
    Ｒ１。
  13. 【請求項１３】 レチノイク（retinoic）酸受容体のエ
    クスプレッションのためのエクスプレッション ベクタ
    ＹＥｐＲＡＲ。
  14. 【請求項１４】 ＣＯＵＰタンパク質のエクスプレッシ
    ョンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＣＯＵ
    Ｐ。
  15. 【請求項１５】 鶏ビタミンＤ受容体のエクスプレッシ
    ョンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＶ９。
  16. 【請求項１６】 鼠ビタミンＤ受容体のエクスプレッシ
    ョンのためのエクスプレッション ベクタＹＥｐＶ10。
  17. 【請求項１７】 リポータベクタであって、イースト
    イソ-１-シトクロームＣの基部助触媒要素と、前記助触
    媒にヒユーズされた構造的遺伝子で、この遺伝子はβ-
    ガラクトシダーゼ、ガラクトキナーゼ及びＵＲＡ３を含
    む群から選ばれた遺伝子とを有する。
  18. 【請求項１８】 受容体応答要素のための加入部をさら
    に有する請求項17のリポータベクタ。
  19. 【請求項１９】 受容体応答要素をさらに有する請求項
    18のリポータ ベクタ。
  20. 【請求項２０】 請求項19のリポータ ベクタで、受容
    体応答要素はプロゲステロン受容体応答シーケンス、男
    性ホルモン受容体応答シーケンス、グルココルトリコイ
    ド受容体応答シーケンス、ビタミンＤ受容体応答シーケ
    ンス、発情物質受容体応答シーケンス、甲状線受容体応
    答シーケンス及びレチノイク酸受容体応答シーケンスを
    含む群から選ばれるリポータ ベクタ。
  21. 【請求項２１】 リポータ ベクタＹＲＰ(Ａ)。
  22. 【請求項２２】 リポータ ベクタＹＲＰ(Ｂ)。
  23. 【請求項２３】 受容体アゴニスト又はアンタゴニスト
    トランスクリプション アッセイで、適当なメディア
    内において請求項19のリポータ ベクタを生長させる工
    程と、試験用アゴニスト又はアンタゴニストを付加し、
    成長結果を試験する工程とを含むアッセイ。
  24. 【請求項２４】 受容体ベクタが構造的遺伝子としての
    β-ガラクトシダーゼを含み、メディアは５-ブロモ-４-
    コルロ-３-インドリル β-Ｄ-ガラクトピラノシド、β
    -ガラクトシダーゼ基板、ＣｕＳＯ4及び寒天を含む請求
    項23のアッセイ。
  25. 【請求項２５】 受容体ベクタは構造的遺伝子としての
    ガラクトキナーゼを含み、メディアは３％グリセリン、
    ２％エタノール、２％寒天、ＣｕＳＯ4及び0.1％２-デ
    オキシ-Ｄ-ガラクトースを含む請求項23のアッセイ。
  26. 【請求項２６】 キメラ受容体を作る方法であって、公
    知の受容体からＤＮＡ結合ドメインを制限されたエンド
    ヌクレアーゼで削除する工程と、未知の受容体中にＤＮ
    Ａ結合ドメインにおいてコンパチブル制限部位を導入す
    る工程と、前記コンパチブル制限部位において、未知の
    受容体からＤＮＡ結合ドメインを削除する工程と、公知
    のＤＮＡ結合ドメインにコンパチブル制限部位置におい
    て前記未知の受容体を加入する工程とを有する方法。
  27. 【請求項２７】 未知の受容体を固定するためのアッセ
    イであって、請求項26の方法によって作られたキメラ受
    容体を生長させ、キメラ受容体の未知の部分をスクリー
    ンするため適当なアゴニストを付加し、未知のＤＮＡ受
    容体結合ドメインの応答を計測するアッセイ。
  28. 【請求項２８】 生物的供試体における生物学的コンパ
    ウンドを計測するためのアッセイであって、請求項１の
    エクスプレッション ベクタによって合成されている生
    物学的作用受容体に適当なラベルド生物学的コンパウン
    ドを予めラベルし、予めラベルドされた受容体の前記供
    試体のサンプルを付加し、前記供試体内の生物的コンパ
    ウンドの量を決定するため前記供試体中の生物学的コン
    パウンドによって、置換されたラベルド コンパウンド
    の量を計測するアッセイ。
  29. 【請求項２９】 ラベルがラジオアイソトープ、フルオ
    レサ、化学ルミネッセンス、酵素及びアンチボデイの群
    から選ばれる請求項28のアッセイ。
  30. 【請求項３０】 ラベルはアイソトープである請求項29
    のアッセイ。
  31. 【請求項３１】 生物的作用受容体がエストロゲン受容
    体、男性ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、プロゲス
    テロン受容体、コーチゾン受容体、プレドニゾン受容
    体、プレドニゾロン受容体、アルドステロン受容体、レ
    チノイク酸受容体及びスロイド受容体の群から選ばれる
    請求項28のアッセイ。
  32. 【請求項３２】 生物的供試体中の生物学的コンパウン
    ドを計測するためのキットであって、請求項１のエクス
    プレッション ベクタによって合成された生物学的作用
    受容体を有するキット。
  33. 【請求項３３】 生物的作用受容体に結合するためにラ
    ジオ-ラベルドしたコンパウンドをさらに含む請求項32
    のキット。
  34. 【請求項３４】 標準曲線を創生するための制御サンプ
    ルをさらに含む請求項32のキット。
  35. 【請求項３５】 生物的供試体における生物コンパウン
    ドを計測するためのアッセイであって、生物的作用受容
