JPH06228199A - 血液脳関門通過可能なペプチド結合体 - Google Patents
血液脳関門通過可能なペプチド結合体Info
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】それ自身血液脳関門を通過しない生理活性ペプ
チドないし蛋白質を血液脳関門を通過させ脳全体に均一
に輸送しうる結合体を提供する。 【構成】それ自身血液脳関門を通過しない生理活性ペプ
チドないし蛋白質とそれ自身実質的に生理活性を示さず
血液脳関門を通過可能なキャリアーペプチドとを結合さ
せてなるペプチド結合体を作製した。 【効果】本発明の結合体により、キャリアーペプチドに
よる副作用がなく、かつ簡便にそれ自身血液脳関門を通
過しない生理活性ペプチドないし蛋白質を血液脳関門を
通過させ脳全体に均一に輸送する事ができる。
チドないし蛋白質を血液脳関門を通過させ脳全体に均一
に輸送しうる結合体を提供する。 【構成】それ自身血液脳関門を通過しない生理活性ペプ
チドないし蛋白質とそれ自身実質的に生理活性を示さず
血液脳関門を通過可能なキャリアーペプチドとを結合さ
せてなるペプチド結合体を作製した。 【効果】本発明の結合体により、キャリアーペプチドに
よる副作用がなく、かつ簡便にそれ自身血液脳関門を通
過しない生理活性ペプチドないし蛋白質を血液脳関門を
通過させ脳全体に均一に輸送する事ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ペプチドないし蛋白質
性の薬物を、脳内に送達するための技術に関する。より
具体的には、本発明は、脳毛細血管内皮細胞上にあるレ
セプターを利用して、生理活性ペプチドないし蛋白質と
該ペプチドないし蛋白質をレセプター介在トランスサイ
トーシスにより脳の中に輸送しうるキャリアーペプチド
との結合体に関する。
性の薬物を、脳内に送達するための技術に関する。より
具体的には、本発明は、脳毛細血管内皮細胞上にあるレ
セプターを利用して、生理活性ペプチドないし蛋白質と
該ペプチドないし蛋白質をレセプター介在トランスサイ
トーシスにより脳の中に輸送しうるキャリアーペプチド
との結合体に関する。
【０００２】
【従来の技術】筋肉などの組織毛細血管には細孔や細胞
間腔があるために、血液中の親水性薬物は細胞間ルート
によって速やかに組織細胞間液中に移行する。しかし、
脳毛細血管には細孔が少なく内皮細胞が結合織によって
強く連結しているために、一般に高い脂溶性を有するか
もしくは生理学的ｐＨにおいてイオン化していない分子
量約２００ダルトン以下の小さい分子以外、血液中の薬
物は毛細血管から脳へ移行しにくい。このような、組織
学的なフィルター機能は血液脳関門（Blood Brain Barr
ier : B. B. B）と呼ばれ、脳疾患の薬物療法における
障害となっている。例えば、インターロイキン２（ＩＬ
−２）はＴ細胞が産生し、Ｔ細胞の分化、増殖に重要な
役割を担っているサイトカインであり、近年、ＩＬ−２
が中枢神経系のオリゴデンドロサイト、アストロサイト
およびそれらの前駆細胞を増殖させることが示唆されて
いる。しかし、分子量が１５，４００のタンパク質であ
ることから血液脳関門を通過できないので臨床応用をし
にくい面がある。また、神経成長因子（ＮＧＦ）は神経
栄養因子として、中枢系ではコリン作動性神経細胞の生
存維持に重要な役割を果たしており、アルツハイマー病
等の痴呆症治療薬として期待されている。しかし、分子
量が約１３，０００の蛋白質であることから血液脳関門
を通過できず、やはり臨床応用が困難である。これまで
に直接注入法，薬物の分子修飾等薬物を脳に移送する方
法が種々開発されてきている。薬物の分子修飾のひとつ
の方法としては、ボーダー（Boda）らによって行われて
いる脂溶性を高めて細胞内ルートの透過を増す試みがあ
る。（特開昭６３−２７７６６２号公報）しかし、この
方法には分子量の面から限界があり、生理活性物質が高
分子のペプチド、特に蛋白質の場合には応用しにくい。
間腔があるために、血液中の親水性薬物は細胞間ルート
によって速やかに組織細胞間液中に移行する。しかし、
脳毛細血管には細孔が少なく内皮細胞が結合織によって
強く連結しているために、一般に高い脂溶性を有するか
もしくは生理学的ｐＨにおいてイオン化していない分子
量約２００ダルトン以下の小さい分子以外、血液中の薬
物は毛細血管から脳へ移行しにくい。このような、組織
学的なフィルター機能は血液脳関門（Blood Brain Barr
ier : B. B. B）と呼ばれ、脳疾患の薬物療法における
障害となっている。例えば、インターロイキン２（ＩＬ
−２）はＴ細胞が産生し、Ｔ細胞の分化、増殖に重要な
役割を担っているサイトカインであり、近年、ＩＬ−２
が中枢神経系のオリゴデンドロサイト、アストロサイト
およびそれらの前駆細胞を増殖させることが示唆されて
いる。しかし、分子量が１５，４００のタンパク質であ
ることから血液脳関門を通過できないので臨床応用をし
にくい面がある。また、神経成長因子（ＮＧＦ）は神経
栄養因子として、中枢系ではコリン作動性神経細胞の生
存維持に重要な役割を果たしており、アルツハイマー病
等の痴呆症治療薬として期待されている。しかし、分子
量が約１３，０００の蛋白質であることから血液脳関門
を通過できず、やはり臨床応用が困難である。これまで
に直接注入法，薬物の分子修飾等薬物を脳に移送する方
法が種々開発されてきている。薬物の分子修飾のひとつ
の方法としては、ボーダー（Boda）らによって行われて
いる脂溶性を高めて細胞内ルートの透過を増す試みがあ
る。（特開昭６３−２７７６６２号公報）しかし、この
方法には分子量の面から限界があり、生理活性物質が高
分子のペプチド、特に蛋白質の場合には応用しにくい。
【０００３】また別の方法としては、インスリン、イン
スリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフェリンなどの
ように脳の毛細血管内皮細胞上にレセプターが存在する
生体内ペプチドによるエンドサイトーシスを利用したキ
メラペプチドの試みがある。たとえば、パードリッジ
（Pardridge）らはインスリンなどを神経薬物と結合さ
せた血液脳関門通過可能なキメラペプチドについて報告
している（特表平１−５００９０１号公報）。しかし、
脳への移行率を考慮した場合、かなりの高投与量のイン
スリンが必要とされ、血糖降下による重篤な副作用が懸
念される。一方、インスリンのアミノ酸配列、構造とホ
ルモンレセプターとの親和性の関係については多くの研
究がなされてきた。
スリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフェリンなどの
ように脳の毛細血管内皮細胞上にレセプターが存在する
生体内ペプチドによるエンドサイトーシスを利用したキ
メラペプチドの試みがある。たとえば、パードリッジ
（Pardridge）らはインスリンなどを神経薬物と結合さ
せた血液脳関門通過可能なキメラペプチドについて報告
している（特表平１−５００９０１号公報）。しかし、
脳への移行率を考慮した場合、かなりの高投与量のイン
スリンが必要とされ、血糖降下による重篤な副作用が懸
念される。一方、インスリンのアミノ酸配列、構造とホ
ルモンレセプターとの親和性の関係については多くの研
究がなされてきた。
【０００４】インスリンは、Ａ鎖及びＢ鎖と称せられる
二つの短いポリペプチド鎖が一定のジスルフィド結合で
構成されている６０００ダルトンのポリペプチドホルモ
ンである。Ａ鎖はアミノ酸２１個のポリペプチド鎖で内
部ジスルフィド架橋を有し、Ｂ鎖はアミノ酸３０個のポ
リペプチド鎖である。Ａ鎖及びＢ鎖は２個のジスルフィ
ド架橋で結合している。近年は遺伝子工学的に製造した
ヒトインスリンも用いられているが、一般に糖尿病患者
に適用されるインスリンとしては、ブタインスリンであ
り、ブタインスリンがヒトインスリンと異なるのはＢ鎖
カルボキシ末端のＴyrB30のＡlaB30の置換だけである。
また、異常インスリン血症をきたす４つの症例のインス
リン（ＰheB25→ＬeuB25：シカゴ、ＰheB24→ＳerB24：
ロスアンジェルス、ＶalA3→ＬeuA3：ワカヤマ、トチ
ギ）がホルモンレセプターへの結合能力を欠くことか
ら、Ｂ鎖Ｃ末端とＡ鎖Ｎ末端のアミノ酸がホルモンレセ
プターとの結合に重要な役割を果たすことが示されてい
る。また、Ｂ鎖のカルボキシ末端の構成要素はインスリ
ンの生物活性に影響を及ぼしており、Ｂ鎖の２５位のＰ
he（ＰheB25）が生物活性の力価に関与していることが
見いだされている。ナカガワ（Nakagawa）らはインスリ
ンＢ鎖のＣ末端ペンタペプチド配列の除去及びこの新規
形成Ｃ末端ＰheB25のカルボキシル基のアミド化によっ
て、（Ｂ２５−３０）ペンタペプチド欠損−〔ＰheB25
−α−カルボキシアミド〕インスリンという、天然型の
インスリンと同等の活性を持つアナログを得ている〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．B
iol．Chem．）第２６１巻、７３３２−７３４１頁（１
９８６）〕。また、彼らによって、ＰheB25を２〜３の
他のアミノ酸残基と置換したインスリンアナログから
（Ｂ２６−３０）ペンタペプチド欠損−〔ＴyrB25−α
−カルボキシアミド〕インスリン及びＨisB25アナログ
はインスリンよりも約２.７−３.０倍高い活性をもつこ
と、（Ｂ２５−３０）ヘキサぺプチド欠損、（Ｂ２４−
３０）ヘプタぺプチド欠損及び（Ｂ２３−３０）オクタ
ぺプチド欠損のアナログではほとんどインスリン活性を
持たないことが示されている。また、ピューレン（Pull
en）らは結晶解析構造の研究から生物活性発現のための
重要な点はＡ鎖の３残基（Ｇly1、Ｔyr19、Ａsn21）、
Ｂ鎖の５残基（Ｖal12、Ｔyr16、Ｐhe24、Ｐhe25、Ｔyr
26）を含む親油性レセプター結合部位が分子幾何学的に
安定化していることであると指摘している〔ネーチャー
（Nature）第２５９巻、３６９−３７３頁（１９７
６）〕。これら従来の研究から血糖降下作用を示すホル
モンレセプターに対して親和性を示すインスリンアナロ
グの情報は数多く報告されているが、脳毛細血管上のレ
セプターについてはなんら報告されていない。
二つの短いポリペプチド鎖が一定のジスルフィド結合で
構成されている６０００ダルトンのポリペプチドホルモ
ンである。Ａ鎖はアミノ酸２１個のポリペプチド鎖で内
部ジスルフィド架橋を有し、Ｂ鎖はアミノ酸３０個のポ
リペプチド鎖である。Ａ鎖及びＢ鎖は２個のジスルフィ
ド架橋で結合している。近年は遺伝子工学的に製造した
ヒトインスリンも用いられているが、一般に糖尿病患者
に適用されるインスリンとしては、ブタインスリンであ
り、ブタインスリンがヒトインスリンと異なるのはＢ鎖
カルボキシ末端のＴyrB30のＡlaB30の置換だけである。
また、異常インスリン血症をきたす４つの症例のインス
リン（ＰheB25→ＬeuB25：シカゴ、ＰheB24→ＳerB24：
ロスアンジェルス、ＶalA3→ＬeuA3：ワカヤマ、トチ
ギ）がホルモンレセプターへの結合能力を欠くことか
ら、Ｂ鎖Ｃ末端とＡ鎖Ｎ末端のアミノ酸がホルモンレセ
プターとの結合に重要な役割を果たすことが示されてい
る。また、Ｂ鎖のカルボキシ末端の構成要素はインスリ
ンの生物活性に影響を及ぼしており、Ｂ鎖の２５位のＰ
he（ＰheB25）が生物活性の力価に関与していることが
見いだされている。ナカガワ（Nakagawa）らはインスリ
ンＢ鎖のＣ末端ペンタペプチド配列の除去及びこの新規
形成Ｃ末端ＰheB25のカルボキシル基のアミド化によっ
て、（Ｂ２５−３０）ペンタペプチド欠損−〔ＰheB25
−α−カルボキシアミド〕インスリンという、天然型の
インスリンと同等の活性を持つアナログを得ている〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J．B
iol．Chem．）第２６１巻、７３３２−７３４１頁（１
９８６）〕。また、彼らによって、ＰheB25を２〜３の
他のアミノ酸残基と置換したインスリンアナログから
（Ｂ２６−３０）ペンタペプチド欠損−〔ＴyrB25−α
−カルボキシアミド〕インスリン及びＨisB25アナログ
はインスリンよりも約２.７−３.０倍高い活性をもつこ
と、（Ｂ２５−３０）ヘキサぺプチド欠損、（Ｂ２４−
３０）ヘプタぺプチド欠損及び（Ｂ２３−３０）オクタ
ぺプチド欠損のアナログではほとんどインスリン活性を
持たないことが示されている。また、ピューレン（Pull
en）らは結晶解析構造の研究から生物活性発現のための
