JPH06228191A - 正確に連結されたシスチン橋を有するプロインスリンの取得方法 - Google Patents
正確に連結されたシスチン橋を有するプロインスリンの取得方法Info
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- JPH06228191A JPH06228191A JP5301480A JP30148093A JPH06228191A JP H06228191 A JPH06228191 A JP H06228191A JP 5301480 A JP5301480 A JP 5301480A JP 30148093 A JP30148093 A JP 30148093A JP H06228191 A JPH06228191 A JP H06228191A
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】正確に連結されたシスチン橋を有するプロイン
スリンの製造方法。 【構成】 で示されるプロインスリンの取得方法。（Ｘはａ）遺伝
コード化し得るアミノ酸残基またはｂ）２〜３５個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｙは遺伝コード化
し得るアミノ酸残基であり、Ｒ１はフェニルアラニン残
基または共有結合であり、Ｒ２はａ）水素原子、ｂ）遺
伝コード化し得るアミノ酸残基またはｃ）２〜４５個の
アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ３は遺伝コー
ド化し得るアミノ酸残基であり、そして残基Ａ２−Ａ２
０はヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン
誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、また残基Ｂ２−
Ｂ２９はヒトインスリン、動物インスリンまたはインス
リン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する）。
スリンの製造方法。 【構成】 で示されるプロインスリンの取得方法。（Ｘはａ）遺伝
コード化し得るアミノ酸残基またはｂ）２〜３５個のア
ミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｙは遺伝コード化
し得るアミノ酸残基であり、Ｒ１はフェニルアラニン残
基または共有結合であり、Ｒ２はａ）水素原子、ｂ）遺
伝コード化し得るアミノ酸残基またはｃ）２〜４５個の
アミノ酸残基を有するペプチドであり、Ｒ３は遺伝コー
ド化し得るアミノ酸残基であり、そして残基Ａ２−Ａ２
０はヒトインスリン、動物インスリンまたはインスリン
誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、また残基Ｂ２−
Ｂ２９はヒトインスリン、動物インスリンまたはインス
リン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当する）。
Description
【０００１】ヒトインスリンは全部で５１個のアミノ酸
残基の二本のアミノ酸鎖を有するタンパク質である。そ
れら二本のアミノ酸鎖には６個のシステイン残基が存在
しそして各２個のシステイン残基がジスルフィド橋を介
して相互に連結している。生物学的に活性なヒトインス
リンにおいては、ＡおよびＢ鎖が２個のシスチン橋を介
して相互に連結しており、またＡ鎖にはもう一つのシス
チン橋が存在している。統計的観点からは、ヒトインス
リン１分子内で１５通りのジスルフィド橋形成の可能性
がある。それら１５通りの可能性のうちの一つだけが生
物学的に活性なヒトインスリン中に存在する。ヒトイン
スリン中では次のシステイン残基が相互に連結してい
る： Ａ６−Ａ１１ Ａ７−Ｂ７ Ａ２０−Ｂ１９
残基の二本のアミノ酸鎖を有するタンパク質である。そ
れら二本のアミノ酸鎖には６個のシステイン残基が存在
しそして各２個のシステイン残基がジスルフィド橋を介
して相互に連結している。生物学的に活性なヒトインス
リンにおいては、ＡおよびＢ鎖が２個のシスチン橋を介
して相互に連結しており、またＡ鎖にはもう一つのシス
チン橋が存在している。統計的観点からは、ヒトインス
リン１分子内で１５通りのジスルフィド橋形成の可能性
がある。それら１５通りの可能性のうちの一つだけが生
物学的に活性なヒトインスリン中に存在する。ヒトイン
スリン中では次のシステイン残基が相互に連結してい
る： Ａ６−Ａ１１ Ａ７−Ｂ７ Ａ２０−Ｂ１９
【０００２】ＡまたはＢの文字はそれぞれのインスリン
鎖を表わし、そして数値は各アミノ酸鎖のアミノ末端か
らカルボキシル末端の方向に数えたアミノ酸残基の位置
を表わす。ジスルフィド橋はヒトインスリン２分子間で
も形成され得るため、多くの様々なジスルフィド橋が予
測できない程に容易に生じ得る。
鎖を表わし、そして数値は各アミノ酸鎖のアミノ末端か
らカルボキシル末端の方向に数えたアミノ酸残基の位置
を表わす。ジスルフィド橋はヒトインスリン２分子間で
も形成され得るため、多くの様々なジスルフィド橋が予
測できない程に容易に生じ得る。
【０００３】ヒトインスリンの既知の製造方法はヒトプ
ロインスリンの使用に基づいている。ヒトプロインスリ
ンは８６個のアミノ酸残基で構成された一本の直鎖状ア
ミノ酸鎖を有するタンパク質であり、そしてヒトインス
リンのＡおよびＢ鎖が３５個のアミノ酸残基を有するＣ
ペプチドを介して相互に連結している。ヒトインスリン
中に存在するジスルフィド橋の形成は、中間体を経て行
われ、ヒトインスリンのシスチン残基には硫黄保護基、
例えばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ3 -）基が付与され
る（ＥＰ ０ ０３７ ２５５）。さらに、ブタプロイン
スリンが出発物質として用いられそしてシスチン残基が
チオ残基（−ＳＨ）として存在する、正確に連結された
シスチン橋を有するプロインスリンの取得方法が知られ
ている（Biochemistry, 60, (1968), pp. 622-629）。
「正確に連結されたシスチン橋」という用語は哺乳動物
由来の生物学的に活性なインスリンにみられるジスルフ
ィド橋を意味する。
ロインスリンの使用に基づいている。ヒトプロインスリ
ンは８６個のアミノ酸残基で構成された一本の直鎖状ア
ミノ酸鎖を有するタンパク質であり、そしてヒトインス
リンのＡおよびＢ鎖が３５個のアミノ酸残基を有するＣ
ペプチドを介して相互に連結している。ヒトインスリン
中に存在するジスルフィド橋の形成は、中間体を経て行
われ、ヒトインスリンのシスチン残基には硫黄保護基、
例えばＳ−スルホネート（−Ｓ−ＳＯ3 -）基が付与され
る（ＥＰ ０ ０３７ ２５５）。さらに、ブタプロイン
スリンが出発物質として用いられそしてシスチン残基が
チオ残基（−ＳＨ）として存在する、正確に連結された
シスチン橋を有するプロインスリンの取得方法が知られ
ている（Biochemistry, 60, (1968), pp. 622-629）。
「正確に連結されたシスチン橋」という用語は哺乳動物
