JPH06233676A - 新規微生物及び該微生物によるヒト型コロニー刺激因 子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ｈＭ−ＣＳＦを産生するエシェリキア(Esche
richia) 属に属する微生物、及び該微生物を用いてｈＭ
−ＣＳＦを大量、かつ安価に生産する方法を提供する。 【構成】 ２２４個のアミノ酸配列からなるヒト型コロ
ニー刺激因子をコードするＤＮＡ配列が組み込まれたｈ
Ｍ−ＣＳＦ発現ベクターｐＺＡＣ１１８を保持するエシ
ェリキア(Escherichia) 属に属する微生物、及び該微生
物を培養し、該微生物が産生するヒト型コロニー刺激因
子を採取することを特徴とするヒト型コロニー刺激因子
の製造法。 【効果】 天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の比活性を有する
ｈＭ−ＣＳＦを効率よく生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト型コロニー刺激因
子を産生する新規な微生物、及び該微生物を用いたヒト
型コロニー刺激因子の製造法に関する。更に詳しくは、
本発明は、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列
を有するヒト型コロニー刺激因子をコードするＤＮＡ配
列が組み込まれたベクターｐＺＡＣ１１８を保持するエ
シェリキア(Escherichia) 属に属する新規な微生物、及
び該微生物を培養し、該微生物が産生するヒト型コロニ
ー刺激因子を採取することを特徴とする該ヒト型コロニ
ー刺激因子を大量、かつ安価に効率よく生産することが
可能なヒト型コロニー刺激因子の製造法に関する。

【０００２】本明細書において百分率の表示は、特に断
りのない限り重量による値であり、ヒト尿から分離、精
製したコロニー刺激因子を以後天然型ｈＭ−ＣＳＦと、
また、それ以外のコロニー刺激因子を以後ｈＭ−ＣＳＦ
と、更に、これら両者を包括的に表現する場合には該因
子と、それぞれ、記載することがある。

【０００３】

【従来の技術】天然型ｈＭ−ＣＳＦは、配列表の配列番
号１に記載するアミノ酸配列及び糖鎖を有し、分子量約
８５，０００ダルトンの糖タンパク質であり、分子量約
４３，０００ダルトンの単量体２分子の二量体からなっ
ている。天然型ｈＭ−ＣＳＦは、抗癌剤投与及び放射線
照射による白血球減少治療剤として既に市販されている
が、該天然型ｈＭ−ＣＳＦは、その他にも種々の用途が
期待されており、感染症の治療剤、抗腫瘍剤、骨髄移植
後の白血球増加剤、高コレステロール血症治療剤、動脈
硬化治療剤等として医薬への応用が期待されている他、
白血球減少症、再生不良性貧血等の診断薬としての用途
が期待されている有用な物質である。

【０００４】ところで、従来報告されている該因子の生
産は、主として、ヒト尿から分離、精製する方法により
行われており、最近、遺伝子組換え技術を利用して、Ｃ
ＯＳ細胞（特表平１−５０２３９７号公報）、ＣＯＳ細
胞以外の動物細胞（米国特許第４，８６８，１１２
号）、大腸菌（特表平１−５０３４４０号公報及び国際
公開ＷＯ９１／０６５６７号公報）等を宿主として使用
する方法により、ｈＭ−ＣＳＦが生産されているが、Ｃ
ＯＳ細胞により生産する方法は、大量培養ができず、ま
た、ＣＯＳ細胞以外の動物細胞により生産する方法は、
牛血清等の高価な培地材料を使用すること、培養時間が
３〜４日と長いこと、及び培養に高度な技術を必要とす
ること等から、これらの方法に比較して、該因子を大
量、かつ安価に生産し得る大腸菌を利用する方法が注目
されている。