重要な点はＡ鎖の３残基（Ｇly1、Ｔyr19、Ａsn21）、
Ｂ鎖の５残基（Ｖal12、Ｔyr16、Ｐhe24、Ｐhe25、Ｔyr
26）を含む親油性レセプター結合部位が分子幾何学的に
安定化していることであると指摘している〔ネーチャー
（Nature）第２５９巻、３６９−３７３頁（１９７
６）〕。これら従来の研究から血糖降下作用を示すホル
モンレセプターに対して親和性を示すインスリンアナロ
グの情報は数多く報告されているが、脳毛細血管上のレ
セプターについてはなんら報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】生理活性ペプチドない
し蛋白質を血液脳関門を通過させ、脳内部に輸送させる
方法としては、該ペプチドないし蛋白質を脳全体に均一
に輸送しかつ副作用を最小限にすることが望まれてい
る。しかし、この要求を充分に満たしうる生理活性ペプ
チドないし蛋白質の輸送形態は確立されていない。
し蛋白質を血液脳関門を通過させ、脳内部に輸送させる
方法としては、該ペプチドないし蛋白質を脳全体に均一
に輸送しかつ副作用を最小限にすることが望まれてい
る。しかし、この要求を充分に満たしうる生理活性ペプ
チドないし蛋白質の輸送形態は確立されていない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる技
術背景のもとに、血液脳関門を透過可能であり、生理活
性ペプチドないし蛋白質を脳内へ輸送する上で副作用を
示さないキャリアーペプチドを見い出すべく鋭意努力し
た結果、脳毛細血管内皮細胞上のインスリンレセプター
に対して親和性を示し、インスリンに比較して血糖降下
作用が少ないインスリンフラグメントがレセプター介在
トランスサイトーシスによって血液脳関門を透過し、生
理活性ペプチドおよび蛋白質のキャリアーになるという
事実を発見した。この知見に基づき、血液脳関門におけ
るレセプターを介して行われるトランスサイトーシスの
生理的過程を利用し、そのキャリアーペプチドに結合さ
せたそれ自身では血液脳関門を通過しないペプチドない
し蛋白質を輸送させることができ、かつキャリアーペプ
チド自身の活性による有害な副作用を防止しうるキャリ
アーペプチドおよびその輸送形態についてさらに研究を
進め本発明を完成した。
術背景のもとに、血液脳関門を透過可能であり、生理活
性ペプチドないし蛋白質を脳内へ輸送する上で副作用を
示さないキャリアーペプチドを見い出すべく鋭意努力し
た結果、脳毛細血管内皮細胞上のインスリンレセプター
に対して親和性を示し、インスリンに比較して血糖降下
作用が少ないインスリンフラグメントがレセプター介在
トランスサイトーシスによって血液脳関門を透過し、生
理活性ペプチドおよび蛋白質のキャリアーになるという
事実を発見した。この知見に基づき、血液脳関門におけ
るレセプターを介して行われるトランスサイトーシスの
生理的過程を利用し、そのキャリアーペプチドに結合さ
せたそれ自身では血液脳関門を通過しないペプチドない
し蛋白質を輸送させることができ、かつキャリアーペプ
チド自身の活性による有害な副作用を防止しうるキャリ
アーペプチドおよびその輸送形態についてさらに研究を
進め本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、 １）それ自身血液脳関門を通過しない生理活性ペプチド
ないし蛋白質とそれ自身実質的に生理活性を示さず、血
液脳関門を通過可能なキャリアーペプチドとを結合させ
てなる血液脳関門通過可能なペプチド結合体である。よ
り詳しくは２）キャリアーペプチドが分子量約４，００
０ないし１００，０００のペプチドである上記１記載の
結合体、３）キャリアーペプチドがレセプター仲介型ト
ランスサイトーシスにより血液脳関門を通過しうる生体
内ペプチドの不活性フラグメントである上記１記載の結
合体、４）生体内ペプチドが、インスリン，トランスフ
ェリン，インスリン様成長因子ＩまたはIIである上記２
記載の結合体、５）キャリアーペプチドが、インスリン
のＡ鎖のＮ末端からアミノ酸残基１４ないし２１個のペ
プチド鎖（配列番号１）およびＢ鎖のＮ末端からアミノ
酸残基１６ないし２２個のペプチド鎖（配列番号２）か
らなるインスリンフラグメントである上記１記載の結合
体、６）インスリンフラグメントが
ないし蛋白質とそれ自身実質的に生理活性を示さず、血
液脳関門を通過可能なキャリアーペプチドとを結合させ
てなる血液脳関門通過可能なペプチド結合体である。よ
り詳しくは２）キャリアーペプチドが分子量約４，００
０ないし１００，０００のペプチドである上記１記載の
結合体、３）キャリアーペプチドがレセプター仲介型ト
ランスサイトーシスにより血液脳関門を通過しうる生体
内ペプチドの不活性フラグメントである上記１記載の結
合体、４）生体内ペプチドが、インスリン，トランスフ
ェリン，インスリン様成長因子ＩまたはIIである上記２
記載の結合体、５）キャリアーペプチドが、インスリン
のＡ鎖のＮ末端からアミノ酸残基１４ないし２１個のペ
プチド鎖（配列番号１）およびＢ鎖のＮ末端からアミノ
酸残基１６ないし２２個のペプチド鎖（配列番号２）か
らなるインスリンフラグメントである上記１記載の結合
体、６）インスリンフラグメントが
【化２】 で示されるフラグメントである上記５記載の結合体、
７）インスリンフラグメントが、（Ｂ２３−３０）オク
タペプチド欠失インスリンフラグメントである上記５記
載の結合体、８）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子
量が約２００ないし１２０，０００である上記１記載の
結合体、９）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が
約４００ないし８０，０００である上記１記載の結合
体、１０）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が約
５００ないし６０，０００である１記載の結合体、１
１）生理活性ペプチドないし蛋白質が神経栄養因子であ
る上記１記載の結合体、１２）生理活性ペプチドないし
蛋白質がニューロトロフィンファミリーに属するペプチ
ドないし蛋白質である上記１記載の結合体、１３）生理
活性ペプチドないし蛋白質が神経成長因子（ＮＧＦ）で
ある上記１記載の結合体、１４）生理活性ペプチドが神
経ペプチドである上記１記載の結合体、１５）ニューロ
トロフィンファミリーに属するペプチドないし蛋白質と
インスリンフラグメントを結合させてなる１記載の結合
体、１６）神経成長因子（ＮＧＦ）と（Ｂ２３−３０）
オクタペプチド欠失インスリンフラグメントを結合させ
てなる上記１記載の結合体である。
７）インスリンフラグメントが、（Ｂ２３−３０）オク
タペプチド欠失インスリンフラグメントである上記５記
載の結合体、８）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子
量が約２００ないし１２０，０００である上記１記載の
結合体、９）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が
約４００ないし８０，０００である上記１記載の結合
体、１０）生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が約
５００ないし６０，０００である１記載の結合体、１
１）生理活性ペプチドないし蛋白質が神経栄養因子であ
る上記１記載の結合体、１２）生理活性ペプチドないし
蛋白質がニューロトロフィンファミリーに属するペプチ
ドないし蛋白質である上記１記載の結合体、１３）生理
活性ペプチドないし蛋白質が神経成長因子（ＮＧＦ）で
ある上記１記載の結合体、１４）生理活性ペプチドが神
経ペプチドである上記１記載の結合体、１５）ニューロ
トロフィンファミリーに属するペプチドないし蛋白質と
インスリンフラグメントを結合させてなる１記載の結合
体、１６）神経成長因子（ＮＧＦ）と（Ｂ２３−３０）
オクタペプチド欠失インスリンフラグメントを結合させ
てなる上記１記載の結合体である。
【０００８】本発明の結合体は種々の生理活性ペプチド
または蛋白質を、脳に輸送するために有益である。特に
一般に、血液脳関門を通してほとんど輸送されない高分
子量の蛋白質性の薬物の輸送に最適である。これらペプ
チドないし蛋白質性の薬物の例としては、それ自身血液
脳関門を通過できない脳疾患治療薬物として有用な種々
の神経栄養因子および神経ペプチドが挙げられる。神経
栄養因子としては、ニューロトロフィンファミリー、例
えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、brain-derived neurot
rophine factor（ＢＤＮＦ）、ニュロートロフィン３
（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、ニ
ューロトロフィン５（ＮＴ−５）および ciliaryneurot
rophic factor（ＣＮＴＦ）、アクチビン、あるいは中
枢系でも働く塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、
酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮細胞増殖因
子（ＥＧＦ）等の成長因子あるいは、神経系に直接ある
いは間接的に作用するか、グリア細胞の増殖、分化、活
性化に関わり、神経栄養因子作用を有するサイトカイン
類、例えば、インターフェロンα、インターフェロン
β、インターフェロンγ、インターロイキン１（ＩＬ−
１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイ
キン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−
４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイ
キン６（ＩＬ−６）、ＴＮＦ、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激
因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）更
に、脳で作用するホルモンもしくは神経伝達物質、例え
ば、ソマトスタチン、オキシトシン、バソプレシン、ガ
ラニン、ＶＩＰ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、
コレストキニン（ＣＣＫ）、サブスタンス−Ｐ、ボンベ
ジン、モチリン、グリセンチン、グルカゴン、グルカゴ
ン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ペプチドＹＹ（ＰＹ
Ｙ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ポリペプチド（Ｐ
Ｐ）、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、エンドル
フィン、エンケファリン、ニューロテンシン、ニューロ
メジンＫ、ニューロメジンＬ、カルシトニン関連ペプチ
ド（ＣＧＲＰ）、エンドセリン、心旁性ナトリウム利尿
ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂ
ＮＰ）、Ｃタイプナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、
下垂体性アデニレートサイクレース刺激ペプチド（ＰＡ
ＣＡＰ）等の神経ペプチドおよびその活性誘導体があげ
られる。また、酵素、例えば、ホース・ラディシュ・パ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）なども本発明の生理活性ペプ
チドないし蛋白質として用いることができる。
または蛋白質を、脳に輸送するために有益である。特に
一般に、血液脳関門を通してほとんど輸送されない高分
子量の蛋白質性の薬物の輸送に最適である。これらペプ
チドないし蛋白質性の薬物の例としては、それ自身血液
脳関門を通過できない脳疾患治療薬物として有用な種々
の神経栄養因子および神経ペプチドが挙げられる。神経
栄養因子としては、ニューロトロフィンファミリー、例
えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、brain-derived neurot
rophine factor（ＢＤＮＦ）、ニュロートロフィン３
