JPH06233688A - 植物ウィルス改良転写ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】外来蛋白質を植物細胞内で生産する能力を有す
るトバモウィルスＲＮＡを試験管内で転写するのに適
し、試験管内転写を行うときに線状化処理を必要としな
いように改良された転写ベクタ−（ＤＮＡ）に関する。 【構成】５’末端より３’末端の方向において、i)
トバモウィルスの５’非翻訳領域、ii) トバモウィル
スの複製酵素コ−ド領域、iii) 外来遺伝子連結領域、
iv) トバモウィルスの３’非翻訳領域を含み、該ト
バモウィルス領域の５’側に宿主細胞により認識されな
い転写プロモ−タ−領域、３’側に転写タ−ミネ−タ−
領域を有し、宿主細胞内での複製開始点と選択マ−カ
−遺伝子を有する転写ベクタ−に関する。 【効果】本発明を利用することにより、該ＲＮＡウィル
スを用いて植物細胞内で外来蛋白質を大量に生産するこ
とが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、外来蛋白質を植物細胞
内で生産する能力を有するトバモウィルスＲＮＡを試験
管内で転写するのに適し、遺伝子操作に使用し得る大腸
菌等の宿主中において安定に複製され、試験管内転写を
行うときに線状化処理を必要としないように改良された
転写ベクタ−（ＤＮＡ）に関する。

【０００２】本発明を利用することにより、組換えＲＮ
Ａウィルスの製造が容易となり、該ＲＮＡウィルスを用
いて植物細胞内で外来蛋白質を大量に生産することが可
能になる。

【０００３】

【従来の技術】トバモウィルス（tobamovirus ）はＲＮ
Ａウィルスの一種であり、植物細胞内で自己複製を行い
得ることが知られている。このウィルスＲＮＡに対する
ｃＤＮＡに、外来遺伝子をコ−ドする遺伝子を組み込
み、該組換えｃＤＮＡを試験管内にて転写して組換えト
バモウィルスＲＮＡを調製し、このＲＮＡを植物細胞へ
導入して外来蛋白質を製造するための技術が報告されて
いる（例えば、 Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 83, 5043
-5047 (1986)：特開平1-120190号：特開平2-49591号：
EMBO J. 6, 307-311 (1987)： FEBS Letters 269, 73-7
6 (1990) ）。

【０００４】本技術は以下のように要約される。

【０００５】（１）(イ) 転写プロモ−タ−、及び、トバ
モウィルスＲＮＡに対するｃＤＮＡを、この順に連結し
たＤＮＡ、(ロ) 複製開始領域、及び、(ハ) 選択マ−カ−
の３者を連結したＤＮＡベクタ−（以下「転写ベクタ
−」という。）を調製し、大腸菌等の、ＤＮＡベクタ−
の複製が可能な宿主内で増殖させる。該転写ベクタ−の
一例として報告されているｐＬＦＷ３（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 83 ,5043-5047 (1986) ）の遺伝子地図
を図１に示す。

【０００６】図中、「５’ＮＴ」、「１８０Ｋ／１３０
Ｋ」、「３０Ｋ」、「ＣＰ」、「３’ＮＴ」は、それぞ
れタバコモザイクウィルスエル（ＴＭＶＬ）のｃＤＮＡ
の５’非翻訳領域（配列表配列番号１のヌクレオチド番
号1 〜71に相当する）、複製酵素コ−ド領域（配列表配
列番号１のヌクレオチド番号72〜4922に相当する）、植
物細胞間移行蛋白質コ−ド領域（配列表配列番号５のヌ
クレオチド番号4906〜5700に相当する）、コ−ト蛋白質
コ−ド領域（配列表配列番号７のヌクレオチド番号5703
〜6182に相当する）、３’非翻訳領域（配列表配列番号
７のヌクレオチド番号6183〜6384に相当する）を表す。
「Pm promoter 」とは、文献（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 7066-7070 (1984) ） に示されたラムダファ
−ジ由来の温度感受性プロモ−タ−を表す。Pmプロモ−
タ−に続く「Ｇ」は、ＴＭＶＬの第１番目のヌクレオチ
ドに相当し、その下の「Ｃ」はその相補ヌクレオチド
で、試験管内転写の際、ウィルスＲＮＡの鋳型となるＤ
ＮＡの最初のヌクレオチドを表す。「lacZ promoter 」
とは、大腸菌由来のベ−タ−ガラクトシダ−ゼ遺伝子上
流のプロモ−タ−を表す。「ORI 」は、大腸菌内での複
製開始点を表す。betalactamaseはベ−タ−ラクタマ−
ゼ遺伝子のことで、矢印の方向に発現し、アンピシリン
耐性の表現形質を大腸菌内に賦与する。「PstI」、 「Ec
oRI 」、 「XbaI」、 「BamHI 」、 「KpnI」、 「MluI」、
「BamHI 」はそれぞれ制限酵素名を表し、指し示す部位
にそれぞれの酵素の認識配列が存在することを表す。こ
のうちMluI は、pLFW3 を試験管内転写する際、線状化
するのに用いられるサイトである。「(9.91Kb)」は、こ
のベクタ−プラスミドのサイズが、9.91キロベ−スペア
であることを表す。これらの略号は、第２図〜第１４図
にも共通である。

【０００７】（２）該転写ベクタ−を宿主細胞より抽出
する。

【０００８】（３）該転写ベクタ−に含まれるウィルス
相当領域のうち、植物細胞間移行蛋白質又はコ−ト蛋白
質をコードする領域を所望の外来蛋白質遺伝子で置換す
る。このように作製されたベクタ−ＤＮＡを以下、「組
換え転写ベクタ−」という。

【０００９】（４）上記の組換え転写ベクタ−のウィル
ス相当領域３’末端近傍を制限酵素等で切断することに
より線状化する。

【００１０】（５）この線状化ベクタ−中の転写プロモ
−タ−を認識するＲＮＡポリメラ−ゼを触媒とし、該線
状化ベクタ−中のウィルス相当領域の最初のヌクレオチ
ド（Ｇ）より該切断部位まで転写を行い、ＲＮＡを製造
する。

【００１１】（６）植物細胞に、このＲＮＡを導入す
る。

【００１２】上記の（１）〜（５）に記載したベクタ−
系を用いることにより、改変したコ−ト蛋白質（Virolo
gy 173, 11-20 (1989) ）、クロラムフェニコ−ルアセ
チルトランスフェラ−ゼ（特開平1-120190号： EMBO J.
6, 307-311 (1987)）、コ−ト蛋白質とエンケファリン
との融合蛋白質（特開平2-49591 号：FEBBS Letters26
9, 73-76 (1990) ）等の外来蛋白質を植物内で生産した
例が報告されている。

【００１３】しかし、従来用いられていた転写ベクタ−
を大腸菌等の宿主細胞内で増殖させた場合、この宿主細
胞が高頻度で死滅するといった宿主の生存率の低下や、
該転写ベクタ−の性状が宿主の増殖に伴い変化するとい
う転写ベクタ−の不安定性等がしばしば観察されてい
た。したがって、本ベクタ−系を使用して外来蛋白質を
大量に生産することは、事実上困難であった。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、このよ
うな宿主の生存率の低下や転写ベクタ−自体の不安定性
を解消するために、従来用いられてきた転写ベクタ−に
ついて種々の遺伝子工学的改変を試みた。そして、転写
ベクタ−に含まれるウィルス領域５’末端に宿主細胞に
よって認識を受けない転写プロモ−タ−、ウィルス領域
３’末端に転写タ−ミネ−タ−を連結した転写ベクタ−
を作製し、該転写ベクタ−が上記問題点を解消すること
を見い出した。同時にウィルス領域末端に転写タ−ミネ
−タ−領域を連結することにより、試験管内転写を行う
ときに線状化処理を必要としないことも見い出し、本発
明を完成させた。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、 ５’末端より３’末端の方向において、 i) トバモウィルスの５’非翻訳領域 ii) トバモウィルスの複製酵素コ−ド領域 iii) 外来遺伝子連結領域 iv) トバモウィルスの３’非翻訳領域 を含み、 該トバモウィルス領域の５’側に宿主細胞により認識
されない転写プロモ−タ−領域、３’側に転写タ−ミネ
−タ−領域を有し、 宿主細胞内での複製開始点と選択マ−カ−遺伝子を有
する 転写ベクタ−に関する。

【００１６】トバモウィルス（tobamovirus ）とは、お
よそ6000-7000 ヌクレオチド長の１本鎖ＲＮＡをゲノム
とする棒状の植物ウィルスであり、この例としてトマ
ト、タバコ等のナス科植物を宿主とするタバコモザイク
ウィルスブルガーレ（TMV Vulgare;Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79, 5818-5822 (1982) ）、タバコモザイクウ
ィルスエル（TMVL; J. Biochem. 96, 1915-1923 (198
4) ）、タバコマイルドグリ−ンモザイクウィルス（TMG
MV;Virology 177, 553-558 (1990)）、キュウリやメロ
ン等のウリ科植物を宿主とするキュウリ緑班モザイクウ
ィルス（CGMMV;J.Gen.Virol. 72, 1487-1495 (1991)
）、コショウやピ−マン等のナス科植物を宿主とする
ペッパ−マイルドモットルウィルス（PMMV; J. Gen. Vi
rol 72, 2875-2884 (1991) ）、ラン等を宿主とするオ
ドントグロッサムリングスポットウィルス（ORSV; Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7204-7208 (1991) ）、
ササゲ等の豆科植物を宿主とする系統（Cc）、ニンニ
ク等のユリ科植物やアブラナ科を宿主とする系統（C
g）、ピ−マン等のナス科植物を宿主とする系統(Ob)等
が知られている。

【００１７】トバモウィルスのゲノムは、５’非翻訳領
域、ウィルスの複製に必要な２種の複製酵素をコ−ドす
る複製酵素コ−ド領域、ウィルスの植物細胞間移行蛋白
質をコ−ドする領域、ウィルスのコ−ト蛋白質をコ−ド
する領域、および３’非翻訳領域より構成される１本鎖
ＲＮＡである。

【００１８】トバモウィルスの５’非翻訳領域（5' non
coding region ）とは、ＴＭＶＬのｃＤＮＡにおいて
は、配列表配列番号１のヌクレオチド番号1 〜71に相当
する領域をいう。５’非翻訳領域は、トバモウィルスの
複製開始を正確に規定し、複製されたＲＮＡがキャップ
構造をとり、ＲＮＡが安定化するために必要な領域であ
る。また、この領域の配列は、オメガ配列（Ω配列）と
も呼ばれ、植物細胞への感染初期に自らを複製するため
に必要な複製酵素を発現させるために必要なエンハンサ
−配列であると考えられている（Nucl. Acids Res. 15,
3257-3273 (1987) ：Nucl. Acids Res. 16, 883-893
(1988) ）。この領域を欠失したトバモウィルスＲＮＡ
は、植物内で複製されないことが示されている。したが
って、５’非翻訳領域は、トバモウィルスがウィルスと
して植物内で増殖するために必須な領域である。

【００１９】トバモウィルスの複製酵素コ−ド領域（re
plication enzyme coding region）とは、５’非翻訳領
域に続くおよそ4800ヌクレオチドより成る領域で、複製
に関与する２種の酵素をコ−ドする領域のことである。
ＴＭＶＬのｃＤＮＡにおいては、配列表配列番号１のヌ
クレオチド番号72〜4922に相当し、この領域は、130K蛋
白質（配列表配列番号２のアミノ酸配列1 〜1116）およ
びそのリ−ドスル−蛋白質である180K蛋白質（配列表配
列番号２のアミノ酸番号1 〜1116、Tyr 、配列表配列番
号４のアミノ酸番号1 〜499 をこの順に接続したもの）
をコ−ドしている。複製酵素コ−ド領域は、トバモウィ
ルスがウィルスとして植物内で増殖するために必須な領
域である（Nuleic Acid Research, 14, 8291-8305 (198
6)）。

【００２０】トバモウィルスの植物細胞間移行蛋白質コ
−ド領域（movement protein coding region）とは、ウ
ィルスが隣接した植物細胞間を移行するのに必要な分子
量およそ30K の蛋白質をコ−ドする領域のことである。
ＴＭＶＬのｃＤＮＡにおいては、配列表配列番号５のヌ
クレオチド番号4906〜5700に相当し、この領域は30K白
質（配列表配列番号６のアミノ酸配列1 〜264 ）をコ−
ドしている。この領域は感染葉における感染範囲を増大
させるためには必要であるが、ウィルスの複製には関与
しないことが示されている（ EMBO J. 6, 2557-2563
(1987) ）。

【００２１】トバモウィルスのコ−ト蛋白質コ−ド領域
（coat protein coding region）とは、コ−ト蛋白質ま
たは外被蛋白質と呼ばれる分子量約18K の蛋白質をコ−
ドする領域である。ＴＭＶＬのｃＤＮＡにおいては、配
列表配列番号７のヌクレオチド番号5703〜6182に相当
し、この領域は18K 蛋白質（配列表配列番号８のアミノ
酸配列1 〜154 ）をコ−ドしている。コ−ト蛋白質はウ
ィルスが粒子を形成したり、上葉への遠い距離を移行す
るために必要な蛋白質であるが、ウィルスの複製には関
与しないことが示されている。（EMBO J. 6, 2557-2563
(1987) ）。

【００２２】トバモウィルスの３’非翻訳領域（3' non
coding region ）とは、ＴＭＶＬのｃＤＮＡにおいて
は、配列表配列番号７のヌクレオチド番号6183〜6384に
相当する。３’非翻訳領域は、ｔＲＮＡと類似の高次構
造とシュ−ドノットと呼ばれる高次構造をとっており、
ウィルスＲＮＡの安定化、トバモウィルスの複製終結点
の規定、複製の鋳型となるマイナス鎖のＲＮＡの正確な
複製に必要な領域であると考えられている。この領域を
欠失したトバモウィルスＲＮＡは植物内で複製されない
ことが示されている（J. Virology 64, 3686-3693 (19
90) ）。したがって ３’非翻訳領域は、トバモウィル
スがウィルスとして植物内で増殖するために必須な領域
である。

【００２３】すなわち、トバモウィルスが植物細胞内で
複製するために必要十分な領域は、５’非翻訳領域、複
製酵素コ−ド領域、および３’非翻訳領域である。これ
ら３つの領域は、同一のトバモウィルス由来のものであ
ることが好ましいが、植物細胞内での複製が可能である
ならば、それぞれの領域を他種のトバモウィルス由来の
該領域に置換したキメラＲＮＡであってもよい（例え
ば、J. virology 65, 3451-3459 (1991) ：Virology 1
64,290-293 (1988) ）。したがって、転写ベクタ−を構
成するのi),ii),iv)に示される領域は、同一のトバモ
ウィルスｃＤＮＡ由来のものであることが好ましいが、
それぞれの領域を他種のトバモウィルスｃＤＮＡ由来の
該領域に置換したＤＮＡであってもよい。

【００２４】転写ベクタ−を構成するのiii)に示され
る外来遺伝子連結領域は、複製酵素コ−ド領域と３’非
翻訳領域の間に存在することが必要であり、組換えに必
要な制限酵素サイトがあることが好ましく、さらに好適
には植物細胞間移行蛋白質領域を含み、最適にはコ−ト
蛋白質領域を含むものである。制限酵素サイトは、植物
細胞間移行蛋白質領域またはコ−ト蛋白質領域に存在す
るものを使用することも可能であるし、植物細胞間移行
蛋白質領域またはコ−ト蛋白質領域とは別に作製するこ
とも可能である。外来遺伝子は、その遺伝子がコ−ドす
る蛋白質を独立に発現させるように挿入することも可能
であるが、植物細胞間移行蛋白質やコ−ト蛋白質との融
合蛋白質として発現させるように挿入することもでき
る。