【０００５】しかしながら、従来法により大腸菌で生産
されたｈＭ−ＣＳＦは、Ｎ末端又はＣ末端が欠損してお
り［バイオ／テクノロジー(Bio/Technology)，第７巻，
第７１０ページ，１９８９年，及びジャーナル・オブ・
バイオケミストリー(Journalof Biochemistry)，第１９
７巻，第４０４ページ，１９９１年］、その比活性につ
いても、天然型ｈＭ−ＣＳＦより比活性が低く、そのた
めに、天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等に使用することができ
ないという不都合があった。従って、天然型ｈＭ−ＣＳ
Ｆと同等の比活性を有するｈＭ−ＣＳＦを大腸菌によ
り、大量、かつ安価に生産することが可能な新しい生産
方法を開発することが強く待望されていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況を踏ま
えて、本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研
究を重ねた結果、天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の比活性を
有するｈＭ−ＣＳＦを産生し得るエシェリキア(Escheri
chia) 属に属する新規微生物を遺伝子工学的な手法によ
り開発することに成功し、該大腸菌を使用して、ｈＭ−
ＣＳＦを大量、かつ安価に生産する新しい方法を完成し
た。

【０００７】本発明は、天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の比
活性を有するｈＭ−ＣＳＦを産生するエシェリキア(Esc
herichia) 属に属する新規微生物を提供することを目的
としている。

【０００８】更に、本発明は、天然型ｈＭ−ＣＳＦと同
等の比活性を有するｈＭ−ＣＳＦを産生するエシェリキ
ア(Escherichia) 属に属する前記微生物を用いて、ｈＭ
−ＣＳＦを大量、かつ安価に効率よく生産する方法を提
供することを目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第１の発明は、配列表の配列番号１に記載したアミ
ノ酸配列を有するヒト型コロニー刺激因子をコードする
ＤＮＡ配列が組み込まれたベクターｐＺＡＣ１１８を保
持するエシェリキア(Escherichia) 属に属する微生物、
である。

【００１０】前記課題を解決する本発明の第２の発明
は、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列を有す
るヒト型コロニー刺激因子をコードするＤＮＡ配列が組
み込まれたベクターｐＺＡＣ１１８を保持するエシェリ
キア(Escherichia) 属に属する微生物を培養し、該微生
物が産生するヒト型コロニー刺激因子を採取することを
特徴とするヒト型コロニー刺激因子の製造法、である。

【００１１】更に、本発明は、エシェリキア(Escherich
ia) 属に属する微生物が、エシェリキア・コリ(Escheri
chia coli)ＭＯ９３０１、ＦＥＲＭ Ｐ−１３３８１で
あることを望ましい態様としてもいる。

【００１２】次に、本発明について詳述する。本発明の
エシェリキア(Escherichia) 属に属する微生物は、発現
ベクターとして、次の特定の塩基配列、遺伝子を含むこ
とを特徴とするプラスミドを保持している。本発明にお
いて発現ベクターとして使用されるベクターｐＺＡＣ１
１８は、該ａ）〜ｅ）の特定の塩基配列、遺伝子もしく
はそれらを含む塩基配列、遺伝子領域を常法により機能
的に連結して組み込むことにより構築されたものを意味
するものとして定義される。 ａ）プロモーター、リボソーム結合部位及び２−シスト
ロンシステムをコードする領域を含む塩基配列 ｂ）プロモーターを制御するためのリプレッサー蛋白を
コードする塩基配列 ｃ）大腸菌における複製のための複製オリジン ｄ）選択マーカー遺伝子、及び ｅ）該塩基配列に機能的に連結されて組み込まれた前記
のアミノ酸配列をコードする構造遺伝子

【００１３】前記プロモーター等をコードする領域を含
む塩基配列ａ）及びリプレッサー蛋白をコードする塩基
配列ｂ）としては、常法により合成したＤＮＡ又は市販
されているプラスミド等を利用することもできる。ま
た、複製オリジンｃ）及び選択マーカー遺伝子ｄ）とし
ては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４等
の公知のプラスミド、又はこれらから常法により誘導さ
れた各種プラスミド等のものを利用することができる。
更に、前記アミノ酸配列をコードする構造遺伝子ｅ）と
しては、配列表の配列番号１に記載されたアミノ酸配列
をコードするｃＤＮＡ、常法により合成されたＤＮＡ又
はそれらを組合わせたＤＮＡ等、該アミノ酸配列をコー
ドするものであれば、適宜のものを利用することができ
る。

