JPH06237770A - 動物受精卵への微量注入法 - Google Patents
動物受精卵への微量注入法Info
- Publication number
- JPH06237770A JPH06237770A JP5029064A JP2906493A JPH06237770A JP H06237770 A JPH06237770 A JP H06237770A JP 5029064 A JP5029064 A JP 5029064A JP 2906493 A JP2906493 A JP 2906493A JP H06237770 A JPH06237770 A JP H06237770A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- animal
- microinjection
- fertilized
- ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 注入後も正常分裂が達成されやすい動物受精
卵への微量注入法。 【構成】 ＤＮＡ等を混合させる注入液として、Ｋ+ ＝
２０〜１０００ｍＭ、Ｎａ+ ＝１〜１５０ｍＭ、Ｋ+ ／
Ｎａ+ ＝５〜１００（モル比）でＫ+ イオン及びＮａ+
イオンを含有する水溶液を用いる。
卵への微量注入法。 【構成】 ＤＮＡ等を混合させる注入液として、Ｋ+ ＝
２０〜１０００ｍＭ、Ｎａ+ ＝１〜１５０ｍＭ、Ｋ+ ／
Ｎａ+ ＝５〜１００（モル比）でＫ+ イオン及びＮａ+
イオンを含有する水溶液を用いる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトランスジェニック動物
を作成するのに有効な動物受精卵への微量注入法に関す
る。
を作成するのに有効な動物受精卵への微量注入法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】細胞への微量注入法は特に最近のトラン
スジェニック動物作成において大変重要となってきてい
る。トランスジェニック動物作成の一つの技術として受
精卵雄性前核に微小針を用いて微量注入を行う方法があ
る。
スジェニック動物作成において大変重要となってきてい
る。トランスジェニック動物作成の一つの技術として受
精卵雄性前核に微小針を用いて微量注入を行う方法があ
る。
【０００３】この微量注入において従来はＰＢＳ溶液
（Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline）が用いら
れている（野村達次監修 勝木元也編 発生工学実験マ
ニュアル―トランスジェニック・マウスの作り方―１９
８７年１１月１日発行、講談社サイエンティフィッ
ク）。このＰＢＳ液組成は通常、以下のような組成であ
る：塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、塩化カリウム２００mg／
Ｌ、リン酸―水素ナトリウム（無水）１．１５ｇ／Ｌ、
リン酸二水素カリウム（無水）２００mg／Ｌ。
（Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline）が用いら
れている（野村達次監修 勝木元也編 発生工学実験マ
ニュアル―トランスジェニック・マウスの作り方―１９
８７年１１月１日発行、講談社サイエンティフィッ
ク）。このＰＢＳ液組成は通常、以下のような組成であ
る：塩化ナトリウム８ｇ／Ｌ、塩化カリウム２００mg／
Ｌ、リン酸―水素ナトリウム（無水）１．１５ｇ／Ｌ、
リン酸二水素カリウム（無水）２００mg／Ｌ。
【０００４】しかしながら、ＰＢＳ液を基本構成とする
注入液を用いてマウス受精卵に対し微量注入を行ったと
ころ、注入後の細胞活性に著しい影響がみられた。
注入液を用いてマウス受精卵に対し微量注入を行ったと
ころ、注入後の細胞活性に著しい影響がみられた。
【０００５】通常微量注入を実施した受精卵は偽妊娠さ
せた雌性仮親マウス卵管内に戻して発生させる。この過
程の初期を模倣するものとして受精卵の体外培養を行っ
た。この体外培養において受精卵の分裂が順調に進行す
れば受精卵の状態は一応良好なものと判断され、一方こ
の分裂が順調に進行しない場合は受精卵に問題があると
判断される。前記の微量注入後にみられる細胞活性に対
する著しい影響とは、この体外培養において細胞分裂の
進行が順調ではなかったことを意味している。
せた雌性仮親マウス卵管内に戻して発生させる。この過
程の初期を模倣するものとして受精卵の体外培養を行っ
た。この体外培養において受精卵の分裂が順調に進行す
れば受精卵の状態は一応良好なものと判断され、一方こ
