JPH06237774A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
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- JPH06237774A JPH06237774A JP5067261A JP6726193A JPH06237774A JP H06237774 A JPH06237774 A JP H06237774A JP 5067261 A JP5067261 A JP 5067261A JP 6726193 A JP6726193 A JP 6726193A JP H06237774 A JPH06237774 A JP H06237774A
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- JP
- Japan
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- plasmid
- pste33
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- pstk3
- pstk1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 好熱性バチルス属細菌を宿主として、６０℃
以上の温度で宿主を培養しても宿主から脱落することな
く、安定に宿主中で自律増殖し得るプラスミドを提供す
る。 【構成】 バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
ＴＫ１０５からプラスミドｐＳＴＫ１を得る。直鎖化し
たプラスミドｐＳＴＫ１を含むプラスミドｐＳＴＥ３３
およびｐＳＴＫ３を合成する。
以上の温度で宿主を培養しても宿主から脱落することな
く、安定に宿主中で自律増殖し得るプラスミドを提供す
る。 【構成】 バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）
ＴＫ１０５からプラスミドｐＳＴＫ１を得る。直鎖化し
たプラスミドｐＳＴＫ１を含むプラスミドｐＳＴＥ３３
およびｐＳＴＫ３を合成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は好熱性細菌プラスミドに
関し、高温で生育するグラム陽性好熱性細菌内で安定に
複製させることの可能なプラスミドに関する。
関し、高温で生育するグラム陽性好熱性細菌内で安定に
複製させることの可能なプラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】これまでに、好熱性細菌、特に好熱性バ
チルス属の細菌内で複製可能なプラスミドとして、ｐＵ
Ｂ１１０、ｐＩＨ４１など幾つか報告されている。これ
らのプラスミドは抗生物質添加などによる選択圧をかけ
ずに６０℃以上で培養すると、宿主から高頻度で脱落し
てしまう（例えば、遺伝子工学、１３４〜１６７頁、共
立出版株式会社１９８７年）。
チルス属の細菌内で複製可能なプラスミドとして、ｐＵ
Ｂ１１０、ｐＩＨ４１など幾つか報告されている。これ
らのプラスミドは抗生物質添加などによる選択圧をかけ
ずに６０℃以上で培養すると、宿主から高頻度で脱落し
てしまう（例えば、遺伝子工学、１３４〜１６７頁、共
立出版株式会社１９８７年）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】これらのプラスミドに
はカナマイシン等の抗生物質に対する耐性因子がコード
されているため、対応する抗生物質を培養液に添加して
プラスミド保持菌を培養することにより、プラスミドが
脱落してしまった宿主を選択的に殺し、プラスミドを保
持している宿主のみを生育させることにより、上記のよ
うなプラスミドの脱落を見かけ上防止することは可能で
あるが、抗生物質自体の費用に加え、培養後の培養液に
残留した抗生物質の処理に多大な費用がかかるため、プ
ラスミド保持菌の大量培養には多大の費用を要する。
はカナマイシン等の抗生物質に対する耐性因子がコード
されているため、対応する抗生物質を培養液に添加して
プラスミド保持菌を培養することにより、プラスミドが
脱落してしまった宿主を選択的に殺し、プラスミドを保
持している宿主のみを生育させることにより、上記のよ
うなプラスミドの脱落を見かけ上防止することは可能で
あるが、抗生物質自体の費用に加え、培養後の培養液に
残留した抗生物質の処理に多大な費用がかかるため、プ
ラスミド保持菌の大量培養には多大の費用を要する。
【０００４】本発明の目的は、上記問題点を解消し、宿
主中に安定に保持されるプラスミドを提供することにあ
る。
主中に安定に保持されるプラスミドを提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】第１の発明は、約１８８
２ｂｐであって下記に示す通りの制限酵素切断点を有す
ることを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ１である。
２ｂｐであって下記に示す通りの制限酵素切断点を有す
ることを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ１である。
【０００６】
【化４】
【０００７】第２の発明は、約５６５０ｂｐであって、
下記に示す通りの制限酵素切断点を有することを特徴と
するプラスミドｐＳＴＥ３３である。
下記に示す通りの制限酵素切断点を有することを特徴と
するプラスミドｐＳＴＥ３３である。
【０００８】
【化５】
【０００９】第３の発明は、約３０２０ｂｐであって、
下記に示す通りの制限酵素切断点を有することを特徴と
するプラスミドｐＳＴＫ３である。
下記に示す通りの制限酵素切断点を有することを特徴と
するプラスミドｐＳＴＫ３である。
【００１０】
【化６】
【００１１】
【実施例】次に本発明の実施例について説明する。 １．プラスミドｐＳＴＫ１の取得 土壌から採取した試料を５ｍｌのＭＧ培地（グルコース
