JPH0622791A

JPH0622791A - サルモネラ菌の簡易検出法およびその培地組成物

Info

Publication number: JPH0622791A
Application number: JP20422992A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Morita; 隆行盛田
Original assignee: Nisshin Oil Mills Ltd
Current assignee: Nisshin Oillio Group Ltd
Priority date: 1992-07-09
Filing date: 1992-07-09
Publication date: 1994-02-01

Abstract

(57)【要約】【構成】サルモネラ菌で汚染された各種検体成分を、
必要に応じてＬ−シスチンを強化した特定の寒天培地で
培養し、この培地上に、中心部が黒色で周縁部が半透明
のコロニーを形成し、かつ黒色の痕跡を認めることで、
検体中のサルモネラ菌を検出する。【効果】長い時間と労力、熟練を必要とせず、簡単な
操作で短時間に多数の検体を安価に処理できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、食品、食糧、飼料、そ
れらの原料等に混入したサルモネラ菌の簡易な検出法、
およびこれに用いる培地組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】サルモネラ菌は病原性の腸内細菌の一属
であり、一般には食中毒や腸チフスを引き起こす病原菌
として知られている。食品、食糧、飼料、あるいはそれ
らの原料を介してヒトや動物に感染し、他の感染型食中
毒菌と同様に小腸上皮細胞に侵入して腸管壁を障害し、
下痢を起こす。このため食品および飼料製造における衛
生管理、保健所や各種研究機関における衛生検査等にお
いて、サルモネラ菌の検出・判定方法がすでに開発され
ている。

【０００３】例えば、食品中のサルモネラ菌の検出方法
としては、公定書である食品衛生検査指針（（社）日本
食品衛生協会編）に記載されている。この方法は、まず
検体を、Enterobacteriaceae Enrichment Mannitol Bro
th（以下、ＥＥＭ培地という）上で、３７℃で２４時
間、前増菌培養し、この培養液の一部をさらにハーナテ
トラチオン酸塩基礎培地で３７℃、２４時間、増菌培養
した後、この一部をDesoxycholate Hydrogen Sulfide L
actose Agar（以下、ＤＨＬ寒天培地という）で３７
℃、２０〜２４時間培養すると、該寒天平板上に、産生
された硫化水素（Ｈ₂Ｓ）と培地中のクエン酸鉄アンモ
ニウムとの反応により生じた中心部が黒色で周縁部が半
透明の定型的コロニーが形成されるので、これをサルモ
ネラ菌の推定試験とすることができる（J.F.McFADDIN,
"Biochemical Test for Identification of Medical B
acterial",1976, pp89-99参照）。次いで、上記ＤＨＬ
寒天平板上に出現したＨ₂Ｓ産生コロニーを釣菌し、Tri
ple Sugar Iron Agar（以下、ＴＳＩ培地という），Sul
fide Indol Motility Medium（以下、ＳＩＭ培地とい
う）およびLysine Indole Motility Medium（以下、Ｌ
ＩＭ培地という）を用いる生化学的分類手法により、サ
ルモネラパターンすなわちＴＳＩ培地で斜面赤色から高
層黒色、ガス産生を示し、ＳＩＭ培地で黒色、運動性
（＋）、インドール産生（−）、インドールピルビン酸
産生（−）を示し、ＬＩＭ培地で全体紫色、運動性
（＋）を示すもの（細菌・真菌・原虫用培地「ニッス
イ」マニュアル第４版、第３１〜３４頁、１９８７年，
日本製薬（株）発行など）を区分して確認試験とし、さ
らに上記確認試験でサルモネラ菌の疑いのあるものにつ
いては血清型別試験に供して、抗原・抗体反応による菌
体抗原（Ｏ抗原）および鞭毛抗原（Ｈ抗原第１相および
第２相）の有無を調べ、完全確認試験を行うものであ
る。これらの一連の試験結果をもってサルモネラ菌を特
定することができる。