（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、ニ
ューロトロフィン５（ＮＴ−５）および ciliaryneurot
rophic factor（ＣＮＴＦ）、アクチビン、あるいは中
枢系でも働く塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、
酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮細胞増殖因
子（ＥＧＦ）等の成長因子あるいは、神経系に直接ある
いは間接的に作用するか、グリア細胞の増殖、分化、活
性化に関わり、神経栄養因子作用を有するサイトカイン
類、例えば、インターフェロンα、インターフェロン
β、インターフェロンγ、インターロイキン１（ＩＬ−
１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイ
キン３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−
４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイ
キン６（ＩＬ−６）、ＴＮＦ、顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激
因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子
（Ｍ−ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）更
に、脳で作用するホルモンもしくは神経伝達物質、例え
ば、ソマトスタチン、オキシトシン、バソプレシン、ガ
ラニン、ＶＩＰ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、
コレストキニン（ＣＣＫ）、サブスタンス−Ｐ、ボンベ
ジン、モチリン、グリセンチン、グルカゴン、グルカゴ
ン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ペプチドＹＹ（ＰＹ
Ｙ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ポリペプチド（Ｐ
Ｐ）、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、エンドル
フィン、エンケファリン、ニューロテンシン、ニューロ
メジンＫ、ニューロメジンＬ、カルシトニン関連ペプチ
ド（ＣＧＲＰ）、エンドセリン、心旁性ナトリウム利尿
ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂ
ＮＰ）、Ｃタイプナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、
下垂体性アデニレートサイクレース刺激ペプチド（ＰＡ
ＣＡＰ）等の神経ペプチドおよびその活性誘導体があげ
られる。また、酵素、例えば、ホース・ラディシュ・パ
ーオキシダーゼ（ＨＲＰ）なども本発明の生理活性ペプ
チドないし蛋白質として用いることができる。
【０００９】上記のとおり本発明において、輸送を目的
とされる生理活性ペプチドないし蛋白質は一般に、分子
量が２００ダルトン以上のポリペプチドであり、親水性
のためそれ自身では血液脳関門を通過できないものであ
れば、動植物由来の天然型のものでもよく、また、公知
のペプチド合成法あるいは遺伝子工学的手法により得ら
れたものであってもよい。また、上述の活性誘導体とし
ては、光学異性体，活性フラグメントおよびムテインな
どが挙げられる。ここで、ムテインとしては、アミノ酸
の付加、構成アミノ酸の欠損、あるいは他のアミノ酸へ
の置換などによって、元の蛋白質のアミノ酸配列を変異
させたもので、しかも元の蛋白質の生理活性を有してい
るものが挙げられる。該ムテインは、付加、欠損および
置換の変異が２つ以上組み合わさったものでもよい。ア
ミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸が付
加しているムテインが挙げられるが、該ムテインにおけ
る付加アミノ酸には、ペプチドを発現する際に用いられ
る開始コドンに起因するメチオニンやシグナルペプチド
は含まれないものとする。付加アミノ酸の数としては、
少なくとも１個であるが、本来の生理活性を失わない限
り何個でもよい。構成アミノ酸の欠損としては、少なく
とも１個の構成アミノ酸が欠失しているムテインが挙げ
られ、欠損している構成アミノ酸の数としては、それ自
身が本来有する生理活性を失わない限り何個でもよい。
とされる生理活性ペプチドないし蛋白質は一般に、分子
量が２００ダルトン以上のポリペプチドであり、親水性
のためそれ自身では血液脳関門を通過できないものであ
れば、動植物由来の天然型のものでもよく、また、公知
のペプチド合成法あるいは遺伝子工学的手法により得ら
れたものであってもよい。また、上述の活性誘導体とし
ては、光学異性体，活性フラグメントおよびムテインな
どが挙げられる。ここで、ムテインとしては、アミノ酸
の付加、構成アミノ酸の欠損、あるいは他のアミノ酸へ
の置換などによって、元の蛋白質のアミノ酸配列を変異
させたもので、しかも元の蛋白質の生理活性を有してい
るものが挙げられる。該ムテインは、付加、欠損および
置換の変異が２つ以上組み合わさったものでもよい。ア
ミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸が付
加しているムテインが挙げられるが、該ムテインにおけ
る付加アミノ酸には、ペプチドを発現する際に用いられ
る開始コドンに起因するメチオニンやシグナルペプチド
は含まれないものとする。付加アミノ酸の数としては、
少なくとも１個であるが、本来の生理活性を失わない限
り何個でもよい。構成アミノ酸の欠損としては、少なく
とも１個の構成アミノ酸が欠失しているムテインが挙げ
られ、欠損している構成アミノ酸の数としては、それ自
身が本来有する生理活性を失わない限り何個でもよい。
【００１０】他のアミノ酸への置換としては、少なくと
も１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
ムテインが挙げられ、置換される前の構成アミノ酸の数
としては、少なくとも１個であるがその本来の生理活性
を失わない限り何個でもよい。本明細書において、「血
液脳関門を通過する」とは、血液脳関門に対して通常の
投与許容量の範囲での生理活性ペプチドないし蛋白質の
投与において、該ペプチドないし蛋白質の本来の生理活
性により投与対象に対して生理活性、たとえば脳疾患治
療効果を生じさせうる程度の透過性を示すことをいう。
従って、血液脳関門に対する極めて低い透過性を示す生
理活性ペプチドないし蛋白質およびその誘導体も本発明
でいう血液脳関門を通過しない生理活性ペプチドないし
蛋白質の範疇に含まれる。本発明の結合体により輸送で
きる脳疾患治療薬物等の生理活性ペプチドないし蛋白質
の分子量は、その分子の立体形状、大きさ、酵素に対す
る安定性、水溶性などによって多少異なり、低分子ペプ
チドについては特に制限はないが、一般には約２００ダ
ルトン以上で最大約１２０，０００ダルトンの蛋白質が
挙げられる。なかでも本発明結合体の輸送能力をより効
果的に発揮できるのは分子量約４００〜８０,０００ダ
ルトンの薬物で、さらに好ましくは約５００〜６０,０
００ダルトンのものが挙げられる。
も１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
ムテインが挙げられ、置換される前の構成アミノ酸の数
としては、少なくとも１個であるがその本来の生理活性
を失わない限り何個でもよい。本明細書において、「血
液脳関門を通過する」とは、血液脳関門に対して通常の
投与許容量の範囲での生理活性ペプチドないし蛋白質の
投与において、該ペプチドないし蛋白質の本来の生理活
性により投与対象に対して生理活性、たとえば脳疾患治
療効果を生じさせうる程度の透過性を示すことをいう。
従って、血液脳関門に対する極めて低い透過性を示す生
理活性ペプチドないし蛋白質およびその誘導体も本発明
でいう血液脳関門を通過しない生理活性ペプチドないし
蛋白質の範疇に含まれる。本発明の結合体により輸送で
きる脳疾患治療薬物等の生理活性ペプチドないし蛋白質
の分子量は、その分子の立体形状、大きさ、酵素に対す
る安定性、水溶性などによって多少異なり、低分子ペプ
チドについては特に制限はないが、一般には約２００ダ
ルトン以上で最大約１２０，０００ダルトンの蛋白質が
挙げられる。なかでも本発明結合体の輸送能力をより効
果的に発揮できるのは分子量約４００〜８０,０００ダ
ルトンの薬物で、さらに好ましくは約５００〜６０,０
００ダルトンのものが挙げられる。
【００１１】本発明のキャリアーペプチドとしては、そ
れ自身実質的に生理活性を有さずかつ好ましくは、脳毛
細血管内皮細胞上に親和性を有するペプチドが挙げられ
る。特に好ましくは該細胞上にレセプターを有するペプ
チドであるが、それ自身血液脳関門を通過しない生理活
性ペプチドないし蛋白質と結合させて形成される結合体
が血液脳関門を通過するものである血液脳関門通過性の
ペプチドであれば、いずれを用いてもよい。このような
キャリアーペプチドとしては、通常分子量約４，０００
ないし１００，０００のペプチドが用いられる。また、
ここでいう「それ自身実質的に生理活性を有さないペプ
チド」とは、通常の投与許容量で生体中で何ら生理活性
現象を惹起しないかもしくは、惹起される生理活性現象
が通常の生理的変動の範囲内であるペプチドを示す。従
って、本発明のキャリアーペプチドは膜透過性、レセプ
ター親和性等の生理活性に直接関与しない活性を有して
いてもよく、とりわけ本発明においては、脳毛細血管内
皮細胞上でのレセプター仲介トランスサイトーシス活性
を有していることが好ましい。また、抗原性，安全性等
の面から哺乳動物の生体内ペプチドであることが好まし
く、とりわけ投与対象動物の生体内ペプチドであること
が好ましく、特に、血液脳関門を通過しうる生体内ペプ
チドの不活性フラグメントもしくは、該関門通過性を保
持しつつ本来の生理活性を減弱ないし消失させた誘導体
が好ましく用いられる。本発明のキャリアーペプチドと
しては例えば、インスリン、トランスフェリン、インス
リン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因
子II（ＩＧＦ−II）などの不活性ペプチドフラグメント
が挙げられ、またこれらのペプチドのアミノ酸配列の一
部を組み合わせて得られる脳毛細血管内皮細胞上に親和
性のあるペプチドなどが挙げられる。これらのペプチド
フラグメントは、様々な方法で入手でき、例えばインス
リンなどをトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パ
パイン、Ｖ8プロテアーゼ等のプロテアーゼを用いて分
解することによって得ることができる。
れ自身実質的に生理活性を有さずかつ好ましくは、脳毛
細血管内皮細胞上に親和性を有するペプチドが挙げられ
る。特に好ましくは該細胞上にレセプターを有するペプ
チドであるが、それ自身血液脳関門を通過しない生理活
性ペプチドないし蛋白質と結合させて形成される結合体
が血液脳関門を通過するものである血液脳関門通過性の
ペプチドであれば、いずれを用いてもよい。このような
キャリアーペプチドとしては、通常分子量約４，０００
ないし１００，０００のペプチドが用いられる。また、
ここでいう「それ自身実質的に生理活性を有さないペプ
チド」とは、通常の投与許容量で生体中で何ら生理活性
現象を惹起しないかもしくは、惹起される生理活性現象
が通常の生理的変動の範囲内であるペプチドを示す。従
って、本発明のキャリアーペプチドは膜透過性、レセプ
ター親和性等の生理活性に直接関与しない活性を有して
いてもよく、とりわけ本発明においては、脳毛細血管内
皮細胞上でのレセプター仲介トランスサイトーシス活性
を有していることが好ましい。また、抗原性，安全性等
の面から哺乳動物の生体内ペプチドであることが好まし
く、とりわけ投与対象動物の生体内ペプチドであること
が好ましく、特に、血液脳関門を通過しうる生体内ペプ
チドの不活性フラグメントもしくは、該関門通過性を保
持しつつ本来の生理活性を減弱ないし消失させた誘導体
が好ましく用いられる。本発明のキャリアーペプチドと
しては例えば、インスリン、トランスフェリン、インス
リン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因