０．５％、ニトリル３酢酸０．０２％、リン酸２カリウ
ム０．０５２％、リン酸１カリウム０．０１５％、硫酸
マグネシウム７水和物０．０１５％、塩化カルシウム２
水和物０．０１３％、硝酸ナトリウム０．０５％）に入
れ、７０℃で１晩培養する。この培養液１００μｌをＭ
Ｇ寒天培地（ＭＧ培地に２．０％寒天を加える）上に拡
げ１日培養する。生じたコロニーより釣菌し、その細菌
を純粋分離した後、５ｍｌ Ｌ培地（トリプトン１％、
酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．２に
調整）中で７０℃で１晩振盪培養し、アルカリーＳＤＳ
法でＤＮＡを抽出する。抽出液をエタノール沈殿し、遠
心による回収後、アガロース電気泳動にかけ、プラスミ
ドの有無を確認する。このような操作を多数の分離株に
ついて行ない、プラスミド保有株を選択した。バチルス
・ステアアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＫＯ１５株に見
いだされた３種のプラスミドのうち最も分子量が小さい
ものをｐＳＴＫ１と命名した。これを図１に示す。
０．５％、ニトリル３酢酸０．０２％、リン酸２カリウ
ム０．０５２％、リン酸１カリウム０．０１５％、硫酸
マグネシウム７水和物０．０１５％、塩化カルシウム２
水和物０．０１３％、硝酸ナトリウム０．０５％）に入
れ、７０℃で１晩培養する。この培養液１００μｌをＭ
Ｇ寒天培地（ＭＧ培地に２．０％寒天を加える）上に拡
げ１日培養する。生じたコロニーより釣菌し、その細菌
を純粋分離した後、５ｍｌ Ｌ培地（トリプトン１％、
酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．２に
調整）中で７０℃で１晩振盪培養し、アルカリーＳＤＳ
法でＤＮＡを抽出する。抽出液をエタノール沈殿し、遠
心による回収後、アガロース電気泳動にかけ、プラスミ
ドの有無を確認する。このような操作を多数の分離株に
ついて行ない、プラスミド保有株を選択した。バチルス
・ステアアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＫＯ１５株に見
いだされた３種のプラスミドのうち最も分子量が小さい
ものをｐＳＴＫ１と命名した。これを図１に示す。
【００１２】なお、プラスミドｐＳＴＫ１を保有するバ
チルス・ステアロサーモフィルスＴＫＯ１５株はＦＥＲ
Ｍ−１３５２６として寄託されている。 ２．プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の合成 プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の合成経路を図２
を参照して説明する。 （１）プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで完全
消化した後、フェノール抽出によりこれを精製した。こ
れにアルカリ性フォスファターゼを作用させ、５’末端
のリン酸基を除去した。これに制限酵素ＮｒｕＩで切断
して直鎖化したプラスミドｐＳＴＫ１を加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより両者を連結、環状化した。
チルス・ステアロサーモフィルスＴＫＯ１５株はＦＥＲ
Ｍ−１３５２６として寄託されている。 ２．プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の合成 プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の合成経路を図２
を参照して説明する。 （１）プラスミドｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで完全
消化した後、フェノール抽出によりこれを精製した。こ
れにアルカリ性フォスファターゼを作用させ、５’末端
のリン酸基を除去した。これに制限酵素ＮｒｕＩで切断
して直鎖化したプラスミドｐＳＴＫ１を加え、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより両者を連結、環状化した。
【００１３】この反応物を用い大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。形質転
換体からプラスミドを抽出し、制限酵素による切断パタ
ーンからｐＳＴＫ１断片の挿入向きが異なる２通りのプ
ラスミド（大きさ約４．６ｋｂｐ）ｐＳＴＥ３１とｐＳ
ＴＥ３２が得られたことを確認した。 （２）プラスミドｐＫＭ１４（自治医科大学看護短期大
学木原裕研究所所有）を制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、カナマイシン耐性遺伝子
を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片の
両端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、プラ
スミドｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入・
連結した。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。形質転換体か
らプラスミドを抽出し、制限酵素による切断パターンか
らカナマイシン耐性遺伝子をふくむＤＮＡ断片の挿入向
きが異なる２通りのプラスミド（大きさ約３．８ｋｂ
ｐ）ｐＫＭ１４１とｐＫＭ１４２が得られたことを確認
した。 （３）プラスミドｐＫＭ１４１を制限酵素ＸｂａＩと制
限酵素ＰｓｔＩで完全消化して、カナマイシン耐性遺伝
子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を調整した。この
断片を、ｐＳＴＥ３１をＸｂａＩとＰｓｔＩで完全消化