【０００４】また、サルモネラ菌を同定するための種々
の簡易法も開発されている。例えばバイオコントロール
社（ＵＳＡ）が開発した、いわゆる１−２テスト法は、
食品中のサルモネラ菌を２種類のチャンバーからなるＬ
字型プラスチック容器内で培養し、サルモネラ菌の鞭毛
に対する抗原・抗体反応を白いイムノバンドとして検出
する簡易キットである。種々の食品サンプルを常法によ
り前増菌培養し、この培養液を液体培地が入った接種チ
ャンバーで増菌培養すると、この培養液の一部が、抗体
を含むゲル状培地が入った運動チャンバーに移動し、該
運動チャンバー内でサルモネラ菌が抗原・抗体反応して
白色のイムノバンドを形成するため、この原理を利用し
てサルモネラ菌の存在を確認するものである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述のごとく、サルモ
ネラ菌の検出法としては、従来、食品衛生検査指針の、
いわゆる公定法およびその簡易法などが利用されてき
た。しかしながら、前者では検体の前増菌培養、増菌培
養、分離培養による推定試験のほかに、生化学的分類法
および免疫学的判定法による確認試験を必要とし、検体
中のサルモネラ菌を同定するまでには極めて長い時間と
労力、熟練を要するものであった。殊に分離培養による
推定試験では、上述のごとく培地成分とサルモネラ菌と
の作用で中心部が黒色で周縁部が半透明の定型的コロニ
ーを生じるが、かかるコロニーの特徴を有するサルモネ
ラ菌以外の細菌類も多く、この段階でサルモネラ菌を同
定することは困難であった。また後者は、上述の１−２
テスト法のごとく、操作が簡単で、費やす時間も短縮で
きる簡易法もあるが、装置および試薬キットの費用が高
く、多数の検体を処理する場合には非常にコストが高く
なり、汎用的な手法ではなかった。

【０００６】したがって本発明は、食品をはじめとする
種々の検体中のサルモネラ菌を、特定の培地組成物を用
いて、特殊な熟練・技術を必要とせず、短時間に簡単か
つ容易に検出できる方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、検体成
分を含硫アミノ酸と鉄イオンを含む寒天培地で培養し
て、該培地上に中心部が黒色で周縁部が半透明のコロニ
ーを形成し、かつ前記集落裏側における前記培地表面に
おいて黒色の痕跡を検出することを特徴とするサルモネ
ラ菌の簡易検出法が提供される。

【０００８】すなわち本発明は、検体成分を必要に応じ
てＬ−シスチンを強化したＤＨＬ寒天培地で培養し、該
培地上に中心部が黒色で周縁部が半透明のコロニーを形
成し、かつ主として硫化水素に由来する黒色の痕跡を認
めることを特徴とする。

【０００９】さらに本発明は、上述のサルモネラ菌の簡
易検出法に最適な、含硫アミノ酸と鉄イオンを含む寒天
培地組成物を提供する。

【００１０】本発明では、食品、食糧、飼料およびその
原材料をはじめ、サルモネラ菌で汚染されている懸念の
ある物質・製品を検体として選ぶことができる。かかる
検体はそのまま本発明に適用できるが、その種類や形
状、あるいは本発明を実施する際の状態、たとえば汚染
の状況などによって、混入あるいは付着菌数および種類
が異なるため、適当な前処理を行なうことが望ましい。

【００１１】検体の前処理としては、周知の方法が使用
できる。例えば所要量の検体を培地に添加し、３５〜３
７℃で２４時間培養し、前増菌培養物を得、さらに該培
養液の一部を用いて増菌培養用の培地でほぼ同条件にて
培養し、増菌培養物を得る。ここで前増菌培養用の培地
としては公知のものを適宜選んで使用できるが、検体が
加工食品の場合には乳糖ブイヨン培地、生肉類ではＴＢ
Ｇ培地、粉製品のときには乳糖ブイヨンおよびＴＢＧ培
地、油粕類の場合にはＥＥＭ培地などが好ましい。また
増菌培養用の培地も公知のもの、すなわちサルモネラ菌
の増菌用培地として市販されている、例えばハーナテト
ラチオン酸塩基礎培地、ＳＢＧ培地、セレナイト培地な
どが使用できる。かくして得られる増菌培養物を、本発
明のサルモネラ菌検出用の試料とする。

【００１２】本発明は、検体又は上述のごとき検体の培
養物を特定成分からなる寒天培地で培養して得られるコ
ロニーの特性によって、サルモネラ菌を精度よく同定す
ることを特徴とする。