の分裂が順調に進行しない場合は受精卵に問題があると
判断される。前記の微量注入後にみられる細胞活性に対
する著しい影響とは、この体外培養において細胞分裂の
進行が順調ではなかったことを意味している。
【０００６】我々はこの“著しい影響”について検討を
行い、微量注入に伴う上記問題を大幅に減少させる方法
を見出し、本発明を完成するに至った。
行い、微量注入に伴う上記問題を大幅に減少させる方法
を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】はじめに本発明を完成するに至った背景に
ついて述べる。カリウムイオン（Ｋ + ）とナトリウムイ
オン（Ｎａ+ ）の化学的性質は相当類似している。しか
し生物の体内ではＫ+ やＮａ+ の濃度は重要な生理的意
義をもっており、高等動物では体液及び細胞内のＮａ+
及びＫ+ 濃度は厳密に制御され、正常な生理機能を発揮
するのに不都合のないように調整されている。この調節
された濃度でＮａ+ とＫ+ の濃度は細胞の内外で相当な
差がある。この濃度について、Bruce Alberts他著“Mol
ecular Biology of the Cell (Garland Publishing, In
c., 1983 ）ｐ２８６では典型的な哺乳動物細胞での値
として細胞外ではＮａ+ １４５ｍＭ、Ｋ + ５ｍＭ、細胞
内ではＮａ+ ５〜１５ｍＭ、Ｋ+ １４０ｍＭとしてい
る。絶対値については細胞によって若干差があるとして
も、Ｎａ+ 濃度は細胞外＞細胞内、Ｋ+ は細胞内＞細胞
外であることは多くの動物で共通である（ｐ１２２“Ce
ll Biology”P.L. Altman とD.D. Katz 編、Federation
of American Societies forExperimental Biology
刊、１９８６）。
ついて述べる。カリウムイオン（Ｋ + ）とナトリウムイ
オン（Ｎａ+ ）の化学的性質は相当類似している。しか
し生物の体内ではＫ+ やＮａ+ の濃度は重要な生理的意
義をもっており、高等動物では体液及び細胞内のＮａ+
及びＫ+ 濃度は厳密に制御され、正常な生理機能を発揮
するのに不都合のないように調整されている。この調節
された濃度でＮａ+ とＫ+ の濃度は細胞の内外で相当な
差がある。この濃度について、Bruce Alberts他著“Mol
ecular Biology of the Cell (Garland Publishing, In
c., 1983 ）ｐ２８６では典型的な哺乳動物細胞での値
として細胞外ではＮａ+ １４５ｍＭ、Ｋ + ５ｍＭ、細胞
内ではＮａ+ ５〜１５ｍＭ、Ｋ+ １４０ｍＭとしてい
る。絶対値については細胞によって若干差があるとして
も、Ｎａ+ 濃度は細胞外＞細胞内、Ｋ+ は細胞内＞細胞
外であることは多くの動物で共通である（ｐ１２２“Ce
ll Biology”P.L. Altman とD.D. Katz 編、Federation
of American Societies forExperimental Biology
刊、１９８６）。
【０００８】細胞はエネルギーを消費して、このような
内外のＫ+ 、Ｎａ+ の化学ポテンシャルを維持しつづけ
ている。
内外のＫ+ 、Ｎａ+ の化学ポテンシャルを維持しつづけ
ている。
【０００９】しかるに先程あげた通常の受精卵微量注入
に利用される液の基本組成は細胞外体液組成を基礎とし
ており、前に記載したＰＢＳの例でもわかるようにＮａ
+ ＞＞Ｋ+ の組成をもっている。このような組成の液を
細胞内に直接注入すれば当然細胞内のＫ+ 、Ｎａ+ 濃度
に対して大きな変化を惹起し、而して細胞の生理機能に
も重大な影響を及ぼすものと思われる。このような原因
により前述のような微量注入による著しい細胞活性への
影響につながるものと推定される。
に利用される液の基本組成は細胞外体液組成を基礎とし
ており、前に記載したＰＢＳの例でもわかるようにＮａ
+ ＞＞Ｋ+ の組成をもっている。このような組成の液を
細胞内に直接注入すれば当然細胞内のＫ+ 、Ｎａ+ 濃度
に対して大きな変化を惹起し、而して細胞の生理機能に
も重大な影響を及ぼすものと思われる。このような原因
により前述のような微量注入による著しい細胞活性への
影響につながるものと推定される。
【００１０】我々はこの問題を解決すべく鋭意検討を行
った結果、注入液基本成分をＮａ+＜＜Ｋ+ の組成とす
る緩衝液にすることにより、驚くべきことに前述のよう
な“著しい影響”を回避できることを見出した。
った結果、注入液基本成分をＮａ+＜＜Ｋ+ の組成とす
る緩衝液にすることにより、驚くべきことに前述のよう