由来の生物学的に活性なインスリンにみられるジスルフ
ィド橋を意味する。
【０００４】組換え法により、微生物でヒトプロインス
リン、またはヒトインスリンのそれからは逸脱したアミ
ノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するプロイン
スリンを製造することが可能となっている。組換えによ
り変えられた大腸菌（Escherichia coli）細胞から製造
されたプロインスリン類は正確に連結されたシスチン橋
を全く有していない。大腸菌を用いたヒトインスリンの
取得方法（ＥＰ ０ ０５５ ９４５）は次の手順段階に
基づいている：
リン、またはヒトインスリンのそれからは逸脱したアミ
ノ酸配列および／またはアミノ酸鎖長を有するプロイン
スリンを製造することが可能となっている。組換えによ
り変えられた大腸菌（Escherichia coli）細胞から製造
されたプロインスリン類は正確に連結されたシスチン橋
を全く有していない。大腸菌を用いたヒトインスリンの
取得方法（ＥＰ ０ ０５５ ９４５）は次の手順段階に
基づいている：
【０００５】微生物の発酵─細胞破砕─融合タンパク質
の単離─臭化シアンによる融合タンパク質の切断─プロ
インスリン配列を有する切断生成物の単離─Ｓ−スルホ
ネート基によるプロインスリンのシステイン残基の保護
─正確に連結されたシスチン橋の形成─亜硫酸分解─プ
ロインスリンの脱塩─正確に連結されたシスチン橋を有
するプロインスリンのクロマトグラフィー精製─プロイ
ンスリン溶液の濃縮─濃縮プロインスリン溶液のクロマ
トグラフィー精製─プロインスリンの酵素切断によるヒ
トインスリンの取得─生成ヒトインスリンのクロマトグ
ラフィー精製。
の単離─臭化シアンによる融合タンパク質の切断─プロ
インスリン配列を有する切断生成物の単離─Ｓ−スルホ
ネート基によるプロインスリンのシステイン残基の保護
─正確に連結されたシスチン橋の形成─亜硫酸分解─プ
ロインスリンの脱塩─正確に連結されたシスチン橋を有
するプロインスリンのクロマトグラフィー精製─プロイ
ンスリン溶液の濃縮─濃縮プロインスリン溶液のクロマ
トグラフィー精製─プロインスリンの酵素切断によるヒ
トインスリンの取得─生成ヒトインスリンのクロマトグ
ラフィー精製。
【０００６】この方法の短所は手順段階の数、および精
製段階での損失であり、それらの損失はインスリン収率
の低下につながる。多段階手順経路のため、この手順を
用いる場合には実質的な損失を受け入れなければならな
い。臭化シアン切断、亜硫酸分解およびプロインスリン
精製を介しての単離融合タンパク質の段階から、４０％
にのぼるプロインスリン損失が予測される（ＥＰ ０ ０
５５ ９４５）。それ以後の最終生成物に到る精製段階
の過程でも同様の高損失が生じ得る。
製段階での損失であり、それらの損失はインスリン収率
の低下につながる。多段階手順経路のため、この手順を
用いる場合には実質的な損失を受け入れなければならな
い。臭化シアン切断、亜硫酸分解およびプロインスリン
精製を介しての単離融合タンパク質の段階から、４０％
にのぼるプロインスリン損失が予測される（ＥＰ ０ ０
５５ ９４５）。それ以後の最終生成物に到る精製段階
の過程でも同様の高損失が生じ得る。
【０００７】ヒトインスリンの、またはインスリン誘導
体の、組換えによる製造に関連した収率増加は、必要な
手順段階数を顕著に低下できれば達成することができ
る。
体の、組換えによる製造に関連した収率増加は、必要な
手順段階数を顕著に低下できれば達成することができ
る。
【０００８】本発明の目的は、より少ない手順段階でよ
くそして総精製損失がより低い、プロインスリンアミノ
酸鎖中に正確に連結されたシスチン橋を有するプロイン
スリンの取得方法にある。
くそして総精製損失がより低い、プロインスリンアミノ
酸鎖中に正確に連結されたシスチン橋を有するプロイン
スリンの取得方法にある。
【０００９】Ａ） 式II Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Gly−Ａ２−Ａ20−Ｒ3 （II） で示されるタンパク質を、式IIで示されるタンパク質の
システイン残基１個あたり２〜１０個のメルカプタン由
来−ＳＨラジカルを生成する量のメルカプタンと、カオ
トロピック助剤の存在下に水性媒質中１０〜１１のpH
で、水性媒質１リットルあたり式IIで示されるタンパク
質濃度を０.０５〜０.３ｇとして反応させ、そして得ら
れた式Ｉで示されるプロインスリンを Ｂ） ４〜７のpHで水性媒質１リットルあたり３〜５０
ｇの疎水性吸着剤樹脂と混合し、 Ｃ） 式Ｉで示される、プロインスリンを吸着した吸着
剤樹脂を単離し、そして Ｄ） 式Ｉで示されるプロインスリンを吸着剤樹脂から
脱着することより成る、式Ｉ
システイン残基１個あたり２〜１０個のメルカプタン由
来−ＳＨラジカルを生成する量のメルカプタンと、カオ
トロピック助剤の存在下に水性媒質中１０〜１１のpH
で、水性媒質１リットルあたり式IIで示されるタンパク
質濃度を０.０５〜０.３ｇとして反応させ、そして得ら
れた式Ｉで示されるプロインスリンを Ｂ） ４〜７のpHで水性媒質１リットルあたり３〜５０
ｇの疎水性吸着剤樹脂と混合し、 Ｃ） 式Ｉで示される、プロインスリンを吸着した吸着
剤樹脂を単離し、そして Ｄ） 式Ｉで示されるプロインスリンを吸着剤樹脂から
脱着することより成る、式Ｉ
【００１０】
【化２】 で示されるプロインスリンの取得方法であって
【００１１】前記式ＩおよびIIにおいて、 Ｘはａ）遺伝コード化し得るアミノ酸残基または ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、Ｙは遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、Ｒ1
はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 Ｒ2はａ）水素原子、 ｂ）遺伝コード化し得るアミノ酸残基または ｃ）２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、Ｒ3は遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、そ
して残基Ａ２−Ａ２０はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当
し、また残基Ｂ２−Ｂ２９はヒトインスリン、動物イン
スリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に
相当する、が見出された。
り、Ｙは遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、Ｒ1
はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 Ｒ2はａ）水素原子、 ｂ）遺伝コード化し得るアミノ酸残基または ｃ）２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、Ｒ3は遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、そ