【００１３】すなわち本発明の特定成分からなる寒天培
地とは、菌体が増殖するために必要な炭素源および窒素
源のほかに、チオ硫酸塩および鉄イオン含有化合物を基
本成分とし、必要に応じてＬ−シスチンを強化した寒天
培地を意味し、炭素源としては乳糖、白糖、ブドウ糖、
マンニトール、ソルビトールなど、窒素源としては肉汁
エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、カゼイン
などの公知のものが使用でき、チオ硫酸塩としてはナト
リウムおよび／又はカリウム塩、鉄イオン含有化合物と
してはクエン酸第二鉄、クエン酸鉄アンモニウムなどが
好適例としてあげられる。本発明では、かかる成分に、
さらに必要に応じてＬ−シスチンを、好ましくは培地の
０．０１〜１重量％（培地１リットルあたり０．１〜１
０グラム）、さらに好ましくは０．０５〜０．１重量％
（０．５〜１グラム）添加した寒天培地を用いる。０．
０１重量％未満の添加量では、サルモネラ菌を識別する
ための培養時間の短縮化に効果がなく、また後述する硫
化水素に由来する痕跡が明瞭でなくなる。一方、１重量
％を越えるＬ−シスチンを添加すると、サルモネラ菌以
外の菌体でも該痕跡を生じることがあるため、サルモネ
ラ菌を特定することが困難になることがある。かかる成
分を含む培地の例としては、市販のＤＨＬ寒天培地に
０．１重量％のＬ−シスチンを添加したものなどがあ
る。

【００１４】上記の特定成分からなる寒天培地に、サル
モネラ菌を含有する試料を常法により画線し、３０〜４
０℃、好ましくは３５〜３７℃で５〜３０時間、好まし
くは１０〜２４時間培養すると、該寒天培地の表面に、
中心部が黒色で周縁部が半透明の定型的コロニーを生じ
る。ついでこのコロニーを、先の丸いループ又はガラス
棒等で個々にかき取ると、その部分の培地表面に黒色の
硫化水素に由来する痕跡を残すものが認められる。本発
明では、上述のコロニーの特徴および寒天培地上の痕跡
を有するものをサルモネラ菌と同定する。サルモネラ菌
以外のものは、たとえＨ₂Ｓガスを産生し、中心部が黒
色で周縁部が半透明の定型的コロニーを形成する細菌で
あっても、本発明の特定の寒天培地表面に黒色の痕跡を
残さないので、特別の熟練を要せずしてサルモネラ菌を
識別することができる。

【００１５】

【実施例】

実施例１理化学研究所微生物系統保存施設から入手したサルモネ
ラ菌（各種血清型）およびＨ₂Ｓ産生能の可能性のある
他の標準菌株の各々をハートインフュージョン培地（Ｄ
ＩＦＣＯ社製）で増菌培養（３７℃、２４時間）し、さ
らにその一部をＥＥＭ培地（日水製薬（株）製）で前増
菌培養（３７℃、２４時間）した後、ハーナテトラチオ
ン酸塩基礎培地（栄研化学（株）製）で増菌培養（３７
℃、２４時間）し、表１に示すＬ−シスチン強化ＤＨＬ
寒天平板上に画線して、３７℃で２４時間培養した。

【００１６】

【表１】該寒天平板上のコロニーの発育状況、Ｈ₂Ｓ産生能およ
び痕跡産生能を観察した結果を表２に示す。

【００１７】

【表２】（注）発育、Ｈ₂ Ｓ産生能および痕跡産生能の評価：+++ ＞++
＞＋＞＋ｗ＞±＞− Ｈ₂ Ｓ産生能：生成される硫化鉄によるコロニー中心部
の黒色により判定。

【００１８】痕跡産生能：コロニーを除去し、培地上
の黒色痕跡の有無で判定。表２から、サルモネラ菌では
血清型や種別にかかわらず、すべての菌株で、Ｌ−シス
チン強化寒天平板で発育よく、Ｈ₂Ｓ産生能があり、そ
れに由来する黒色の痕跡を残したことが明らかである。
一方、Ｈ₂Ｓ産生が予想されたサルモネラ菌以外の腸内
細菌は、Ｈ₂Ｓを産生しないか、もしくは産生しても該
寒天平板上で痕跡を残さなかった。