な“著しい影響”を回避できることを見出した。
【００１１】
【課題を解決するための手段】しかして本発明は、 １）Ｋ+ イオン１０〜１０００ｍＭ、Ｎａ+ イオン１〜
１５０ｍＭを含み、且つＫ+ イオン／Ｎａ+ イオンモル
比が５〜１００の範囲にある注入液に注入物質を溶解し
た注入溶液を微小中空針の中に含ませ、当該微小中空針
で動物受精卵を刺孔し、上記注入溶液を当該受精卵に注
入することを特徴とする動物受精卵への微量注入法、 ２）当該注入物質が蛋白、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡであ
る項１記載の動物受精卵への微量注入法、 ３）当該微小中空針が内径０．１〜５μｍ及び外径１〜
１０μｍの先端を有する微小ガラス中空針である項１又
は２記載の動物受精卵への微量注入法、 ４）当該動物受精卵がマウス又はラットの受精卵であ
る、項１〜３記載のいずれかの動物受精卵への微量注入
法、 ５）当該動物受精卵が卵割球である、項１〜３記載のい
ずれかの動物受精卵への微量注入法、 ６）当該動物受精卵が、Ｎａ+ イオン２０〜１０００ｍ
Ｍ、Ｋ+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、且つＮａ+ イオ
ン／Ｋ+ イオンモル比が５〜１００の範囲にある培養液
中に存在する、項１〜５記載のいずれかの動物受精卵へ
の微量注入法、 ７）当該注入液がＫ+ イオン及びＮａ+ イオン以外の成
分に関し、基本的にイーグル基礎培地、ダルベッコ改変
イーグル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシャー培地、イス
コーブ改変ダルベッコ培地、１９９培地、ＲＰＭＩ １
６４０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液（ＰＢＳ）、ウィッ
テン培地及びアール平衡塩溶液から選ばれた培地の組成
と同一である、項１〜６記載のいずれかの動物受精卵へ
の微量注入法、 ８）当該注入液が塩化ナトリウム１５８mg／Ｌ、塩化カ
リウム１０．２ｇ／Ｌ、燐酸二水素カリウム（無水）
０．２ｇ／Ｌ、燐酸水素二ナトリウム（無水）１．１５
ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム（６水塩）８１３mg／Ｌを含
有する、項１〜７記載のいずれかの動物受精卵への微量
注入法、及び ９）当該培養液が、Ｍ―１６培地、イーグル基礎培地、
ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシ
ャー培地、イスコーブ改変ダルベッコ培地、１９９培
地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液
（ＰＢＳ）、ウィッテン培地及びアール平衡塩溶液から
選ばれた培地、特にダルベッコ燐酸緩衝液又はＭ―１６
培地である、項６〜８記載のいずれかの動物受精卵への
微量注入法である。
１５０ｍＭを含み、且つＫ+ イオン／Ｎａ+ イオンモル
比が５〜１００の範囲にある注入液に注入物質を溶解し
た注入溶液を微小中空針の中に含ませ、当該微小中空針
で動物受精卵を刺孔し、上記注入溶液を当該受精卵に注
入することを特徴とする動物受精卵への微量注入法、 ２）当該注入物質が蛋白、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡであ
る項１記載の動物受精卵への微量注入法、 ３）当該微小中空針が内径０．１〜５μｍ及び外径１〜
１０μｍの先端を有する微小ガラス中空針である項１又
は２記載の動物受精卵への微量注入法、 ４）当該動物受精卵がマウス又はラットの受精卵であ
る、項１〜３記載のいずれかの動物受精卵への微量注入
法、 ５）当該動物受精卵が卵割球である、項１〜３記載のい
ずれかの動物受精卵への微量注入法、 ６）当該動物受精卵が、Ｎａ+ イオン２０〜１０００ｍ
Ｍ、Ｋ+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、且つＮａ+ イオ
ン／Ｋ+ イオンモル比が５〜１００の範囲にある培養液
中に存在する、項１〜５記載のいずれかの動物受精卵へ
の微量注入法、 ７）当該注入液がＫ+ イオン及びＮａ+ イオン以外の成
分に関し、基本的にイーグル基礎培地、ダルベッコ改変
イーグル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシャー培地、イス
コーブ改変ダルベッコ培地、１９９培地、ＲＰＭＩ １
６４０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液（ＰＢＳ）、ウィッ