して残基Ａ２−Ａ２０はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当
し、また残基Ｂ２−Ｂ２９はヒトインスリン、動物イン
スリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に
相当する、が見出された。
【００１２】式中、ＸがヒトインスリンのＣ鎖のアミノ
酸配列を有するペプチドであり、ＹがＡｌａ、Ｔｈｒま
たはＳｅｒより成る群より選択されるアミノ酸残基であ
り、Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、Ｒ3がＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙより成る群より
選択されるアミノ酸残基であり、そして残基Ａ２−Ａ２
０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのＡおよびＢ鎖
のアミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク質
が好ましい。
酸配列を有するペプチドであり、ＹがＡｌａ、Ｔｈｒま
たはＳｅｒより成る群より選択されるアミノ酸残基であ
り、Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、Ｒ3がＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙより成る群より
選択されるアミノ酸残基であり、そして残基Ａ２−Ａ２
０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのＡおよびＢ鎖
のアミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク質
が好ましい。
【００１３】式中、Ｘが２〜３５個のアミノ酸残基を有
するペプチド（該ペプチドの最初と最後に２個の塩基性
アミノ酸、特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ、が位置し
ている）であり、Ｙがアミノ酸残基Ｔｈｒであり、Ｒ1
がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）そのカルボキシル末端にアミノ酸残基Ｍｅｔまたは
Ａｒｇが位置している、２〜１５個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、Ｒ3がアミノ酸残基Ａｓｎであ
り、そして残基Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９はヒト
インスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、
式IIで示されるタンパク質が特に好ましい。
するペプチド（該ペプチドの最初と最後に２個の塩基性
アミノ酸、特にＡｒｇおよび／またはＬｙｓ、が位置し
ている）であり、Ｙがアミノ酸残基Ｔｈｒであり、Ｒ1
がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）そのカルボキシル末端にアミノ酸残基Ｍｅｔまたは
Ａｒｇが位置している、２〜１５個のアミノ酸残基を有
するペプチドであり、Ｒ3がアミノ酸残基Ａｓｎであ
り、そして残基Ａ２−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９はヒト
インスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、
式IIで示されるタンパク質が特に好ましい。
【００１４】驚くべきことに、通例、再折りたたみに先
立って行われる反応段階（R. Jaenicke, R. Rudolph, 1
989, Folding Proteins, in Protein Structure a prac
tical Approach；ed. Creighton, T.E. pp. 191-224, J
RL Press Oxford；EP 0 219874）において式IIで示され
るタンパク質を完全に還元する必要がないこと、およ
び、記載された手順において高割合の異タンパク質（７
０〜９０％）であるにもかかわらず、−ＳＨ保護基を有
する相応に精製されたプロインスリンを折りたたんだ際
に得られるものと同等の大きさの折りたたみ収率が得ら
れることが見出された。
立って行われる反応段階（R. Jaenicke, R. Rudolph, 1
989, Folding Proteins, in Protein Structure a prac
tical Approach；ed. Creighton, T.E. pp. 191-224, J
RL Press Oxford；EP 0 219874）において式IIで示され
るタンパク質を完全に還元する必要がないこと、およ
び、記載された手順において高割合の異タンパク質（７
０〜９０％）であるにもかかわらず、−ＳＨ保護基を有
する相応に精製されたプロインスリンを折りたたんだ際
に得られるものと同等の大きさの折りたたみ収率が得ら
れることが見出された。
【００１５】既知の方法に比べ、本発明の方法により、
より迅速でかつより高い収率の得られる製造が可能にな
る。この理由は、亜硫酸分解および場合によっては臭化
シアン切断という手順段階が回避され、また式（Ｉ）に
相当するプロインスリンを限定量のカオトロピック塩の
存在下にその変性状態から直接高収率で生物学的に活性
な構造に折りたたむというこれまでに知られていない選
択が可能になったためである。これによって生成プロイ
ンスリンを折りたたみ溶液から吸着により分取すること
ができる。すなわち、それらプロインスリンは、吸着剤
から脱着した後、予め中間単離または精製を行うことな
く、インスリンへの酵素転化に用いることができる。本
発明方法により、放置時間の短縮および損失の回避のた
めに、既知の方法に比べ２５〜１００％程度の収率増加
が可能な実質的に製造手順が短縮される。
より迅速でかつより高い収率の得られる製造が可能にな
る。この理由は、亜硫酸分解および場合によっては臭化
シアン切断という手順段階が回避され、また式（Ｉ）に
相当するプロインスリンを限定量のカオトロピック塩の
存在下にその変性状態から直接高収率で生物学的に活性
な構造に折りたたむというこれまでに知られていない選
択が可能になったためである。これによって生成プロイ
ンスリンを折りたたみ溶液から吸着により分取すること
ができる。すなわち、それらプロインスリンは、吸着剤
から脱着した後、予め中間単離または精製を行うことな
く、インスリンへの酵素転化に用いることができる。本
発明方法により、放置時間の短縮および損失の回避のた
めに、既知の方法に比べ２５〜１００％程度の収率増加
が可能な実質的に製造手順が短縮される。
【００１６】ペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列
はアミノ酸鎖のＮ−末端から示される。式Ｉの括弧に示