子II（ＩＧＦ−II）などの不活性ペプチドフラグメント
が挙げられ、またこれらのペプチドのアミノ酸配列の一
部を組み合わせて得られる脳毛細血管内皮細胞上に親和
性のあるペプチドなどが挙げられる。これらのペプチド
フラグメントは、様々な方法で入手でき、例えばインス
リンなどをトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パ
パイン、Ｖ8プロテアーゼ等のプロテアーゼを用いて分
解することによって得ることができる。
【００１２】特に、キャリアーペプチドとしてインスリ
ンフラグメントを用いる場合、好ましいインスリンフラ
グメントの範囲としては、Ａ鎖のＮ末端からアミノ酸残
基１４ないし２１個のペプチド鎖（配列番号１）及びＢ
鎖のＮ末端からアミノ酸残基１６ないし２２個のペプチ
ド鎖（配列番号２）からなるフラグメントが挙げられ
る。また、これらのフラグメントにおいて本来の脳毛細
血管内皮細胞に対する親和性を保持させるために、その
立体構造に関与するジスルフィド架橋、例えばＡ鎖のア
ミノ酸残基番号６番と１１番の間の分子内架橋やＡ鎖と
Ｂ鎖間の架橋が天然型全分子蛋白と同じ位置に保持され
ていることが好ましい。なかでも、後述の実施例２で得
られた（Ｂ２３−３０）オクタペプチド欠失インスリン
フラグメント〔図６〕が脳毛細血管内皮細胞上のレセプ
ターに対してインスリンと同程度の親和性を持つこと
は、従来のインスリンアナログのホルモンレセプターに
対する親和性の知見からは予想外であって、本発明にお
ける好ましいキャリアーペプチドの例としてあげること
ができる。これらのキャリアーペプチドは公知のペプチ
ド合成技術でも得ることができる。たとえば、その一例
としてはポリスチレン樹脂を担体とする固相合成法が挙
げられる。この方法はカルボキシ末端のアミノ酸残基を
樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ基の保護基
の除去、保護アミノ酸を順次繰り返して、アミノ末端に
向けてペプチドを延長させ目的のアミノ酸配列を有する
保護ペプチド樹脂を得る事をその原理としている。目的
とするキャリアーペプチドが２本鎖以上のペプチド鎖か
らなるペプチドである場合、例えばインスリンフラグメ
ント（２本鎖）では、予め２本鎖それぞれを別々に合成
しておき、得られた２本のペプチド鎖を弱アルカリ性下
で反応させることにより、簡単にジスルフィド結合を形
成させ、目的とするキャリアーペプチド粗精製物を得る
ことができる。得られたキャリアーペプチド粗精製物
は、ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製
することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロ
マト、疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロマトグラ
フィーや高速液体クロマトグラフィーなどの精製法が挙
げられる。
ンフラグメントを用いる場合、好ましいインスリンフラ
グメントの範囲としては、Ａ鎖のＮ末端からアミノ酸残
基１４ないし２１個のペプチド鎖（配列番号１）及びＢ
鎖のＮ末端からアミノ酸残基１６ないし２２個のペプチ
ド鎖（配列番号２）からなるフラグメントが挙げられ
る。また、これらのフラグメントにおいて本来の脳毛細
血管内皮細胞に対する親和性を保持させるために、その
立体構造に関与するジスルフィド架橋、例えばＡ鎖のア
ミノ酸残基番号６番と１１番の間の分子内架橋やＡ鎖と
Ｂ鎖間の架橋が天然型全分子蛋白と同じ位置に保持され
ていることが好ましい。なかでも、後述の実施例２で得
られた（Ｂ２３−３０）オクタペプチド欠失インスリン
フラグメント〔図６〕が脳毛細血管内皮細胞上のレセプ
ターに対してインスリンと同程度の親和性を持つこと
は、従来のインスリンアナログのホルモンレセプターに
対する親和性の知見からは予想外であって、本発明にお
ける好ましいキャリアーペプチドの例としてあげること
ができる。これらのキャリアーペプチドは公知のペプチ
ド合成技術でも得ることができる。たとえば、その一例
としてはポリスチレン樹脂を担体とする固相合成法が挙
げられる。この方法はカルボキシ末端のアミノ酸残基を
樹脂担体に共有結合させておき、α−アミノ基の保護基
の除去、保護アミノ酸を順次繰り返して、アミノ末端に
向けてペプチドを延長させ目的のアミノ酸配列を有する
保護ペプチド樹脂を得る事をその原理としている。目的
とするキャリアーペプチドが２本鎖以上のペプチド鎖か
らなるペプチドである場合、例えばインスリンフラグメ
ント（２本鎖）では、予め２本鎖それぞれを別々に合成
しておき、得られた２本のペプチド鎖を弱アルカリ性下
で反応させることにより、簡単にジスルフィド結合を形
成させ、目的とするキャリアーペプチド粗精製物を得る
ことができる。得られたキャリアーペプチド粗精製物
は、ペプチドまたは蛋白質を精製する公知の手段で精製
することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロ
マト、疎水クロマトグラフィー、分配吸着クロマトグラ
フィーや高速液体クロマトグラフィーなどの精製法が挙
げられる。
【００１３】また、細菌、真菌などの微生物、ハムスタ
ー卵細胞などの生物細胞を宿主として用いた遺伝子工学
的方法によって得ることもできる。本発明の結合体は、
キャリアーペプチドに生理活性ペプチドないし蛋白質を
結合させることにより得られるが、その結合方法として
は化学的あるいは遺伝子工学的な公知の方法が用いられ
る。具体的には化学結合の場合、ペプチド結合を形成さ
せる１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（ＥＤＡＣ、ＷＳＣ）等の２つのペプチ
ド分子（すなわち、生理活性ペプチドないし蛋白質とキ
ャリアーペプチド）のいずれとも反応しうる架橋剤が用
いられる。中でも２つのペプチドの間にジスルフィド結
合を形成させるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、シスタミン
のような試薬で処理することを特徴としたペプチドのチ
オレート化を応用した方法が好ましい。その他の公知の
結合剤についても、２つのペプチド分子を、変性により
キャリアーペプチドの血液脳関門通過性及び生理活性ペ
プチドないし蛋白質の生理活性のいずれも減退させるこ
となく、結合させうるものであれば、どのような結合剤
を使用してよい。より具体的には、官能基に対する反応
性とスペーサーの長さから以下のような架橋剤が選択さ
れる。グルタルアルデヒド、４,４’−ジイソチオシアノスチルベン-
2,２’−ジスルフォン酸（ＤＩＤＳ）、Ｎ−（Ｅ−マレ
イイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ
Ｓ）、Ｎ−（ガンマー−マレイイミドブチルオキシ）ス
クシンイミド（ＧＭＢＳ）、ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、光活性化試薬として
４,４’−ジチオビスフェニルアジド（ＤＴＢＰＡ）な
どがある。
ー卵細胞などの生物細胞を宿主として用いた遺伝子工学
的方法によって得ることもできる。本発明の結合体は、
キャリアーペプチドに生理活性ペプチドないし蛋白質を
結合させることにより得られるが、その結合方法として
は化学的あるいは遺伝子工学的な公知の方法が用いられ
る。具体的には化学結合の場合、ペプチド結合を形成さ
せる１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（ＥＤＡＣ、ＷＳＣ）等の２つのペプチ
ド分子（すなわち、生理活性ペプチドないし蛋白質とキ
ャリアーペプチド）のいずれとも反応しうる架橋剤が用
いられる。中でも２つのペプチドの間にジスルフィド結
合を形成させるＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、シスタミン
のような試薬で処理することを特徴としたペプチドのチ
オレート化を応用した方法が好ましい。その他の公知の
結合剤についても、２つのペプチド分子を、変性により
キャリアーペプチドの血液脳関門通過性及び生理活性ペ
プチドないし蛋白質の生理活性のいずれも減退させるこ
となく、結合させうるものであれば、どのような結合剤
を使用してよい。より具体的には、官能基に対する反応
性とスペーサーの長さから以下のような架橋剤が選択さ
れる。グルタルアルデヒド、４,４’−ジイソチオシアノスチルベン-
2,２’−ジスルフォン酸（ＤＩＤＳ）、Ｎ−（Ｅ−マレ
イイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣ
Ｓ）、Ｎ−（ガンマー−マレイイミドブチルオキシ）ス
クシンイミド（ＧＭＢＳ）、ジチオビス（スクシンイミ
ジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、光活性化試薬として
４,４’−ジチオビスフェニルアジド（ＤＴＢＰＡ）な
どがある。
【００１４】また、これらの結合物は通常の液相法ある
いは固相法によりアミド結合あるいは還元剤を用いたジ
スルフィド結合により合成することもできる。さらに、
細菌、真菌などの微生物、ハムスター卵細胞などの生物
細胞を用い公知の遺伝子工学的手法によってこれらの生
理活性ペプチド結合物を直接発現させてもよい。すなわ
ち、例えばインスリンをコードする公知のｃＤＮＡから
本発明のキャリアーペプチドに対応するｃＤＮＡを取得
し、これに輸送を目的とされる生理活性ペプチドないし
は蛋白質をコードするｃＤＮＡを直接結合したｃＤＮＡ
を取得し、これを含有するベクターで適当な宿主細胞を
形質転換することで達せられる。本発明結合物におい
て、これを構成する生理活性ペプチドないし蛋白質とキ
ャリアーペプチドそれぞれの結合比率は結合物とした場
合のキャリアーの送達能力、薬物の活性および活性物質
への復元性などによって選択することができる。このよ
うな、キャリアーと薬物である生理活性ペプチドないし
蛋白質との結合モル比率としては、４：１〜１：５、よ
り好ましくは２：１〜１：３がよい。
いは固相法によりアミド結合あるいは還元剤を用いたジ
スルフィド結合により合成することもできる。さらに、
細菌、真菌などの微生物、ハムスター卵細胞などの生物
細胞を用い公知の遺伝子工学的手法によってこれらの生
理活性ペプチド結合物を直接発現させてもよい。すなわ
ち、例えばインスリンをコードする公知のｃＤＮＡから
本発明のキャリアーペプチドに対応するｃＤＮＡを取得
し、これに輸送を目的とされる生理活性ペプチドないし
は蛋白質をコードするｃＤＮＡを直接結合したｃＤＮＡ
を取得し、これを含有するベクターで適当な宿主細胞を
形質転換することで達せられる。本発明結合物におい
て、これを構成する生理活性ペプチドないし蛋白質とキ
ャリアーペプチドそれぞれの結合比率は結合物とした場
合のキャリアーの送達能力、薬物の活性および活性物質
への復元性などによって選択することができる。このよ
うな、キャリアーと薬物である生理活性ペプチドないし
蛋白質との結合モル比率としては、４：１〜１：５、よ
り好ましくは２：１〜１：３がよい。
【００１５】本発明において、薬物とする生理活性ペプ
チドないし蛋白質とキャリアーペプチドとの比率は、用
いる両ペプチドの組み合わせ、すなわち各ペプチド鎖中
の蛋白質の結合反応にあづかる官能基例えば、Ｎ末端、
Ｃ末端、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチ
ジンなど）酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン
酸など）およびシステイン残基などの種類および数の選
択に応じて変更可能であり、また、試薬の種類および濃
度、反応時間など反応条件をコントロールすることによ
って制御できる。このようにして得られた本発明の結合
体は、脳腫瘍、脳血管障害、アルツハイマー等各種脳疾
患等の予防、治療を目的として温血動物、特に哺乳類
（ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒトなど）に、単一ないし
数種を組み合わせで調剤し投与することができ、また薬
理学的に許容しうる他の薬物をさらに配合して安全に投
与することができる。本発明の結合物の投与方法として
は非経口投与が好ましく、例えば血管内、筋肉内、皮下
などに通常の注射剤として投与することができ、とりわ
け静脈内あるいは動脈内に投与することが好ましい。本