テン培地及びアール平衡塩溶液から選ばれた培地の組成
と同一である、項１〜６記載のいずれかの動物受精卵へ
の微量注入法、 ８）当該注入液が塩化ナトリウム１５８mg／Ｌ、塩化カ
リウム１０．２ｇ／Ｌ、燐酸二水素カリウム（無水）
０．２ｇ／Ｌ、燐酸水素二ナトリウム（無水）１．１５
ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム（６水塩）８１３mg／Ｌを含
有する、項１〜７記載のいずれかの動物受精卵への微量
注入法、及び ９）当該培養液が、Ｍ―１６培地、イーグル基礎培地、
ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシ
ャー培地、イスコーブ改変ダルベッコ培地、１９９培
地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液
（ＰＢＳ）、ウィッテン培地及びアール平衡塩溶液から
選ばれた培地、特にダルベッコ燐酸緩衝液又はＭ―１６
培地である、項６〜８記載のいずれかの動物受精卵への
微量注入法である。
【００１２】本発明の注入液はＫ+ イオン２０〜１００
０ｍＭ、Ｎａ+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、Ｋ+ イオ
ン／Ｎａ+ イオンモル比が５〜１００の範囲にある水溶
液であるが、好ましくはＫ+ イオン５０〜３００ｍＭ、
Ｎａ+ イオン３〜１００ｍＭを含み、Ｋ+ イオン／Ｎａ
+ イオンモル比が７〜３２の範囲のものであり、特に好
ましくはＫ+ イオン１００〜１６０ｍＭ、Ｎａ+ イオン
５〜５０ｍＭを含み、Ｋ+ イオン／Ｎａ+ イオンモル比
が１０〜１６の範囲のものである。
０ｍＭ、Ｎａ+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、Ｋ+ イオ
ン／Ｎａ+ イオンモル比が５〜１００の範囲にある水溶
液であるが、好ましくはＫ+ イオン５０〜３００ｍＭ、
Ｎａ+ イオン３〜１００ｍＭを含み、Ｋ+ イオン／Ｎａ
+ イオンモル比が７〜３２の範囲のものであり、特に好
ましくはＫ+ イオン１００〜１６０ｍＭ、Ｎａ+ イオン
５〜５０ｍＭを含み、Ｋ+ イオン／Ｎａ+ イオンモル比
が１０〜１６の範囲のものである。
【００１３】上記注入液はＫ+ イオン及びＮａ+ イオン
以外の成分を含有することができ、かかる成分としては
Ｍ―１６培地、イーグル基礎培地、ダルベッコ改変イー
グル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシャー培地、イスコー
ブ改変ダルベッコ培地、１９９培地、ＲＰＭＩ １６４
０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液（ＰＢＳ）及びアール平
衡塩溶液から選ばれた培地の成分及び濃度を用いること
ができる。これらの中でもＭ―１６培地の成分及び濃度
が好ましい。
以外の成分を含有することができ、かかる成分としては
Ｍ―１６培地、イーグル基礎培地、ダルベッコ改変イー
グル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシャー培地、イスコー
ブ改変ダルベッコ培地、１９９培地、ＲＰＭＩ １６４
０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液（ＰＢＳ）及びアール平
衡塩溶液から選ばれた培地の成分及び濃度を用いること
ができる。これらの中でもＭ―１６培地の成分及び濃度
が好ましい。
【００１４】しかして本発明で用いる注入液は、前記培
地を作成する手順においてＫ+ イオン濃度及びＮａ+ イ
オン濃度を本発明の範囲に入るように調整するだけでも
簡単に製造することができる。
地を作成する手順においてＫ+ イオン濃度及びＮａ+ イ
オン濃度を本発明の範囲に入るように調整するだけでも
簡単に製造することができる。
【００１５】本発明の注入物質は、蛋白、ＤＮＡ及び／
又はＲＮＡであるが、これらを注入液に混合して注入溶
液を形成する。そして注入溶液を注入後これらは動物受
精卵内で生理的機能を発現することとなる。
又はＲＮＡであるが、これらを注入液に混合して注入溶
液を形成する。そして注入溶液を注入後これらは動物受
精卵内で生理的機能を発現することとなる。
【００１６】蛋白を注入物質として用いる例としては、
細胞質内に注入して胚発生の初期の状態をコントロール
したり、核に注入して、同時に注入されたＤＮＡの染色
体への組み込みの効率を上げたりすることが挙げられ
る。