したデータ、例えばＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７またはＢ
１９はインスリンのＡおよびＢ鎖におけるアミノ酸残基
の位置に相当する。
はアミノ酸鎖のＮ−末端から示される。式Ｉの括弧に示
したデータ、例えばＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７またはＢ
１９はインスリンのＡおよびＢ鎖におけるアミノ酸残基
の位置に相当する。
【００１７】アミノ酸Gly、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、
Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、
Tyr、Phe、Trp、Proおよびセレノシステインは「遺伝コ
ード化し得るアミノ酸残基」を表わす。
Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Met、Arg、Lys、His、
Tyr、Phe、Trp、Proおよびセレノシステインは「遺伝コ
ード化し得るアミノ酸残基」を表わす。
【００１８】動物インスリンの残基Ａ２−Ａ２０および
残基Ｂ２−Ｂ２９という用語は、例えば、ウシ、ブタま
たは家禽由来のインスリンのアミノ酸配列を意味する。
残基Ｂ２−Ｂ２９という用語は、例えば、ウシ、ブタま
たは家禽由来のインスリンのアミノ酸配列を意味する。
【００１９】インスリン誘導体の残基Ａ２−Ａ２０およ
びＢ２−Ｂ２９は、アミノ酸を他の遺伝コード化し得る
アミノ酸と交換することにより形成される相当するヒト
インスリンのアミノ酸配列を表わす。
びＢ２−Ｂ２９は、アミノ酸を他の遺伝コード化し得る
アミノ酸と交換することにより形成される相当するヒト
インスリンのアミノ酸配列を表わす。
【００２０】ヒトインスリンのＡ鎖は次の配列を有する
（配列番号：１）：Gly，Ile，Val，Glu，Gln，Cys，Cy
s，Thr，Ser，Ile，Cys，Ser，Leu，Tyr，Gln，Leu，Gl
u，Asn，Tyr，Cys，Asn
（配列番号：１）：Gly，Ile，Val，Glu，Gln，Cys，Cy
s，Thr，Ser，Ile，Cys，Ser，Leu，Tyr，Gln，Leu，Gl
u，Asn，Tyr，Cys，Asn
【００２１】ヒトインスリンのＢ鎖は次の配列を有する
（配列番号：２）：Phe，Val，Asn，Gln，His，Leu，Cy
s，Gly，Ser，His，Leu，Val，Glu，Ala，Leu，Tyr，Le
u，Val，Cys，Gly，Glu，Arg，Gly，Phe，Phe，Tyr，Th
r，Pro，Lys，Thr
（配列番号：２）：Phe，Val，Asn，Gln，His，Leu，Cy
s，Gly，Ser，His，Leu，Val，Glu，Ala，Leu，Tyr，Le
u，Val，Cys，Gly，Glu，Arg，Gly，Phe，Phe，Tyr，Th
r，Pro，Lys，Thr
【００２２】ヒトインスリンのＣ鎖は次の配列を有する
（配列番号：３）：Arg，Arg，Glu，Ala，Glu，Asp，Le
u，Gln，Val，Gly，Gln，Val，Glu，Leu，Gly，Gly，Gl
y，Pro，Gly，Ala，Gly，Ser，Leu，Gln，Pro，Leu，Al
a，Leu，Glu，Gly，Ser，Leu，Gln，Lys，Arg
（配列番号：３）：Arg，Arg，Glu，Ala，Glu，Asp，Le
u，Gln，Val，Gly，Gln，Val，Glu，Leu，Gly，Gly，Gl
y，Pro，Gly，Ala，Gly，Ser，Leu，Gln，Pro，Leu，Al
a，Leu，Glu，Gly，Ser，Leu，Gln，Lys，Arg
【００２３】カオトロピック助剤は水性溶液中で水素結
合を切断する化合物、例えば硫酸アンモニウム、グアニ
ジン塩酸塩、エチレンカーボネート、チオシアネート、
ジメチルスルホキシドおよび尿素などである。
合を切断する化合物、例えば硫酸アンモニウム、グアニ
ジン塩酸塩、エチレンカーボネート、チオシアネート、
ジメチルスルホキシドおよび尿素などである。
【００２４】疎水性吸着剤樹脂という用語は、非イオン
性、疎水性、架橋ポリマーおよび／またはコポリマー、
例えばポリスチレンまたはスチレンとジビニルベンゼン
とより成るコポリマー、特に大きな表面と多くの大きな
細孔を有するポリマーの吸着剤樹脂、例えばRohm and H
aas社またはMitsubishi Chemical Industries Ltd．社
からの市販調製物、例えばＸＡＤ１６、ＸＡＤ１６００
またはＨＰ２０などを表わす。
性、疎水性、架橋ポリマーおよび／またはコポリマー、
例えばポリスチレンまたはスチレンとジビニルベンゼン
とより成るコポリマー、特に大きな表面と多くの大きな
細孔を有するポリマーの吸着剤樹脂、例えばRohm and H
aas社またはMitsubishi Chemical Industries Ltd．社
からの市販調製物、例えばＸＡＤ１６、ＸＡＤ１６００
またはＨＰ２０などを表わす。
【００２５】メルカプタンという用語は、水溶性であ
り、そして少なくとも一つの−ＳＨ基を含む化合物を意
味する。これら化合物の例は、ジチオトレイトール、ジ
チオエリトロール、２−メルカプトエタノール、システ
イン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１,
２−プロパンジオールおよび３−メルカプトプロピオン
酸である。
り、そして少なくとも一つの−ＳＨ基を含む化合物を意
味する。これら化合物の例は、ジチオトレイトール、ジ
チオエリトロール、２−メルカプトエタノール、システ
イン、メチルチオグリコレート、３−メルカプト−１,
２−プロパンジオールおよび３−メルカプトプロピオン
酸である。
【００２６】式IIで示されるタンパク質は微生物中で、
様々な組換え構築物を用いて形成することができる（Ｅ
Ｐ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７８１、ＥＰ
０ ４５３ ９６９）。
様々な組換え構築物を用いて形成することができる（Ｅ
Ｐ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７８１、ＥＰ
０ ４５３ ９６９）。
【００２７】組換え構築物は大腸菌またはストレプトマ
イシス類（streptomycetes）などの微生物中で発酵中に
発現される。形成されたタンパク質は微生物の内部に貯
蔵される（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）か、または発酵溶
液中に分泌される。
イシス類（streptomycetes）などの微生物中で発酵中に
発現される。形成されたタンパク質は微生物の内部に貯
蔵される（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）か、または発酵溶
液中に分泌される。
【００２８】本発明の方法には、細胞破砕直後の、発酵
溶液または微生物由来の様々なタンパク質で依然として
汚染されている式IIで示されるタンパク質を用いること
ができる。しかしながら、式IIで示されるタンパク質