発明の結合物の注射剤の調製においては通常注射剤に用
いられる防腐剤、安定化剤、等張化剤などを添加しても
よい。たとえば、水溶液、油溶液および懸濁性の注射剤
とする場合は、注射用蒸留水、水性溶剤（生理的食塩
水、リンゲル液）、油性溶剤（例、ゴマ油、オリーブ
油）などの溶剤、または所望により溶解補助剤（例、Tw
een-80, アルギニン）、緩衝剤（例、リン酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、等張化剤
（例、ブドウ糖、グリセリン、ソルビトール）、安定化
剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ル）、保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノー
ル）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロ
カイン）などの添加剤を用いて、常套手段により製造さ
れる。
チドないし蛋白質とキャリアーペプチドとの比率は、用
いる両ペプチドの組み合わせ、すなわち各ペプチド鎖中
の蛋白質の結合反応にあづかる官能基例えば、Ｎ末端、
Ｃ末端、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチ
ジンなど）酸性アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン
酸など）およびシステイン残基などの種類および数の選
択に応じて変更可能であり、また、試薬の種類および濃
度、反応時間など反応条件をコントロールすることによ
って制御できる。このようにして得られた本発明の結合
体は、脳腫瘍、脳血管障害、アルツハイマー等各種脳疾
患等の予防、治療を目的として温血動物、特に哺乳類
（ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒトなど）に、単一ないし
数種を組み合わせで調剤し投与することができ、また薬
理学的に許容しうる他の薬物をさらに配合して安全に投
与することができる。本発明の結合物の投与方法として
は非経口投与が好ましく、例えば血管内、筋肉内、皮下
などに通常の注射剤として投与することができ、とりわ
け静脈内あるいは動脈内に投与することが好ましい。本
発明の結合物の注射剤の調製においては通常注射剤に用
いられる防腐剤、安定化剤、等張化剤などを添加しても
よい。たとえば、水溶液、油溶液および懸濁性の注射剤
とする場合は、注射用蒸留水、水性溶剤（生理的食塩
水、リンゲル液）、油性溶剤（例、ゴマ油、オリーブ
油）などの溶剤、または所望により溶解補助剤（例、Tw
een-80, アルギニン）、緩衝剤（例、リン酸ナトリウ
ム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、等張化剤
（例、ブドウ糖、グリセリン、ソルビトール）、安定化
剤（例、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコー
ル）、保存剤（例、ベンジルアルコール、フェノー
ル）、無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロ
カイン）などの添加剤を用いて、常套手段により製造さ
れる。
【００１６】また、たとえば用時溶解あるいは分散型の
固形状注射用製剤とするには溶解液および分散媒（例、
蒸留水、生理的食塩水、ブドウ糖液）、賦形剤（例、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、マンニトール、
アルギン酸ナトリウム）、保存剤（例、ベンジルアルコ
ール、塩化ベンザルコニウム、フェノール）、無痛化剤
（例、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイ
ン）などを混合し、常套手段により固形状注射用製剤に
製造することができる。また、注射剤以外の製剤として
は鼻、口腔、直腸、膣、子宮などの粘膜投与製剤、ある
いはマイクロカプセル型徐放性製剤、埋め込み剤などの
放出制御製剤などが挙げられる。これらの製剤化にあた
っては、ブドウ糖などの単糖類や、アミノ酸、各種塩
類、ヒト血清アルブミンなどを添加してもよく、その他
上記の通常の等張化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、防腐剤
およびそれ自身既知の吸収促進剤（例、クエン酸、α−
シクロデキストリン、マンデル酸、サルチル酸ナトリウ
ム、胆汁酸、ポオキシエチレン（９）ラウリルエーテ
ル、タウロジヒドロフシジール酸）などを加えて、安定
で有効な結合体の製剤を調製することができる。本発明
の結合物は、例えば神経栄養因子であるヒトＮＧＦ、Ｂ
ＤＮＦ、ＮＴ、ＦＧＦなどの投与目的ではアルツハイマ
ー病の進行の抑制あるいは治療に比較的低用量で充分有
用な効果が期待できる。また、脳で作用する神経ペプチ
ドである種々のエンケファリン、ソマトスタチン、サブ
スタンス−Ｐ、ＶＩＰなどは、本発明により効率よく脳
に送達できることによって、同様に用量の低減と末梢で
の副作用の低減が期待できる。本発明結合物の人におけ
る投与量は、用いる生理活性ペプチドないし蛋白質、投
与対象、症状、投与形態等によって異なるが、必要とす
る薬理効果を発現する量であればよく、通常１０μg〜
２g、より好ましくは２０μg〜１gを１日１〜３回に分
けて非経口的に投与される。
固形状注射用製剤とするには溶解液および分散媒（例、
蒸留水、生理的食塩水、ブドウ糖液）、賦形剤（例、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、マンニトール、
アルギン酸ナトリウム）、保存剤（例、ベンジルアルコ
ール、塩化ベンザルコニウム、フェノール）、無痛化剤
（例、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイ
ン）などを混合し、常套手段により固形状注射用製剤に
製造することができる。また、注射剤以外の製剤として
は鼻、口腔、直腸、膣、子宮などの粘膜投与製剤、ある
いはマイクロカプセル型徐放性製剤、埋め込み剤などの
放出制御製剤などが挙げられる。これらの製剤化にあた
っては、ブドウ糖などの単糖類や、アミノ酸、各種塩
類、ヒト血清アルブミンなどを添加してもよく、その他
上記の通常の等張化剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、防腐剤
およびそれ自身既知の吸収促進剤（例、クエン酸、α−
シクロデキストリン、マンデル酸、サルチル酸ナトリウ
ム、胆汁酸、ポオキシエチレン（９）ラウリルエーテ
ル、タウロジヒドロフシジール酸）などを加えて、安定
で有効な結合体の製剤を調製することができる。本発明
の結合物は、例えば神経栄養因子であるヒトＮＧＦ、Ｂ
ＤＮＦ、ＮＴ、ＦＧＦなどの投与目的ではアルツハイマ
ー病の進行の抑制あるいは治療に比較的低用量で充分有
用な効果が期待できる。また、脳で作用する神経ペプチ
ドである種々のエンケファリン、ソマトスタチン、サブ
スタンス−Ｐ、ＶＩＰなどは、本発明により効率よく脳
に送達できることによって、同様に用量の低減と末梢で
の副作用の低減が期待できる。本発明結合物の人におけ
る投与量は、用いる生理活性ペプチドないし蛋白質、投
与対象、症状、投与形態等によって異なるが、必要とす
る薬理効果を発現する量であればよく、通常１０μg〜
２g、より好ましくは２０μg〜１gを１日１〜３回に分
けて非経口的に投与される。
【００１７】また、本発明の結合体は、脳毛細血管内皮
細胞上のレセプターのみならず肝臓，腎臓など種々の臓
器または癌細胞上に存在するインスリン，トランスフェ
リン，インスリン様成長因子ＩまたはIIなどレセプター
を検出するのに用いることができる。例えば、酵素（ホ
ース・ラディッシュ・パーオキシダーゼなど）などのマ
ーカーとなる生理活性ペプチドないし蛋白質と、キャリ
ヤーペプチドとの結合体などが、この目的に用いること
ができ、さらに生理活性ペプチドに対する抗体を用いた
免疫測定と組み合わせて検出に用いることもできる。こ
のように、本発明の結合体、例えば、インスリンの不活
性フラグメントとマーカーペプチドとの結合体は、イン
スリンレセプターの不全を解明するうえで有用で、たと
えば、肝細胞，リンパ球，脂肪細胞，星状膠細胞，神経
細胞，グリア細胞などの各種の細胞に対するインスリン
の作用機作を解明するのに有用に用いうる。また、例え
ば、先天性あるいは後天性肥満症において、それがイン
スリンレセプター欠損に起因するか否かあるいは肝癌や
肺癌などの癌細胞においてインスリンに反応性であるか
否かを検出するのに用いることができる。
細胞上のレセプターのみならず肝臓，腎臓など種々の臓
器または癌細胞上に存在するインスリン，トランスフェ
リン，インスリン様成長因子ＩまたはIIなどレセプター
を検出するのに用いることができる。例えば、酵素（ホ
ース・ラディッシュ・パーオキシダーゼなど）などのマ
ーカーとなる生理活性ペプチドないし蛋白質と、キャリ
ヤーペプチドとの結合体などが、この目的に用いること
ができ、さらに生理活性ペプチドに対する抗体を用いた
免疫測定と組み合わせて検出に用いることもできる。こ
のように、本発明の結合体、例えば、インスリンの不活
性フラグメントとマーカーペプチドとの結合体は、イン
スリンレセプターの不全を解明するうえで有用で、たと
えば、肝細胞，リンパ球，脂肪細胞，星状膠細胞，神経
細胞，グリア細胞などの各種の細胞に対するインスリン
の作用機作を解明するのに有用に用いうる。また、例え
ば、先天性あるいは後天性肥満症において、それがイン
スリンレセプター欠損に起因するか否かあるいは肝癌や
肺癌などの癌細胞においてインスリンに反応性であるか
否かを検出するのに用いることができる。
【００１８】なお、本願明細書や図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示
すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｇly ：グリシン（Ｇ） Ａla ：アラニン（Ａ） Ｖal ：バリン（Ｖ） Ｌeu ：ロイシン（Ｌ） Ｉle ：イソロイシン（Ｉ） Ｓer ：セリン（Ｓ） Ｔhr ：スレオニン（Ｔ） Ｃys ：システイン（Ｃ） 1/2Ｃys ：ハーフシスチン Ｍet ：メチオニン（Ｍ） Ｇlu ：グルタミン酸（Ｅ） Ａsp ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌys ：リジン（Ｋ） Ａrg ：アルギニン（Ｒ） Ｈis ：ヒスチジン（Ｈ） Ｐhe ：フェニールアラニン（Ｆ） Ｔyr ：チロシン（Ｙ） Ｔrp ：トリプトファン（Ｗ） Ｐro ：プロリン（Ｐ） Ａsn ：アスパラギン（Ｎ） Ｇln ：グルタミン（Ｑ）
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異
性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示
すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン Ｇly ：グリシン（Ｇ） Ａla ：アラニン（Ａ） Ｖal ：バリン（Ｖ） Ｌeu ：ロイシン（Ｌ） Ｉle ：イソロイシン（Ｉ） Ｓer ：セリン（Ｓ） Ｔhr ：スレオニン（Ｔ） Ｃys ：システイン（Ｃ） 1/2Ｃys ：ハーフシスチン Ｍet ：メチオニン（Ｍ） Ｇlu ：グルタミン酸（Ｅ） Ａsp ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌys ：リジン（Ｋ） Ａrg ：アルギニン（Ｒ） Ｈis ：ヒスチジン（Ｈ） Ｐhe ：フェニールアラニン（Ｆ） Ｔyr ：チロシン（Ｙ） Ｔrp ：トリプトファン（Ｗ） Ｐro ：プロリン（Ｐ） Ａsn ：アスパラギン（Ｎ） Ｇln ：グルタミン（Ｑ）
【００１９】
【実施例】以下に製剤例、参考例および実施例を示し、
本発明をさらに詳しく説明するが、これらは単なる例示
であって本発明を何ら限定するものではない。 参考例１：血液脳関門透過性試験125 Ｉ標識検体−キャリアーペプチド結合体を生理食塩
水で溶解後、ＩＣＲマウスに投与して、一定時間後の
125Ｉ標識検体の取り込みを測定する。各時間における
125Ｉ標識検体の脳への取り込みを同様に調製した125Ｉ
標識検体を単独投与した場合と比較することによりキャ