【００１４】本発明のエシェリキア(Escherichia) 属に
属する新規微生物は、通常の形質転換可能な大腸菌、す
なわち、公知、かつ容易に入手し得るエシェリキア(Esc
herichia) 属に属する微生物［例えば、市販の大腸菌Ｎ
Ｍ５２２（ストラタジーン社製）、市販の大腸菌ＪＭ１
０９株（宝酒造社製）等を例示することができ、その
他、形質転換可能な大腸菌株を利用できる。特にエシェ
リキア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２株の派生株が望
ましいものとして使用される。］を宿主とし、常法によ
り前記ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）及びｅ）を機能的に連結
して組み込むことにより構築したプラスミドを、該宿主
微生物に導入して形質転換することにより簡便に作出す
ることができる。

【００１５】前記発現ベクターとしてのプラスミド、該
プラスミドを保持する形質転換体、及びそれらを作出す
る方法について、その一例を示せば次のとおりである。
即ち、本発明において、ｈＭ−ＣＳＦ発現ベクターとし
て使用されるベクターｐＺＡＣ１１８は、図１に示すと
おりの制限地図により示されるものである。図１におい
て、ｈＭ−ＣＳＦ、Ａｐ^r 、ｏｒｉ、ｌａｃＩ^q 、Ｐｔ
ａｃは、それぞれ、ｈＭ−ＣＳＦ遺伝子、アンピシリン
耐性遺伝子、複製起源、ｌａｃＩ遺伝子、及びｔａｃプ
ロモーターを示す。

【００１６】該発現ベクターのベクターｐＺＡＣ１１８
は、例えば、常法により合成したｈＭ−ＣＳＦ遺伝子、
ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）の複製オリジン、アンピシ
リン耐性遺伝子（宝酒造社製）、ｌａｃＩ^q 遺伝子（フ
ァルマシア社製）及びｔａｃプロモーター（ファルマシ
ア社製）を、常法により、それぞれ、図１の制限地図で
示される構造に連結して組み込むことによって、分子量
約５．１ｋｂｐのプラスミドとして調製することができ
る。この発現ベクターを、常法のカルシウム法により、
大腸菌ＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）に導入して
形質転換し、ｈＭ−ＣＳＦ発現大腸菌を得ることができ
る。

【００１７】本発明者らは、このようにして、ベクター
ｐＺＡＣ１１８を導入して作出した形質転換体の菌株を
エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＭＯ９３０１と
命名し、本発明の代表的な菌株の例として、工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託済みであり、エシェリキ
ア・コリ(Escherichia coli)ＭＯ９３０１、ＦＥＲＭＰ
−１３３８１なる受託番号が付与されている。尚、本発
明のエシェリキア(Escherichia) 属に属する微生物は、
寄託した該菌株に限定されるものではなく、ｈＭ−ＣＳ
Ｆ発現ベクターｐＺＡＣ１１８を公知の方法により、公
知の形質転換可能な菌株に導入し形質転換させたものを
同様に使用することができる。

【００１８】前記のようにして得られた菌株の菌学的性
質は、次のとおりである。 （ａ）形態 １）細胞の形及び大きさ：短桿菌、２〜４μｍ×０．４
〜０．７μｍ ２）細胞の多様性：無 ３）運動性：有 ４）胞子形成能：無 ５）グラム染色：陰性 ６）抗酸性：陰性

【００１９】（ｂ）各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養：生育良好 ２）肉汁寒天斜面培養：生育良好 ３）肉汁液体培地：生育良好 ４）肉汁ゼラチン穿刺培地：液化しない（２２℃） ５）リトマス・ミルク：酸性

【００２０】（ｃ）生理学的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒素：陽性 ３）ＭＲテスト：陽性 ４）ＶＰテスト：陰性 ５）インドールの精製：陽性 ６）硫化水素の生成：陰性 ７）デンプンの加水分解：陰性 ８）クエン酸の利用：陰性 ９）無機窒素源の利用：陽性