は、例えば沈殿またはクロマトグラフィー精製後、予め
精製された形で用いることもできる。
溶液または微生物由来の様々なタンパク質で依然として
汚染されている式IIで示されるタンパク質を用いること
ができる。しかしながら、式IIで示されるタンパク質
は、例えば沈殿またはクロマトグラフィー精製後、予め
精製された形で用いることもできる。
【００２９】手順段階Ａ）におけるアプローチは次のと
おりである：タンパク質をカオトロピック助剤に、また
は様々なカオトロピック助剤の混合物に溶解する。好ま
しくは、グアニジン塩酸塩を溶媒としての水に基づき６
〜１０Ｍ、好ましくは８Ｍ、の濃度で用いる。反応混合
物のpHは８.５から１０.８である。使用できる緩衝剤の
例は、ホスフェート、トリ（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Tris）、ボレートまたはグリシン緩衝剤などで
ある。水性媒質中の緩衝物質濃度は０.５Ｍまで、好ま
しくは０.００５Ｍ〜０.５Ｍ、特に好ましくは０.０５
Ｍ〜０.１Ｍである。次に、タンパク質混合物をメルカ
プタンの水性溶液と混合する。これによって反応溶液中
に次の（水に基づく）濃度が得られる：
おりである：タンパク質をカオトロピック助剤に、また
は様々なカオトロピック助剤の混合物に溶解する。好ま
しくは、グアニジン塩酸塩を溶媒としての水に基づき６
〜１０Ｍ、好ましくは８Ｍ、の濃度で用いる。反応混合
物のpHは８.５から１０.８である。使用できる緩衝剤の
例は、ホスフェート、トリ（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（Tris）、ボレートまたはグリシン緩衝剤などで
ある。水性媒質中の緩衝物質濃度は０.５Ｍまで、好ま
しくは０.００５Ｍ〜０.５Ｍ、特に好ましくは０.０５
Ｍ〜０.１Ｍである。次に、タンパク質混合物をメルカ
プタンの水性溶液と混合する。これによって反応溶液中
に次の（水に基づく）濃度が得られる：
【００３０】式IIで示されるタンパク質の濃度は、０.
０５〜０.３ｇ／リットル、好ましくは０.１〜０.２ｇ
／リットル、である。
０５〜０.３ｇ／リットル、好ましくは０.１〜０.２ｇ
／リットル、である。
【００３１】メルカプタンの量は、式IIで示されるタン
パク質のシステイン残基１個あたり、メルカプタンの−
ＳＨラジカル２〜１０個、好ましくは３〜６個、であ
る。
パク質のシステイン残基１個あたり、メルカプタンの−
ＳＨラジカル２〜１０個、好ましくは３〜６個、であ
る。
【００３２】溶液のpHは１０〜１１、好ましくは１０.
８である。前述の緩衝成分が用いられる。精密なpHは、
水酸化ナトリウム溶液を添加することにより設定され
る。緩衝成分の濃度は０.００５〜０.５Ｍ、好ましくは
０.０５〜０.１Ｍ、である。
８である。前述の緩衝成分が用いられる。精密なpHは、
水酸化ナトリウム溶液を添加することにより設定され
る。緩衝成分の濃度は０.００５〜０.５Ｍ、好ましくは
０.０５〜０.１Ｍ、である。
【００３３】メルカプタン含有反応混合物中のカオトロ
ピック助剤の濃度は、１Ｍ以下、好ましくは０.１〜０.
８Ｍ、特に０.３〜０.６Ｍ、である。システインまたは
２−メルカプトエタノールいずれか単独、またはそれら
両者の混合物をメルカプタンとして用いるのが好まし
い。
ピック助剤の濃度は、１Ｍ以下、好ましくは０.１〜０.
８Ｍ、特に０.３〜０.６Ｍ、である。システインまたは
２−メルカプトエタノールいずれか単独、またはそれら
両者の混合物をメルカプタンとして用いるのが好まし
い。
【００３４】手順段階Ａ）における折りたたみの際の温
度は０℃〜５０℃、好ましくは２℃〜３０℃、特に４℃
〜１０℃、である。反応時間は３〜１２時間、好ましく
は４〜８時間、特に５時間、である。
度は０℃〜５０℃、好ましくは２℃〜３０℃、特に４℃
〜１０℃、である。反応時間は３〜１２時間、好ましく
は４〜８時間、特に５時間、である。
【００３５】手順段階Ａ）からの生成物は、正確に連結
されたシスチン橋を含む式Ｉで示されるプロインスリン
である。
されたシスチン橋を含む式Ｉで示されるプロインスリン
である。
【００３６】手順段階Ｂ）においては、手順段階Ａ）か
らの反応溶液は、酸、例えば塩酸または硫酸を用いて４
〜７のpHに調節される。溶液に濁りが生じたら、これら
を濾過または遠心分離により除去する。次に、残留溶液
に疎水性吸着剤樹脂を添加する。ＸＡＤまたはＨＰ２０
型の樹脂が適切であることがわかっている。樹脂の量は
反応溶液１リットルあたり３〜５０ｇ、好ましくは１０
〜２５ｇである。
らの反応溶液は、酸、例えば塩酸または硫酸を用いて４
〜７のpHに調節される。溶液に濁りが生じたら、これら
を濾過または遠心分離により除去する。次に、残留溶液
に疎水性吸着剤樹脂を添加する。ＸＡＤまたはＨＰ２０
型の樹脂が適切であることがわかっている。樹脂の量は
反応溶液１リットルあたり３〜５０ｇ、好ましくは１０
〜２５ｇである。
【００３７】得られた懸濁液を３〜４時間撹拌する。式
Ｉで示されるプロインスリンの樹脂への吸着は、サンプ
リングにより、また高圧液体クロマトグラフィー分析
（ＨＰＬＣ分析）により点検する。溶液中にプロインス
リンがもはや検出し得なくなったらただちに、吸着剤樹
脂を水性反応溶液から分取する（手順段階Ｃ）。これ
は、例えば既知方法に従って濾過または遠心分離などに
より行われる。プロインスリンを吸着した樹脂は、純粋
に水性の溶液で、または緩衝剤含有水性溶液で洗浄され
る。
Ｉで示されるプロインスリンの樹脂への吸着は、サンプ
リングにより、また高圧液体クロマトグラフィー分析
（ＨＰＬＣ分析）により点検する。溶液中にプロインス
リンがもはや検出し得なくなったらただちに、吸着剤樹
脂を水性反応溶液から分取する（手順段階Ｃ）。これ
は、例えば既知方法に従って濾過または遠心分離などに
より行われる。プロインスリンを吸着した樹脂は、純粋
に水性の溶液で、または緩衝剤含有水性溶液で洗浄され
る。
【００３８】式Ｉで示されるプロインスリンの脱着（手
順段階Ｄ）は、使用した疎水性吸着剤樹脂に依存する既
知方法に従って行われる。例えばＸＡＤまたはＨＰ２０
吸着剤樹脂の場合には、脱着は、１０〜５０％の、水と
混和し得る非イオン性有機溶媒、例えば（Ｃ1〜Ｃ6）−
アルカノール、を含有する水性溶液を用いて行われる。
好ましくは、５０％イソプロパノールを溶媒としての水
中で用いる。式Ｉで示されるプロインスリンの脱着は、
例えばそのイソプロパノール溶液で洗浄することにより
行われる。その洗浄は、撹拌機付き容器内でイソプロパ
ノール溶液と混合することにより、あるいはカラムでの
クロマトグラフィーにより行うことができる。樹脂容量
対イソプロパノール溶液容量の比は１：１〜１：１０、
好ましくは１：１.１〜１：２である。洗浄段階は１〜
５回、好ましくは２回、反復することができる。合一し
たイソプロパノール画分は、直接、あるいは水で希釈し
た後、さらなるクロマトグラフィー精製、またはプロイ
ンスリンのインスリンへの酵素切断に用いることができ
る（Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246（1971）, p.