リアーペプチドの in vivo における輸送能力を評価す
る。
本発明をさらに詳しく説明するが、これらは単なる例示
であって本発明を何ら限定するものではない。 参考例１：血液脳関門透過性試験125 Ｉ標識検体−キャリアーペプチド結合体を生理食塩
水で溶解後、ＩＣＲマウスに投与して、一定時間後の
125Ｉ標識検体の取り込みを測定する。各時間における
125Ｉ標識検体の脳への取り込みを同様に調製した125Ｉ
標識検体を単独投与した場合と比較することによりキャ
リアーペプチドの in vivo における輸送能力を評価す
る。
【００２０】実施例１：Ｆ００１の調製法及び同定 １０mＭ塩酸２.５mlに溶解したブタ−インスリン（清水
製薬）１００mgを０.１Ｍリン酸緩衝液（pH７.０）５０
mlで希釈し、これにトリプシン（シグマ社）５mgを加
え、室温で３日間放置し、全量を凍結乾燥した。得られ
た分解混合物を１Ｎ酢酸に溶解し、０.４５μm のフィ
ルターで不溶物を除去した後、０.１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル／水でグラジエント
溶出する逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）（カラム：ＴＳＫ gel ＯＤＳ−１２０Ｔ、２.１５
×３０cm；流速０.７ml／分；最初の３分間はアセトニ
トリル濃度１０％，その後２５分間にわたって１０％か
ら６０％まで濃度勾配をかけて溶出）にて、メインピー
クを分取し、凍結乾燥にて濃縮して白色粉末を得た。得
られたインスリンフラグメントをＦ００１と命名した。
Ｆ００１は逆相分析ＨＰＬＣでインスリンピークと分離
されたシングルピーク（〔図１〕及び〔図２〕）であ
り、収率は６.５％であった。Ｆ００１はアミノ酸シー
クエンサーによる解析結果から〔図３〕に示すような構
造式に決定した。
製薬）１００mgを０.１Ｍリン酸緩衝液（pH７.０）５０
mlで希釈し、これにトリプシン（シグマ社）５mgを加
え、室温で３日間放置し、全量を凍結乾燥した。得られ
た分解混合物を１Ｎ酢酸に溶解し、０.４５μm のフィ
ルターで不溶物を除去した後、０.１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル／水でグラジエント
溶出する逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）（カラム：ＴＳＫ gel ＯＤＳ−１２０Ｔ、２.１５
×３０cm；流速０.７ml／分；最初の３分間はアセトニ
トリル濃度１０％，その後２５分間にわたって１０％か
ら６０％まで濃度勾配をかけて溶出）にて、メインピー
クを分取し、凍結乾燥にて濃縮して白色粉末を得た。得
られたインスリンフラグメントをＦ００１と命名した。
Ｆ００１は逆相分析ＨＰＬＣでインスリンピークと分離
されたシングルピーク（〔図１〕及び〔図２〕）であ
り、収率は６.５％であった。Ｆ００１はアミノ酸シー
クエンサーによる解析結果から〔図３〕に示すような構
造式に決定した。
【００２１】実施例２：Ｆ００７の調製法及び同定 １０mＭ塩酸２.５mlに溶解したブタ−インスリン３００
mgを２mＭのＥＤＴＡを含む０.１Ｍ Ｎ−エチルモルフ
ォリン（ｐＨ８.０）１５０mlで希釈し、これに２０mＭ
の塩化カルシウムを含む０.１ＭＮ−エチルモルフォリ
ン１５０mlに溶解したトリプシン４５mgを加え、３７℃
で９０分間インキュベートを行った。１Ｎ酢酸、１０ml
を加えて反応の進行を止め、全量を凍結乾燥した。得ら
れた分解混合物を１Ｎ酢酸に溶解し、０.４５μm のフ
ィルターで不溶物を除去した後、０.１％ＴＦＡを含む
アセトニトリル／水でグラジエント溶出する逆相分取Ｈ
ＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ gel ＯＤＳ−１２０Ｔ、２.１
５×３０cm；流速０.７ml／分；最初の３分間はアセト
ニトリル濃度１０％，その後２５分間にわたって１０％
から６０％まで濃度勾配をかけて溶出）にて、メインピ
ークを分取し、凍結乾燥にて濃縮して白色粉末を得た。
得られたインスリンフラグメントはＦ００７と命名し
た。Ｆ００７は逆相分析ＨＰＬＣでインスリンピークと
分離されたシングルピーク（〔図４〕及び〔図５〕）で
あり、収率は２９.５％であった。 Ｆ００７は６Ｎ塩
酸加水分解後にアミノ酸分析の結果〔表１〕とインスリ
ンの構造式から〔図６〕に示すような構造式に決定し
た。
mgを２mＭのＥＤＴＡを含む０.１Ｍ Ｎ−エチルモルフ
ォリン（ｐＨ８.０）１５０mlで希釈し、これに２０mＭ
の塩化カルシウムを含む０.１ＭＮ−エチルモルフォリ
ン１５０mlに溶解したトリプシン４５mgを加え、３７℃
で９０分間インキュベートを行った。１Ｎ酢酸、１０ml
を加えて反応の進行を止め、全量を凍結乾燥した。得ら
れた分解混合物を１Ｎ酢酸に溶解し、０.４５μm のフ
ィルターで不溶物を除去した後、０.１％ＴＦＡを含む
アセトニトリル／水でグラジエント溶出する逆相分取Ｈ
ＰＬＣ（カラム：ＴＳＫ gel ＯＤＳ−１２０Ｔ、２.１
５×３０cm；流速０.７ml／分；最初の３分間はアセト
ニトリル濃度１０％，その後２５分間にわたって１０％
から６０％まで濃度勾配をかけて溶出）にて、メインピ
ークを分取し、凍結乾燥にて濃縮して白色粉末を得た。
得られたインスリンフラグメントはＦ００７と命名し
た。Ｆ００７は逆相分析ＨＰＬＣでインスリンピークと
分離されたシングルピーク（〔図４〕及び〔図５〕）で
あり、収率は２９.５％であった。 Ｆ００７は６Ｎ塩
酸加水分解後にアミノ酸分析の結果〔表１〕とインスリ
ンの構造式から〔図６〕に示すような構造式に決定し
た。
【００２２】
【表１】Ｆ００７のアミノ酸分析結果 インスリン Ｆ００７ ──────────────────────────── アミノ酸 分析結果 理論値 分析結果 理論値 ──────────────────────────── Ａｓｐ ２．９ ３ ２．９ ３ Ｇｌｕ ６．７ ７ ６．３ ７ Ｓｅｒ ２．８ ３ ３ ３ Ｇｌｙ ４．２ ４ ３．５ ３ Ｈｉｓ １．９ ２ １．９ ２ Ａｒｇ １．１ １ １ １ Ｔｈｒ １．９ ２ １．１ １ Ａｌａ ２．１ ２ １．２ １ Ｐｒｏ １．１ １ ０．２ ０ Ｔｙｒ ４．１ ４ ３．３ ３ Ｖａｌ ３．５ ４ ３．６ ４ Ｃｙｓ ２．５ ６ ２．６ ６ Ｉｌｅ １．６ ２ １．７ ２ Ｌｅｕ ６ ６ ６ ６ Ｐｈｅ ３．１ ３ １．５ １ Ｌｙｓ １．１ １ ０．２ ０ ────────────────────────────
【００２３】実施例３：インスリンフラグメントのレセ
プター親和性（１） 米国のボーチャード（Ronald T. Borchart）らによる
「牛毛細血管内皮細胞上の大中性アミノ酸移行システム
の特性（Characterristics of the Large Neutral Amin
o Acid Transport System of Bovine Brain Microvesse
l endotherial cell Monolayers）」〔ジャーナル・オ
ブ・ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistr
y) 第４７巻、頁４８４−４８８（１９８６）〕に記載
の要領で、牛脳毛細血管内皮細胞を分離し、単層膜を作
成して内皮細胞上にあるレセプターに対する親和性を測
定した。すなわち、充填構造に至った培養細胞に125Ｉ
−インスリン共存化で実施例１及び２で得られたインス
リンフラグメント（Ｆ００１、Ｆ００７）、非標識のイ
ンスリンを各々添加し、毛細血管内皮細胞上に存在する
インスリンレセプターに対する親和性を125Ｉ−インス
リンに対する競合阻害実験で検討した。〔表２〕に示す
ようにＦ００１及びＦ００７はいずれも親和性を示し、
Ｆ００７についてはインスリン全分子と同程度の親和性
を示した。従来の研究が示しているように、培養脳毛細
血管に対する親和性は in vivoでの脳毛細血管透過性の
信頼しうる指標で、本実施例はインスリンレセプターを
介してのトランスサイトーシスによる脳への送達が充分
示唆された。
プター親和性（１） 米国のボーチャード（Ronald T. Borchart）らによる
「牛毛細血管内皮細胞上の大中性アミノ酸移行システム
の特性（Characterristics of the Large Neutral Amin
o Acid Transport System of Bovine Brain Microvesse
l endotherial cell Monolayers）」〔ジャーナル・オ
ブ・ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistr
y) 第４７巻、頁４８４−４８８（１９８６）〕に記載
の要領で、牛脳毛細血管内皮細胞を分離し、単層膜を作
成して内皮細胞上にあるレセプターに対する親和性を測
定した。すなわち、充填構造に至った培養細胞に125Ｉ
−インスリン共存化で実施例１及び２で得られたインス
リンフラグメント（Ｆ００１、Ｆ００７）、非標識のイ
ンスリンを各々添加し、毛細血管内皮細胞上に存在する
インスリンレセプターに対する親和性を125Ｉ−インス
リンに対する競合阻害実験で検討した。〔表２〕に示す
ようにＦ００１及びＦ００７はいずれも親和性を示し、
Ｆ００７についてはインスリン全分子と同程度の親和性
を示した。従来の研究が示しているように、培養脳毛細
血管に対する親和性は in vivoでの脳毛細血管透過性の
信頼しうる指標で、本実施例はインスリンレセプターを
介してのトランスサイトーシスによる脳への送達が充分
示唆された。
【００２４】
【表２】脳毛細血管内皮細胞上のレセプターに対するイ
ンスリンとＦ００１、Ｆ００７の親和性の比較 非標識化合物添加時の125Ｉ- インスリンの結合率（％） ──────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） インスリン Ｆ００１ Ｆ００７ ──────────────────────────────── 1.6 X 102 13.6 ± 0.2 1.0 X 102 61.6 ± 1.2 11.8 ± 2.5 1.0 X 102 23.0 ± 6.3 78.5 ± 3.8 18.1 ± 2.6 1.0 X 10 24.2 ± 1.5 93.2 ± 0.4 33.5 ± 1.7 1.0 X 10-1 30.2 ± 3.9 55.7 ± 6.6 1.0 X 10-2 44.6 ± 0.9 73.7 ± 8.8 1.0 X 10-3 73.7 ± 8.3 90.3 ± 2.8 1.0 X 10-4 85.7 ± 8.5 94.7 ±10.8 ────────────────────────────────
ンスリンとＦ００１、Ｆ００７の親和性の比較 非標識化合物添加時の125Ｉ- インスリンの結合率（％） ──────────────────────────────── 添加濃度（μＭ） インスリン Ｆ００１ Ｆ００７ ──────────────────────────────── 1.6 X 102 13.6 ± 0.2 1.0 X 102 61.6 ± 1.2 11.8 ± 2.5 1.0 X 102 23.0 ± 6.3 78.5 ± 3.8 18.1 ± 2.6 1.0 X 10 24.2 ± 1.5 93.2 ± 0.4 33.5 ± 1.7 1.0 X 10-1 30.2 ± 3.9 55.7 ± 6.6 1.0 X 10-2 44.6 ± 0.9 73.7 ± 8.8 1.0 X 10-3 73.7 ± 8.3 90.3 ± 2.8 1.0 X 10-4 85.7 ± 8.5 94.7 ±10.8 ────────────────────────────────
【００２５】実施例４：Ｆ００７の合成 Ｆ００７のＡ鎖及びＢ鎖の合成をポリスチレン樹脂を担
体とする固相合成法にておこなった。Ｎ（α）−アミノ
基にはｔ-ブトキシカルボニル（ｔＢＯＣ）基を、アミ
ノ酸側鎖の官能基にはベンジルタイプの保護基をそれぞ
れ用いた。また、Ｆ００７のＡ及びＢ鎖中のジスルフィ
ド結合に関与するシステイン残基（Ａ鎖７位及び２０
位、Ｂ鎖７位及び１９位）は、アセトアミドメチル（Ａ
ｃｍ）基を保護基とする最大保護法でおこなった。Ｃ末
端アミノ酸を結合させたポリスチレン樹脂を出発原料と
して順次ｔＢＯＣ基を０．５％メタンスルホン酸にて除
去した後に ２％ピリジンで洗浄、つづいてｔＢＯＣ保
護アミノ酸をベンゾトリアゾール−１−１−イル−オキ