細胞質内に注入して胚発生の初期の状態をコントロール
したり、核に注入して、同時に注入されたＤＮＡの染色
体への組み込みの効率を上げたりすることが挙げられ
る。
【００１７】ＤＮＡを注入物質として用いる例として
は、当該技術分野で多数知られており、遺伝子が発現す
ることを目的とするものや、遺伝子の発現を抑制するも
のが挙げられる。
は、当該技術分野で多数知られており、遺伝子が発現す
ることを目的とするものや、遺伝子の発現を抑制するも
のが挙げられる。
【００１８】ＲＮＡを注入物質として用いる例として
は、主としてアンチセンスＲＮＡを注入することが挙げ
られる。
は、主としてアンチセンスＲＮＡを注入することが挙げ
られる。
【００１９】かかる注入物質の注入溶液中の濃度は特に
限定されないが、一般に０．１〜１００μｇ／ｍＬ、好
ましくは１〜１０μｇ／ｍＬである。
限定されないが、一般に０．１〜１００μｇ／ｍＬ、好
ましくは１〜１０μｇ／ｍＬである。
【００２０】注入溶液を注入する微小中空針は当該技術
分野では周知である。これらは一般的にその先端部分が
内径０．１〜５μｍ、外径１〜１０μｍの寸法を有して
おり、ガラス製のものが多い。
分野では周知である。これらは一般的にその先端部分が
内径０．１〜５μｍ、外径１〜１０μｍの寸法を有して
おり、ガラス製のものが多い。
【００２１】この微小中空針に前記注入溶液を含ませ、
上記先端で動物受精卵を刺して孔をあけ、そこから該針
中の注入溶液を卵中に送り込む。かかる実験操作の詳細
は前出「発生工学実験マニュアル―トランスジェニック
マウスの作り方」を参照することができる。
上記先端で動物受精卵を刺して孔をあけ、そこから該針
中の注入溶液を卵中に送り込む。かかる実験操作の詳細
は前出「発生工学実験マニュアル―トランスジェニック
マウスの作り方」を参照することができる。
【００２２】本発明の動物受精卵は、受精されて未だ分
割されていない卵であることが好ましいが、受精後卵割
がおこったものをバラバラにした卵割球であってもよ
い。この場合８細胞期ぐらいまでの早い段階のものを用
いるのが好ましい。
割されていない卵であることが好ましいが、受精後卵割
がおこったものをバラバラにした卵割球であってもよ
い。この場合８細胞期ぐらいまでの早い段階のものを用
いるのが好ましい。
【００２３】このような動物としては、マウスやラット
の如き小動物或いはヤギ、ウシ、ブタ、ウマなどの大動
物が考えられる。
の如き小動物或いはヤギ、ウシ、ブタ、ウマなどの大動
物が考えられる。
【００２４】本発明の注入を行う際には、動物受精卵は
培養液中に保持されている。かかる動物受精卵を保持す
る培養液は、Ｎａ+ イオンとＫ+ イオンはＮａ+ の方が
濃度が高い。即ちＮａ+ イオン２０〜１０００ｍＭ、Ｋ
+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、Ｎａ+ イオン／Ｋ+ イ
オンモル比が５〜１００の範囲のものである。かかる培
養液としては前記注入液を作成する説明で例示した公知
の培地を用いることができる。
培養液中に保持されている。かかる動物受精卵を保持す
る培養液は、Ｎａ+ イオンとＫ+ イオンはＮａ+ の方が
濃度が高い。即ちＮａ+ イオン２０〜１０００ｍＭ、Ｋ
+ イオン１〜１５０ｍＭを含み、Ｎａ+ イオン／Ｋ+ イ
オンモル比が５〜１００の範囲のものである。かかる培
養液としては前記注入液を作成する説明で例示した公知
の培地を用いることができる。
【００２５】
【発明の効果】トランスジェニック動物を得るには作成
の各素段階の成功確率の積により全体の成功確率が決ま
るため、各素段階の成功確率を上げることはトランスジ
ェニック動物を作成する上において極めて重要なことで
ある。本発明はその素段階の一つであり、この段階での
成功確率は直接全体としてのトランスジェニック動物作
成の成功確率に反映される重要なものである。本発明は
微量注入の段階の成功確率（活性な受精卵の得られる確
率）を画期的に上昇させるものであり、トランスジェニ
ック動物作成全体の成否に大きな影響を及ぼすものであ
る。
の各素段階の成功確率の積により全体の成功確率が決ま
るため、各素段階の成功確率を上げることはトランスジ
ェニック動物を作成する上において極めて重要なことで
ある。本発明はその素段階の一つであり、この段階での
成功確率は直接全体としてのトランスジェニック動物作
成の成功確率に反映される重要なものである。本発明は
微量注入の段階の成功確率（活性な受精卵の得られる確
率）を画期的に上昇させるものであり、トランスジェニ
ック動物作成全体の成否に大きな影響を及ぼすものであ
る。