【００２１】１０）色素の生成：陰性 １１）ウレアーゼ：陰性 １２）オキシダーゼ：陰性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）生育の範囲：１８〜４２℃、ｐＨ７．０±１．０ １５）酸素に対する態度：通性嫌気性菌 １６）Ｆ−Ｏテスト：発酵性

【００２２】１７）糖の資化性 (1) Ｌ−アラビノース：陽性 (2) Ｄ−キシロース：陽性 (3) Ｄ−グルコース：陽性 (4) Ｄ−マンノース：陽性 (5) Ｄ−フラクトース：陽性 (6) Ｄ−ガラクトース：陽性

【００２３】(7) 麦芽糖：陽性 (8) 乳糖：陰性 (9) トレハロース：陽性 (10) Ｄ−ソルビット：陽性 (11) Ｄ−マンニット：陽性 (12) イノシット：陰性 (13) グリセリン：陽性 (14) デンプン：陰性

【００２４】（ｄ）その他の性質 １）アンピシリン耐性 ２）ｈＭ−ＣＳＦ産生 ３）ベクターｐＺＡＣ１１８を保持する

【００２５】次に、本発明のｈＭ−ＣＳＦの製造法につ
いて詳述する。前記のようにして得られた本発明のエシ
ェリキア(Escherichia) 属に属する微生物を培養し、該
微生物が産生するｈＭ−ＣＳＦを採取する。該微生物の
培養は、アンピシリンを含むことを除き、大腸菌を培養
するための通常の培地を使用することができるが、２０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地
［１．６％バクトトリプトン、１．０％酵母エキス、及
び０．５％食塩からなる。モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) ，第３巻，第２版，コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press) ，１９８９年］を使用す
ることが特に望ましい。

【００２６】前培養した菌体懸濁液を、培地に添加して
培養し、対数増殖後期に１ｍＭの濃度でイソプロピルチ
オ−β−Ｄ−ガラクトシドを培養液に添加し、更に約４
時間培養し、ｈＭ−ＣＳＦを産生させる。次いで、培養
液から遠心分離等により菌体を回収し、洗浄し、菌体を
破砕し、遠心分離等により顆粒体を回収する。

【００２７】回収した顆粒体に、尿素、ジチオスレイト
ール及びエチレンジアミン四酢酸を添加して攪拌し、顆
粒体を可溶化し、遠心分離して上清を得る。得られた上
清を常法によりゲルろ過し、所定の画分を分画し、常法
により遠心濃縮し、ｈＭ−ＣＳＦ単量体（以下単量体と
記載する）を分離し、常法により少なくとも１４１時間
リフォルディングを行い、ｈＭ−ＣＳＦ二量体（以下二
量体と記載する）とする〔バイオ／テクノロジー(Bio/T
echnology)，第７巻，第７１０ページ，１９８９年、及
びジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of
Biochemistry)，第１９７巻，第４０４ページ，１９９
１年］。次いで、常法（例えば、疎水相互作用クロマト
グラフィー等）により二量体を分離、精製し、ほぼ純粋
な二量体を得る。

【００２８】以上のようにして得たｈＭ−ＣＳＦは、公
知の方法［オーストラリアン・ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディカル・
サイエンス（Australian Journal of Experimental Bio
logy and Medical Science)，第４４巻，第２８７ペー
ジ，１９６６年〕により、天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の
比活性を有することを確認し得る。

【００２９】次に、試験例を示して本発明を詳述する。 試験例１ この試験は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより溶出さ
れる分画を調べるために行った。後記する実施例３と同
一の方法により、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施し
た。溶出液を２ｍｌずつ分画し、各分画の２９０ｎｍに
おける吸光度を測定し、データ処理装置（島津製作所、
ＣＲ−４Ａ）を用いて解析し、得られた各画分を後記す
る試験例４と同一の方法によるＳＤＳ−電気泳動にか
け、クマーシーブルー（以下ＣＢＢと記載する）染色し
た。染色されたタンパク質のバンドから、単量体に相当
する分画を確認した。