シ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェイトを用いて活性化することにより縮合
した。全縮合反応が完了した保護ペプチド樹脂を減圧乾
燥した。乾燥保護ペプチド樹脂を適当なカチオンスカベ
ンジャーの存在下、フッ化水素中に氷冷下２時間撹拌
し、ペプチドを樹脂から脱離させるとともに保護基の除
去をおこなった。フッ化水素を減圧下で溜去し、残査に
エーテルを加えペプチドを析出沈澱させた。さらにエー
テルにて３回洗い、フッ化水素、スカベンジャー類を充
分取り除いた。つぎに得られた粗ペプチドを１Ｎ 酢酸
で抽出してグラスフィルターで不溶物および樹脂を濾去
し、濾液を凍結乾燥した。得られた乾燥品を少量の１Ｎ
酢酸に溶解し、セファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）カラム（２．７ｘ９０ｃｍ）に添加して、２８０ｎ
ｍ または ２５４ｎｍにおける吸光度をモニターしつ
つ、１Ｎ酢酸で溶出し、目的のペプチドを含有する分画
を集めて凍結乾燥した。
体とする固相合成法にておこなった。Ｎ（α）−アミノ
基にはｔ-ブトキシカルボニル（ｔＢＯＣ）基を、アミ
ノ酸側鎖の官能基にはベンジルタイプの保護基をそれぞ
れ用いた。また、Ｆ００７のＡ及びＢ鎖中のジスルフィ
ド結合に関与するシステイン残基（Ａ鎖７位及び２０
位、Ｂ鎖７位及び１９位）は、アセトアミドメチル（Ａ
ｃｍ）基を保護基とする最大保護法でおこなった。Ｃ末
端アミノ酸を結合させたポリスチレン樹脂を出発原料と
して順次ｔＢＯＣ基を０．５％メタンスルホン酸にて除
去した後に ２％ピリジンで洗浄、つづいてｔＢＯＣ保
護アミノ酸をベンゾトリアゾール−１−１−イル−オキ
シ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェイトを用いて活性化することにより縮合
した。全縮合反応が完了した保護ペプチド樹脂を減圧乾
燥した。乾燥保護ペプチド樹脂を適当なカチオンスカベ
ンジャーの存在下、フッ化水素中に氷冷下２時間撹拌
し、ペプチドを樹脂から脱離させるとともに保護基の除
去をおこなった。フッ化水素を減圧下で溜去し、残査に
エーテルを加えペプチドを析出沈澱させた。さらにエー
テルにて３回洗い、フッ化水素、スカベンジャー類を充
分取り除いた。つぎに得られた粗ペプチドを１Ｎ 酢酸
で抽出してグラスフィルターで不溶物および樹脂を濾去
し、濾液を凍結乾燥した。得られた乾燥品を少量の１Ｎ
酢酸に溶解し、セファデックスＧ−２５（ファルマシア
社）カラム（２．７ｘ９０ｃｍ）に添加して、２８０ｎ
ｍ または ２５４ｎｍにおける吸光度をモニターしつ
つ、１Ｎ酢酸で溶出し、目的のペプチドを含有する分画
を集めて凍結乾燥した。
【００２６】また、非保護のシステイン残基を含むＡ鎖
ペプチドは、希アンモニア水（ｐＨ７．６）をペプチド
１に対して１０００倍量加え、室温で４８時間放置し、
ジスルフィド結合を形成させ、凍結乾燥した。得られた
Ａ鎖及びＢ鎖の乾燥品を１Ｎ酢酸に溶解後、ＴＳＫ ｇ
ｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（２．１５Ｘ３０ｃｍ）逆相分
取ＨＰＬＣにて０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル−
水系でグラジエント溶出させ精製した。目的のピークを
凍結乾燥して白色粉末を得た。これらのペプチドの純度
は逆相ＨＰＬＣで確認し、６Ｎ塩酸加水分解後のアミノ
酸分析結果から目的のペプチドであることを確認した。
次に、Ａ鎖及びＢ鎖のＡｃｍ基をはヨード酸化によって
脱保護し、セファデックスＧ−２５カラム（２．７ｘ９
０ｃｍ）に添加して １Ｎ酢酸で溶出し、凍結乾燥し
た。Ｆ００７に対応するＡ鎖及びＢ鎖を稀アンモニア水
（ｐＨ７．６）中で２４時間、室温で放置することによ
りＡ鎖とＢ鎖のジスルフィド結合を形成させた。逆相分
析ＨＰＬＣにて反応が進行したのを確認したのち、ＴＳ
Ｋｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（２．１５Ｘ３０ｃｍ）逆
相分取ＨＰＬＣにて０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリ
ル−水系でグラジエント溶出させ、目的とするＦ００７
を含むフラクションを集め、凍結乾燥した。得られたＦ
００７は逆相ＨＰＬＣ 、アミノ酸分析にて純度ととも
に目的のペプチドであることを確認した。
ペプチドは、希アンモニア水（ｐＨ７．６）をペプチド
１に対して１０００倍量加え、室温で４８時間放置し、
ジスルフィド結合を形成させ、凍結乾燥した。得られた
Ａ鎖及びＢ鎖の乾燥品を１Ｎ酢酸に溶解後、ＴＳＫ ｇ
ｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（２．１５Ｘ３０ｃｍ）逆相分
取ＨＰＬＣにて０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル−
水系でグラジエント溶出させ精製した。目的のピークを
凍結乾燥して白色粉末を得た。これらのペプチドの純度
は逆相ＨＰＬＣで確認し、６Ｎ塩酸加水分解後のアミノ
酸分析結果から目的のペプチドであることを確認した。
次に、Ａ鎖及びＢ鎖のＡｃｍ基をはヨード酸化によって
脱保護し、セファデックスＧ−２５カラム（２．７ｘ９
０ｃｍ）に添加して １Ｎ酢酸で溶出し、凍結乾燥し
た。Ｆ００７に対応するＡ鎖及びＢ鎖を稀アンモニア水
（ｐＨ７．６）中で２４時間、室温で放置することによ
りＡ鎖とＢ鎖のジスルフィド結合を形成させた。逆相分
析ＨＰＬＣにて反応が進行したのを確認したのち、ＴＳ
Ｋｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ（２．１５Ｘ３０ｃｍ）逆
相分取ＨＰＬＣにて０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリ
ル−水系でグラジエント溶出させ、目的とするＦ００７
を含むフラクションを集め、凍結乾燥した。得られたＦ
００７は逆相ＨＰＬＣ 、アミノ酸分析にて純度ととも
に目的のペプチドであることを確認した。
【００２７】実施例５ Ｆ００１の合成 Ａｃｍにより保護するシステイン残基がＡ鎖７位及びＢ
鎖７位である以外は、実施例４と同様の方法でＦ００１
を合成した。 実施例６ インスリンフラグメントのレセプターの親和
性（２） 実施例３に記載の方法に従い、実施例４及び５で得られ
たインスリンフラグメント（Ｆ００７，Ｆ００１）の毛
細血管内皮細胞上のインスリンレセプターに対する親和
性を測定し、その親和性がそれぞれ実施例１及び２で得
られたフラグメントと同様であることを確認した。 実施例７：インスリンフラグメントの血糖降下作用 Ｆ００７の血糖降下作用をＩＣＲマウスに生理食塩水に
溶解し、皮下投与することによってインスリンとの生物
活性と比較した。表３に示すように投与後１時間後の血
糖値をインスリンと比較すると、同投与量で顕著な低下
は認められず、１０倍量投与してもインスリンほどの極
端な血糖降下作用は示さなかった。これは、インスリン
と比較して、インスリンフラグメントＦ００７は血糖降
下作用が弱く、脳への輸送活性だけを持っており、キャ
リアーペプチドとしての有用性の証明である。
鎖７位である以外は、実施例４と同様の方法でＦ００１
を合成した。 実施例６ インスリンフラグメントのレセプターの親和
性（２） 実施例３に記載の方法に従い、実施例４及び５で得られ
たインスリンフラグメント（Ｆ００７，Ｆ００１）の毛
細血管内皮細胞上のインスリンレセプターに対する親和
性を測定し、その親和性がそれぞれ実施例１及び２で得
られたフラグメントと同様であることを確認した。 実施例７：インスリンフラグメントの血糖降下作用 Ｆ００７の血糖降下作用をＩＣＲマウスに生理食塩水に
溶解し、皮下投与することによってインスリンとの生物
活性と比較した。表３に示すように投与後１時間後の血
糖値をインスリンと比較すると、同投与量で顕著な低下
は認められず、１０倍量投与してもインスリンほどの極
端な血糖降下作用は示さなかった。これは、インスリン
と比較して、インスリンフラグメントＦ００７は血糖降
下作用が弱く、脳への輸送活性だけを持っており、キャ
リアーペプチドとしての有用性の証明である。
【表３】Ｆ００７の血糖降下作用 ＩＣＲマウス投与サンプル 血糖値（ｍｇ／ｄｌ）（ｎ＝５） 平均±ＳＥ ────────────────────────────────── 生理食塩水 291 222 175 223 241 230±19 インスリン（３０μｇ） 113 116 101 108 121 112±3 Ｆ００７（３０μｇ） 190 263 211 218 199 216±13 Ｆ００７（３００μｇ） 166 203 158 161 161 170±8 ──────────────────────────────────
【００２８】実施例８：インターロイキン２（ＩＬ−
２）−キャリアーペプチド結合体 ７mgのＦ００７を ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）
１mlに溶解し、別途調製したＳＰＤＰ／ジメチルスルフ
ォキサイド（ＤＭＳＯ）溶液（７ｍｇ／４０μｌ）を氷
冷下で少量ずつ滴下したのち、室温で３０分間放置し
た。これを未反応のＳＰＤＰを除去するためにゲルカラ
ムＰＤ−１０（ファルマシア社）を用い、０.１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７.４）で溶出し、分取した。一方、同
様にして１０mgのリコンビナントヒトＩＬ−２（武田薬
品）を０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）１mlに溶解
し、別途調製したＳＰＤＰ／ＤＭＳＯ溶液（７mg／４０
μｌ）を氷冷下で少量ずつ滴下したのち、室温で３０分
間放置した。これを未反応のＳＰＤＰを除去するために
ＰＤ−１０を用い、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）
で溶出し、分取した。これをＰＤ−１０にて０.１Ｍ酢
酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.５）に置換した。これを、
減圧下で２.０mlに濃縮したのちに３.６％ジチオスレイ
トール０.１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.５）を添加
して室温で３０分間放置して還元した。これを小分子を
除去するためにＰＤ−１０を用い、０.１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７.４）で溶出し、分取した。次に、ＳＰＤＰ
が結合したＦ００７とＩＬ−２を混合して更に１８時間
放置し、得られた反応液をセファデックスＧ−７５（フ
ァルマシア社）カラムで分離、精製した。得られたＦ０
０７-ＩＬ−２の構造式を次に示す。
２）−キャリアーペプチド結合体 ７mgのＦ００７を ０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）
１mlに溶解し、別途調製したＳＰＤＰ／ジメチルスルフ
ォキサイド（ＤＭＳＯ）溶液（７ｍｇ／４０μｌ）を氷
冷下で少量ずつ滴下したのち、室温で３０分間放置し
た。これを未反応のＳＰＤＰを除去するためにゲルカラ
ムＰＤ−１０（ファルマシア社）を用い、０.１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７.４）で溶出し、分取した。一方、同
様にして１０mgのリコンビナントヒトＩＬ−２（武田薬
品）を０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）１mlに溶解
し、別途調製したＳＰＤＰ／ＤＭＳＯ溶液（７mg／４０
μｌ）を氷冷下で少量ずつ滴下したのち、室温で３０分
間放置した。これを未反応のＳＰＤＰを除去するために
ＰＤ−１０を用い、０.１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）
で溶出し、分取した。これをＰＤ−１０にて０.１Ｍ酢
酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.５）に置換した。これを、
減圧下で２.０mlに濃縮したのちに３.６％ジチオスレイ
トール０.１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.５）を添加