【００２５】の宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、
酵母、真菌類等の微生物で遺伝子組換え操作が容易に行
うことの可能なものが好ましい。ＴＭＶ領域の転写産物
は宿主細胞に対して毒性を示すことが推察されているた
め、転写プロモ−タ−は、宿主細胞により認識されない
ことが必須である。転写ベクタ−の転写プロモ−タ−と
して、宿主以外の微生物、動物細胞、植物細胞、ウィル
ス由来のプロモ−タ−で、宿主由来のＲＮＡポリメラ−
ゼにより認識されないプロモ−タ−を使用することがで
きるが、後の試験管内転写の操作を容易に行うため該プ
ロモ−タ−を認識するＲＮＡポリメラ−ゼが安定で且つ
容易に入手できるものであることが好ましい。例えば宿
主細胞が大腸菌の場合、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６等のファ−
ジ由来の転写プロモ−タ−は、大腸菌由来のＲＮＡポリ
メラ−ゼによる認識を受けないため好適に使用されう
る。また、ラムダファ−ジ由来の一般のプロモ−タ−は
大腸菌由来のＲＮＡポリメラ−ゼにより認識されるため
好適ではないが、温度感受性となったラムダファ−ジ由
来のＰｍプロモ−タ−下流の遺伝子は、大腸菌由来のＲ
ＮＡポリメラ−ゼにより３７℃で転写されるが３０℃で
は転写されないため、宿主細胞が３０℃で培養される大
腸菌である場合は好適に使用され得る。

【００２６】転写タ−ミネ−タ−は、転写プロモ−タ−
を認識するＲＮＡポリメラ−ゼにより認識されるもので
あることが必要であり、例えば、上記のＴ７、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６ファ−ジ由来のプロモ−タ−に対応してそれぞれＴ
７、Ｔ３、ＳＰ６ファ−ジ由来の転写タ−ミネ−タ−を
使用することができる。

【００２７】転写プロモ−タ−および転写タ−ミネ−タ
−はそれらの起源生物または起源ウィルスより取得する
ことも可能であるが、それぞれの機能を有する最小領域
のヌクレオチドを合成したものを用いることも可能であ
る。

【００２８】の複製開始点は、宿主内での転写ベクタ
−の複製を可能ならしめるものであることが必要であ
る。また、選択マ−カ−としては、アンピシリン、クロ
ラムフェニコ−ル、テトラサイクリン、カナマイシン、
ネオマイシン、ゲンタマイシン等のそれぞれの薬剤に対
して耐性となる耐性遺伝子マ−カ−、宿主細胞の栄養要
求性や炭素源の資化能の欠損等を相補する相補遺伝子マ
−カ−等が挙げられる。トバモウィルスＲＮＡの完全長
のｃＤＮＡは、逆転写酵素でＲＮＡを逆転写する公知の
方法で容易に作製することができる。例えば、ＴＭＶＬ
のｃＤＮＡの作製は、（ J.Biochem. 96, 1915-1923 (1
984)）に記載の方法で製造できる。

【００２９】トバモウィルスｃＤＮＡ、転写プロモ−タ
−、転写タ−ミネ−タ−、宿主細胞の複製開始点、選択
マ−カ−遺伝子、外来遺伝子連結領域、外来遺伝子等の
遺伝子の切断および連結、形質転換、選択培地への塗
布、プラスミドの抽出、電気泳動によるプラスミドの確
認、は基本的には公知の方法（ "Molecular Cloning -A
Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory,
NY (1982)）に従って行うことができる。ただし実施例
に示したように、中間的に作製されるベクタ−の安定性
が悪い場合には、形質転換、プラスミドの抽出の方法を
一部改変することが好ましい。

【００３０】例えば、第６図に示した転写ベクタ−pTLW
3 を保持する大腸菌HB101 株は、ＬＢ培地内で３７℃で
培養すると、高い頻度で死滅したり、プラスミドの性状
が変化するといった現象がしばしば観察される。この現
象は、pTLW3 を保持する大腸菌HB101 株を、ＬＢ培地内
で26℃で培養した場合にはほとんど観察されない。そこ
で、TMVcDNA の全領域を保持するベクタ−を用いて大腸
菌を形質転換する際は、形質転換法最後の熱ショックを
行わずに、選択圧のかかったＬＢ固型培地に塗布し、26
℃で約40時間の静置培養を行ったり、該ベクタ−プラス
ミドを抽出するための液体振とう培養を、25-30 ℃の条
件で行う等の改変が必要である。

【００３１】転写ベクタ−ＤＮＡの配列決定は、例えば
ダイデオキシヌクレオチド鎖終結法（Gene 19, 269-276
(1982) ）等により行うことができる。

【００３２】転写ベクタ−の試験管内転写は、公知の方
法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,81, 7066-7070 (198
4) ）を利用して行うことができる。

【００３３】製造されたＲＮＡは、公知のエレクトロポ
−レ−ション法（FEBS Letters, 219, 65-69 (1987) ）
により植物細胞プロトプラスト内に導入することが可能
である。また、植物体にカ−ボランダム等の研磨剤等を
用いてＲＮＡをこすりつけ、直接接種することも可能で
ある。プロトプラストとは、細胞壁分解酵素を用いて植
物細胞の細胞壁を溶解し、細胞膜を露出させることによ
り等張液中で球状になった細胞のことである。エレクト
ロポ−レ−ション法により、組換えトバモウィルスＲＮ
Ａが導入された細胞は、プロトプラスト用培地中で培養
することにより、細胞壁を再生し、同時に細胞内で該ウ
ィルスの複製が行われる。

【００３４】再生した細胞内のウィルス由来蛋白質の確
認は、公知のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法（Na
ture 227, 680-685 (1970) ）を用いて容易に行うこと
ができる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれに限定されない。

【００３６】(1) 転写ベクタ−pL5013の作製 (イ) T7転写プロモ−タ−配列の合成と、サブクロ−ニン
グ（第２図） 図中、「AatII 」、「HindIII 」、「SphI」、「Sma
I」、「KpnI」、「SacI」、「NsiI」はそれぞれ制限酵
素名を表す。「lacZ」は、ベ−タ−ガラクトシダ−ゼ遺
伝子を表し、発現方向を矢印で示した。また、pUC18 の
制限酵素HindIII 〜EcoRI の部分に示されたペアの配列
は、ポリリンカ−領域のヌクレオチド配列を表す。T7 p
romoter とは下記に示されるプロモ−タ−配列を表し、
その方向を矢印で示した。その他の略号は、第１図の略
号と同一である。

【００３７】プラスミドpUC18 （ Methods in Enzymolo
gy, 101,20-78 (1983)）を制限酵素PstI, BamHI で処理
し、２本の断片を得た。このものをさらにバクテリアル
アルカリフォスファタ−ゼ（Bacterial alkaline phosp
hatase；宝酒造（株）社製）で処理し５’末端を脱りん
酸化した。フェノ−ル処理、エタノ−ル沈澱処理後、0.
7%アガロ−スゲル電気泳動により複製開始点、ベ−タ−
ラクタマ−ゼ遺伝子を含む2.65Kb断片を回収した。ま
た、T7プロモ−タ−配列（ Gene 56, 125-135 (1987)）
を含む合成オリゴヌクレオチド 5'-GGTCGATCTCGATCCCGC
GAAATTAATACGACTCACTATATGCA-3' （配列表の配列番号９
のヌクレオチド番号１〜４４で示されるヌクレオチド配
列に相当する）とその相補鎖 3'-ACGTCCAGCTAGAGCTAGGG
CGCTTTAATTATGCTGAGTGATAT-5' （配列表の配列番号１０
のヌクレオチド番号１〜４４で示されるヌクレオチド配
列に相当する）をDNA 自動合成機により合成した。下線
部は、上記文献に示されたプロモ−タ−配列を表す。両
者の合成オリゴヌクレオチドをT4ポリヌクレオチドキナ
−ゼ（T4 Polynucleotidekinase ；宝酒造（株）社製）
で処理し、５’末端をりん酸化後、アニ−リングし２本
鎖とした。この２本鎖の合成DNA と上記の2.65Kbの断片
とをT4DNA リガ−ゼ（T4 DNA ligase ；宝酒造（株）社
製）を用いて連結し環状DNA を得た。この環状DNA を用
いて大腸菌HB101 を形質転換し、アンピシリン50μg ／
mlを含有するＬＢ固形培地（ "Molecular Cloning - A
Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory,N
Y (1982)）上に塗布した。３７℃で１晩培養したとこ
ろ、多数の形質転換体を得た。得られた形質転換体のコ
ロニ−より、上記のオリゴヌクレオチドのうち前者をプ
ロ−ブとしてコロニ−ハイブリダイゼ−ション（ "Mole
cular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring H
arbor Lboratory,NY(1982)）を行い、ポジティブなクロ
−ンを多数得た。それぞれのポジティブクロ−ンよりプ
ラスミドを抽出し制限酵素解析を行った結果、上記の合
成オリゴヌクレオチドとpUC18 の2.65Kb断片を１分子ず
つ保持し、かつ連結部分がそれぞれ制限酵素PstI, BamH
I で切断されるものを選抜した。このようにして得られ
たプラスミドをpUC18/T7-10 （第２図）と呼ぶ。

【００３８】(ロ) TMVLcDNAの５’末端側のサブクロ−ニ
ング（第３図） 図中、「SpeI」、「NotI」、「EagI」はそれぞれ制限酵
素名を表す。また、pBLUESCRIPT SK(-) に示されたペア
の配列は、ポリリンカ−領域のヌクレオチド配列を表
す。その他の略号は、第１図〜第２図の略号と同一であ
る。

【００３９】ベクタ−pBLUESCRIPTSK(-)（ＳＴＲＡＴＡ
ＧＥＮＥ社製；第３図）を制限酵素PstI,XbaI で処理
し、２本の断片を得た。このものをさらにバクテリアル
アルカリフォスファタ−ゼで処理し５’末端を脱りん酸
化した。フェノ−ル処理、エタノ−ル沈澱処理後、0.7%
アガロ−スゲル電気泳動により複製開始点およびベ−タ
−ラクタマ−ゼ遺伝子を含む2.9Kb 断片を回収した。一
方、公知のTMV 転写ベクタ−プラスミドpLFW3 （ Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5043-5047(1986)）を制限
酵素PstI,XbaI で切断し、４本の断片を得た。このうち
Pmプロモ−タ−（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,706
6-7070 (1984)）および配列表の配列番号１のヌクレオ
チド番号１から1002のヌクレオチドを含む1.86Kbの断片
を0.7%アガロ−スゲル電気泳動により回収した。2.9Kb
断片と、1.86Kb断片とをT4DNA リガ−ゼを用いて連結し
環状DNA を得た。この環状DNA を用いて大腸菌HB101 を
形質転換し、アンピシリン50μg ／mlを含有するＬＢ固
形培地上に塗布した。３７℃で１晩培養したところ、多
数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体のコロニ
−よりプラスミドを抽出し制限酵素解析を行った結果、
pBLUESCRIPTSK(-)由来の2.9Kb 断片とpLFW3 由来の1.86
Kb断片を１分子ずつ保持し、かつ連結部分がそれぞれ制
限酵素PstI,XbaI で切断されるものを選抜した。このよ
うにして得られたプラスミドをpTMV5 と呼ぶ。

【００４０】(ハ) TMVL領域開始部位への制限酵素SnaBI
サイトの導入（第４図） 図中、「SnaBI 」は、制限酵素名を表す。pTMV5 の上部
に書かれた配列は、Pmプロモ−タ−とTMVLcDNAの接続部
分のヌクレオチド配列を表す。MTMV5-4-14の上部に書か
れた配列は、以下の変異処理により生じたPmプロモ−タ
−とTMVLcDNAの接続部分のヌクレオチド配列を表す。そ
の他の略号は、第１図〜第３図の略号と同一である。

【００４１】20mer のオリゴヌクレオチド 5'-ACTCACTT
ACGTATTTTTAC-3' （配列表の配列番号１１のヌクレオチ
ド番号１〜２０で示されるヌクレオチド配列に相当す
る）をDNA 自動合成機により合成した。下線部は、制限
酵素SnaBI の認識配列に相当することを示す。このオリ
ゴヌクレオチドをT4ヌクレオチドキナ−ゼで処理し、
５’末端をりん酸化した。このものを変異原としてプラ
スミドpTMV5 に対して部位特異的変異処理（ Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)）を施した。TMVLcD
NA領域の最初のＧを含む配列が、5'-ATAGTA-3'から5'-T
ACGTA-3' に変異したプラスミドを得た。プラスミドの
確認は、SnaBI による切断反応と、ダイデオキシヌクレ
オチド鎖終結法により行った。これにより得られたプラ
スミドをMTMV5-4-14と呼ぶ。

【００４２】(ニ) T7プロモ−タ−領域とＴＭＶ領域５’
末端の接続（第５図） 図中「Sse8387I」は、制限酵素名を表す。「NsiI+T4pol
ymerase 」は、制限酵素NsiI処理後T4DNA ポリメラ−ゼ
で処理したことを示したもので、その下のペアの配列は
生じたヌクレオチド配列を表す。制限酵素名が括弧内に
あるものは、連結処理後、その制限酵素の認識配列が消
失したことを表す。すなわち「(NsiI/SnaBI)」は、連結
後制限酵素NsiI、SnaBI 両者の認識配列が消失したこと
を表す。その他の略号は、第１図〜第４図の略号と同一
である。

【００４３】pUC18/T7-10 を制限酵素NsiIで切断するこ
とにより線状化し、さらにT4DNA ポリメラ−ゼ（宝酒造
（株）社製）を用いて両突出末端の４ヌクレオチドを削
った。フェノ−ル処理、エタノ−ル沈澱を行って精製し
た後、制限酵素EcoRI で切断して２本の断片を得た。こ
のものをさらにバクテリアルアルカリフォスファタ−ゼ
で処理し５’末端を脱りん酸化した。フェノ−ル処理、
エタノ−ル沈澱処理後、0.7%アガロ−スゲル電気泳動に
より複製開始点およびベ−タ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含
む2.69Kb断片を回収した。また、MTMV5-4-14を制限酵素
SnaBI, EcoRIで切断し、２本の断片を得た。このうちPm
プロモ−タ−及び配列表配列番号１ヌクレオチド番号１
〜273 のヌクレオチドを含む 0.27Kb 断片を1.5%アガロ
−スゲル電気泳動により回収した。2.69Kb断片と0.27Kb
断片とをT4DNA リガ−ゼを用いて連結し環状DNA を得
た。この環状DNA を用いて大腸菌HB101 を形質転換し、
アンピシリン50μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗
布した。３７℃で１晩培養したところ、多数の形質転換
体を得た。それぞれの形質転換体のコロニ−よりプラス
ミドを抽出し制限酵素解析を行った結果、pUC18/T7-10
由来の2.69Kb断片と MTMV5-4-1由来の 0.27Kb 断片を１
分子ずつ保持し、かつ制限酵素EcoRI で切断され、かつ
制限酵素SnaBI で切断されないものを選抜した。ダイデ
オキシヌクレオチド鎖終結法によりTMVLcDNA領域の最初
のＧを含む配列が、5'-CACTATAGTATTTTT-3' （配列表の
配列番号１２のヌクレオチド番号１〜１５で示されるヌ
クレオチド配列に相当する）であることを確認した。こ
のようにして得られたプラスミドをpL501 と呼ぶ。

【００４４】(ホ) pTLW3 の作製（第６図） 図中pUC8内のペアの配列は、ポリリンカ−部分のヌクレ
オチド配列を表す。pTLW3 の外側の枠は、制限酵素断片
の由来と長さを表す。他の略号は、第１図〜第５図の略
号と同一である。

【００４５】pL501 を制限酵素 AatII,EcoRIで切断し、
２本の断片を得た。このうちT7プロモ−タ−領域および
配列表、配列番号１のヌクレオチド番号１から273 のヌ
クレオチドを含む1.86Kbの断片を0.7%アガロ−スゲル電
気泳動により回収した。また、pLFW3 を制限酵素 EcoR
I,KpnI で切断し、4 本の断片を得た。このうち配列
表、配列番号１のヌクレオチド番号274 から4394のヌク
レオチドに相当する4.1KbEcoRI-KpnI 断片を0.7%アガロ
−スゲル電気泳動により回収した。また、pLFW3制限酵
素 KpnI,BamHI で切断し、4 本の断片を得た。このうち
配列表、配列番号１のヌクレオチド番号4395から6384の
ヌクレオチドを含む 2.00Kb のKpnI-BamHI断片を0.7%ア
ガロ−スゲル電気泳動により回収した。また、プラスミ
ドpUC8（Messing,J.(1983) Methods in Enzymology, 10
1,20-78 ）を制限酵素KpnI,BamHIで切断し、２本の断片
を得た。このうちベ−タ−ラクタマ−ゼ遺伝子及び複製
開始点を含む2.24Kbの断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳
動により回収した。以上の回収された４本のDNA 断片を
T4DNA リガ−ゼを用いて連結し環状DNA を得た。この環
状DNA を用いて大腸菌HB101 を形質転換し、アンピシリ
ン50μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布した。３
０℃で２４時間培養したところ、多数の形質転換体を得
た。それぞれの形質転換体のコロニ−よりプラスミドを
抽出し制限酵素解析を行った結果、図６に示す構造のプ
ラスミドpTLW3 を得た。