【００２６】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく
説明する。
説明する。
【００２７】
１．受精卵の取得 雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃ（５週令、日本エスエル
シー（株）より購入）と雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃ
（１１週令、同）を同一ケージ内におくことにより交尾
せしめ、交尾を確認の後、野村達次監修 勝本元也編
「発生工学実験マニュアル―トランスジェニック・マウ
スの作り方（１９８７年１１月１日発行、講談社サイエ
ンシティフィック）」記載の方法により受精卵を取得し
た。取得した受精卵はウィッテン（Whitten ）培地中に
おき、３７℃、５％ＣＯ2 水蒸気飽和雰囲気下で孵置し
た。
シー（株）より購入）と雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＣｒＳｌｃ
（１１週令、同）を同一ケージ内におくことにより交尾
せしめ、交尾を確認の後、野村達次監修 勝本元也編
「発生工学実験マニュアル―トランスジェニック・マウ
スの作り方（１９８７年１１月１日発行、講談社サイエ
ンシティフィック）」記載の方法により受精卵を取得し
た。取得した受精卵はウィッテン（Whitten ）培地中に
おき、３７℃、５％ＣＯ2 水蒸気飽和雰囲気下で孵置し
た。
【００２８】２．微量注入 微量注入は（株）ナリシゲ製ＧＤ１ガラス管を（株）ナ
リシゲ製ＰＢ―７により延伸することにより微量注入用
の針を作製した。微量注入は（株）ナリシゲ製マイクロ
マニピュレーターＭＯ１０２微量注入装置を用い、ニコ
ン（株）製倒立顕微鏡ＴＭＤ下で操作することにより実
施した。Ｋ+ ＞＞Ｎａ+ 緩衝液としては塩化ナトリウム
２．７ｍＭ／Ｌ、リン酸―水素ナトリウム８．１ｍＭ／
Ｌ、塩化カリウム１３７ｍＭ／Ｌ、リン酸二水素カリウ
ム１．５ｍＭ／Ｌ、塩化マグネシウム４．０ｍＭ／Ｌの
組成とした。
リシゲ製ＰＢ―７により延伸することにより微量注入用
の針を作製した。微量注入は（株）ナリシゲ製マイクロ
マニピュレーターＭＯ１０２微量注入装置を用い、ニコ
ン（株）製倒立顕微鏡ＴＭＤ下で操作することにより実
施した。Ｋ+ ＞＞Ｎａ+ 緩衝液としては塩化ナトリウム
２．７ｍＭ／Ｌ、リン酸―水素ナトリウム８．１ｍＭ／
Ｌ、塩化カリウム１３７ｍＭ／Ｌ、リン酸二水素カリウ
ム１．５ｍＭ／Ｌ、塩化マグネシウム４．０ｍＭ／Ｌの
組成とした。
【００２９】また従来法の対照としてはダルベッコ燐酸
緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。
緩衝液（ＰＢＳ）を用いた。
【００３０】３．微量注入後の培養 微量注入操作後の受精卵はウィッテン（Whitten ）培地
中におき、５％ＣＯ2飽和水蒸気雰囲気下で３７℃２４
時間孵置した。しかる後前記の倒立顕微鏡で検鏡を行い
正常に分裂している卵の割合を計数した。
中におき、５％ＣＯ2飽和水蒸気雰囲気下で３７℃２４
時間孵置した。しかる後前記の倒立顕微鏡で検鏡を行い
正常に分裂している卵の割合を計数した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
Claims (9)
- 【請求項１】 Ｋ+ イオン１０〜１０００ｍＭ、Ｎａ+
イオン１〜１５０ｍＭを含み、且つＫ+ イオン／Ｎａ+
イオンモル比が５〜１００の範囲にある注入液に注入物
質を溶解した注入溶液を微小中空針の中に含ませ、当該
微小中空針で動物受精卵を刺孔し、上記注入溶液を当該
受精卵に注入することを特徴とする動物受精卵への微量
注入法。 - 【請求項２】 当該注入物質が蛋白、ＤＮＡ及び／又は
ＲＮＡである請求項１記載の動物受精卵への微量注入
法。 - 【請求項３】 当該微小中空針が内径０．１〜５μｍ及
び外径１〜１０μｍの先端を有する微小ガラス中空針で
ある請求項１又は２記載の動物受精卵への微量注入法。 - 【請求項４】 当該動物受精卵がマウス又はラットの受
精卵である、請求項１〜３記載のいずれかの動物受精卵
への微量注入法。 - 【請求項５】 当該動物受精卵が卵割球である、請求項
１〜３記載のいずれかの動物受精卵への微量注入法。 - 【請求項６】 当該動物受精卵が、Ｎａ+ イオン２０〜
１０００ｍＭ、Ｋ+イオン１〜１５０ｍＭを含み、且つ
Ｎａ+ イオン／Ｋ+ イオンモル比が５〜１００の範囲に
ある培養液中に存在する、請求項１〜５記載のいずれか
の動物受精卵への微量注入法。 - 【請求項７】 当該注入液がＫ+ イオン及びＮａ+ イオ