して室温で３０分間放置して還元した。これを小分子を
除去するためにＰＤ−１０を用い、０.１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７.４）で溶出し、分取した。次に、ＳＰＤＰ
が結合したＦ００７とＩＬ−２を混合して更に１８時間
放置し、得られた反応液をセファデックスＧ−７５（フ
ァルマシア社）カラムで分離、精製した。得られたＦ０
０７-ＩＬ−２の構造式を次に示す。
【化３】
【００２９】実施例９：125Ｉ標識神経成長因子(ＮＧ
Ｆ)−キャリアーペプチド結合体 特開平４−１２８３００号公報記載の方法で得られたリ
コンビナントヒトＮＧＦをまず、クロラミンＴ法によっ
て125Ｉ標識化を行った。これにＦ００７をＳＰＤＰを
用いて実施例８に記載の要領で結合させ、結合体を逆相
系ＨＰＬＣにて分離、精製し、水で透析後、凍結乾燥し
て結合体（125Ｉ−ＮＧＦ−Ｆ００７）を得た。 実施例１０：ソマトスタチン−キャリアーペプチド結合
体 ＩＬ−２に換えてソマトスタチンを用い、実施例８と同
じ方法で、ソマトスタチン−Ｆ００７結合体を得た。 実施例１１：バソプレシン−キャリアーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてバソプレシンを用い、実施例８と同じ
方法で、バソプレシン− Ｆ００７結合体を得た。 実施例１２：インターフェロンα−キャリアーペプチド
結合体 ＩＬ−２に換えてインターフェロンαを用い、実施例８
と同じ方法で、インターフェロンα−Ｆ００７結合体を
得た。 実施例１３：ｂＦＧＦ−キャリアーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてｂＦＧＦを用い、実施例８と同じ方法
で、ｂＦＧＦ−Ｆ００７結合体を得た。 実施例１４：ＨＲＰ−キャリヤーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてＨＲＰを用い、実施例８と同じ方法
で、ＨＲＰ−Ｆ００７結合体を得た。
Ｆ)−キャリアーペプチド結合体 特開平４−１２８３００号公報記載の方法で得られたリ
コンビナントヒトＮＧＦをまず、クロラミンＴ法によっ
て125Ｉ標識化を行った。これにＦ００７をＳＰＤＰを
用いて実施例８に記載の要領で結合させ、結合体を逆相
系ＨＰＬＣにて分離、精製し、水で透析後、凍結乾燥し
て結合体（125Ｉ−ＮＧＦ−Ｆ００７）を得た。 実施例１０：ソマトスタチン−キャリアーペプチド結合
体 ＩＬ−２に換えてソマトスタチンを用い、実施例８と同
じ方法で、ソマトスタチン−Ｆ００７結合体を得た。 実施例１１：バソプレシン−キャリアーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてバソプレシンを用い、実施例８と同じ
方法で、バソプレシン− Ｆ００７結合体を得た。 実施例１２：インターフェロンα−キャリアーペプチド
結合体 ＩＬ−２に換えてインターフェロンαを用い、実施例８
と同じ方法で、インターフェロンα−Ｆ００７結合体を
得た。 実施例１３：ｂＦＧＦ−キャリアーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてｂＦＧＦを用い、実施例８と同じ方法
で、ｂＦＧＦ−Ｆ００７結合体を得た。 実施例１４：ＨＲＰ−キャリヤーペプチド結合体 ＩＬ−２に換えてＨＲＰを用い、実施例８と同じ方法
で、ＨＲＰ−Ｆ００７結合体を得た。
【００３０】製剤例 本発明のペプチド結合体を脳疾患治療薬として用いる場
合、次のような製剤として投与することが可能である。 １．実施例１０で得られたソマトスタチン−Ｆ００７結
合体２００mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、噴霧容器
に入れ鼻腔内に投与できる製剤とする。 ２．実施例１１で得られたバソプレシン−Ｆ００７結合
体１０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、メチルセルロ
ース１００mgを加えて粘調な液とし、鼻腔内に投与でき
る製剤とする。 ３．実施例１２で得られたインターフェロンα−Ｆ００
７結合体１０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、常法に
従い静脈内、皮下及び筋肉内投与用の注射用液剤を調製
する。 ４．実施例１３で得られたｂＦＧＦ−Ｆ００７結合体１
０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、常法に従い静脈
内、皮下及び筋肉内投与用の注射用液剤を調製する。
合、次のような製剤として投与することが可能である。 １．実施例１０で得られたソマトスタチン−Ｆ００７結
合体２００mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、噴霧容器
に入れ鼻腔内に投与できる製剤とする。 ２．実施例１１で得られたバソプレシン−Ｆ００７結合
体１０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、メチルセルロ
ース１００mgを加えて粘調な液とし、鼻腔内に投与でき
る製剤とする。 ３．実施例１２で得られたインターフェロンα−Ｆ００
７結合体１０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、常法に
従い静脈内、皮下及び筋肉内投与用の注射用液剤を調製
する。 ４．実施例１３で得られたｂＦＧＦ−Ｆ００７結合体１
０mgを１０mlの生理食塩水に溶解し、常法に従い静脈
内、皮下及び筋肉内投与用の注射用液剤を調製する。
【００３１】
配列番号(SEQ ID NO)：１ 配列の長さ(SEQUENCE LENGTH)：21 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸(amino acid) トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状(linear) 配列の種類（MOLECULE TYPE)：ペプチド(peptide) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 配列の特徴(FEATURE) 存在位置(location)：6 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ジスルフィド結合 存在位置(location)：11 他の特徴(OTHER INFORMATION)：ジスルフィド結合 配列(SEQUENCE DESCRIPTION): Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20
【００３２】配列番号（SEQ ID NO)：2 配列の長さ（SEQUENCE LENGTH)：22 配列の型(SEQUENCE TYPE)：アミノ酸(amino acid) トポロジ−(TOPOLOGY)：直鎖状(linear) 配列の種類（MOLECULE TYPE)：ペプチド(peptide) ハイポセティカル配列(HIPOTHTICAL)：Ｎｏ 配列の特徴(FEATURE) 他の特徴(OTHER INFORMATION)： 配列(SEQUENCE DESCRIPTION): Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg 20
【図１】実施例１で得られたインスリンフラグメントＦ
００１の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
００１の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図２】実施例１で得られたインスリンフラグメントＦ
００１及びインスリン(全分子)の逆相ＨＰＬＣのクロマ
トグラムである。
００１及びインスリン(全分子)の逆相ＨＰＬＣのクロマ
トグラムである。
【図３】実施例１で得られたインスリンフラグメントＦ
００１の推定される構造式である。
００１の推定される構造式である。
【図４】実施例２で得られたインスリンフラグメントＦ
００７の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
００７の逆相ＨＰＬＣのクロマトグラムである。
【図５】実施例２で得られたインスリンフラグメントＦ
００７及びインスリン(全分子)の逆相ＨＰＬＣのクロマ
トグラムである。
００７及びインスリン(全分子)の逆相ＨＰＬＣのクロマ
トグラムである。
【図６】実施例２で得られたインスリンフラグメントＦ
００７の推定される構造式である。
００７の推定される構造式である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/36 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ 7/16 8318−4Ｈ 7/26 8318−4Ｈ 7/40 8318−4Ｈ 13/00 8318−4Ｈ 15/26 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (16)
- 【請求項１】それ自身血液脳関門を通過しない生理活性
ペプチドないし蛋白質とそれ自身実質的に生理活性を示
さず、血液脳関門を通過可能なキャリアーペプチドとを
結合させてなる血液脳関門通過可能なペプチド結合体。 - 【請求項２】キャリアーペプチドが分子量約４，０００
ないし１００，０００のペプチドである請求項１記載の
結合体。 - 【請求項３】キャリアーペプチドがレセプター仲介型ト
ランスサイトーシスにより血液脳関門を通過しうる生体
内ペプチドの不活性フラグメントである請求項１記載の
結合体。 - 【請求項４】生体内ペプチドが、インスリン，トランス
フェリン，インスリン様成長因子ＩまたはIIである請求
項２記載の結合体。 - 【請求項５】キャリアーペプチドが、インスリンのＡ鎖
のＮ末端からアミノ酸残基１４ないし２１個のペプチド
鎖およびＢ鎖のＮ末端からアミノ酸残基１６ないし２２
個のペプチド鎖からなるインスリンフラグメントである
請求項１記載の結合体。 - 【請求項６】インスリンフラグメントが 【化１】 で示されるフラグメントである請求項５記載の結合体。
- 【請求項７】インスリンフラグメントが、（Ｂ２３−３
０）オクタペプチド欠失インスリンフラグメントである
請求項５記載の結合体。 - 【請求項８】生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が
約２００ないし１２０，０００である請求項１記載の結
合体。 - 【請求項９】生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量が
約４００ないし８０，０００である請求項１記載の結合
体。 - 【請求項１０】生理活性ペプチドないし蛋白質の分子量
が約５００ないし６０，０００である請求項１記載の結
合体。 - 【請求項１１】生理活性ペプチドないし蛋白質が神経栄
養因子である請求項１記載の結合体。 - 【請求項１２】生理活性ペプチドないし蛋白質がニュー
ロトロフィンファミリーに属するペプチドないし蛋白質
である請求項１記載の結合体。 - 【請求項１３】生理活性ペプチドないし蛋白質が神経成
長因子（ＮＧＦ）である請求項１記載の結合体。 - 【請求項１４】生理活性ペプチドが神経ペプチドである
請求項１記載の結合体。 - 【請求項１５】ニューロトロフィンファミリーに属する
ペプチドないし蛋白質とインスリンフラグメントとを結
合させてなる請求項１記載の結合体。 - 【請求項１６】神経成長因子（ＮＧＦ）と（Ｂ２３−３
０）オクタペプチド欠失インスリンフラグメントとを結
合させてなる請求項１記載の結合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5296388A JPH06228199A (ja) | 1992-11-27 | 1993-11-26 | 血液脳関門通過可能なペプチド結合体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31803192 | 1992-11-27 | ||
| JP4-318031 | 1992-11-27 | ||
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