【００４６】(ヘ) クロラムフェニコ−ル耐性中間ベクタ
−の作製（第７図） 図中、「XhoI」は制限酵素名を表す。「CAT 」はクロラ
ムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ遺伝子を表
し、その遺伝子発現方向を矢印で示した。pHSG398 内の
ペアの配列は、ポリリンカ−部分のヌクレオチド配列を
表す。「XylE」は、下記のカテコ−ル2,3-ジオキシゲナ
−ゼ遺伝子を表し、遺伝子発現の方向を矢印によって示
した。他の略号は、第１図〜第５図の略号と同一であ
る。

【００４７】カテコ−ル２，３−ジオキシゲナ−ゼ（J.
Biol. Chem. 243, 2682 (1968) ）をコ−ドする遺伝子
（xylE）を有する公知のプラスミドpTS1137 （J. Bacte
riol. 166 , 739-745 (1986) ）由来のBamHI 、XhoI断
片（2.0Kb ）と、プラスミドpHSG398 （宝酒造（株）社
製）をBamHI,SalIで切断したものとを混合し、T4DNAリ
ガ−ゼを用いて連結し環状DNA を得た。この環状DNA を
用いて大腸菌JM109 を形質転換し、クロラムフェニコ−
ル20μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布した。３
７℃で一晩培養したところ、多数の形質転換体を得た。
１％カテコ−ル水溶液を培養プレ−トに噴霧し、黄色く
発色するコロニ−を選抜した。選抜したコロニ−よりプ
ラスミドを抽出し制限酵素解析を行った。その結果、Ba
mHI 、PstIでそれぞれ１箇所切断され、SalI、XhoIのい
ずれによっても切断されない4.21Kbのプラスミドを選抜
した。これを#1007 と呼ぶ。

【００４８】(ト) pTLW3 のサブクロ−ニング（第８図） 図中の略号は、第１図〜第７図の略号と同一である。

【００４９】プラスミド pTLW3 を制限酵素 SpeI で切
断することにより、２本の断片を得た。このうち4.22Kb
の断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳動により回収し、T4
DNAリガ−ゼを用いて自己連結し環状DNA を得た。この
環状DNA を用いて大腸菌JM109 を形質転換し、アンピシ
リン50μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布した。
37℃で一晩培養したところ、多数の形質転換体を得た。
それぞれの形質転換体のコロニ−よりプラスミドを抽出
し制限酵素解析を行ったところ、制限酵素SpeIで１箇所
切断される4.22Kbのプラスミドを選抜した。このプラス
ミドを#3001 と呼ぶ。

【００５０】(チ) クロラムフェニコ−ル耐性ベクタ−へ
のMluIサイトの導入（第９図） 図中の略号は、第１図〜第８図の略号と同一である。

【００５１】#3001 を制限酵素BamHI,PstIで切断したも
のと、#1007 を BamHI, PstIで切断したものを等量混合
し、エタノ−ル沈澱後、T4DNA リガ−ゼによる連結処理
を施した。このものを用いて大腸菌JM109 を形質転換
し、クロラムフェニコ−ル20μg ／mlを含有するＬＢ固
形培地上に塗布した。37℃で一晩培養したところ、多数
の形質転換体を得た。１％カテコ−ル水溶液を培養プレ
−トに噴霧し、黄色く発色しないコロニ−を選抜した。
選抜したコロニ−よりプラスミドを抽出し制限酵素解析
を行った。その結果、BamHI 、PstI、PstI、SphIでそれ
ぞれ１箇所切断される3.77Kbのプラスミドを得た。これ
を#3003 と呼ぶ。

【００５２】(リ) #3004 の作製（第１０図） 図中の略号は、第１図〜第９図の略号と同一である。

【００５３】プラスミド #3003を制限酵素 SphI, MluI
で切断し２本の断片を得た。このうち複製開始点および
クロラムフェニコ−ルアセチルトランスフェラ−ゼ遺伝
子を含む1.55Kb断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳動によ
り回収した。また、pTLW3 を制限酵素 SphI, MluI で切
断し、２本の断片を得た。このうちT7プロモ−タ−領域
およびTMVLcDNAの全領域（配列表、配列番号１のヌクレ
オチド番号１から6384のヌクレオチド）を含む6.43Kbの
断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳動により回収した。#3
003 由来の1.55Kb断片と、pTLW3 由来の6.43Kb断片とを
T4DNA リガ−ゼを用いて連結し環状DNA を得た。この環
状DNA を用いて大腸菌HB101 を形質転換し、クロラムフ
ェニコ−ル20μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布
した。26℃で40時間培養したところ、多数の形質転換体
を得た。それぞれの形質転換体のコロニ−よりプラスミ
ドを抽出し制限酵素解析を行った結果、第10図に示す構
造の8.65Kbのプラスミド#3004 を得た。

【００５４】(ヌ) pET3-bのEagIサイトの消去（第１１
図） 図中、「BglII 」は制限酵素名を表す。T7タ−ミネ−タ
−は、T7ファ−ジ由来のタ−ミネ−タ−領域を表す。中
央矢印の右側の「EagI」、「S1 nuclease 」、「 T4 D
NA ligase 」はそれぞれ、制限酵素EagIによる切断反
応、S1ヌクレア−ゼ処理、T4DNA リガ−ゼによる連結反
応を表す。他の略号は、第１図〜第１０図の略号と同一
である。

【００５５】公知のプラスミド pET3-b （ Gene 56, 12
5-135 (1987)）を制限酵素EagI で切断した。このもの
を、S1ヌクレア−ゼ（ＢＲＬ社製）で処理して末端を平
滑化した。フェノ−ル処理、エタノ−ル沈澱処理後、T4
DNA ガ−ゼを用いて自己連結し、環状DNA を得た。この
環状DNA を用いて大腸菌HB101 を形質転換し、アンピシ
リン50μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布し、３
７℃で１晩培養したところ、多数の形質転換体を得た。
形質転換体のコロニ−よりプラスミドを抽出し制限酵素
解析を行った結果、EagIで切断されない、4.65Kbのプラ
スミドを得た。これを#5001 と呼ぶ。

【００５６】(ル) pET3-bのBamHI サイトへのリンカ−DN
A の挿入（第１２図） 図中、#5002 内のペアの配列は、下記により合成された
オリゴヌクレオチドがベクタ−内に組み込まれたことを
表す。他の略号は、第１図〜第１０図の略号と同一であ
る。

【００５７】プラスミド pET3-b を制限酵素BamHI で切
断し、線状化した。このものをさらにバクテリアルアル
カリフォスファタ−ゼで処理し５’末端を脱りん酸化し
た。フェノ−ル処理、エタノ−ル沈澱処理後、0.7%アガ
ロ−スゲル電気泳動により断片(2.9Kb) を回収した。ま
た、制限酵素MluIの認識サイト（以下２つの配列の下線
部）を有するオリゴヌクレオチド 5'-GATCCCCCGGGCTCGA
GACGCGTA-3' （配列表の配列番号１３のヌクレオチド番
号１〜２４で示されるヌクレオチド配列に相当する）と
その相補鎖 3'-GGGGCCCGAGCTCTGCGCATCTAG-5'（配列表
の配列番号１４のヌクレオチド番号１〜２４で示される
ヌクレオチド配列に相当する）をDNA 自動合成機により
合成した。両者の合成オリゴヌクレオチドをT4 Polynuc
leotidekinase を用いて５’末端をりん酸化後、アニ
−リングし２本鎖とした。アニ−リングしたものと、上
記の2.9Kb 断片とをT4DNA リガ−ゼを用いて連結し、環
状DNA を得た。この環状DNA を用いて大腸菌ＤＨ５αを
形質転換し、アンピシリン50μg ／mlを含有するＬＢ固
形培地上に塗布し、３７℃で１晩培養したところ、多数
の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体よりプラス
ミドを抽出し制限酵素解析を行った結果、アニ−ルした
オリゴヌクレオチドと、pET3-b断片を１分子すつ保持
し、かつ制限酵素BamHI 、MluI、SmaI、XhoIサイトがこ
の順にT7プロモ−タ−と同一方向に挿入されているプラ
スミドを得た。これを#5002 と呼ぶ。

【００５８】(ヲ) #5003 の作製（第１３図） 図中の略号は、第１図〜第１２図の略号と同一である。

【００５９】プラスミド#5001 を制限酵素 PstI, BglII
で切断し、2 本の断片を得た。このうち複製開始領域
を保持する3.24Kb断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳動に
より回収した。また、プラスミド#5002 を制限酵素 Pst
I, BglII で切断して得られる断片のうち、複製開始領
域を保持しないほうの1.44Kb断片を0.7%アガロ−スゲル
電気泳動により回収した。#5001 由来の3.24Kb断片と#5
002 由来の1.44Kb断片とをT4DNA リガ−ゼを用いて連結
し、環状DNA を得た。この環状DNA を用いて大腸菌JM10
9 を形質転換し、アンピシリン50μg ／mlを含有するＬ
Ｂ固形培地上に塗布し、37℃で１晩培養したところ、多
数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体のコロニ
−よりプラスミドを抽出し制限酵素解析を行った結果、
BamHI 、MluI、SmaI、XhoI,BglIIで切断され、EagIで切
断されない4.68Kbのプラスミドを得た。このプラスミド
を#5003 と呼ぶ。

【００６０】(ワ) pL5013の作製（第１４図） 図中の略号は、第１図〜第１３図の略号と同一である。

【００６１】オリゴヌクレオチド 5'-GATCTGCA-3'をDN
A 自動合成機により合成した。このオリゴヌクレオチド
は、りん酸化を施さなかった。プラスミド#3004 を制限
酵素Sse8387I,MluI 両者の酵素で切断して２本の断片を
得た。このものに、上記のオリゴヌクレオチドをT4DNA
リガ−ゼを用いて連結した。0.7%アガロ−スゲル電気泳
動によりT7プロモ−タ−領域及びTMVLcDNA領域（配列
表、配列番号１のヌクレオチド番号１から6384のヌクレ
オチド）を含む6.43Kb断片を回収した。この断片は片方
の末端が、脱りん酸化されたBglII サイト、反対側の末
端が、りん酸化されたMluIサイトとなっている。

【００６２】一方、プラスミド#5003 を制限酵素 BglI
I,MluI で切断し、２本の断片を得た。このうちベ−タ
−ラクタマ−ゼ遺伝子、複製開始領域及びT7タ−ミネ−
タ−を保持する4.52Kb断片を0.7%アガロ−スゲル電気泳
動により回収した。

【００６３】上記の6.43Kb断片と、4.52Kb断片とをT4DN
A リガ−ゼを用いて連結し、環状DNA を得た。この環状
DNA を用いて大腸菌HB101 を形質転換し、アンピシリン
50μg ／mlを含有するＬＢ固形培地上に塗布し、26℃で
40時間培養したところ、多数の形質転換体を得た。それ
ぞれの形質転換体よりプラスミドを抽出し制限酵素解析
を行った。その結果、MluIで１箇所、BglII で３箇所、
PstIで３箇所切断されるが、Sse8387Iでは切断されない
10.9Kbのプラスミドを得た。このプラスミドをpL5013と
呼ぶ。

【００６４】(2) 転写ベクタ−の安定性−１ 転写ベクタ−pTLW3 またはpL5013もしくは#3004 をそれ
ぞれ保持する大腸菌HB101 を、アンピシリン50mg/lもし
くはクロラムフェニコール20mg/l含有するＬＢ培地（Ma
niatis,T.et al(1982): "Molecular Cloning - A Labor
atory Manual"Cold Spring Harbor Lboratory,NY ）３
ｍｌ中で３７℃、２４時間培養し、抽出されるプラスミ
ドDNA を０．７％アガロ−スゲル電気泳動に供し、もと
のプラスミドの分子量に対して変化を生じるかどうかを
検査した。その結果、#3004 を保持する大腸菌からはも
との分子量より小さい分子量のプラスミドが抽出され
た。また、pTLW3 保持する大腸菌からはもとの分子量よ
り大きい分子量のプラスミドが抽出された。pL5013の分
子量は変化しなかった。従って、転写ベクタ−pL5013
は、３７℃培養の大腸菌内に保持される場合、少なくと
も物理的性状において他の転写ベクタ−よりも安定であ
ることが示された。

【００６５】(3) 転写ベクタ−の大量培養 転写ベクタ−pTLW3 またはpL5013もしくは#3004 をそれ
ぞれ保持する大腸菌HB101 を、アンピシリン50mg/l も
しくはクロラムフェニコ−ル20mg/l 含有するＬＢ培地
200 ｍｌ中で２６℃、４０時間培養し、抽出されるプラ
スミドDNA を塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配遠心法により精製した。

【００６６】また、pL5013を保持する大腸菌HB101 を、
アンピシリン50mg/l 含有するＬＢ培地200 ｍｌ中で３
７℃、１５時間培養し、抽出されるプラスミドDNA を塩
化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法により
精製した。

【００６７】それぞれのプラスミドDNA を0.7 ％アガロ
−スゲル電気泳動に供し、もとのプラスミドの分子量に
対して変化を生じていないことを、電気泳動の移動度よ
り判定した。

【００６８】(4) 転写ベクタ−の機能 (イ) 試験管内転写（第１５図） 上記により、培養温度26℃の培養条件で作製されたpTLW
3 、pL5013をそれぞれ10μg ずつ準備し、それぞれを５
μg ずつ２つの区に分けた。１つは制限酵素MluIで切断
するもので、以下「切断区」という。もう１つは制限酵
素処理をしないもので、以下「非切断区」という。pTLW
3 「切断区」、pTLW3 「非切断区」、pL5013「切断
区」、pL5013「非切断区」の４つの区とも、MluIで切断
用の緩衝液100 μl に溶解し、切断区には、MluI20unit
(2μl)を添加し、非切断区には滅菌蒸留水2 μl を添加
した。反応は、３７℃で１晩行った。

【００６９】反応により切断区のDNA が線状になってお
り、非切断区のDNA が線状になっていないことを、それ
ぞれの反応溶液の2 μl を用いて0.7%アガロ−ス電気泳
動にて確認した。

【００７０】それぞれの反応溶液にフェノ−ル−クロロ
ホルム1:1 液100 μl を添加して激しく撹拌後、毎分15
000 回転で５分間遠心し、上清を別の滅菌マイクロチュ
−ブに移した。同様の操作をもう１回行った。８０μl
のエ−テルをそれぞれのチュ−ブに添加し、激しく撹拌
後、毎分15000 回転で２分間遠心した。上清を捨て、溶
液量の３倍量のエタノ−ルを添加し、ドライアイス中で
５分間冷却した。毎分15000 回転で５分間遠心し、沈澱
を真空中で５分間乾燥させた。

【００７１】４つの区のDNA の試験管内転写を「表１」
に示した組成の反応液100 μl 中で３７℃、２時間行っ
た。反応物を２％アガロ−スゲル電気泳動に供し、エチ
ジウムブロミド水溶液で染色した。その染色パタ−ンを
写真に収めたものを、第１５図に示した。