【００３０】この試験の結果は、図２に示すとおりであ
る。図２は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出曲
線であり、縦軸及び横軸は、それぞれ、２９０ｎｍにお
ける吸光度及び分画番号である。図２から明らかなよう
に、５つのピークが得られたが、試験例４と同一の方法
によるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、分画番号２４〜３
０のピークが単量体であることが判明した。

【００３１】従って、本発明においては、所望の単量体
を含む分画番号２４〜３０のピーク、即ち分画開始から
４８〜６０ｍｌの溶出液を回収する。尚、実施例２で作
出したｈＭ−ＣＳＦ発現大腸菌を用いて産生させた場合
にもほぼ同様の結果が得られた。

【００３２】試験例２ この試験は、リフォルディングの時間を調べるために行
った。後記する実施例３と同一の方法により、リフォル
ディングを実施した。ただし、リフォルディング用緩衝
液に濃縮したゲルろ過画分を添加した時点を時間０と
し、以後１．５時間、４時間、９時間、２４時間、４８
時間、７４時間、１２２時間、１４１時間及び１６６時
間経過後に試料を採取し、カルボキシメチル化し、ゲル
ろ過クロマトグラフィーにより分画し、生じた二量体の
比率をゲルろ過クロマトグラムから計算した。

【００３３】その結果、１４１時間経過以降は二量体の
形成率が約８５％で頭打ちになることが判明し、これ以
上の反応は効果がないものと認められた。従って、本発
明においては、少なくとも１４１時間のリフォルディン
グが必要である。尚、後記する実施例２で作出したｈＭ
−ＣＳＦ発現大腸菌を用いて産生させた場合にもほぼ同
様の結果が得られた。

【００３４】試験例３ この試験は、単量体と二量体との分離を調べるために行
った。後記する実施例３と同一の方法により、疎水相互
クロマトグラフィーを実施し、溶出液を１０ｍｌずつ分
別し、各分画を２９０ｎｍで吸光度を測定し、更に各分
画を試験例４と同一の方法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで確
認し、溶出される分画を試験した。

【００３５】その結果は、図３に示すとおりである。図
３は、疎水相互作用クロマトグラフィーによる溶出曲線
であり、左縦軸、右縦軸及び横軸は、それぞれ、２９０
ｎｍにおける吸光度、硫酸アンモニウム濃度及び分画番
号であり、図中の実線及び破線は、それぞれ、溶出曲線
及び硫酸アンモニウム濃度を示す。図３から明らかなよ
うに、４つのピークが得られたが、試験例４と同一の方
法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から分画番号５７〜６
３に二量体が溶出されていることが判明した。従って、
本発明においては、所望の二量体を含む分画番号５７〜
６３のピーク、即ち分画開始から５７０〜６３０ｍｌの
溶出液を回収する。尚、後記する実施例２で作出したｈ
Ｍ−ＣＳＦ発現大腸菌を用いて産生させた場合にもほぼ
同様の結果が得られた。

【００３６】試験例４ この試験は、得られたｈＭ−ＣＳＦの各種性状を調べる
ために行った。 １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 単量体の場合は、市販の８４×９０×１ｍｍの１０〜２
０％ゲル（第一化学薬品製）を用い、６０ｍＡの定電
流、１５０〜３００Ｖの電圧の条件で、二量体の場合
は、市販の７７×８３×１ｍｍの８〜１６％ゲル（テフ
コ社製）を用い、１８ｍＡの定電流、１００〜２００Ｖ
の電圧の条件で泳動を行った。泳動用緩衝液の組成は、
３．０３ｇトリス、１４．４ｇグリシン、０．１ｇドデ
シル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと記載する）／ｌであ
った。