して得た約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合した。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。
形質転換体からプラスミドを抽出し、約５６５０ｂｐの
大きさのｐＳＴＥ３３を得た。
質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。形質転
換体からプラスミドを抽出し、制限酵素による切断パタ
ーンからｐＳＴＫ１断片の挿入向きが異なる２通りのプ
ラスミド（大きさ約４．６ｋｂｐ）ｐＳＴＥ３１とｐＳ
ＴＥ３２が得られたことを確認した。 （２）プラスミドｐＫＭ１４（自治医科大学看護短期大
学木原裕研究所所有）を制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素
ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化し、カナマイシン耐性遺伝子
を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片の
両端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、プラ
スミドｐＵＣ１９の制限酵素ＨｉｎｃＩＩ部位に挿入・
連結した。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換
し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。形質転換体か
らプラスミドを抽出し、制限酵素による切断パターンか
らカナマイシン耐性遺伝子をふくむＤＮＡ断片の挿入向
きが異なる２通りのプラスミド（大きさ約３．８ｋｂ
ｐ）ｐＫＭ１４１とｐＫＭ１４２が得られたことを確認
した。 （３）プラスミドｐＫＭ１４１を制限酵素ＸｂａＩと制
限酵素ＰｓｔＩで完全消化して、カナマイシン耐性遺伝
子を含む約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を調整した。この
断片を、ｐＳＴＥ３１をＸｂａＩとＰｓｔＩで完全消化
して得た約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合した。この反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９
株を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を得た。
形質転換体からプラスミドを抽出し、約５６５０ｂｐの
大きさのｐＳＴＥ３３を得た。
【００１４】なお、ｐＳＴＥ３３を含む大腸菌ＪＭ１０
９株はＦＥＲＭ−１３５２８として寄託されている。
９株はＦＥＲＭ−１３５２８として寄託されている。
【００１５】（４）ｐＳＴＥ３３をＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで完全消化し、約３０２０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。この断片を両端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状化した。この
反応物でバチルス・ステアロサーモフィルスＫ１０４１
株を形質転換した。形質転換は、バイオテクノロジー・
テクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ）誌、第６巻、８３〜８６頁、１９９２年に
示された電気穿孔法により行なった。電気穿孔法処理後
の菌体を１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培
地（Ｌ培地に２．０％の寒天を添加し、固化したもの）
上に広げ４８℃で２４時間培養して、カナマイシン耐性
形質転換体を得た。形質転換体からプラスミドを抽出
し、約３０２０ｂｐのｐＳＴＫ３を得た。
ｄＩＩＩで完全消化し、約３０２０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。この断片を両端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平
滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状化した。この
反応物でバチルス・ステアロサーモフィルスＫ１０４１
株を形質転換した。形質転換は、バイオテクノロジー・
テクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ）誌、第６巻、８３〜８６頁、１９９２年に
示された電気穿孔法により行なった。電気穿孔法処理後
の菌体を１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬ寒天培
地（Ｌ培地に２．０％の寒天を添加し、固化したもの）
上に広げ４８℃で２４時間培養して、カナマイシン耐性
形質転換体を得た。形質転換体からプラスミドを抽出
し、約３０２０ｂｐのｐＳＴＫ３を得た。
【００１６】なお、ｐＳＴＫ３を含むバチルス・ステア
ロサーモフィルスＫ１０４１株はＦＥＲＭ−１３５２７
として寄託されている。 ３．プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の安定性 プラスミドｐＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３を用いて前述
し方法と同様にしてバチルス・ステアロサーモフィルス
Ｋ１０４１株を形質転換した。形質転換体をＬ培地で６
０℃、約２０世代振盪培養後、培養液を適宜希釈してＬ
寒天培地上および１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む
Ｌ寒天培地上に広げ、４８℃で２４時間培養後、両寒天
培地に形成されたコロニー数を比較した。同様な操作を
形質転換体のＬ培地による振盪培養温度を４７、５７、
６７℃に設定して行なった。