【００７２】

【表１】４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（pH 8.0） ２０ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ ジチオスレイト−ル １００μg/ml ウシ血清アルブミン １ｍＭ アデノシン５’−３りん酸 １ｍＭ ウリジン５’−３りん酸 １ｍＭ シチジン５’−３りん酸 ０．２ｍＭ グアノシン５’−３りん酸 ２ｍＭ m7GpppG （注） ５μｇ 鋳型DNA 50-100 unit T7ポリメラ−ゼ ５０ unit リボヌクレア−ゼインヒビタ− 注） ７メチルグアノシン５’−３りん酸−５’グアノ
シン 第１５図において、レ−ン1,2,3,4 は、それぞれpTLW3
「切断区」、pTLW3 「非切断区」、pL5013「切断区」、
pL5013「非切断区」のDNA を鋳型をしたものに相当す
る。レ−ン１の下のバンドは、鋳型となった線状のpTLW
3DNAを表す。上のバンドは、転写産物のRNA で、TMVLRN
A とほぼ同じ移動度を示した。レ−ン３の下のバンド
は、鋳型となった線状のpL5013DNA を表す。上のバンド
は転写産物のRNA でレ−ン１の上のバンドと同一の移動
度を示した。一方、レ−ン２に見られる３つのバンドの
うち、移動度の小さい２つのバンドは、図の上からそれ
ぞれpTLW3 のオ−プンサ−キュラ−DNA 、クロ−ズドサ
−キュラ−DNA に相当し、いちばん下に観察されるバン
ドが転写産物のRNA である。このRNA は、レ−ン１およ
び３に観察されるRNA よりも移動度が小さい、すなわ
ち、正常なＴＭＶRNA よりも大きな分子のRNA であるも
のと考えられた。レ−ン４に見られる３つのバンドのう
ち、移動度の小さい２つのバンドは、図の上からそれぞ
れpL5013のオ−プンサ−キュラ−DNA 、クロ−ズドサ−
キュラ−DNA に相当し、いちばん下に観察されるバンド
が転写産物のRNA である。このRNA は、レ−ン１および
３に観察されるRNA とほぼ同じ移動度を示しており、正
常に転写が終結していることが示された。

【００７３】この実験より、タ−ミネ−タ−が試験管内
転写において正常に機能していることが示された。

【００７４】(ロ) 転写物の植物細胞への導入 （第１６
図） 上記の反応により製造されたRNA をエレクトロポ−レ−
ション法（ FEBS Letter, vol.219, 65-69(1987)）にて
タバコ培養細胞ＢＹ２株に導入する実験を行った。

【００７５】タバコ培養細胞の経代培養及び本培養は、
「表２」に示された培地100ml を、500ml 用三角フラス
コに入れ、通気性の良いシリコ栓をしてオ−トクレ−ブ
したものを用いた。

【００７６】

【表２】 100ml 10 倍濃度無機塩類（シグマ社製、M-0529） 100ml 10 倍濃度りん酸緩衝液（シグマ社製、M-0654） 1ml 100 倍濃度塩酸チアミン溶液（伊勢久（株）社
製） 1ml 100倍濃度ミオイノシト−ル溶液（伊勢久（株）
社製） 1ml 2,4-D 溶液（20mg/100mlエタノ−ル溶液） 30g シュ−クロ−ス 蒸留水で約９００ｍｌとし、１規定水酸化カリウムでpH
5.8 に調製した後蒸留水で１リットルとした。経代培養
は、７日間回転振とう培養した培養液の2ml または3ml
を新鮮な上記の培地に植え継ぐことにより行った。培養
条件は、光照射のない条件下、温度２５℃、毎分１００
回転の回転振とう培養とした。本培養は、約10mlの経代
培養７日目の培養液を新鮮な上記の培地に植え継ぐこと
により行った。

【００７７】本培養開始から約４８時間を経た培養細胞
を５０ｍｌ用滅菌済みポリプロピレンチュ−ブ２本に移
し、約５分間自然落下させることにより細胞を集めた。
真空ポンプの吸引口に滅菌したパスツ−ルピペット接続
したものを用いて上清を捨て、細胞の入っているそれぞ
れのチュ−ブに約20mlずつの滅菌した0.4Mマニト−ル水
溶液を加え軽く懸濁した。どちらか片側のチュ−ブに懸
濁液をまとめ、３０℃、１０分間放置した。自然落下し
た細胞の上清を上記と同様にして吸引により捨て、プロ
トプラスト作製用酵素溶液２５ｍｌをポアサイズ20μm
のフィルタ−を通して添加した。プロトプラスト作製用
酵素溶液とは、セルラ−ゼオノズカＲＳ（ヤクルト本社
（株）社製）１％、ペクトリア−ゼＹ−２３（盛進製薬
（株）社製）０．１％を含有する０．４Ｍマニト−ル水
溶液をいう。穏やかに懸濁した後、滅菌シャ−レに移
し、２６℃、５０分放置した。この段階において、大半
の細胞がプロトプラストとなった。このプロトプラスト
懸濁液を吸引口の径が5mm 程度の滅菌ピペットを用い
て、５０ｍｌ用滅菌チュ−ブに移した。

【００７８】毎分1000回転の遠心を３分間行い、プロト
プラストを沈澱させた。上清を捨て、40mlの氷冷した0.
4Mマニト−ル水溶液を添加した。この操作を３回繰り返
した。

【００７９】これにより得られたプロトプラスト細胞懸
濁液の一部を血球計数板に滴下して細胞密度を測定した
ところ、約0.5 ×10⁶ 細胞／mlの値を得た。

【００８０】口径15mmの滅菌済みポリプロピレン製チュ
−ブを５本準備し、それぞれのチュ−ブに上記のプロト
プラスト懸濁液 2ml ずつ（約1 ×10⁶ 細胞）を分注し
た。毎分1000回転の遠心を1.5 分間行い、上清をパスツ
−ルピペットとニップルを用いて捨てた。沈澱したプロ
トプラストに0.6ml のMES-0.3Mマニト−ル水溶液を添加
し、穏やかに懸濁した。MES-0.3Mマニト−ル水溶液と
は、5mM MES, 70mMKCl,を含む0.3Mマニト−ル水溶液（p
H5.8 ）をいう。

【００８１】一方、上記で転写ベクタ−を試験管内で転
写して得られたRNA を含む４種類の反応溶液およびネガ
ティブコントロ−ルとして滅菌水の計５種類の溶液５０
μl0.2ml のMES-0.3Mマニト−ル水溶液を添加し軽く懸
濁した。

【００８２】プロトプラスト懸濁液0.6ml をそれぞれ上
記のRNA 溶液５種類をそれぞれ添加し、軽く懸濁後、す
ばやくザルシュテッド社製のプラスチックキュベット
（No.67.742 ）に入れ、滅菌したステンレス製の電極を
挿入し、充電した１００μF 電解コンデンサ−より１回
の放電を行った。このプロトプラスト懸濁液をすばやく
口径15mmの滅菌済みポリプロピレン製チュ−ブに移し、
氷上で３０分間放置した。

【００８３】30℃で５分間放置し、毎分1000回転の遠心
1.5 分にて感染を終えたプロトプラストを沈澱させた。
上清を捨て、タバコプロトプラスト用培地（「表３」に
示した）10mlを添加し、穏やかに懸濁した。

【００８４】

【表３】 100ml 10 倍濃度無機塩類（シグマ社製、M-0529） 100ml 10 倍濃度りん酸緩衝液（シグマ社製、M-0654） 1ml 100 倍濃度塩酸チアミン溶液（伊勢久（株）社
製） 1ml 100倍濃度ミオイノシト−ル溶液（伊勢久（株）
社製） 1ml 2,4-D 溶液（20mg/100mlエタノ−ル溶液） 10g シュ−クロ−ス 72.88g D- マニト−ル 蒸留水で約９００ｍｌとし、１規定水酸化カリウムでpH
5.8 に調製した後蒸留水で１リットルとした。口径3cm
の滅菌ガラスシャ−レに、1.5ml ずつを分注し、光照射
の無い条件下、28℃で培養を行った。確認のため、倒立
顕微鏡によりそれぞれのプロトプラストの状態を観察
し、正常であることを確認した。

【００８５】培養後 19, 25, 32, 43 時間後の細胞を1.
5ml 用マイクロチュ−ブに集め、毎分5000回転で２分の
遠心を行い、50μl のサンプルバッファ−（10% グリセ
ロ−ル、62.4mMトリス−塩酸(pH6.8), 2%SDS, 3%β- メ
ルカプトエタノ−ル,0.008%ロモフェノ−ルブル−を含
む水溶液）に懸濁後直ちに１００℃で２分間処理した。
文献（Laemmli (1970) Nature 227, 680-685 ）の方法
にしたがって12.5％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動
により植物内の蛋白質を観察した。その結果、pTLW3 ま
たはpL5013を制限酵素MluIで切断した線状DNA 若しくは
pL5013を制限酵素で切断しない環状DNA を鋳型とした場
合の転写産物を導入したそれぞれの細胞は、培養時間の
経過とともに細胞内のコ−ト蛋白質量が増加したが、pT
LW3 を制限酵素で切断しない環状DNA を鋳型とした場合
の転写産物を導入した細胞では、コ−ト蛋白質に相当す
る蛋白質は検出されなかった。この間、いずれの培養区
でも細胞壁の再生は行われているが、分裂はほとんど行
われていないことが顕微鏡観察で確認された。従って、
コ−ト蛋白質量の増加はＴＭＶが植物細胞内で複製した
ことに起因することが示された。

【００８６】(5) 転写ベクタ−の安定性−２ 「転写ベクタ−の大量培養」の項で、３７℃培養の条件
下で抽出されたpL5013を用いて、MluIによる切断を施さ
ずに「試験管内転写」、「転写物の植物細胞への導入」
を上記と全く同様の方法を用いて行った。その結果、４
３時間培養後の植物細胞よりコ−ト蛋白質に相当する蛋
白質が検出された。該蛋白質の生産量と２６℃培養の条
件下で抽出されたpL5013を用いた場合の該蛋白質の生産
量との間に有為差は認められなかった。従って、３７℃
培養の条件下で抽出された転写ベクタ−pL5013は、ウィ
ルスＲＮＡの転写機能を保持していることが確認され
た。 (6) 転写ベクタ−ｐＬ５０２０の作製（第１７図） プラスミド#3004 を制限酵素AlwNI で切断して２本の断
片を得た。このうち大腸菌内複製開始点、Ｔ７プロモ−
タ−領域、および配列表、配列番号１のヌクレオチド番
号１から4001を含む4.76Kb断片を0.7 ％アガロ−スゲル
電気泳動により回収した。

【００８７】また、pL5013を制限酵素AlwNI で切断して
２本の断片を得た。このうち、配列表、配列番号１のヌ
クレオチド番号4002から6384、Ｔ７タ−ミネ−タ−領
域、およびベ−タ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含む4.39Kbの
断片を0.7 ％アガロ−スゲル電気泳動により回収した。

【００８８】以上の回収された２本のＤＮＡ断片をＴ４
ＤＮＡリガ−ゼを用いて連結し、環状ＤＮＡを得た。こ
の環状ＤＮＡを用いて、大腸菌ＨＢ101 株を形質転換
し、アンピシリン50μg/mlを含有するＬＢ固形培地上に
塗布した。30℃で24時間培養したところ、多数の形質転
換体を得た。それぞれの形質転換体のコロニ−よりプラ
スミドを抽出し、制限酵素解析を行った結果、図１７に
示す構造のプラスミドｐＬ5020を得た。

【００８９】転写ベクタ−ｐＬ5020を保持する大腸菌Ｈ
Ｂ101 を、アンピシリン50mg/ml 含有するＬＢ培地200
ｍｌ中で37℃15時間培養し、抽出されたプラスミドＤＮ
Ａを塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配遠心法
により精製した。

【００９０】上記により精製されたｐＬ5020を、Ｍｌｕ
Ｉによる切断を施さずに「試験管内転写」、「転写物の
植物細胞への導入」を上記と全く同様の方法を用いて行
った。その結果、２日間培養後の植物細胞よりコ−ト蛋
白質に相当する蛋白質が検出された。したがって、転写
ベクタ−ｐＬ５０２０はウイルスＲＮＡの転写機能を保
持していることが確認された。

【００９１】

【発明の効果】本発明により新たに構築された転写ベク
タ−を用いて植物細胞間移行蛋白質またはコ−ト蛋白質
の一部を所望の遺伝子に組み換える際、転写ベクタ−の
不安定性が除去され、かつ線状化操作を省略することが
可能となったため、所望のウィルスRNA を調製すること
が容易になった。これにより、植物組織内で該ＲＮＡウ
ィルスを発現させ、所望の外来蛋白質を大量に得ること
が可能となった。