【００３７】試料は、緩衝液［０．０６２５Ｍトリス−
塩酸、２％ＳＤＳ、１０％ショ糖、０．００２％ブロム
フェノールブルー（以下ＢＰＢと記載する）、ｐＨ６.
８］の３倍濃厚液を用いて希釈し、室温で１０〜２０分
間放置した後、泳動を行った。泳動により得られたゲル
を、０．２５％（重量／容量）ＣＢＢを含む４５％（容
量）メタノール、１０％（容量）酢酸水溶液を用いて室
温で６０分間染色し、２５％（容量）エタノール、１０
％（容量）酢酸水溶液で十分に脱色し、タンパク質のバ
ンドを検出した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還
元）上で後記する実施例３と同一の方法により得られた
ｈＭ−ＣＳＦの分子量は５８ｋＤであった。

【００３８】２）タンパク質の定量 タンパク質の含量は、色素結合法であるブラッドフォー
ド法（バイオラド社製）により定量を行った。ただし、
ウシγ−グロブリンを検量線用標準タンパク質として使
用した。試料液量２０μｌに対して色素５倍希釈液１ｍ
ｌを添加し、室温で１０分間以上放置し、５９５ｎｍに
おける吸光度を測定し、標準タンパク質から得られた検
量線に基づいてタンパク質の含量を算出した。後記する
実施例３と同一の方法により得られたｈＭ−ＣＳＦは、
タンパク質濃度１. ４ｍｇ／ｍｌ、純度は９５％以上で
あった。

【００３９】３）Ｎ末端アミノ酸配列分析 後記する実施例３と同一の方法により得られたｈＭ−Ｃ
ＳＦを脱塩し、ピリジルエチル化し、ペプチドシーケン
サー（アプライドバイオシステムズ社製、４７３Ａ）を
用いて、そのＮ末端からのアミノ酸配列を分析した。

【００４０】その結果、配列表の配列番号２に示すよう
に、Ｎ末端（１残基目）にメチオニン残基が付加されて
いたが、それ以降の２２残基までは公知のｈＭ−ＣＳＦ
のアミノ酸配列と一致していた。Ｎ末端にメチオニン残
基が存在していたことから、少なくともこのＮ末端メチ
オニンはホルミル基等で修飾されていないことが明らか
であった。

【００４１】Ｎ末端がアシル化されている可能性も考え
られるので、Ｎ末端デブロッキングキット（宝酒造社
製）を用いて脱アシル化酵素処理し、確認試験を行った
が、そのような兆候は認められなかった。

【００４２】４）生物活性 生物活性を、Ｃ５７ＢＬマウスの大腿骨骨髄を用いた公
知の軟寒天培養法［オーストラリアン・ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデ
ィカル・サイエンス（Australian Journal of Experime
ntal Biology and Medical Science），第４４巻，第２
８７ページ，１９６６年］により測定した。その結果、
後記する実施例３と同一の方法により得られたｈＭ−Ｃ
ＳＦの生物活性は、２×１０⁸ 単位／ｍｇあった。

【００４３】５）エンドトキシン含量 市販のパイロジェントシングルテスト用キット（第一化
学薬品社製、検出限界０．０６ＥＵ／ｍｌ）を用いてエ
ンドトキシン含量を測定した。その結果、後記する実施
例３と同一の方法により得られたｈＭ−ＣＳＦのエンド
トキシン含量は、ｈＭ−ＣＳＦ１００μｇ当たり０．０
６ＥＵ未満であり、動物実験等に使用しても発熱及び他
のサイトカインの副次的な誘導の危険性はないものと認
められた。尚、後記する実施例２で作出したｈＭ−ＣＳ
Ｆ発現大腸菌を用いて産生させた場合にも、前記各性状
とほぼ同様の結果が得られた。