ロサーモフィルスＫ１０４１株はＦＥＲＭ−１３５２７
として寄託されている。 ３．プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３の安定性 プラスミドｐＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３を用いて前述
し方法と同様にしてバチルス・ステアロサーモフィルス
Ｋ１０４１株を形質転換した。形質転換体をＬ培地で６
０℃、約２０世代振盪培養後、培養液を適宜希釈してＬ
寒天培地上および１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む
Ｌ寒天培地上に広げ、４８℃で２４時間培養後、両寒天
培地に形成されたコロニー数を比較した。同様な操作を
形質転換体のＬ培地による振盪培養温度を４７、５７、
６７℃に設定して行なった。
【００１７】その結果、Ｌ培地による振盪培養温度によ
らず、いずれの形質転換体も両寒天培地上にほぼ同数の
コロニーを形成した。
らず、いずれの形質転換体も両寒天培地上にほぼ同数の
コロニーを形成した。
【００１８】また、ｐＳＴＥ３３に関して各温度での培
養菌体から全ＤＮＡを抽出し、電気泳動にかけ泳動上で
染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの量の比からプラス
ミドのコピー数を算出したところ、４７〜６７℃ではコ
ピー数の変化はなかった。 ４．薬剤耐性遺伝子の融通性 ｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３上のカナマイシン耐性遺伝子
を利用した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の形質転換
を試みた。ｐＳＴＥ３３に関しては、１０5 ＣＦＵ／μ
ｇ程度で、ｐＳＴＫ３は１０4 ＣＦＵ／μｇ程度の形質
転換効率だった。この結果から、ｐＳＴＥ３３はもちろ
んｐＳＴＫ３も大腸菌−好熱菌間のシャトルベクターと
なることがわかった。
養菌体から全ＤＮＡを抽出し、電気泳動にかけ泳動上で
染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの量の比からプラス
ミドのコピー数を算出したところ、４７〜６７℃ではコ
ピー数の変化はなかった。 ４．薬剤耐性遺伝子の融通性 ｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３上のカナマイシン耐性遺伝子
を利用した大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９の形質転換
を試みた。ｐＳＴＥ３３に関しては、１０5 ＣＦＵ／μ
ｇ程度で、ｐＳＴＫ３は１０4 ＣＦＵ／μｇ程度の形質
転換効率だった。この結果から、ｐＳＴＥ３３はもちろ
んｐＳＴＫ３も大腸菌−好熱菌間のシャトルベクターと
なることがわかった。
【００１９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明のプラスミ
ドｐＳＴＫ１を制限酵素ＮｒｕＩで切断・直鎖化して得
られた断片を含む本発明のプラスミドｐＳＴＥ３３およ
びｐＳＴＫ３は、好熱性バチルスであるパチルス・ステ
アロサーモフィルを形質転換し、形質転換体を７０℃で
約２０世代培養しても、宿主から全く脱落せず、安定に
複製する。したがって、形質転換体を高温で培養する場
合にも、培地中に抗生物質を添加する必要はなく、形質
転換体を利用する種々の工学的応用が容易となった。
ドｐＳＴＫ１を制限酵素ＮｒｕＩで切断・直鎖化して得
られた断片を含む本発明のプラスミドｐＳＴＥ３３およ
びｐＳＴＫ３は、好熱性バチルスであるパチルス・ステ
アロサーモフィルを形質転換し、形質転換体を７０℃で
約２０世代培養しても、宿主から全く脱落せず、安定に
複製する。したがって、形質転換体を高温で培養する場
合にも、培地中に抗生物質を添加する必要はなく、形質
転換体を利用する種々の工学的応用が容易となった。
【００２０】プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３のこ
のような安定性はブラスミドｐＳＴＫ１にコードされて
いるプラスミド複製関与遺伝子の機能によることは明ら
かである。したがって、本発明で開示したブラスミドｐ
ＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３以外にもプラスミドｐＳＴ
Ｋ１の全ＤＮＡ断片もしくは一部のＤＮＡ断片を用い
て、プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３と同様な安定
性をもつプラスミドを合成することができることは容易
に類推することができる。
のような安定性はブラスミドｐＳＴＫ１にコードされて
いるプラスミド複製関与遺伝子の機能によることは明ら
かである。したがって、本発明で開示したブラスミドｐ
ＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３以外にもプラスミドｐＳＴ
Ｋ１の全ＤＮＡ断片もしくは一部のＤＮＡ断片を用い
て、プラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３と同様な安定
性をもつプラスミドを合成することができることは容易
に類推することができる。
【００２１】プラスミドｐＳＴＫ１はバチルス・ステア
ロサーモフィルスを宿主とした場合、マーカーとして利
用できるような形質を宿主に賊与することはないが、プ
ラスミドｐＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３は宿主にカナマ
イシン耐性を賊与する。
ロサーモフィルスを宿主とした場合、マーカーとして利
用できるような形質を宿主に賊与することはないが、プ
ラスミドｐＳＴＥ３３およびｐＳＴＫ３は宿主にカナマ
イシン耐性を賊与する。
【００２２】プラスミドｐＳＴＥ３３はプラスミドｐＵ