6786；EP 0 305 760）。
順段階Ｄ）は、使用した疎水性吸着剤樹脂に依存する既
知方法に従って行われる。例えばＸＡＤまたはＨＰ２０
吸着剤樹脂の場合には、脱着は、１０〜５０％の、水と
混和し得る非イオン性有機溶媒、例えば（Ｃ1〜Ｃ6）−
アルカノール、を含有する水性溶液を用いて行われる。
好ましくは、５０％イソプロパノールを溶媒としての水
中で用いる。式Ｉで示されるプロインスリンの脱着は、
例えばそのイソプロパノール溶液で洗浄することにより
行われる。その洗浄は、撹拌機付き容器内でイソプロパ
ノール溶液と混合することにより、あるいはカラムでの
クロマトグラフィーにより行うことができる。樹脂容量
対イソプロパノール溶液容量の比は１：１〜１：１０、
好ましくは１：１.１〜１：２である。洗浄段階は１〜
５回、好ましくは２回、反復することができる。合一し
たイソプロパノール画分は、直接、あるいは水で希釈し
た後、さらなるクロマトグラフィー精製、またはプロイ
ンスリンのインスリンへの酵素切断に用いることができ
る（Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246（1971）, p.
6786；EP 0 305 760）。
【００３９】本発明による方法は次の実施例に詳述され
ている。パーセント値は特に断らない限り重量に関する
ものである。
ている。パーセント値は特に断らない限り重量に関する
ものである。
【００４０】実施例１ 次のアミノ酸配列を有するプロインスリン１は遺伝子的
に修飾された大腸菌細胞を発酵させることにより製造さ
れる（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）。 プロインスリン１（配列番号：４）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
に修飾された大腸菌細胞を発酵させることにより製造さ
れる（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）。 プロインスリン１（配列番号：４）： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
【００４１】プロインスリン１は、式中Ｘがヒトインス
リンのＣペプチドであり、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であ
り、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2が１１個のアミノ
酸残基を有するペプチドであり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２
１）であり、そしてＡ２−Ａ２０がヒトインスリンのＡ
鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）でありまた
Ｂ２−Ｂ２９がヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２９）である式IIに相当する。
リンのＣペプチドであり、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であ
り、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2が１１個のアミノ
酸残基を有するペプチドであり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２
１）であり、そしてＡ２−Ａ２０がヒトインスリンのＡ
鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）でありまた
Ｂ２−Ｂ２９がヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸配列
（アミノ酸残基２〜２９）である式IIに相当する。
【００４２】発現されたプロインスリン１は大腸菌細胞
中に蓄積しそして封入体を形成する。発酵が完了した
ら、細胞を遠心分離により分取し、そして慣用の高圧ホ
モジナイゼーションにより破砕する。遊離した融合タン
パク質封入体は遠心分離により単離される。
中に蓄積しそして封入体を形成する。発酵が完了した
ら、細胞を遠心分離により分取し、そして慣用の高圧ホ
モジナイゼーションにより破砕する。遊離した融合タン
パク質封入体は遠心分離により単離される。
【００４３】プロインスリンの単離された融合タンパク
質封入体１０００ｇ（凍結乾燥後の水分不含重量に基づ
く）をpH１０.８で８Ｍグアニジン塩酸塩溶液１００リ
ットルに溶解する。遠心分離により少量の濁り源固体を
除去した後、その澄明溶液を、１０.８のpHおよび４℃
の温度で、システイン（１２５ｇのシステイン塩酸塩水
和物）の水性溶液９００リットル中に撹拌しながら添加
する。融合タンパク質のインスリン含量は、ＳＤＳ電気
泳動走査により測定する（U.K. Laemmli, Nature, Volu
me227, pp. 680-685, 1970）。それは１５％である。折
りたたみ反応の完了後、反応混合物中のプロインスリン
は分析的ＨＰＬＣにより１０５ｇと測定される。
質封入体１０００ｇ（凍結乾燥後の水分不含重量に基づ
く）をpH１０.８で８Ｍグアニジン塩酸塩溶液１００リ
ットルに溶解する。遠心分離により少量の濁り源固体を
除去した後、その澄明溶液を、１０.８のpHおよび４℃
の温度で、システイン（１２５ｇのシステイン塩酸塩水
和物）の水性溶液９００リットル中に撹拌しながら添加
する。融合タンパク質のインスリン含量は、ＳＤＳ電気
泳動走査により測定する（U.K. Laemmli, Nature, Volu
me227, pp. 680-685, 1970）。それは１５％である。折
りたたみ反応の完了後、反応混合物中のプロインスリン
は分析的ＨＰＬＣにより１０５ｇと測定される。
【００４４】その溶液を６Ｎ ＨＣｌを用いて４.５のpH
に調節し、そしてわずかな濁りを遠心分離により除去す
る。３０kgのＨＰ２０（Mitsubishi Chemical Industri
es Ltd製）をその澄明な溶液に添加する。その懸濁液を
上清中にプロインスリン１がもはや検出し得なくなるま
で約４時間、ゆっくり撹拌する。その樹脂を吸引フイル
ターを通して濾過することにより分取しそして水洗す
る。生成物の脱着は、イソプロパノールの５０％強度水
性溶液５０リットル中で樹脂をスラリー化することによ
り行われる。前記濾過およびイソプロパノール溶液との
インキュベーションを２回繰り返す。式Ｉで示されるプ
ロインスリンの収量は１０３ｇである。
に調節し、そしてわずかな濁りを遠心分離により除去す
る。３０kgのＨＰ２０（Mitsubishi Chemical Industri
es Ltd製）をその澄明な溶液に添加する。その懸濁液を
上清中にプロインスリン１がもはや検出し得なくなるま
で約４時間、ゆっくり撹拌する。その樹脂を吸引フイル
ターを通して濾過することにより分取しそして水洗す
る。生成物の脱着は、イソプロパノールの５０％強度水
性溶液５０リットル中で樹脂をスラリー化することによ
り行われる。前記濾過およびイソプロパノール溶液との
インキュベーションを２回繰り返す。式Ｉで示されるプ
ロインスリンの収量は１０３ｇである。
【００４５】ＨＰＬＣ分析 ０.５ｇのタンパク質を６Ｍグアニジン塩酸塩、５０mM
Tris、pH８.５、５mMエチレンジアミンテトラアセテー
ト（ＥＤＴＡ）、１％２−メルカプトエタノールおよび
１０mMジチオトレイトールより成る溶液４０mlに９５℃
で２分間溶解し、次いで１４０００ｇで２０分間遠心分
離する。０.０２mlの澄明な上清を高圧液体クロマトグ
ラフィーカラムにかける。
Tris、pH８.５、５mMエチレンジアミンテトラアセテー