【００４４】

【実施例】次に、実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１ ｈＭ−ＣＳＦ遺伝子（ジェネティックス・インスティテ
ュート社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）の複製オリ
ジン、アンピシリン耐性遺伝子（宝酒造社製）、ｌａｃ
Ｉ^q 遺伝子（ファルマシア社製）、公知の方法［メソー
ズ・ニン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology
），第１８６巻，第９４ページ，アカデミック・プレ
ス(Academic Press)社，１９９０年］により合成した２
−シストロンシステム及びｔａｃプロモーター（ファル
マシア社製）を使用し、常法により、それぞれ、図１の
制限地図で示される構造に連結して組み込むことによっ
て、分子量約５．１ｋｂｐのプラスミドからなるベクタ
ーｐＺＡＣ１１８を調製した。この発現ベクターを、常
法のカルシウム法により、大腸菌ＮＭ５２２株（ストラ
タジーン社製）に導入して形質転換し、ｈＭ−ＣＳＦ発
現大腸菌を作出した。前記したように、該大腸菌は、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託済みであり、エ
シェリキア・コリ(Escherichia coli)ＭＯ９３０１、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３３８１なる受託番号が付与されてい
る。

【００４５】実施例２ 大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造社製）を用いたことを除
き、実施例１と同一の方法により、ｈＭ−ＣＳＦ発現大
腸菌を作出した。

【００４６】実施例３ ｈＭ−ＣＳＦ発現大腸菌の培養 実施例１で作出したｈＭ−ＣＳＦ発現大腸菌を、２００
μｇ／ｍｌの割合でアンピシリンを含む前記２ｘＹＴ培
地（１．６％バクトトリプトン、１．０％酵母エキス、
０．５％塩化ナトリウム）で前培養し、菌体懸濁液を同
一組成の培地２ｌに１％（容量）添加し、３ｌの培養槽
で通気しながら培養し、対数増殖後期（Ｏ．Ｄ．６６０
＝０．６〜０．８）に達した段階で、１ｍＭの濃度でイ
ソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（宝酒造社製）
を添加し、更に４時間培養した。

【００４７】顆粒体の調製 前記の培養液を遠心して菌体を回収し、１０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、菌体破砕装置
（レイニー社製、ミニラボ）を用いて細菌を破砕し、再
度遠心分離して顆粒体を含む沈澱を回収し、緩衝液で顆
粒体を懸濁した。

【００４８】顆粒体の可溶化 前記で得られた顆粒体に、尿素、ジチオスレイトール
及びエチレンジアミン四酢酸を、それぞれ、８Ｍ、１０
ｍＭ及び１ｍＭの最終濃度で加え、更に脱イオン水を加
え、最終液量を２０ｍｌに調整し、室温で２時間撹拌し
て顆粒体を還元し、可溶化し、顆粒体溶液を超遠心（１
００，０００×ｇで３０分間）して上清を得た。

【００４９】ゲルろ過 得られた上清を孔径０．４５μｍの無菌ろ過膜を用いて
ろ過し、予め８Ｍ尿素、１ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭエチレンジアミン四酢酸、及び０．１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．９）で平衡化した分取用ゲルろ
過カラムＧ３０００ＳＷ（東ソー社製、２１．５ｍｍ×
６００ｍｍ＋ガードカラム）に通液し、同一緩衝液を４
ｍｌ／分の流速で通液し、４８〜６０ｍｌの溶出分画を
回収し、遠心濃縮器（アミコン社製、セントリプレップ
−１０、分画分子量１０ｋＤ）を用いて遠心濃縮した。

【００５０】リフォルディング ２ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍＭ酸化型グルタチオ
ン、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％（容量）アジ化ナト
リウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
５）に対して、前記濃縮したゲルろ過画分を蛋白濃度で
０．６ｍｇ／ｍｌとなるように徐々に添加し、そのまま
４℃で１４１時間連続撹拌（５０ｒｐｍ）してリフォル
ディングした。

【００５１】疎水相互作用クロマトクラフィー 前記の反応液を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）に対して、十分透析（分画分子量６，０００
〜８，０００ｋＤ）し、硫酸アンモニウム（粉末）を
１．２Ｍの最終濃度で添加し、ｐＨをリン酸二ナトリウ
ムで７．０に調整し、遠心（１７，０００×ｇ、３０分
間）して上清を得た。