【００９２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic vir
us） トマト（Lycopersicon esculentum ） セルライン：エル（Ｌ） 配列の特徴 72-3419 E CDS 配列 GTATTTTTAC AACAATTACC AACAACAACA ACAAACAACA ACAACATTAC ATTTTACATT 60 CTACAACTAC A ATG GCA TAC ACA CAA ACA GCC ACA TCG TCC GCT TTG CTT 110 Met Ala Tyr Thr Gln Thr Ala Thr Ser Ser Ala Leu Leu 1 5 10 GAG ACC GTC CGA GGT AAC AAT ACC TTG GTC AAC GAT CTT GCA AAG CGG 158 Glu Thr Val Arg Gly Asn Asn Thr Leu Val Asn Asp Leu Ala Lys Arg 15 20 25 CGT CTA TAT GAC ACA GCG GTC GAT GAA TTT AAT GCT AGG GAC CGC AGG 206 Arg Leu Tyr Asp Thr Ala Val Asp Glu Phe Asn Ala Arg Asp Arg Arg 30 35 40 45 CCT AAA GTC AAT TTT TCC AAA GTA GTA AGC GAA GAA CAG ACG CTT ATT 254 Pro Lys Val Asn Phe Ser Lys Val Val Ser Glu Glu Gln Thr Leu Ile 50 55 60 GCA ACC AAA GCC TAC CCA GAA TTC CAA ATT ACA TTC TAC AAC ACG CAG 302 Ala Thr Lys Ala Tyr Pro Glu Phe Gln Ile Thr Phe Tyr Asn Thr Gln 65 70 75 AAT GCT GTG CAT TCC CTT GCA GGC GGT CTC CGA TCA TTA GAA TTG GAA 350 Asn Ala Val His Ser Leu Ala Gly Gly Leu Arg Ser Leu Glu Leu Glu 80 85 90 TAT CTG ATG ATG CAA ATT CCC TAC GGA TCA TTG ACA TAT GAT ATC GGA 398 Tyr Leu Met Met Gln Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Thr Tyr Asp Ile Gly 95 100 105 GGT AAT TTT GCA TCT CAT CTG TTC AAA GGG CGA GCA TAC GTT CAC TGC 446 Gly Asn Phe Ala Ser His Leu Phe Lys Gly Arg Ala Tyr Val His Cys 110 115 120 125 TGT ATG CCG AAT CTG GAT GTC CGC GAC ATA ATG CGG CAC GAG GGC CAA 494 Cys Met Pro Asn Leu Asp Val Arg Asp Ile Met Arg His Glu Gly Gln 130 135 140 AAG GAC AGT ATT GAA CTA TAC CTT TCT AGG CTC GAG AGG GGC AAC AAA 542 Lys Asp Ser Ile Glu Leu Tyr Leu Ser Arg Leu Glu Arg Gly Asn Lys 145 150 155 CAT GTC CCA AAC TTC CAA AAG GAA GCT TTC GAC AGA TAC GCT GAA ATG 590 His Val Pro Asn Phe Gln Lys Glu Ala Phe Asp Arg Tyr Ala Glu Met 160 165 170 CCA AAC GAA GTA GTC TGT CAC GAT ACT TTC CAA ACG TGT AGG CAT TCT 638 Pro Asn Glu Val Val Cys His Asp Thr Phe Gln Thr Cys Arg His Ser 175 180 185 CAA GAA TGT TAC ACG GGA AGA GTG TAT GCT ATT GCT TTG CAT AGT ATA 686 Gln Glu Cys Tyr Thr Gly Arg Val Tyr Ala Ile Ala Leu His Ser Ile 190 195 200 205 TAC GAT ATA CCT GCC GAC GAG TTC GGC GCG GCA CTG CTG AGA AAG AAT 734 Tyr Asp Ile Pro Ala Asp Glu Phe Gly Ala Ala Leu Leu Arg Lys Asn 210 215 220 GTA CAT GTA TGT TAT GCC GCT TTC CAC TTT TCC GAG AAT TTA CTT CTC 782 Val His Val Cys Tyr Ala Ala Phe His Phe Ser Glu Asn Leu Leu Leu 225 230 235 GAA GAT TCA CAC GTC AAC CTC GAC GAG ATC AAT GCA TGT TTC CAA AGA 830 Glu Asp Ser His Val Asn Leu Asp Glu Ile Asn Ala Cys Phe Gln Arg 240 245 250 GAT GGA GAC AGG TTG ACT TTT TCC TTT GCA TCT GAG AGT ACT CTT AAT 878 Asp Gly Asp Arg Leu Thr Phe Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Leu Asn 255 260 265 TAT AGT CAT AGT TAT TCT AAT ATT CTT AAG TAT GTT TGC AAA ACT TAC 926 Tyr Ser His Ser Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Val Cys Lys Thr Tyr 270 275 280 285 TTC CCA GCC TCT AAT AGA GAG GTT TAC ATG AAG GAG TTT TTA GTA ACT 974 Phe Pro Ala Ser Asn Arg Glu Val Tyr Met Lys Glu Phe Leu Val Thr 290 295 300 AGA GTT AAT ACC TGG TTT TGT AAA TTT TCT AGA ATA GAT ACT TTC TTA 1022 Arg Val Asn Thr Trp Phe Cys Lys Phe Ser Arg Ile Asp Thr Phe Leu 305 310 315 TTG TAC AAA GGT GTA GCG CAT AAG GGT GTA GAT AGT GAG CAG TTT TAC 1070 Leu Tyr Lys Gly Val Ala His Lys Gly Val Asp Ser Glu Gln Phe Tyr 320 325 330 AAG GCT ATG GAA GAC GCA TGG CAC TAC AAA AAG ACT CTT GCG ATG TGC 1118 Lys Ala Met Glu Asp Ala Trp His Tyr Lys Lys Thr Leu Ala Met Cys 335 340 345 AAC AGT GAA AGA ATC TTG TTA GAG GAT TCT TCA TCA GTT AAT TAC TGG 1166 Asn Ser Glu Arg Ile Leu Leu Glu Asp Ser Ser Ser Val Asn Tyr Trp 350 355 360 365 TTT CCA AAA ATG AGG GAT ATG GTG ATA GTT CCA CTA TTT GAC ATA TCT 1214 Phe Pro Lys Met Arg Asp Met Val Ile Val Pro Leu Phe Asp Ile Ser 370 375 380 CTC GAG ACT AGT AAA AGA ACA CGC AAA GAG GTC TTA GTT TCA AAG GAC 1262 Leu Glu Thr Ser Lys Arg Thr Arg Lys Glu Val Leu Val Ser Lys Asp 385 390 395 TTT GTT TAT ACA GTG TTA AAT CAC ATT CGT ACG TAC CAG GCC AAA GCG 1310 Phe Val Tyr Thr Val Leu Asn His Ile Arg Thr Tyr Gln Ala Lys Ala 400 405 410 CTT ACT TAC TCC AAC GTG TTA TCT TTC GTC GAA TCA ATT CGT TCG AGA 1358 Leu Thr Tyr Ser Asn Val Leu Ser Phe Val Glu Ser Ile Arg Ser Arg 415 420 425 GTG ATC ATT AAC GGG GTT ACT GCT AGG TCT GAG TGG GAT GTC GAT AAA 1406 Val Ile Ile Asn Gly Val Thr Ala Arg Ser Glu Trp Asp Val Asp Lys 430 435 440 445 TCA TTA TTA CAG TCC TTG TCG ATG ACG TTC TTC CTA CAC ACC AAG CTT 1454 Ser Leu Leu Gln Ser Leu Ser Met Thr Phe Phe Leu His Thr Lys Leu 450 455 460 GCC GTT CTG AAA GAC GAT CTT TTG ATT AGC AAG TTT GCA CTT GGA CCA 1502 Ala Val Leu Lys Asp Asp Leu Leu Ile Ser Lys Phe Ala Leu Gly Pro 465 470 475 AAA ACT GTC TCA CAA CAT GTG TGG GAT GAG ATT TCC CTA GCT TTC GGC 1550 Lys Thr Val Ser Gln His Val Trp Asp Glu Ile Ser Leu Ala Phe Gly 480 485 490 AAT GCT TTC CCA TCG ATC AAG GAA AGA TTG ATA AAC CGG AAA CTG ATC 1598 Asn Ala Phe Pro Ser Ile Lys Glu Arg Leu Ile Asn Arg Lys Leu Ile 495 500 505 AAA ATT ACG GAG AAT GCG TTA GAG ATC AGG GTG CCC GAT CTT TAT GTC 1646 Lys Ile Thr Glu Asn Ala Leu Glu Ile Arg Val Pro Asp Leu Tyr Val 510 515 520 525 ACT TTC CAT GAT AGG TTA GTT TCT GAG TAC AAA ATG TCA GTG GAC ATG 1694 Thr Phe His Asp Arg Leu Val Ser Glu Tyr Lys Met Ser Val Asp Met 530 535 540 CCG GTG CTA GAC ATT AGG AAA AAG ATG GAA GAA ACT GAG GAA ATG TAC 1742 Pro Val Leu Asp Ile Arg Lys Lys Met Glu Glu Thr Glu Glu Met Tyr 545 550 555 AAT GCA CTG TCC GAA CTG TCT GTA CTT AAA AAT TCA GAC AAG TTC GAT 1790 Asn Ala Leu Ser Glu Leu Ser Val Leu Lys Asn Ser Asp Lys Phe Asp 560 565 570 GTT GAC GTT TTT TCC CAG ATG TGC CAA TCT TTA GAA GTC GAT CCA ATG 1838 Val Asp Val Phe Ser Gln Met Cys Gln Ser Leu Glu Val Asp Pro Met 575 580 585 ACT GCA GCA AAG GTA ATA GTA GCA GTT ATG AGC AAC GAG AGT GGT CTT 1886 Thr Ala Ala Lys Val Ile Val Ala Val Met Ser Asn Glu Ser Gly Leu 590 595 600 605 ACT CTC ACG TTT GAA CAG CCC ACC GAA GCT AAT GTT GCG CTA GCA TTG 1934 Thr Leu Thr Phe Glu Gln Pro Thr Glu Ala Asn Val Ala Leu Ala Leu 610 615 620 CAA GAT TCT GAA AAG GCT TCT GAT GGG GCG TTG GTA GTT ACC TCA AGA 1982 Gln Asp Ser Glu Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Ser Arg 625 630 635 GAT GTT GAG GAA CCG TCC ATA AAG GGT TCG ATG GCC CGT GGT GAG TTA 2030 Asp Val Glu Glu Pro Ser Ile Lys Gly Ser Met Ala Arg Gly Glu Leu 640 645 650 CAA TTG GCC GGA TTA TCT GGC GAC GTT CCT GAA TCT TCA TAC ACT AGG 2078 Gln Leu Ala Gly Leu Ser Gly Asp Val Pro Glu Ser Ser Tyr Thr Arg 655 660 665 AGC GAG GAG ATT GAG TCT CTC GAG CAG TTT CAT ATG GCA ACA GCT AGT 2126 Ser Glu Glu Ile Glu Ser Leu Glu Gln Phe His Met Ala Thr Ala Ser 670 675 680 685 TCG TTA ATT CAT AAG CAG ATG TGT TCG ATC GTG TAC ACG GGC CCT CTT 2174 Ser Leu Ile His Lys Gln Met Cys Ser Ile Val Tyr Thr Gly Pro Leu 690 695 700 AAA GTT CAA CAA ATG AAA AAC TTT ATA GAC AGC CTG GTA GCC TCG CTC 2222 Lys Val Gln Gln Met Lys Asn Phe Ile Asp Ser Leu Val Ala Ser Leu 705 710 715 TCT GCT GCG GTG TCG AAT CTA GTG AAG ATC CTA AAA GAT ACA GCC GCG 2270 Ser Ala Ala Val Ser Asn Leu Val Lys Ile Leu Lys Asp Thr Ala Ala 720 725 730 ATT GAC CTT GAA ACT CGT CAA AAG TTC GGA GTT CTG GAT GTT GCT TCG 2318 Ile Asp Leu Glu Thr Arg Gln Lys Phe Gly Val Leu Asp Val Ala Ser 735 740 745 AAA AGG TGG CTA GTT AAA CCA TCC GCA AAG AAC CAT GCA TGG GGG GTT 2366 Lys Arg Trp Leu Val Lys Pro Ser Ala Lys Asn His Ala Trp Gly Val 750 755 760 765 GTT GAG ACT CAT GCG AGG AAA TAT CAC GTC GCA TTA CTG GAG CAC GAT 2414 Val Glu Thr His Ala Arg Lys Tyr His Val Ala Leu Leu Glu His Asp 770 775 780 GAA TTT GGC ATT ATT ACG TGC GAT AAC TGG CGA CGG GTG GCT GTG AGT 2462 Glu Phe Gly Ile Ile Thr Cys Asp Asn Trp Arg Arg Val Ala Val Ser 785 790 795 TCT GAG TCG GTA GTA TAT TCT GAT ATG GCT AAA CTC AGG ACT CTG AGA 2510 Ser Glu Ser Val Val Tyr Ser Asp Met Ala Lys Leu Arg Thr Leu Arg 800 805 810 AGA TTG CTC AAA GAT GGA GAA CCA CAC GTT AGT TCA GCA AAG GTG GTT 2558 Arg Leu Leu Lys Asp Gly Glu Pro His Val Ser Ser Ala Lys Val Val 815 820 825 TTG GTG GAT GGC GTT CCA GGG TGC GGG AAG ACA AAG GAA ATT CTT TCG 2606 Leu Val Asp Gly Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Lys Glu Ile Leu Ser 830 835 840 845 AGA GTT AAT TTC GAA GAA GAT CTA ATT CTT GTC CCT GGT CGT CAA GCT 2654 Arg Val Asn Phe Glu Glu Asp Leu Ile Leu Val Pro Gly Arg Gln Ala 850 855 860 GCC GAG ATG ATC AGA AGA AGA GCT AAT GCG TCG GGC ATA ATA GTG GCT 2702 Ala Glu Met Ile Arg Arg Arg Ala Asn Ala Ser Gly Ile Ile Val Ala 865 870 875 ACA AAG GAT AAT GTG CGC ACC GTC GAT TCA TTT TTG ATG AAT TAC GGG 2750 Thr Lys Asp Asn Val Arg Thr Val Asp Ser Phe Leu Met Asn Tyr Gly 880 885 890 AAA GGG GCA CGC TGT CAG TTC AAA AGA TTG TTC ATA GAC GAA GGT TTG 2798 Lys Gly Ala Arg Cys Gln Phe Lys Arg Leu Phe Ile Asp Glu Gly Leu 895 900 905 ATG CTG CAT ACT GGT TGT GTG AAT TTT TTG GTT GAA ATG TCT CTG TGC 2846 Met Leu His Thr Gly Cys Val Asn Phe Leu Val Glu Met Ser Leu Cys 910 915 920 925 GAT ATT GCA TAT GTT TAT GGA GAC ACC CAA CAG ATT CCG TAC ATC AAC 2894 Asp Ile Ala Tyr Val Tyr Gly Asp Thr Gln Gln Ile Pro Tyr Ile Asn 930 935 940 AGA GTA ACT GGT TTC CCG TAC CCT GCA CAC TTT GCA AAA TTG GAG GTC 2942 Arg Val Thr Gly Phe Pro Tyr Pro Ala His Phe Ala Lys Leu Glu Val 945 950 955 GAC GAA GTC GAA ACA AGA AGA ACT ACT CTT CGT TGT CCG GCT GAT GTC 2990 Asp Glu Val Glu Thr Arg Arg Thr Thr Leu Arg Cys Pro Ala Asp Val 960 965 970 ACA CAC TTC CTA AAT CAA AGG TAT GAA GGA CAC GTA ATG TGC ACG TCT 3038 Thr His Phe Leu Asn Gln Arg Tyr Glu Gly His Val Met Cys Thr Ser 975 980 985 TCT GAA AAG AAA TCA GTT TCC CAG GAA ATG GTT AGT GGG GCT GCG TCT 3086 Ser Glu Lys Lys Ser Val Ser Gln Glu Met Val Ser Gly Ala Ala Ser 990 995 1000 1005 ATC AAT CCT GTG TCC AAG CCG CTT AAG GGA AAA ATT TTG ACT TTC ACA 3134 Ile Asn Pro Val Ser Lys Pro Leu Lys Gly Lys Ile Leu Thr Phe Thr 1010 1015 1020 CAG TCT GAC AAG GAG GCC CTT CTC TCA AGG GGC TAC GCA GAT GTC CAT 3182 Gln Ser Asp Lys Glu Ala Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Ala Asp Val His 1025 1030 1035 ACT GTA CAT GAG GTA CAA GGT GAG ACT TAT GCA GAC GTA TCG TTA GTT 3230 Thr Val His Glu Val Gln Gly Glu Thr Tyr Ala Asp Val Ser Leu Val 1040 1045 1050 CGA CTA ACA CCT ACG CCT GTA TCT ATC ATC GCA AGA GAC AGT CCG CAT 3278 Arg Leu Thr