Ｃ１９に由来するＤＮＡ断片を含むため、大腸菌を宿主
としても複製ができる。したがって、外来遺伝子のクロ
ーニング、サブクローニングなどを形質転換率が高く、
生物学的性質がよく知られている大腸菌で行なった後、
組換えプラスミドをバチルス・ステアロサーモフィルス
に導入して、種々の工学的応用を検討することが可能に
なった。
Ｃ１９に由来するＤＮＡ断片を含むため、大腸菌を宿主
としても複製ができる。したがって、外来遺伝子のクロ
ーニング、サブクローニングなどを形質転換率が高く、
生物学的性質がよく知られている大腸菌で行なった後、
組換えプラスミドをバチルス・ステアロサーモフィルス
に導入して、種々の工学的応用を検討することが可能に
なった。
【００２３】プラスミドｐＳＴＫ３はｐＳＴＥ３３から
ｐＵＣ１９領域を除いて短鎖化して得られたプラスミド
であるにも関わらず、大腸菌を宿主とすることが可能で
あり、大きさが約３０２０ｂｐと小型であるため、プラ
スミドｐＳＴＥ３３より大きな外来ＤＮＡ断片をクロー
ニングすることが可能である。
ｐＵＣ１９領域を除いて短鎖化して得られたプラスミド
であるにも関わらず、大腸菌を宿主とすることが可能で
あり、大きさが約３０２０ｂｐと小型であるため、プラ
スミドｐＳＴＥ３３より大きな外来ＤＮＡ断片をクロー
ニングすることが可能である。
【図１】本発明のプラスミドｐＳＴＫ１
【図２】本発明のプラスミドｐＳＴＥ３３、ｐＳＴＫ３
の合成経路の説明図である。
の合成経路の説明図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】
【課題を解決するための手段】第１の発明は、約１８８
０ｂｐであって下記に示す通りの制限酸素切断点を有す
ることを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ１である。
０ｂｐであって下記に示す通りの制限酸素切断点を有す
ることを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ１である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (3)
- 【請求項１】 約１８８０ｂｐであって、下記の制限酵
素切断点を有することを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ
１。 【化１】 - 【請求項２】 約５６５０ｂｐであって、下記の制限酵
素切断点を有することを特徴とするプラスミドｐＳＴＥ
３３。 【化２】 - 【請求項３】 約３０２０ｂｐであって、下記の制限酵
素切断点を有することを特徴とするプラスミドｐＳＴＫ
３。 【化３】
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5067261A JPH0789933B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-03-26 | プラスミド |
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Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34372192 | 1992-12-24 | ||
| JP4-343721 | 1992-12-24 | ||
| JP5067261A JPH0789933B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-03-26 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237774A true JPH06237774A (ja) | 1994-08-30 |
| JPH0789933B2 JPH0789933B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=26408440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5067261A Expired - Lifetime JPH0789933B2 (ja) | 1992-12-24 | 1993-03-26 | プラスミド |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5384258A (ja) |
| JP (1) | JPH0789933B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017169751A1 (ja) * | 2016-03-29 | 2017-10-05 | イムラ・ジャパン株式会社 | 低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0000185D0 (en) * | 2000-01-06 | 2000-03-01 | Agrol Limited | Ethanol production |
-
1993
- 1993-03-26 JP JP5067261A patent/JPH0789933B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-08 US US08/148,988 patent/US5384258A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017169751A1 (ja) * | 2016-03-29 | 2017-10-05 | イムラ・ジャパン株式会社 | 低温菌及び中温菌由来酵素の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5384258A (en) | 1995-01-24 |
| JPH0789933B2 (ja) | 1995-10-04 |
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