【００５２】得られた上清を、予め０．５Ｎ水酸化ナト
リウムで脱パイロジェン化し、更に１．２Ｍ硫酸アンモ
ニウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したフェニルトヨパール（東ソー社製、Ｍ
−６５０、２５ｍｍ×８．７ｃｍ、カラム体積４３ｍ
ｌ）に添加し、前記緩衝液で洗浄し、更に０．８Ｍ硫酸
アンモニウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で十分に洗浄し、次いで硫酸アンモニウムの濃
度を０．８Ｍから０Ｍまでの直線濃度勾配により変化さ
せて３．３ｍｌ／分の通液速度で通液し、５７０〜６３
０ｍｌの溶出液を回収し、前記と同一の遠心濃縮器によ
り濃縮し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸
ナトリウム、ｐＨ７．０に対して透析し、無菌ろ過し、
二量体約１００ｍｇを得た。

【００５３】実施例４ 実施例２で作出したｈＭ−ＣＳＦ発現大腸菌を用いたこ
とを除き、実施例３と同一の方法により、二量体約８０
ｍｇを得た。

【００５４】

【発明の効果】以上詳述したとおり、本発明は、配列表
の配列番号１に記載したアミノ酸配列を有するヒト型コ
ロニー刺激因子をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた
ｈＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐＺＡＣ１１８を保持するエ
シェリキア(Escherichia) 属に属する新規微生物、及び
該微生物を培養し、該微生物が産生するヒト型コロニー
刺激因子を採取することを特徴とするヒト型コロニー刺
激因子の製造方法に係るものであり、本発明によって奏
せられる効果は、次のとおりである。

【００５５】１）天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の比活性を
有するｈＭ−ＣＳＦを安定、かつ確実に産生するエシェ
リキア(Escherichia) 属に属する微生物を簡便に作出し
得る。 ２）天然型ｈＭ−ＣＳＦと同等の比活性を有するｈＭ−
ＣＳＦを大量、かつ安価に製造し得る。

【００５６】

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：２２４ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状態 配列の種類：ペプチド 配列 Met Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His 1 5 10 15 Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys 20 25 30 Gln Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val 35 40 45 Cys Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp 50 55 60 Thr Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln 65 70 75 80 Leu Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr 85 90 95 Glu Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu 100 105 110 Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu 115 120 125 Leu Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe 130 135 140 Ala Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys 145 150 155 160 Leu Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro 165 170 175 His Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp 180 185 190 Glu Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln 195 200 205 Pro Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg 210 215 220

【００５７】 配列番号 ：２ 配列の長さ：２３ 配列の型 ：アミノ酸 トポロジー：直鎖状態 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：配列番号１のペプチドのＮ末端 配列 Met Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His 1 5 10 15 Leu Gln Ser Leu Gln Arg Leu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐＺＡＣ１１８の制
限地図である。

【図２】ゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出曲線で
ある。

【図３】疎水相互作用クロマトグラフィーによる溶出曲
線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ 8314−4Ｃ ＡＤＮ ＡＤＵ ＡＤＷ Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列を有するヒト型コロニー刺激因子をコードするＤＮ
   Ａ配列が組み込まれたベクターｐＺＡＣ１１８を保持す
   るエシェリキア(Escherichia) 属に属する微生物。
2. 【請求項２】 エシェリキア(Escherichia) 属に属する
   微生物が、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＭＯ
   ９３０１、ＦＥＲＭ Ｐ−１３３８１である請求項１に
   記載の微生物。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列を有するヒト型コロニー刺激因子をコードするＤＮ
   Ａ配列が組み込まれたベクターｐＺＡＣ１１８を保持す
   るエシェリキア(Escherichia) 属に属する微生物を培養
   し、該微生物が産生するヒト型コロニー刺激因子を採取
   することを特徴とするヒト型コロニー刺激因子の製造
   法。
4. 【請求項４】 エシェリキア(Escherichia) 属に属する
   微生物が、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)ＭＯ
   ９３０１、ＦＥＲＭ Ｐ−１３３８１である請求項３に
   記載のヒト型コロニー刺激因子の製造法。