ン以外の成分に関し、基本的にイーグル基礎培地、ダル
ベッコ改変イーグル培地（Ｄ―ＭＥＭ）、フィッシャー
培地、イスコーブ改変ダルベッコ培地、１９９培地、Ｒ
ＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）、ウィッテン培地及びアール平衡塩溶液から選ばれ
た培地の組成と同一である、請求項１〜６記載のいずれ
かの動物受精卵への微量注入法。 - 【請求項８】 当該注入液が塩化ナトリウム１５８mg／
Ｌ、塩化カリウム１０．２ｇ／Ｌ、燐酸二水素カリウム
（無水）０．２ｇ／Ｌ、燐酸水素二ナトリウム（無水）
１．１５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム（６水塩）８１３mg
／Ｌを含有する、請求項１〜７記載のいずれかの動物受
精卵への微量注入法。 - 【請求項９】 当該培養液が、Ｍ―１６培地、イーグル
基礎培地、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ―ＭＥ
Ｍ）、フィッシャー培地、イスコーブ改変ダルベッコ培
地、１９９培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ダルベッコ
燐酸緩衝液（ＰＢＳ）、ウィッテン培地及びアール平衡
塩溶液から選ばれた培地、特にダルベッコ燐酸緩衝液又
はＭ―１６培地である、請求項６〜８記載のいずれかの
動物受精卵への微量注入法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5029064A JPH06237770A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | 動物受精卵への微量注入法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5029064A JPH06237770A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | 動物受精卵への微量注入法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237770A true JPH06237770A (ja) | 1994-08-30 |
Family
ID=12265942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5029064A Pending JPH06237770A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | 動物受精卵への微量注入法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06237770A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5539925Y2 (ja) * | 1976-12-02 | 1980-09-18 | ||
| JPS637707A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-13 | 澁澤 栄 | 深耕用アップカットロ−タリ耕耘方法および装置 |
-
1993
- 1993-02-18 JP JP5029064A patent/JPH06237770A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5539925Y2 (ja) * | 1976-12-02 | 1980-09-18 | ||
| JPS637707A (ja) * | 1986-06-30 | 1988-01-13 | 澁澤 栄 | 深耕用アップカットロ−タリ耕耘方法および装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rosen et al. | Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function | |
| Yang et al. | Specific double-stranded RNA interference in undifferentiated mouse embryonic stem cells | |
| Harrison et al. | Senescence and the fidelity of protein synthesis in Drosophila | |