【００１９】実施例２サルモネラ菌陰性の菜種粕２５ｇに、Ｈ₂Ｓ産生の可能
性がある表３の菌体培養液各０．１ｍｌを添加して供試
検体とし、ＥＥＭ培地（日水製薬（株）製）２２５ｍｌ
で前増菌培養（３７℃、２４時間）、次いでこの１ｍｌ
をハーナテトラチオン酸塩基礎培地（栄研化学（株）
製）１０ｍｌで（３７℃、２４時間）した。この培養物
の１白金耳量をＤＨＬ寒天平板培地（日水製薬（株）
製）に画線し、３５℃で２０時間培養した後、シャーレ
上のＨ₂Ｓ産生定型的コロニーを５個ずつ釣菌し、痕跡
の有無を確認するとともに、公定法のＴＳＩ，ＳＩＭお
よびＬＩＭ各培地（いずれも日水製薬（株）製）に接種
し、確認試験を行った。結果を表４に示す。

【００２０】

【表３】

【００２１】

【表４】（注）Ｈ₂Ｓ産生能および痕跡産生能の評価＝表２と
同じ確認試験による判定：ＴＳＩ，ＳＩＭ，ＬＩＭ培地で下
記のサルモネラパターンを示したものをサルモネラ菌と
した。

【００２２】（サルモネラパターン）ＴＳＩ培地＝斜面赤色、高層黒色、ガス産生（＋）ＳＩＭ培地＝黒色、運動生（＋）、インドール産生
（−）、インドールピルビン酸産生（−）ＬＩＭ培地＝全体紫色、運動生（＋）。

【００２３】実施例３常法により製造した魚粉から７０検体をサンプリング
し、各２５ｇを使用して、実施例２と同様の操作で増菌
培養物を得た。これをＬ−シスチン０．５重量部強化し
たＤＨＬ寒天平板培地に画線し、３７℃、２４時間培養
して発生した菌株の数個を選び、コロニーの特徴、Ｈ₂
Ｓ産生能および痕跡の有無により判定した。なお、すべ
てのコロニーについてＴＳＩ，ＳＩＭおよびＬＩＭ培地
で確認試験を行い、サルモネラ菌の可能性のあるものに
ついては血清型別試験（デンカ生研サルモネラ免疫血清
を使用）を行った。その結果を表５に示す。

【００２４】

【表５】注 ¹⁾中心部が黒色で周縁部が半透明を呈するコロニー
の数²⁾ サルモネラパターン：表４の（注）と同じ³⁾ Ｏ抗原のみ決定：４３株のうち、04型（12株）,013型
（26株）,01 ,3,19 型（４株）,other serotype（１
株）であった。上記の寒天平板上でＨ₂Ｓを産生する典型的コロニーの
うち、痕跡を有するものの約９６％がサルモネラ菌であ
った。またＨ₂Ｓを産生し、定型的コロニーを形成する
が、痕跡を残さないものはすべてサルモネラ菌ではなか
った。なお、Ｈ₂Ｓ産生かつ痕跡を有し、確認試験でサ
ルモネラパターンを示さなかったものは、コロニーが全
体黒色で中心部が白色をおびたサイトロバクターフロイ
ンディと同定できた。

【００２５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来、判定のた
めに長時間、労力かつ熟練を必要とし、また費用が高
く、多数の検体を処理することが困難であった各種検体
中からのサルモネラ菌の検出を簡単かつ容易な操作で、
短時間に行うことができ、また従来法の推定段階で高い
確率で判定できるので安価である。また本発明によるサ
ルモネラ菌の簡易検出方法は、単に特定寒天平板培地を
直接に視覚的に判別するのみならず、コロニーの特徴お
よび痕跡を機械的あるいは電気的に認識し、自動的にサ
ルモネラ菌を識別する方式に応用することも可能であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体成分を含硫アミノ酸と鉄イオンを含
む寒天培地で培養して、該培地上に中心部が黒色で周縁
部が半透明のコロニーを形成し、かつ前記集落裏側にお
ける前記培地表面において黒色の痕跡を検出することを
特徴とするサルモネラ菌の簡易検出法。
【請求項２】請求項１に記載の検出法の実施のために
使用する含硫アミノ酸と鉄イオンを含む寒天培地組成
物。