ト（ＥＤＴＡ）、１％２−メルカプトエタノールおよび
１０mMジチオトレイトールより成る溶液４０mlに９５℃
で２分間溶解し、次いで１４０００ｇで２０分間遠心分
離する。０.０２mlの澄明な上清を高圧液体クロマトグ
ラフィーカラムにかける。
【００４６】カラム：RNucleogel RP 300−5／46（Mach
erey & Nagel社製） 勾 配：緩衝剤Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ） 緩衝剤Ｂ：アセトニトリル中０.０９％ＴＦＡ 温 度：５５℃ 総ランニング時間：１５分 前記勾配は相当するランニング時間後の次の緩衝剤Ｂ量
によって特徴付けられる：１０分 ２５％、１２分 ６０
％、１３分 ９０％、１５分 １００％。 流 速：１ml／分 検 出：２１５nm プロインスリンの保持時間：９分間
erey & Nagel社製） 勾 配：緩衝剤Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ） 緩衝剤Ｂ：アセトニトリル中０.０９％ＴＦＡ 温 度：５５℃ 総ランニング時間：１５分 前記勾配は相当するランニング時間後の次の緩衝剤Ｂ量
によって特徴付けられる：１０分 ２５％、１２分 ６０
％、１３分 ９０％、１５分 １００％。 流 速：１ml／分 検 出：２１５nm プロインスリンの保持時間：９分間
【００４７】実施例２ 次のアミノ酸配列を有するプロインスリン２は遺伝子的
に修飾された大腸菌を発酵させることにより製造される
（ＥＰ ０ ３４７ ７８１）。 プロインスリン２（配列番号：５）： Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
に修飾された大腸菌を発酵させることにより製造される
（ＥＰ ０ ３４７ ７８１）。 プロインスリン２（配列番号：５）： Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
【００４８】発現されたプロインスリン２は大腸菌細胞
中に蓄積しそしてしばしば封入体を形成する。実施例１
と同様に細胞の破砕を行う。このようにして得られたプ
ロインスリンを臭化シアンによる切断に付すとプロイン
スリン３（配列番号：７）が形成される。
中に蓄積しそしてしばしば封入体を形成する。実施例１
と同様に細胞の破砕を行う。このようにして得られたプ
ロインスリンを臭化シアンによる切断に付すとプロイン
スリン３（配列番号：７）が形成される。
【００４９】プロインスリン３は、式中ＸがＡｒｇであ
り、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であり、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ
１）であり、Ｒ2が４個のアミノ酸残基を有するペプチ
ドであり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２１）であり、そしてＡ２
−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのそれぞ
れＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当
する。
り、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であり、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ
１）であり、Ｒ2が４個のアミノ酸残基を有するペプチ
ドであり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２１）であり、そしてＡ２
−Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのそれぞ
れＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当
する。
【００５０】臭化シアンに切断の後、９.２％インスリ
ン含有タンパク質を含有する凍結乾燥試料中のプロイン
スリン３含量をＳＤＳ電気泳動により定量的に測定す
る。
ン含有タンパク質を含有する凍結乾燥試料中のプロイン
スリン３含量をＳＤＳ電気泳動により定量的に測定す
る。
【００５１】１０００ｇのプロインスリン３を実施例１
と同様にシステイン塩酸塩水和物と共にインキュベート
する。その後で、全反応混合物中の式Ｉで示されるプロ
インスリンの含量は分析的ＨＰＬＣを用いて６３ｇと測
定される。実施例１と同様、生成物を３５kgのＸＡＤ−
１６００樹脂（Rohm and Haas Company製）で吸着し、
そして反応溶液から取出す。その樹脂を洗浄しそして生
成物を脱着した後、式Ｉで示されるプロインスリンの含
量は５６ｇと測定される。
と同様にシステイン塩酸塩水和物と共にインキュベート
する。その後で、全反応混合物中の式Ｉで示されるプロ
インスリンの含量は分析的ＨＰＬＣを用いて６３ｇと測
定される。実施例１と同様、生成物を３５kgのＸＡＤ−
１６００樹脂（Rohm and Haas Company製）で吸着し、
そして反応溶液から取出す。その樹脂を洗浄しそして生
成物を脱着した後、式Ｉで示されるプロインスリンの含
量は５６ｇと測定される。
【００５２】実施例３ 次のアミノ酸配列を有するプロインスリン４は組換えに
より修飾された大腸菌を発酵させることにより製造され
る（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）： プロインスリン４（配列番号：６） Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
より修飾された大腸菌を発酵させることにより製造され
る（ＥＰ ０ ４８９ ７８０）： プロインスリン４（配列番号：６） Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
【００５３】プロインスリン４は、式中ＸがＡｒｇであ
り、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であり、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ
１）であり、Ｒ2が１１個のアミノ酸を有するペプチド
であり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２１）であり、そしてＡ２−
Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのそれぞれ
ＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当す
る。
り、ＹがＴｈｒ（Ｂ３０）であり、Ｒ1がＰｈｅ（Ｂ
１）であり、Ｒ2が１１個のアミノ酸を有するペプチド
であり、Ｒ3がＡｓｎ（Ａ２１）であり、そしてＡ２−
Ａ２０およびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのそれぞれ
ＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIに相当す
る。
【００５４】細胞を破砕後、融合タンパク質をホモジネ
ートから遠心分離により単離する。実施例１と同様、生
成物含量（１５％）を測定した後、１０００ｇの融合タ
ンパク質を折りたたみ反応に用いる。反応終了時の折り
たたみ収率を実施例１と同様測定したところ６０％と測
定される。プロインスリン収量は１０８ｇである。
ートから遠心分離により単離する。実施例１と同様、生
成物含量（１５％）を測定した後、１０００ｇの融合タ
ンパク質を折りたたみ反応に用いる。反応終了時の折り