| US6563017B2 (en) | In vivo electroporation method for early stage embryo of chickens | |
| Clark et al. | Effect of cortisone and other steroids upon in vitro synthesis of chondroitin sulfate | |
| CN103710299A (zh) | 用于培养猪孤雌激活胚及体外受精胚胎的体外培养液 | |
| Barnett et al. | The distribution of ascorbic acid (vitamin C) in the early stages of the developing chick embryo | |
| Prochazkova et al. | CPEB2 is necessary for proper porcine meiotic maturation and embryonic development | |
| CN114214364A (zh) | 一种刺参基因编辑体系的构建方法 | |
| Osborne et al. | Protein synthesis in the fat body of the female desert locust, Schistocerca gregaria Forsk., in relation to maturation | |
| Kijima et al. | CatSper mediates not only chemotactic behavior but also the motility of ascidian sperm | |
| DE102020126733A1 (de) | Lösung zur Verlängerung der Öffnungszeit der Befruchtungsöffnung von Fischeiern und Verfahren zum Einführen exogener Gene durch die Befruchtungsöffnung | |
| CN105255889A (zh) | RNAi干扰片段、干扰载体、制备方法及其应用 | |
| Hechter et al. | Relationship between sugar concentration and glycogenetic action of insulin on rat diaphragm in vitro | |
| CN109897867B (zh) | 基因改造方法 | |
| Loomis | p CO2 Inhibition of Normal and Malignant Growth | |
| CN104152404A (zh) | 提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法 | |
| TW201917132A (zh) | 醫藥組合物、化合物的用途及合成方法 | |
| Miyoshi | Development of a culture medium for rat 1-cell embryos | |
| Sturgill et al. | A simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes | |
| Gillette et al. | Alteration in fibroblasts treated with steroids in a perfusion chamber. | |
| Neyfakh et al. | Ornithine decarboxylase activity in embryos depends on temperature of development rather than on the stage of development. Molecular adaptation to temperature changes in poikilothermic animals | |
| CN111297852B (zh) | 一种促进三疣梭子蟹雌蟹卵黄积累与卵巢发育的方法 | |
| McKean et al. | Cardiac effects of hypoxia in the neotenous tiger salamander Ambystoma tigrinum | |
| Brinster | Activity of 6-phosphogluconate dehydrogenase in the preimplantation mouse and rabbit embryo |