Pro Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Arg Asp Ser Pro His 1055 1060 1065 GTT CTG GTC TCG TTG TCA AGA CAC ACA AAA TCC CTA AAG TAC TAC ACC 3326 Val Leu Val Ser Leu Ser Arg His Thr Lys Ser Leu Lys Tyr Tyr Thr 1070 1075 1080 1085 GTT GTG ATG GAT CCT TTA GTT AGT ATC ATT AGA GAT TTA GAA CGG GTT 3374 Val Val Met Asp Pro Leu Val Ser Ile Ile Arg Asp Leu Glu Arg Val 1090 1095 1100 AGT AGT TAC TTA TTA GAC ATG TAC AAA GTA GAT GCA GGT ACT CAA 3419 Ser Ser Tyr Leu Leu Asp Met Tyr Lys Val Asp Ala Gly Thr Gln 1105 1110 1115 TAGCAATTAC AGGTCGACTC TGTGTTTAAA AATTTCAATC TTTTTGTAGC AGCTCCAAAG 3479 ACTGGAGATA TATCTGATAT GCAATTTTAC TATGATAAGT GTCTTCCTGG GAACAGCACG 3539 TTGTTGAACA ACTACGACGC TGTTACCATG AAATTGACTG ACATTTCTCT GAATGTCAAA 3599 GATTGCATAT TAGATATGTC TAAGTCTGTA GCTGCTCCGA AAGATGTCAA ACCAACTTTA 3659 ATACCGATGG TACGAACGGC GGCAGAAATG CCTCGCCAGA CTGGACTGTT GGAAAATCTA 3719 GTTGCGATGA TTAAAAGAAA TTTTAATTCA CCAGAGTTGT CCGGAGTAGT TGATATTGAA 3779 AATACTGCAT CTTTAGTGGT AGATAAGTTT TTTGATAGTT ATTTACTTAA GGAAAAAAGA 3839 AAACCAAACA AAAATTTTTC ACTGTTTAGT AGAGAGTCTC TCAATAGGTG GATAGCAAAG 3899 CAAGAACAAG TCACAATTGG TCAGTTGGCC GATTTTGATT TTGTGGATCT TCCAGCCGTT 3959 GATCAGTACA GGCATATGAT TAAAGCGCAA CCGAAGCAGA AACTGGATCT GTCAATTCAG 4019 ACAGAATATC CAGCGTTGCA AACGATTGTG TATCATTCAA AGAAAATCAA CGCAATATTT 4079 GGTCCTCTTT TCAGTGAGCT TACAAGGCAA TTACTTGACA GTATTGACTC AAGCAGATTC 4139 TTGTTCTTTA CGAGAAAGAC ACCGGCTCAG ATCGAAGATT TCTTCGGAGA TCTAGACAGT 4199 CATGTCCCAA TGGACGTACT TGAGTTGGAT GTTTCGAAGT ATGATAAGTC TCAAAACGAG 4259 TTTCATTGTG CTGTTGAGTA CGAAATCTGG AGGAGACTGG GTCTGGAGGA TTTCTTGGCA 4319 GAAGTGTGGA AACAAGGGCA TAGAAAAACC ACTCTGAAAG ATTACACTGC TGGTATAAAA 4379 ACGTGTTTAT GGTACCAGAG AAAGAGTGGT GATGTTACAA CTTTTATCGG TAATACCGTC 4439 ATCATTGCTT CGTGTCTAGC ATCAATGCTC CCGATGGAAA AATTGATAAA AGGAGCCTTC 4499 TGCGGAGATG ACAGTTTGTT GTACTTTCCT AAGGGTTGTG AGTATCCCGA TATACAACAA 4559 GCTGCTAATC TAATGTGGAA TTTTGAGGCC AAACTGTTCA AGAAGCAATA TGGGTACTTC 4619 TGCGGGAGGT ACGTGATTCA TCACGATAGA GGTTGCATAG TATACTACGA CCCTTTGAAG 4679 CTGATTTCGA AACTTGGTGC TAAACACATC AAGGATTGGG ATCATTTGGA GGAGTTCAGA 4739 AGATCCCTCT GTGATGTTGC TGAGTCGTTG AACAATTGCG CGTATTACAC ACAATTGGAC 4799 GACGCTGTTG GGGAGGTTCA TAAAACCGCC CCACCTGGTT CGTTTGTTTA TAAGAGTTTA 4859 GTTAAGTATT TGTCAGATAA AGTTTTGTTT AGAAGTTTAT TTCTTGATGG CTCTAGTTGT 4919 TAAAGGTAAG GTAAATATTA ATGAGTTTAT CGATCTGTCA AAGTCTGAGA AACTTCTCCC 4979 GTCGATGTTC ACGCCTGTAA AGAGTGTTAT GGTTTCAAAG GTTGATAAGA TTATGGTCCA 5039 TGAAAATGAA TCATTGTCTG AAGTAAATCT CTTAAAAGGT GTAAAACTTA TAGAAGGTGG 5099 GTATGTTTGC TTAGTCGGTC TTGTTGTGTC CGGTGAGTGG AATTTACCAG ATAATTGCCG 5159 TGGTGGTGTG AGTGTCTGCA TGGTTGACAA GAGAATGGAA AGAGCGGACG AAGCCACACT 5219 GGGGTCATAT TACACTGCTG CTGCTAAAAA GCGGTTTCAG TTTAAAGTGG TCCCAAATTA 5279 CGGTATTACA ACAAAGGATG CAGAAAAGAA CATATGGCAG GTCTTAGTAA ATATTAAAAA 5339 TGTAAAAATG AGTGCGGGCT ACTGCCCTTT GTCATTAGAA TTTGTGTCTG TGTGTATTGT 5399 TTATAAAAAT AATATAAAAT TGGGTTTGAG GGAGAAAGTA ACGAGTGTGA ACGATGGAGG 5459 ACCCATGGAA CTTTCGGAAG AAGTTGTTGA TGAGTTCATG GAGAATGTTC CAATGTCGGT 5519 TAGACTCGCA AAGTTTCGAA CCAAATCCTC AAAAAGAGGT CCGAAAAATA ATAATAATTT 5579 AGGTAAGGGG CGTTCAGGCG GAAGGCCTAA ACCAAAAAGT TTTGATGAAG TTGAAAAAGA 5639 GTTTGATAAT TTGATTGAAG ATGAAGCCGA GACGTCGGTC GCGGATTCTG ATTCGTATTA 5699 AATATGTCTT ACTCAATCAC TTCTCCATCG CAATTTGTGT TTTTGTCATC TGTATGGGCT 5759 GACCCTATAG AATTGTTAAA CGTTTGTACA AATTCGTTAG GTAACCAGTT TCAAACACAG 5819 CAAGCAAGAA CTACTGTTCA ACAGCAGTTC AGCGAGGTGT GGAAACCTTT CCCTCAGAGC 5879 ACCGTCAGAT TTCCTGGCGA TGTTTATAAG GTGTACAGGT ACAATGCAGT TTTAGATCCT 5939 CTAATTACTG CGTTGCTGGG GGCTTTTGAT ACTAGGAATA GAATAATCGA AGTAGAAAAC 5999 CAGCAGAGTC CGACAACAGC TGAAACGTTA GATGCTACCC GCAGGGTAGA CGACGCTACG 6059 GTTGCAATTC GGTCTGCTAT AAATAATTTA GTTAATGAAC TAGTAAGAGG TACTGGACTG 6119 TACAATCAGA ATACTTTTGA AAGTATGTCT GGGTTGGTCT GGACCTCTGC ACCTGCATCT 6179 TAAATGCATA GGTGCTGAAA TATAAAGTTT GTGTTTCTAA AACACACGTG GTACGTACGA 6239 TAACGTACAG TGTTTTTCCC TCCACTTAAA TCGAAGGGTA GTGTCTTGGA GCGCGCGGAG 6299 TAAACATATA TGGTTCATAT ATGTCCGTAG GCACGTAAAA AAAGCGAGGG ATTCGAATTC 6359 CCCCGGAACC CCCGGTTGGG GCCCA 6384 配列番号：２ 配列の長さ：１１１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Tyr Thr Gln Thr Ala Thr Ser Ser Ala Leu Leu Glu Thr Val 1 5 10 15 Arg Gly Asn Asn Thr Leu Val Asn Asp Leu Ala Lys Arg Arg Leu Tyr 20 25 30 Asp Thr Ala Val Asp Glu Phe Asn Ala Arg Asp Arg Arg Pro Lys Val 35 40 45 Asn Phe Ser Lys Val Val Ser Glu Glu Gln Thr Leu Ile Ala Thr Lys 50 55 60 Ala Tyr Pro Glu Phe Gln Ile Thr Phe Tyr Asn Thr Gln Asn Ala Val 65 70 75 80 His Ser Leu Ala Gly Gly Leu Arg Ser Leu Glu Leu Glu Tyr Leu Met 85 90 95 Met Gln Ile Pro Tyr Gly Ser Leu Thr Tyr Asp Ile Gly Gly Asn Phe 100 105 110 Ala Ser His Leu Phe Lys Gly Arg Ala Tyr Val His Cys Cys Met Pro 115 120 125 Asn Leu Asp Val Arg Asp Ile Met Arg His Glu Gly Gln Lys Asp Ser 130 135 140 Ile Glu Leu Tyr Leu Ser Arg Leu Glu Arg Gly Asn Lys His Val Pro 145 150 155 160 Asn Phe Gln Lys Glu Ala Phe Asp Arg Tyr Ala Glu Met Pro Asn Glu 165 170 175 Val Val Cys His Asp Thr Phe Gln Thr Cys Arg His Ser Gln Glu Cys 180 185 190 Tyr Thr Gly Arg Val Tyr Ala Ile Ala Leu His Ser Ile Tyr Asp Ile 195 200 205 Pro Ala Asp Glu Phe Gly Ala Ala Leu Leu Arg Lys Asn Val His Val 210 215 220 Cys Tyr Ala Ala Phe His Phe Ser Glu Asn Leu Leu Leu Glu Asp Ser 225 230 235 240 His Val Asn Leu Asp Glu Ile Asn Ala Cys Phe Gln Arg Asp Gly Asp 245 250 255 Arg Leu Thr Phe Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Leu Asn Tyr Ser His 260 265 270 Ser Tyr Ser Asn Ile Leu Lys Tyr Val Cys Lys Thr Tyr Phe Pro Ala 275 280 285 Ser Asn Arg Glu Val Tyr Met Lys Glu Phe Leu Val Thr Arg Val Asn 290 295 300 Thr Trp Phe Cys Lys Phe Ser Arg Ile Asp Thr Phe Leu Leu Tyr Lys 305 310 315 320 Gly Val Ala His Lys Gly Val Asp Ser Glu Gln Phe Tyr Lys Ala Met 325 330 335 Glu Asp Ala Trp His Tyr Lys Lys Thr Leu Ala Met Cys Asn Ser Glu 340 345 350 Arg Ile Leu Leu Glu Asp Ser Ser Ser Val Asn Tyr Trp Phe Pro Lys 355 360 365 Met Arg Asp Met Val Ile Val Pro Leu Phe Asp Ile Ser Leu Glu Thr 370 375 380 Ser Lys Arg Thr Arg Lys Glu Val Leu Val Ser Lys Asp Phe Val Tyr 385 390 395 400 Thr Val Leu Asn His Ile Arg Thr Tyr Gln Ala Lys Ala Leu Thr Tyr 405 410 415 Ser Asn Val Leu Ser Phe Val Glu Ser Ile Arg Ser Arg Val Ile Ile 420 425 430 Asn Gly Val Thr Ala Arg Ser Glu Trp Asp Val Asp Lys Ser Leu Leu 435 440 445 Gln Ser Leu Ser Met Thr Phe Phe Leu His Thr Lys Leu Ala Val Leu 450 455 460 Lys Asp Asp Leu Leu Ile Ser Lys Phe Ala Leu Gly Pro Lys Thr Val 465 470 475 480 Ser Gln His Val Trp Asp Glu Ile Ser Leu Ala Phe Gly Asn Ala Phe 485 490 495 Pro Ser Ile Lys Glu Arg Leu Ile Asn Arg Lys Leu Ile Lys Ile Thr 500 505 510 Glu Asn Ala Leu Glu Ile Arg Val Pro Asp Leu Tyr Val Thr Phe His 515 520 525 Asp Arg Leu Val Ser Glu Tyr Lys Met Ser Val Asp Met Pro Val Leu 530 535 540 Asp Ile Arg Lys Lys Met Glu Glu Thr Glu Glu Met Tyr Asn Ala Leu 545 550 555 560 Ser Glu Leu Ser Val Leu Lys Asn Ser Asp Lys Phe Asp Val Asp Val 565 570 575 Phe Ser Gln Met Cys Gln Ser Leu Glu Val Asp Pro Met Thr Ala Ala 580 585 590 Lys Val Ile Val Ala Val Met Ser Asn Glu Ser Gly Leu Thr Leu Thr 595 600 605 Phe Glu Gln Pro Thr Glu Ala Asn Val Ala Leu Ala Leu Gln Asp Ser 610 615 620 Glu Lys Ala Ser Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Ser Arg Asp Val Glu 625 630 635 640 Glu Pro Ser Ile Lys Gly Ser Met Ala Arg Gly Glu Leu Gln Leu Ala 645 650 655 Gly Leu Ser Gly Asp Val Pro Glu Ser Ser Tyr Thr Arg Ser Glu Glu 660 665 670 Ile Glu Ser Leu Glu Gln Phe His Met Ala Thr Ala Ser Ser Leu Ile 675 680 685 His Lys Gln Met Cys Ser Ile Val Tyr Thr Gly Pro Leu Lys Val Gln 690 695 700 Gln Met Lys Asn Phe Ile Asp Ser Leu Val Ala Ser Leu Ser Ala Ala 705 710 715 720 Val Ser Asn Leu Val Lys Ile Leu Lys Asp Thr Ala Ala Ile Asp Leu 725 730 735 Glu Thr Arg Gln Lys Phe Gly Val Leu Asp Val Ala Ser Lys Arg Trp 740 745 750 Leu Val Lys Pro Ser Ala Lys Asn His Ala Trp Gly Val Val Glu Thr 755 760 765 His Ala Arg Lys Tyr His Val Ala Leu Leu Glu His Asp Glu Phe Gly 770 775 780 Ile Ile Thr Cys Asp Asn Trp Arg Arg Val Ala Val Ser Ser Glu Ser 785 790 795 800 Val Val Tyr Ser Asp Met Ala Lys Leu Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu 805 810 815 Lys Asp Gly Glu Pro His Val Ser Ser Ala Lys Val Val Leu Val Asp 820 825 830 Gly Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Lys Glu Ile Leu Ser Arg Val Asn 835 840 845 Phe Glu Glu Asp Leu Ile Leu Val Pro Gly Arg Gln Ala Ala Glu Met 850 855 860 Ile Arg Arg Arg Ala Asn Ala Ser Gly Ile Ile Val Ala Thr Lys Asp 865 870 875 880 Asn Val Arg Thr Val Asp Ser Phe Leu Met Asn Tyr Gly Lys Gly Ala 885 890 895 Arg Cys Gln Phe Lys Arg Leu Phe Ile Asp Glu Gly Leu Met Leu His 900 905 910 Thr Gly Cys Val Asn Phe Leu Val Glu Met Ser Leu Cys Asp Ile Ala 915 920 925 Tyr Val Tyr Gly Asp Thr Gln Gln Ile Pro Tyr Ile Asn Arg Val Thr 930 935 940 Gly Phe Pro Tyr Pro Ala His Phe Ala Lys Leu Glu Val Asp Glu Val 945 950 955 960 Glu Thr Arg Arg Thr Thr Leu Arg Cys Pro Ala Asp Val Thr His Phe 965 970 975 Leu Asn Gln Arg Tyr Glu Gly His Val Met Cys Thr Ser Ser Glu Lys 980 985 990 Lys Ser Val Ser Gln Glu Met Val Ser Gly Ala Ala Ser Ile Asn Pro 995 1000 1005 Val Ser Lys Pro Leu Lys Gly Lys Ile Leu Thr Phe Thr Gln Ser Asp 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Ala Asp Val His Thr Val His 1025 1030 1035 1040 Glu Val Gln Gly Glu Thr Tyr Ala Asp Val Ser Leu Val Arg Leu Thr 1045 1050 1055 Pro Thr Pro Val Ser Ile Ile Ala Arg Asp Ser Pro His Val Leu Val 1060 1065 1070 Ser Leu Ser Arg His Thr Lys Ser Leu Lys Tyr Tyr Thr Val Val Met 1075 1080 1085 Asp Pro Leu Val Ser Ile Ile Arg Asp Leu Glu Arg Val Ser Ser Tyr 1090 1095 1100 Leu Leu Asp Met Tyr Lys Val Asp Ala Gly Thr Gln 1105 1110 1115 配列番号：３ 配列の長さ：６３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic vir