    体及び受容体ベクタを含むイーストを生育し、その受容
    体ベクタはβ-ガラクトシターゼ、ガラクトシターゼ及
    びＵＲＡ３の群から選ばれた構造遺伝子にヒューズされ
    たイースト イソ-１-シトクロームの基部助触媒要素を
    含み、イースト セルに前記供試体のサンプルを付加
    し、構造遺伝子の蛋白質生成物の活性を計測することに
    よって、前記供試体内の生物的コンパウンドの量を決定
    するアッセイ。
  36. 【請求項３６】 受容体がキメリック受容体である請求
    項35のアッセイ。
  37. 【請求項３７】 キメリック受容体はエストロゲン応答
    要素及び非エストロゲン リガンド結合ドメインを含む
    請求項36のアッセイ。
  38. 【請求項３８】 リガンド結合ドメインはエストロゲン
    受容体、男性ホルモン受容体、ビタミンＤ受容体、プロ
    ゲステロン受容体、コーチゾン受容体、プレドニゾン受
    容体、プレドニゾロン受容体、アルドステロン受容体、
    レチノイク酸受容体及びスロイド受容体の群から選ばれ
    る請求項37のアッセイ。
  39. 【請求項３９】 受容体は超活性受容体である請求項35
    のアッセイ。
  40. 【請求項４０】 超活性受容体は読取フレーム内に含ま
    れるヘルペス シンプレックス ＶＰ16 蛋白質の活性
    化ドメインをもつエストロゲン受容体である請求項39の
    アッセイ。
  41. 【請求項４１】 受容体はエストロゲン受容体、男性ホ
    ルモン受容体、ビタミンＤ受容体、プロゲステロン受容
    体、コーチゾン受容体、プレドニゾン受容体、プレドニ
    ゾロン受容体、アルドステロン受容体、レチノイク酸受
    容体及びスロイド受容体の群から選ばれる請求項35のア
    ッセイ。
  42. 【請求項４２】 受容体はエストロゲン受容体であり、
    構造遺伝子はβ-ガラクトシターゼである請求項41のア
    ッセイ。
  43. 【請求項４３】 リポータ ＹＲｐＨＳＥＲＥＧ４。
  44. 【請求項４４】 リポータ ＹＲｐＥＧ１。
  45. 【請求項４５】 リポータ ＹＲｐＥＧ２。
  46. 【請求項４６】 リポータ ＹＲｐＥＧ３。
  47. 【請求項４７】 検出ＤＮＡ結合のためのリポータで、
    ＤＮＡに結合するトランスクリプション因子のためのシ
    ーケンス及び生物的作用受容体からの応答要素のための
    シーケンスを含み、トランスクリプション因子のための
    シーケンス及び応答要素のためのシーケンスは、単一蛋
    白質が与えられた時間でヒューズドシーケンスを占める
    ようにヒユーズされるリポータ。
  48. 【請求項４８】 トランスクリプション因子及び応答要
    素シーケンスは少くとも１つのベース重複にヒユーズさ
    れる請求項47のリポータ。
  49. 【請求項４９】 トランスクリプション因子は、ＧＡＬ
    ４，ＧＣＮ４，ｙＡＰ１及びＡＣＥ１から選ばれ、応答
    要素はエストロゲン受容体、男性ホルモン受容体、ビタ
    ミンＤ受容体、プロゲステロン受容体、コーチゾン受容
    体、プレドニゾン受容体、プレドニゾロン受容体、アル
    ドステロン受容体、レチノイク酸受容体及びスロイド受
    容体の群から選ばれる請求項47のリポータ。
  50. 【請求項５０】 トランスクリプション因子は、ＣｔＡ
    Ｌ４であり、応答要素はエストロゲン受容体承認シーケ
    ンスである請求項47のリポータ。
  51. 【請求項５１】 複数のヒューズド シーケンスがある
    請求項47のリポータ。
  52. 【請求項５２】 請求項47の作用リポータに結合する生
    物的供試体内の生物的コンパウンドを計測するためのア
    ッセイで、リポータ及び生物的作用受容体をセル内に加
    入し、適当なメディア内でセルを生長し、生長したセル
    に生物的供試体を付加し、トランスクリプショナル活性
    の量を計測し、そのトランスクリプショナル活性は前記
    生物的供試体内の生物的コンパウンドの量に比例するア
    ッセイ。
  53. 【請求項５３】 セルはサッカロミセス属及びアスペル
    ギルスの群から選ばれる請求項52のアッセイ。
  54. 【請求項５４】 アゴニスト又はアンタゴニストをスク
    リーンするためのアッセイで、請求項47のリポータ及び
    生物的作用受容体をセル内に加入し、適当なメディア内
    でセルを生長し、試用アゴニスト又はアンタゴニストを
    付加し、トランスクリプショナル活性結果を試験するア
    ッセイ。
  55. 【請求項５５】 未知トランスクリプション因子を固定
    する方法であって、セル内に請求項47のリポータ及び公
    知の生物的作用受容体を加入し、該リポータは公知の応
    答要素にヒューズされた未知のトランスクリプション因
    子を含み、適当なメディア内でセルを生長し、生物的作
    用受容体を結合するコンパウンドを付加し、トランスク
    リプション因子を固定するために試用蛋白質を付加し、
    トランスクリプショナル活性を試験する固定方法。
  56. 【請求項５６】 未知トランスクリプション因子を固定
    する方法であって、セル内に請求項47のリポータ及び未
    知の受容体を加入し、該リポータは公知のトランスクリ
    プション因子及び未知のリポータの応答要素を含み、適
    当なメディア内でセルを生長し、生物的作用受容体を固
    定するために試用コンパウンドを付加し、トランスクリ
    プション活性を試験する固定方法。
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