たたみ収率を実施例１と同様測定したところ６０％と測
定される。プロインスリン収量は１０８ｇである。
【００５５】
配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 配列： Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20
【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 配列： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30
【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 配列： Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu 20 25 30 Gln Lys Arg
【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：９７ 配列の型：アミノ酸 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu 35 40 45 Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu 50 55 60 Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu 65 70 75 80 Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys 85 90 95 Asn
【００５９】配列番号：５ 配列の長さ：９６ 配列の型：アミノ酸 配列： Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln 35 40 45 His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly 50 55 60 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln 65 70 75 80 Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 85 90 95
【００６０】配列番号：６ 配列の長さ：６３ 配列の型：アミノ酸 配列： Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys 35 40 45 Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55 60
【００６１】配列番号：７ 配列の長さ：５６ 配列の型：アミノ酸 配列： Ile Glu Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu 35 40 45 Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn 50 55
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ユルゲン・ルートヴイヒ ドイツ連邦共和国デー−63636ブラハトタ ール．リングシユトラーセ13 (72)発明者 ヴアルター・ザーベル ドイツ連邦共和国デー−65520バートカム ベルク．ノイガセ４ツエー
Claims (7)
- 【請求項１】 Ａ） 式II Ｒ2−Ｒ1−Ｂ２−Ｂ29−Ｙ−Ｘ−Gly−Ａ２−Ａ20−Ｒ3 （II） で示されるタンパク質を、式IIで示されるタンパク質の
システイン残基１個あたり２〜１０個のメルカプタン由
来−ＳＨラジカルを生成する量のメルカプタンと、カオ
トロピック助剤の存在下に水性媒質中１０〜１１のpH
で、水性媒質１リットルあたり式IIで示されるタンパク
質濃度を０.０５〜０.３ｇとして反応させ、そして得ら
れた式Ｉで示されるプロインスリンを Ｂ） ４〜７のpHで水性媒質１リットルあたり３〜５０
ｇの疎水性吸着剤樹脂と混合し、 Ｃ） 式Ｉで示される、プロインスリンを吸着した吸着
剤樹脂を単離し、そして Ｄ） 式Ｉで示されるプロインスリンを吸着剤樹脂から
脱着することより成る、式Ｉ 【化１】 で示されるプロインスリンの取得方法。（前記式Ｉおよ
びIIにおいて、 Ｘはａ）遺伝コード化し得るアミノ酸残基または ｂ）２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Ｙは遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、 Ｒ1はフェニルアラニン残基または共有結合であり、 Ｒ2はａ）水素原子、 ｂ）遺伝コード化し得るアミノ酸残基または ｃ）２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Ｒ3は遺伝コード化し得るアミノ酸残基であり、そして
残基Ａ２−Ａ２０はヒトインスリン、動物インスリンま
たはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、
また残基Ｂ２−Ｂ２９はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当
する）。 - 【請求項２】 式中、 ＸがヒトインスリンのＣ鎖のアミノ酸配列を有するペプ
チドであり、 ＹがＡｌａ、ＴｈｒまたはＳｅｒより成る群より選択さ
れるアミノ酸残基であり、 Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）２〜２５個のアミノ酸残基を有するペプチドであ
り、 Ｒ3がＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙより成る群より選択
されるアミノ酸残基であり、そして残基Ａ２−Ａ２０お
よびＢ２−Ｂ２９がヒトインスリンのＡおよびＢ鎖のア
ミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク質を用
いる請求項１記載の方法。 - 【請求項３】式中、 Ｘが２〜３５個のアミノ酸残基を有するペプチド（該ペ
プチドの最初と最後に２個の塩基性アミノ酸、特にＡｒ
ｇおよび／またはＬｙｓ、が位置している）であり、 Ｙがアミノ酸残基Ｔｈｒであり、 Ｒ1がアミノ酸残基Ｐｈｅであり、 Ｒ2がａ）水素原子、または ｂ）そのカルボキシル末端にアミノ酸残基Ｍｅｔまたは
Ａｒｇが位置している、２〜１５個のアミノ酸残基を有
するペプチド であり、 Ｒ3がアミノ酸残基Ａｓｎであり、そして残基Ａ２−Ａ
２０およびＢ２−Ｂ２９はヒトインスリンのＡおよびＢ
鎖のアミノ酸配列に相当する、式IIで示されるタンパク
質を用いる請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 システインまたはシステイン塩酸塩水和
物をメルカプタンとして用いる請求項１〜３のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項５】 架橋ポリスチレンまたはポリスチレンと
ジビニルベンゼンとで構成されるコポリマーが疎水性吸
着剤樹脂として用いられる請求項１〜４のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項６】 式Ｉで示されるプロインスリンをイソプ
ロパノールを用いて吸着剤樹脂から脱着する請求項１〜
５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の方法に
より取得された式Ｉで示されるプロインスリン。
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