us） トマト（Lycopersicon esculentum ） セルライン： エル（Ｌ） 配列の特徴 3423-4919 E CDS 配列 GTATTTTTAC AACAATTACC AACAACAACA ACAAACAACA ACAACATTAC ATTTTACATT 60 CTACAACTAC AATGGCATAC ACACAAACAG CCACATCGTC CGCTTTGCTT GAGACCGTCC 120 GAGGTAACAA TACCTTGGTC AACGATCTTG CAAAGCGGCG TCTATATGAC ACAGCGGTCG 180 ATGAATTTAA TGCTAGGGAC CGCAGGCCTA AAGTCAATTT TTCCAAAGTA GTAAGCGAAG 240 AACAGACGCT TATTGCAACC AAAGCCTACC CAGAATTCCA AATTACATTC TACAACACGC 300 AGAATGCTGT GCATTCCCTT GCAGGCGGTC TCCGATCATT AGAATTGGAA TATCTGATGA 360 TGCAAATTCC CTACGGATCA TTGACATATG ATATCGGAGG TAATTTTGCA TCTCATCTGT 420 TCAAAGGGCG AGCATACGTT CACTGCTGTA TGCCGAATCT GGATGTCCGC GACATAATGC 480 GGCACGAGGG CCAAAAGGAC AGTATTGAAC TATACCTTTC TAGGCTCGAG AGGGGCAACA 540 AACATGTCCC AAACTTCCAA AAGGAAGCTT TCGACAGATA CGCTGAAATG CCAAACGAAG 600 TAGTCTGTCA CGATACTTTC CAAACGTGTA GGCATTCTCA AGAATGTTAC ACGGGAAGAG 660 TGTATGCTAT TGCTTTGCAT AGTATATACG ATATACCTGC CGACGAGTTC GGCGCGGCAC 720 TGCTGAGAAA GAATGTACAT GTATGTTATG CCGCTTTCCA CTTTTCCGAG AATTTACTTC 780 TCGAAGATTC ACACGTCAAC CTCGACGAGA TCAATGCATG TTTCCAAAGA GATGGAGACA 840 GGTTGACTTT TTCCTTTGCA TCTGAGAGTA CTCTTAATTA TAGTCATAGT TATTCTAATA 900 TTCTTAAGTA TGTTTGCAAA ACTTACTTCC CAGCCTCTAA TAGAGAGGTT TACATGAAGG 960 AGTTTTTAGT AACTAGAGTT AATACCTGGT TTTGTAAATT TTCTAGAATA GATACTTTCT 1020 TATTGTACAA AGGTGTAGCG CATAAGGGTG TAGATAGTGA GCAGTTTTAC AAGGCTATGG 1080 AAGACGCATG GCACTACAAA AAGACTCTTG CGATGTGCAA CAGTGAAAGA ATCTTGTTAG 1140 AGGATTCTTC ATCAGTTAAT TACTGGTTTC CAAAAATGAG GGATATGGTG ATAGTTCCAC 1200 TATTTGACAT ATCTCTCGAG ACTAGTAAAA GAACACGCAA AGAGGTCTTA GTTTCAAAGG 1260 ACTTTGTTTA TACAGTGTTA AATCACATTC GTACGTACCA GGCCAAAGCG CTTACTTACT 1320 CCAACGTGTT ATCTTTCGTC GAATCAATTC GTTCGAGAGT GATCATTAAC GGGGTTACTG 1380 CTAGGTCTGA GTGGGATGTC GATAAATCAT TATTACAGTC CTTGTCGATG ACGTTCTTCC 1440 TACACACCAA GCTTGCCGTT CTGAAAGACG ATCTTTTGAT TAGCAAGTTT GCACTTGGAC 1500 CAAAAACTGT CTCACAACAT GTGTGGGATG AGATTTCCCT AGCTTTCGGC AATGCTTTCC 1560 CATCGATCAA GGAAAGATTG ATAAACCGGA AACTGATCAA AATTACGGAG AATGCGTTAG 1620 AGATCAGGGT GCCCGATCTT TATGTCACTT TCCATGATAG GTTAGTTTCT GAGTACAAAA 1680 TGTCAGTGGA CATGCCGGTG CTAGACATTA GGAAAAAGAT GGAAGAAACT GAGGAAATGT 1740 ACAATGCACT GTCCGAACTG TCTGTACTTA AAAATTCAGA CAAGTTCGAT GTTGACGTTT 1800 TTTCCCAGAT GTGCCAATCT TTAGAAGTCG ATCCAATGAC TGCAGCAAAG GTAATAGTAG 1860 CAGTTATGAG CAACGAGAGT GGTCTTACTC TCACGTTTGA ACAGCCCACC GAAGCTAATG 1920 TTGCGCTAGC ATTGCAAGAT TCTGAAAAGG CTTCTGATGG GGCGTTGGTA GTTACCTCAA 1980 GAGATGTTGA GGAACCGTCC ATAAAGGGTT CGATGGCCCG TGGTGAGTTA CAATTGGCCG 2040 GATTATCTGG CGACGTTCCT GAATCTTCAT ACACTAGGAG CGAGGAGATT GAGTCTCTCG 2100 AGCAGTTTCA TATGGCAACA GCTAGTTCGT TAATTCATAA GCAGATGTGT TCGATCGTGT 2160 ACACGGGCCC TCTTAAAGTT CAACAAATGA AAAACTTTAT AGACAGCCTG GTAGCCTCGC 2220 TCTCTGCTGC GGTGTCGAAT CTAGTGAAGA TCCTAAAAGA TACAGCCGCG ATTGACCTTG 2280 AAACTCGTCA AAAGTTCGGA GTTCTGGATG TTGCTTCGAA AAGGTGGCTA GTTAAACCAT 2340 CCGCAAAGAA CCATGCATGG GGGGTTGTTG AGACTCATGC GAGGAAATAT CACGTCGCAT 2400 TACTGGAGCA CGATGAATTT GGCATTATTA CGTGCGATAA CTGGCGACGG GTGGCTGTGA 2460 GTTCTGAGTC GGTAGTATAT TCTGATATGG CTAAACTCAG GACTCTGAGA AGATTGCTCA 2520 AAGATGGAGA ACCACACGTT AGTTCAGCAA AGGTGGTTTT GGTGGATGGC GTTCCAGGGT 2580 GCGGGAAGAC AAAGGAAATT CTTTCGAGAG TTAATTTCGA AGAAGATCTA ATTCTTGTCC 2640 CTGGTCGTCA AGCTGCCGAG ATGATCAGAA GAAGAGCTAA TGCGTCGGGC ATAATAGTGG 2700 CTACAAAGGA TAATGTGCGC ACCGTCGATT CATTTTTGAT GAATTACGGG AAAGGGGCAC 2760 GCTGTCAGTT CAAAAGATTG TTCATAGACG AAGGTTTGAT GCTGCATACT GGTTGTGTGA 2820 ATTTTTTGGT TGAAATGTCT CTGTGCGATA TTGCATATGT TTATGGAGAC ACCCAACAGA 2880 TTCCGTACAT CAACAGAGTA ACTGGTTTCC CGTACCCTGC ACACTTTGCA AAATTGGAGG 2940 TCGACGAAGT CGAAACAAGA AGAACTACTC TTCGTTGTCC GGCTGATGTC ACACACTTCC 3000 TAAATCAAAG GTATGAAGGA CACGTAATGT GCACGTCTTC TGAAAAGAAA TCAGTTTCCC 3060 AGGAAATGGT TAGTGGGGCT GCGTCTATCA ATCCTGTGTC CAAGCCGCTT AAGGGAAAAA 3120 TTTTGACTTT CACACAGTCT GACAAGGAGG CCCTTCTCTC AAGGGGCTAC GCAGATGTCC 3180 ATACTGTACA TGAGGTACAA GGTGAGACTT ATGCAGACGT ATCGTTAGTT CGACTAACAC 3240 CTACGCCTGT ATCTATCATC GCAAGAGACA GTCCGCATGT TCTGGTCTCG TTGTCAAGAC 3300 ACACAAAATC CCTAAAGTAC TACACCGTTG TGATGGATCC TTTAGTTAGT ATCATTAGAG 3360 ATTTAGAACG GGTTAGTAGT TACTTATTAG ACATGTACAA AGTAGATGCA GGTACTCAAT 3420 AG CAA TTA CAG GTC GAC TCT GTG TTT AAA AAT TTC AAT CTT TTT GTA 3467 Gln Leu Gln Val Asp Ser Val Phe Lys Asn Phe Asn Leu Phe Val 1 5 10 15 GCA GCT CCA AAG ACT GGA GAT ATA TCT GAT ATG CAA TTT TAC TAT GAT 3515 Ala Ala Pro Lys Thr Gly Asp Ile Ser Asp Met Gln Phe Tyr Tyr Asp 20 25 30 AAG TGT CTT CCT GGG AAC AGC ACG TTG TTG AAC AAC TAC GAC GCT GTT 3563 Lys Cys Leu Pro Gly Asn Ser Thr Leu Leu Asn Asn Tyr Asp Ala Val 35 40 45 ACC ATG AAA TTG ACT GAC ATT TCT CTG AAT GTC AAA GAT TGC ATA TTA 3611 Thr Met Lys Leu Thr Asp Ile Ser Leu Asn Val Lys Asp Cys Ile Leu 50 55 60 GAT ATG TCT AAG TCT GTA GCT GCT CCG AAA GAT GTC AAA CCA ACT TTA 3659 Asp Met Ser Lys Ser Val Ala Ala Pro Lys Asp Val Lys Pro Thr Leu 65 70 75 ATA CCG ATG GTA CGA ACG GCG GCA GAA ATG CCT CGC CAG ACT GGA CTG 3707 Ile Pro Met Val Arg Thr Ala Ala Glu Met Pro Arg Gln Thr Gly Leu 80 85 90 95 TTG GAA AAT CTA GTT GCG ATG ATT AAA AGA AAT TTT AAT TCA CCA GAG 3755 Leu Glu Asn Leu Val Ala Met Ile Lys Arg Asn Phe Asn Ser Pro Glu 100 105 110 TTG TCC GGA GTA GTT GAT ATT GAA AAT ACT GCA TCT TTA GTG GTA GAT 3803 Leu Ser Gly Val Val Asp Ile Glu Asn Thr Ala Ser Leu Val Val Asp 115 120 125 AAG TTT TTT GAT AGT TAT TTA CTT AAG GAA AAA AGA AAA CCA AAC AAA 3851 Lys Phe Phe Asp Ser Tyr Leu Leu Lys Glu Lys Arg Lys Pro Asn Lys 130 135 140 AAT TTT TCA CTG TTT AGT AGA GAG TCT CTC AAT AGG TGG ATA GCA AAG 3899 Asn Phe Ser Leu Phe Ser Arg Glu Ser Leu Asn Arg Trp Ile Ala Lys 145 150 155 CAA GAA CAA GTC ACA ATT GGT CAG TTG GCC GAT TTT GAT TTT GTG GAT 3947 Gln Glu Gln Val Thr Ile Gly Gln Leu Ala Asp Phe Asp Phe Val Asp 160 165 170 175 CTT CCA GCC GTT GAT CAG TAC AGG CAT ATG ATT AAA GCG CAA CCG AAG 3995 Leu Pro Ala Val Asp Gln Tyr Arg His Met Ile Lys Ala Gln Pro Lys 180 185 190 CAG AAA CTG GAT CTG TCA ATT CAG ACA GAA TAT CCA GCG TTG CAA ACG 4043 Gln Lys Leu Asp Leu Ser Ile Gln Thr Glu Tyr Pro Ala Leu Gln Thr 195 200 205 ATT GTG TAT CAT TCA AAG AAA ATC AAC GCA ATA TTT GGT CCT CTT TTC 4091 Ile Val Tyr His Ser Lys Lys Ile Asn Ala Ile Phe Gly Pro Leu Phe 210 215 220 AGT GAG CTT ACA AGG CAA TTA CTT GAC AGT ATT GAC TCA AGC AGA TTC 4139 Ser Glu Leu Thr Arg Gln Leu Leu Asp Ser Ile Asp Ser Ser Arg Phe 225 230 235 TTG TTC TTT ACG AGA AAG ACA CCG GCT CAG ATC GAA GAT TTC TTC GGA 4187 Leu Phe Phe Thr Arg Lys Thr Pro Ala Gln Ile Glu Asp Phe Phe Gly 240 245 250 255 GAT CTA GAC AGT CAT GTC CCA ATG GAC GTA CTT GAG TTG GAT GTT TCG 4235 Asp Leu Asp Ser His Val Pro Met Asp Val Leu Glu Leu Asp Val Ser 260 265 270 AAG TAT GAT AAG TCT CAA AAC GAG TTT CAT TGT GCT GTT GAG TAC GAA 4283 Lys Tyr Asp Lys Ser Gln Asn Glu Phe His Cys Ala Val Glu Tyr Glu 275 280 285 ATC TGG AGG AGA CTG GGT CTG GAG GAT TTC TTG GCA GAA GTG TGG AAA 4331 Ile Trp Arg Arg Leu Gly Leu Glu Asp Phe Leu Ala Glu Val Trp Lys 290 295 300 CAA GGG CAT AGA AAA ACC ACT CTG AAA GAT TAC ACT GCT GGT ATA AAA 4379 Gln Gly His Arg Lys Thr Thr Leu Lys Asp Tyr Thr Ala Gly Ile Lys 305 310 315 ACG TGT TTA TGG TAC CAG AGA AAG AGT GGT GAT GTT ACA ACT TTT ATC 4427 Thr Cys Leu Trp Tyr Gln Arg Lys Ser Gly Asp Val Thr Thr Phe Ile 320 325 330 335 GGT AAT ACC GTC ATC ATT GCT TCG TGT CTA GCA TCA ATG CTC CCG ATG 4475 Gly Asn Thr Val Ile Ile Ala Ser Cys Leu Ala Ser Met Leu Pro Met 340 345 350 GAA AAA TTG ATA AAA GGA GCC TTC TGC GGA GAT GAC AGT TTG TTG TAC 4523 Glu Lys Leu Ile Lys Gly Ala Phe Cys Gly Asp Asp Ser Leu Leu Tyr 355 360 365 TTT CCT AAG GGT TGT GAG TAT CCC GAT ATA CAA CAA GCT GCT AAT CTA 4571 Phe Pro Lys Gly Cys Glu Tyr Pro Asp Ile Gln Gln Ala Ala Asn Leu 370 375 380 ATG TGG AAT TTT GAG GCC AAA CTG TTC AAG AAG CAA TAT GGG TAC TTC 4619 Met Trp Asn Phe Glu Ala Lys Leu Phe Lys Lys Gln Tyr Gly Tyr Phe 385 390 395 TGC GGG AGG TAC GTG ATT CAT CAC GAT AGA GGT TGC ATA GTA TAC TAC 4667 Cys Gly Arg Tyr Val Ile His His Asp Arg Gly Cys Ile Val Tyr Tyr 400 405 410 415 GAC CCT TTG AAG CTG ATT TCG AAA CTT GGT GCT AAA CAC ATC AAG GAT 4715 Asp Pro Leu Lys Leu Ile Ser Lys Leu Gly Ala Lys His Ile Lys Asp 420 425 430 TGG GAT CAT TTG GAG GAG TTC AGA AGA TCC CTC TGT GAT GTT GCT GAG 4763 Trp Asp His Leu Glu Glu Phe Arg Arg Ser Leu Cys Asp Val Ala Glu 435 440 445 TCG TTG AAC AAT TGC GCG TAT TAC ACA CAA TTG GAC GAC GCT GTT GGG 4811 Ser Leu Asn Asn Cys Ala Tyr Tyr Thr Gln Leu Asp Asp Ala Val Gly 450 455 460 GAG GTT CAT AAA ACC GCC CCA CCT GGT TCG TTT GTT TAT AAG AGT TTA 4859 Glu Val His Lys Thr Ala Pro Pro Gly Ser Phe Val Tyr Lys Ser Leu 465 470 475 GTT AAG TAT TTG TCA GAT AAA GTT TTG TTT AGA AGT TTA TTT CTT GAT 4907 Val Lys Tyr Leu Ser Asp Lys Val Leu Phe Arg Ser Leu Phe Leu Asp 480 485 490 495 GGC TCT AGT TGT TAAAGGTAAG GTAAATATTA ATGAGTTTAT CGATCTGTCA 4959 Gly Ser Ser Cys AAGTCTGAGA AACTTCTCCC GTCGATGTTC ACGCCTGTAA AGAGTGTTAT GGTTTCAAAG 5019 GTTGATAAGA TTATGGTCCA TGAAAATGAA TCATTGTCTG AAGTAAATCT CTTAAAAGGT 5079 GTAAAACTTA TAGAAGGTGG GTATGTTTGC TTAGTCGGTC TTGTTGTGTC CGGTGAGTGG 5139 AATTTACCAG ATAATTGCCG TGGTGGTGTG AGTGTCTGCA TGGTTGACAA GAGAATGGAA 5199 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us） トマト（Lycopersicon esculentum ） セルライン： エル（Ｌ） 配列の特徴： 4906-5697 E CDS 配列 GTATTTTTAC AACAATTACC AACAACAACA ACAAACAACA ACAACATTAC ATTTTACATT 60 CTACAACTAC AATGGCATAC ACACAAACAG CCACATCGTC CGCTTTGCTT GAGACCGTCC 120 GAGGTAACAA TACCTTGGTC AACGATCTTG CAAAGCGGCG TCTATATGAC ACAGCGGTCG 180 ATGAATTTAA TGCTAGGGAC CGCAGGCCTA AAGTCAATTT TTCCAAAGTA GTAAGCGAAG 240 AACAGACGCT TATTGCAACC AAAGCCTACC CAGAATTCCA AATTACATTC TACAACACGC 300 AGAATGCTGT GCATTCCCTT GCAGGCGGTC TCCGATCATT AGAATTGGAA TATCTGATGA 360 TGCAAATTCC CTACGGATCA TTGACATATG ATATCGGAGG TAATTTTGCA TCTCATCTGT 420 TCAAAGGGCG AGCATACGTT CACTGCTGTA TGCCGAATCT GGATGTCCGC GACATAATGC 480 GGCACGAGGG CCAAAAGGAC AGTATTGAAC TATACCTTTC TAGGCTCGAG AGGGGCAACA 540 AACATGTCCC AAACTTCCAA AAGGAAGCTT TCGACAGATA CGCTGAAATG CCAAACGAAG 600 TAGTCTGTCA CGATACTTTC CAAACGTGTA GGCATTCTCA AGAATGTTAC ACGGGAAGAG 660 TGTATGCTAT TGCTTTGCAT AGTATATACG ATATACCTGC CGACGAGTTC GGCGCGGCAC 720 TGCTGAGAAA GAATGTACAT GTATGTTATG CCGCTTTCCA CTTTTCCGAG AATTTACTTC 780 TCGAAGATTC 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us） トマト（Lycopersicon esculentum ） セルライン： エル（Ｌ） 配列の特徴： 5703-6179 E CDS 配列 GTATTTTTAC AACAATTACC AACAACAACA ACAAACAACA ACAACATTAC ATTTTACATT 60 CTACAACTAC AATGGCATAC ACACAAACAG CCACATCGTC CGCTTTGCTT GAGACCGTCC 120 GAGGTAACAA TACCTTGGTC AACGATCTTG CAAAGCGGCG TCTATATGAC ACAGCGGTCG 180 ATGAATTTAA TGCTAGGGAC CGCAGGCCTA AAGTCAATTT TTCCAAAGTA GTAAGCGAAG 240 AACAGACGCT TATTGCAACC AAAGCCTACC CAGAATTCCA AATTACATTC TACAACACGC 300 AGAATGCTGT GCATTCCCTT GCAGGCGGTC TCCGATCATT AGAATTGGAA TATCTGATGA 360 TGCAAATTCC CTACGGATCA TTGACATATG ATATCGGAGG TAATTTTGCA TCTCATCTGT 420 TCAAAGGGCG AGCATACGTT CACTGCTGTA TGCCGAATCT GGATGTCCGC GACATAATGC 480 GGCACGAGGG CCAAAAGGAC AGTATTGAAC TATACCTTTC TAGGCTCGAG AGGGGCAACA 540 AACATGTCCC AAACTTCCAA AAGGAAGCTT TCGACAGATA CGCTGAAATG CCAAACGAAG 600 TAGTCTGTCA CGATACTTTC CAAACGTGTA GGCATTCTCA AGAATGTTAC ACGGGAAGAG 660 TGTATGCTAT TGCTTTGCAT AGTATATACG ATATACCTGC CGACGAGTTC GGCGCGGCAC 720 TGCTGAGAAA GAATGTACAT GTATGTTATG CCGCTTTCCA CTTTTCCGAG AATTTACTTC 780 TCGAAGATTC 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GCCCGATCTT TATGTCACTT TCCATGATAG GTTAGTTTCT GAGTACAAAA 1680 TGTCAGTGGA CATGCCGGTG CTAGACATTA GGAAAAAGAT GGAAGAAACT GAGGAAATGT 1740 ACAATGCACT GTCCGAACTG TCTGTACTTA AAAATTCAGA CAAGTTCGAT GTTGACGTTT 1800 TTTCCCAGAT GTGCCAATCT TTAGAAGTCG ATCCAATGAC TGCAGCAAAG GTAATAGTAG 1860 CAGTTATGAG CAACGAGAGT GGTCTTACTC TCACGTTTGA ACAGCCCACC GAAGCTAATG 1920 TTGCGCTAGC ATTGCAAGAT TCTGAAAAGG CTTCTGATGG GGCGTTGGTA GTTACCTCAA 1980 GAGATGTTGA GGAACCGTCC ATAAAGGGTT CGATGGCCCG TGGTGAGTTA CAATTGGCCG 2040 GATTATCTGG CGACGTTCCT GAATCTTCAT ACACTAGGAG CGAGGAGATT GAGTCTCTCG 2100 AGCAGTTTCA TATGGCAACA GCTAGTTCGT TAATTCATAA GCAGATGTGT TCGATCGTGT 2160 ACACGGGCCC TCTTAAAGTT CAACAAATGA AAAACTTTAT AGACAGCCTG GTAGCCTCGC 2220 TCTCTGCTGC GGTGTCGAAT CTAGTGAAGA TCCTAAAAGA TACAGCCGCG ATTGACCTTG 2280 AAACTCGTCA AAAGTTCGGA GTTCTGGATG TTGCTTCGAA AAGGTGGCTA GTTAAACCAT 2340 CCGCAAAGAA CCATGCATGG GGGGTTGTTG AGACTCATGC GAGGAAATAT CACGTCGCAT 2400 TACTGGAGCA CGATGAATTT GGCATTATTA CGTGCGATAA CTGGCGACGG GTGGCTGTGA 2460 GTTCTGAGTC GGTAGTATAT TCTGATATGG CTAAACTCAG GACTCTGAGA AGATTGCTCA 2520 AAGATGGAGA ACCACACGTT AGTTCAGCAA AGGTGGTTTT GGTGGATGGC GTTCCAGGGT 2580 GCGGGAAGAC AAAGGAAATT CTTTCGAGAG TTAATTTCGA AGAAGATCTA ATTCTTGTCC 2640 CTGGTCGTCA AGCTGCCGAG ATGATCAGAA GAAGAGCTAA TGCGTCGGGC ATAATAGTGG 2700 CTACAAAGGA TAATGTGCGC ACCGTCGATT CATTTTTGAT GAATTACGGG AAAGGGGCAC 2760 GCTGTCAGTT CAAAAGATTG TTCATAGACG AAGGTTTGAT GCTGCATACT GGTTGTGTGA 2820 ATTTTTTGGT TGAAATGTCT CTGTGCGATA TTGCATATGT TTATGGAGAC ACCCAACAGA 2880 TTCCGTACAT CAACAGAGTA ACTGGTTTCC CGTACCCTGC ACACTTTGCA AAATTGGAGG 2940 TCGACGAAGT CGAAACAAGA AGAACTACTC TTCGTTGTCC GGCTGATGTC ACACACTTCC 3000 TAAATCAAAG GTATGAAGGA CACGTAATGT GCACGTCTTC TGAAAAGAAA TCAGTTTCCC 3060 AGGAAATGGT TAGTGGGGCT GCGTCTATCA ATCCTGTGTC CAAGCCGCTT AAGGGAAAAA 3120 TTTTGACTTT CACACAGTCT GACAAGGAGG CCCTTCTCTC AAGGGGCTAC GCAGATGTCC 3180 ATACTGTACA TGAGGTACAA GGTGAGACTT ATGCAGACGT ATCGTTAGTT CGACTAACAC 3240 CTACGCCTGT ATCTATCATC GCAAGAGACA GTCCGCATGT TCTGGTCTCG TTGTCAAGAC 3300 ACACAAAATC CCTAAAGTAC TACACCGTTG TGATGGATCC TTTAGTTAGT ATCATTAGAG 3360 ATTTAGAACG GGTTAGTAGT TACTTATTAG ACATGTACAA AGTAGATGCA GGTACTCAAT 3420 AGCAATTACA GGTCGACTCT GTGTTTAAAA ATTTCAATCT TTTTGTAGCA GCTCCAAAGA 3480 CTGGAGATAT ATCTGATATG CAATTTTACT ATGATAAGTG TCTTCCTGGG AACAGCACGT 3540 TGTTGAACAA CTACGACGCT GTTACCATGA AATTGACTGA CATTTCTCTG AATGTCAAAG 3600 ATTGCATATT AGATATGTCT AAGTCTGTAG CTGCTCCGAA AGATGTCAAA CCAACTTTAA 3660 TACCGATGGT ACGAACGGCG GCAGAAATGC CTCGCCAGAC TGGACTGTTG GAAAATCTAG 3720 TTGCGATGAT TAAAAGAAAT TTTAATTCAC CAGAGTTGTC CGGAGTAGTT GATATTGAAA 3780 ATACTGCATC TTTAGTGGTA GATAAGTTTT TTGATAGTTA TTTACTTAAG GAAAAAAGAA 3840 AACCAAACAA AAATTTTTCA CTGTTTAGTA GAGAGTCTCT CAATAGGTGG ATAGCAAAGC 3900 AAGAACAAGT CACAATTGGT CAGTTGGCCG ATTTTGATTT TGTGGATCTT CCAGCCGTTG 3960 ATCAGTACAG GCATATGATT AAAGCGCAAC CGAAGCAGAA ACTGGATCTG TCAATTCAGA 4020 CAGAATATCC AGCGTTGCAA ACGATTGTGT ATCATTCAAA GAAAATCAAC GCAATATTTG 4080 GTCCTCTTTT CAGTGAGCTT ACAAGGCAAT TACTTGACAG TATTGACTCA AGCAGATTCT 4140 TGTTCTTTAC GAGAAAGACA CCGGCTCAGA TCGAAGATTT CTTCGGAGAT CTAGACAGTC 4200 ATGTCCCAAT GGACGTACTT GAGTTGGATG TTTCGAAGTA TGATAAGTCT CAAAACGAGT 4260 TTCATTGTGC TGTTGAGTAC GAAATCTGGA GGAGACTGGG TCTGGAGGAT TTCTTGGCAG 4320 AAGTGTGGAA ACAAGGGCAT AGAAAAACCA CTCTGAAAGA TTACACTGCT GGTATAAAAA 4380 CGTGTTTATG GTACCAGAGA AAGAGTGGTG ATGTTACAAC TTTTATCGGT AATACCGTCA 4440 TCATTGCTTC GTGTCTAGCA TCAATGCTCC CGATGGAAAA ATTGATAAAA GGAGCCTTCT 4500 GCGGAGATGA CAGTTTGTTG TACTTTCCTA AGGGTTGTGA GTATCCCGAT ATACAACAAG 4560 CTGCTAATCT AATGTGGAAT TTTGAGGCCA AACTGTTCAA GAAGCAATAT GGGTACTTCT 4620 GCGGGAGGTA CGTGATTCAT CACGATAGAG GTTGCATAGT ATACTACGAC CCTTTGAAGC 4680 TGATTTCGAA ACTTGGTGCT AAACACATCA AGGATTGGGA TCATTTGGAG GAGTTCAGAA 4740 GATCCCTCTG TGATGTTGCT GAGTCGTTGA ACAATTGCGC GTATTACACA CAATTGGACG 4800 ACGCTGTTGG GGAGGTTCAT AAAACCGCCC CACCTGGTTC GTTTGTTTAT AAGAGTTTAG 4860 TTAAGTATTT GTCAGATAAA GTTTTGTTTA GAAGTTTATT TCTTGATGGC TCTAGTTGTT 4920 AAAGGTAAGG TAAATATTAA TGAGTTTATC GATCTGTCAA AGTCTGAGAA ACTTCTCCCG 4980 TCGATGTTCA CGCCTGTAAA GAGTGTTATG GTTTCAAAGG TTGATAAGAT TATGGTCCAT 5040 GAAAATGAAT CATTGTCTGA AGTAAATCTC TTAAAAGGTG TAAAACTTAT AGAAGGTGGG 5100 TATGTTTGCT TAGTCGGTCT TGTTGTGTCC GGTGAGTGGA ATTTACCAGA TAATTGCCGT 5160 GGTGGTGTGA GTGTCTGCAT GGTTGACAAG AGAATGGAAA GAGCGGACGA AGCCACACTG 5220 GGGTCATATT ACACTGCTGC TGCTAAAAAG CGGTTTCAGT TTAAAGTGGT CCCAAATTAC 5280 GGTATTACAA CAAAGGATGC AGAAAAGAAC ATATGGCAGG TCTTAGTAAA TATTAAAAAT 5340 GTAAAAATGA GTGCGGGCTA CTGCCCTTTG TCATTAGAAT TTGTGTCTGT GTGTATTGTT 5400 TATAAAAATA ATATAAAATT GGGTTTGAGG GAGAAAGTAA CGAGTGTGAA CGATGGAGGA 5460 CCCATGGAAC TTTCGGAAGA AGTTGTTGAT GAGTTCATGG AGAATGTTCC AATGTCGGTT 5520 AGACTCGCAA AGTTTCGAAC CAAATCCTCA AAAAGAGGTC CGAAAAATAA TAATAATTTA 5580 GGTAAGGGGC GTTCAGGCGG AAGGCCTAAA CCAAAAAGTT TTGATGAAGT TGAAAAAGAG 5640 TTTGATAATT TGATTGAAGA TGAAGCCGAG ACGTCGGTCG CGGATTCTGA TTCGTATTAA 5700 AT ATG TCT TAC TCA ATC ACT TCT CCA TCG CAA TTT GTG TTT TTG TCA 5747 Met Ser Tyr Ser Ile Thr Ser Pro Ser Gln Phe Val Phe Leu Ser 1 5 10 15 TCT GTA TGG GCT GAC CCT ATA GAA TTG TTA AAC GTT TGT ACA AAT TCG 5795 Ser Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn Ser 20 25 30 TTA GGT AAC CAG TTT CAA ACA CAG CAA GCA AGA ACT ACT GTT CAA CAG 5843 Leu Gly Asn Gln Phe Gln Thr Gln Gln Ala Arg Thr Thr Val Gln Gln 35 40 45 CAG TTC AGC GAG GTG TGG AAA CCT TTC CCT CAG AGC ACC GTC AGA TTT 5891 Gln Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gln Ser Thr Val Arg Phe 50 55 60 CCT GGC GAT GTT TAT AAG GTG TAC AGG TAC AAT GCA GTT TTA GAT CCT 5939 Pro Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Val Leu Asp Pro 65 70 75 CTA ATT ACT GCG TTG CTG GGG GCT TTT GAT ACT AGG AAT AGA ATA ATC 5987 Leu Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ala Phe Asp Thr Arg Asn Arg Ile Ile 80 85 90 95 GAA GTA GAA AAC CAG CAG AGT CCG ACA ACA GCT GAA ACG TTA GAT GCT 6035 Glu Val Glu Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Ala 100 105 110 ACC CGC AGG GTA GAC GAC GCT ACG GTT GCA ATT CGG TCT GCT ATA AAT 6083 Thr Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn 115 120 125 AAT TTA GTT AAT GAA CTA GTA AGA GGT ACT GGA CTG TAC AAT CAG AAT 6131 Asn Leu Val Asn Glu Leu Val Arg Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gln Asn 130 135 140 ACT TTT GAA AGT ATG TCT GGG TTG GTC TGG ACC TCT GCA CCT GCA TCT 6179 Thr Phe Glu Ser Met Ser Gly Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser 145 150 155 TAAATGCATA GGTGCTGAAA TATAAAGTTT GTGTTTCTAA AACACACGTG GTACGTACGA 6239 TAACGTACAG TGTTTTTCCC TCCACTTAAA TCGAAGGGTA GTGTCTTGGA GCGCGCGGAG 6299 TAAACATATA TGGTTCATAT ATGTCCGTAG GCACGTAAAA AAAGCGAGGG ATTCGAATTC 6359 CCCCGGAACC CCCGGTTGGG GCCCA 6384 配列番号：８ 配列の長さ：１５９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ser Tyr Ser Ile Thr Ser Pro Ser Gln Phe Val Phe Leu Ser Ser 1 5 10 15 Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn Ser Leu 20 25 30 Gly Asn Gln Phe Gln Thr Gln Gln Ala Arg Thr Thr Val Gln Gln Gln 35 40 45 Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gln Ser Thr Val Arg Phe Pro 50 55 60 Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala Val Leu Asp Pro Leu 65 70 75 80 Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ala Phe Asp Thr Arg Asn Arg Ile Ile Glu 85 90 95 Val Glu Asn Gln Gln Ser Pro Thr Thr Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr 100 105 110 Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn Asn 115 120 125 Leu Val Asn Glu Leu Val Arg Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gln Asn Thr 130 135 140 Phe Glu Ser Met Ser Gly Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser 145 150 155 配列番号：９ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 GGTCGATCTC GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA TGCA 44 配列番号：１０ 配列の長さ：４４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCGACC TGCA 44 配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 ACTCACTTAG GTATTTTTAC 20 配列番号：１２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 配列 ＣＡＣＴＡＴＡＧＴＡ ＴＴＴＴＴ
15 配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 GATCCCCCGG GCTCGAGACG CGTA 24 配列番号：１４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列 GATCTACGCG TCTCGAGCCC GGGG 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 公知の転写ベクタ−pLFW3 の模式図

【図２】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図３】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図４】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図５】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図６】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図７】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図８】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図９】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式図

【図１０】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式
図

【図１１】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式
図

【図１２】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式
図

【図１３】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式
図

【図１４】 転写ベクタ−pL5013を作製する手順の模式
図

【図１５】 試験管内転写の結果を示したアガロ−スゲ
ル電気泳動の泳動パタ−ン

【図１６】 転写物の植物細胞への導入の結果を示した
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の泳動パタ−ン

【図１７】 転写ベクターpL5020を作成する手順の模式
図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 吉美 千葉県松戸市常盤平２丁目６番14号

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】５’末端より３’末端の方向において、 i) トバモウィルスの５’非翻訳領域 ii) トバモウィルスの複製酵素コ−ド領域 iii) 外来遺伝子連結領域 iv) トバモウィルスの３’非翻訳領域 を含み、 該トバモウィルス領域の５’側に宿主細胞により認識
   されない転写プロモ−タ−領域、３’側に転写タ−ミネ
   −タ−領域を有し、 宿主細胞内での複製開始点と選択マ−カ−遺伝子を有
   する転写ベクタ−。