JPH06253829A - 除草剤を検出するための生物学的スクリーニング - Google Patents
除草剤を検出するための生物学的スクリーニングInfo
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- JPH06253829A JPH06253829A JP6023612A JP2361294A JPH06253829A JP H06253829 A JPH06253829 A JP H06253829A JP 6023612 A JP6023612 A JP 6023612A JP 2361294 A JP2361294 A JP 2361294A JP H06253829 A JPH06253829 A JP H06253829A
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- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 植物に特異的な、予め決めた酵素または代謝
標的部位または経路を特異的に阻害する化合物をスクリ
ーニングして迅速同定するための新規なプロトコルに関
するものである。 【構成】 この新規なスクリーニングで特異的もしくは
間接的影響を受ける酵素には、グルタミンシンセターゼ
（ＧＳ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネ
ート７−ホスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰ）、ジヒド
ロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）、アセトヒド
ロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）およびホスホリ
ボシルアントラニレートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）
が含まれる。これらの酵素の阻害は、ヒトまたは動物に
ほとんどか或は全く毒性を与えるべきでない。これらの
スクリーニングは、試験化合物が示す除草剤効力を評価
するに有効な迅速方法を提供する。
標的部位または経路を特異的に阻害する化合物をスクリ
ーニングして迅速同定するための新規なプロトコルに関
するものである。 【構成】 この新規なスクリーニングで特異的もしくは
間接的影響を受ける酵素には、グルタミンシンセターゼ
（ＧＳ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネ
ート７−ホスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰ）、ジヒド
ロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）、アセトヒド
ロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）およびホスホリ
ボシルアントラニレートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）
が含まれる。これらの酵素の阻害は、ヒトまたは動物に
ほとんどか或は全く毒性を与えるべきでない。これらの
スクリーニングは、試験化合物が示す除草剤効力を評価
するに有効な迅速方法を提供する。
Description
【０００１】
【発明の背景】近年、除草剤の発見において、栄養的に
必須なアミノ酸のための代謝経路が興味の持たれている
主要焦点になってきている。このような興味は、上記経
路中の酵素を阻害することが見いだされている、高い活
性を示すと共に低い動物毒性を示す、いくつかの種類の
除草剤が発見されたことが原因となっている。これらの
除草剤は、分枝鎖アミノ酸類（イミダゾリドン類、スル
ホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン類による阻
害）、芳香族アミノ酸類（グリホセート（glyphosate）
による阻害）、グルタミン（ビアラホス（bialaphos）
およびホスフィノトリシン（phosphinothricin）による
阻害）またはヒスチジン（アミトロール（amitrole）に
よる阻害）のための経路中の酵素を阻害している。
必須なアミノ酸のための代謝経路が興味の持たれている
主要焦点になってきている。このような興味は、上記経
路中の酵素を阻害することが見いだされている、高い活
性を示すと共に低い動物毒性を示す、いくつかの種類の
除草剤が発見されたことが原因となっている。これらの
除草剤は、分枝鎖アミノ酸類（イミダゾリドン類、スル
ホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン類による阻
害）、芳香族アミノ酸類（グリホセート（glyphosate）
による阻害）、グルタミン（ビアラホス（bialaphos）
およびホスフィノトリシン（phosphinothricin）による
阻害）またはヒスチジン（アミトロール（amitrole）に
よる阻害）のための経路中の酵素を阻害している。
【０００２】伝統的な除草剤発見では、化学サンプルを
全植物の上に噴霧し、そして一定期間、典型的には投与
から２から３週間おいた後、その化学品の効果の評価が
行われている。その後、このようなアプローチで同定さ
れた化合物に関して更に、それの影響を受ける植物のス
ペクトル、毒性および作用部位の特徴付けを行う必要が
ある。このような過程は、多量の試験化合物を必要とす
ると共に、時間を消費し、高価でありそして非効率的で
ある。従って、除草剤の開発では、可能な除草剤をスク
リーニングするための迅速で小規模な方法が有利であ
る。
全植物の上に噴霧し、そして一定期間、典型的には投与
から２から３週間おいた後、その化学品の効果の評価が
行われている。その後、このようなアプローチで同定さ
れた化合物に関して更に、それの影響を受ける植物のス
ペクトル、毒性および作用部位の特徴付けを行う必要が
ある。このような過程は、多量の試験化合物を必要とす
ると共に、時間を消費し、高価でありそして非効率的で
ある。従って、除草剤の開発では、可能な除草剤をスク
リーニングするための迅速で小規模な方法が有利であ
る。
【０００３】
【発明の要約】本発明は、多くの場合植物に特異的な、
予め決めた酵素または代謝標的部位を特異的に阻害する
化合物をスクリーニングして迅速同定するための新規な
プロトコルに関するものである。本発明は更に、ここに
記述するスクリーニング方法で用いるに有効な微生物株
にも関する。この新規なスクリーニングで特異的もしく
は間接的影響を受ける酵素には、グルタミンシンセター
ゼ（ＧＳ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソ
ネート（heptulosonate）７−ホスフェートシンターゼ
（ＤＡＨＰ）、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ
（ＤＨＰＳ）、アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
（ＡＨＡＳ）およびホスホリボシルアントラニレートト
ランスフェラーゼ（ＰＡＴ）が含まれる。理想的には、
この新規なスクリーニングプロトコルの標的となる酵素
経路は、植物、細菌および菌・カビにユニークであり、
そしてこれらは低レベルで存在している。ここに記述す
るスクリーニングはまた、動物の中に存在している酵
素、例えばグルタミンシンセターゼなども標的にし得
る。これらの酵素の形態、或は化合物の輸送、吸収また
は分解において植物と動物との間に有意な差が存在して
いることから、植物酵素の阻害剤が必ずしも動物形態の
酵素に活性を示すとは限らない。従って、これらの酵素
の阻害は、ヒトまたは動物にほとんどか或は全く毒性を
与えるべきでない。これらのスクリーニングは、試験化
合物が示す除草剤効力を評価するに有効な迅速方法を提
供する。この新規なスクリーニングプロトコルで同定さ
れた先頭に立つ化合物は、植物の成長を阻害する除草剤
として用いられ得る。
予め決めた酵素または代謝標的部位を特異的に阻害する
化合物をスクリーニングして迅速同定するための新規な
プロトコルに関するものである。本発明は更に、ここに
記述するスクリーニング方法で用いるに有効な微生物株
にも関する。この新規なスクリーニングで特異的もしく
は間接的影響を受ける酵素には、グルタミンシンセター
ゼ（ＧＳ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソ
ネート（heptulosonate）７−ホスフェートシンターゼ
（ＤＡＨＰ）、ジヒドロ−ジピコリネートシンターゼ
（ＤＨＰＳ）、アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
（ＡＨＡＳ）およびホスホリボシルアントラニレートト
ランスフェラーゼ（ＰＡＴ）が含まれる。理想的には、
この新規なスクリーニングプロトコルの標的となる酵素
経路は、植物、細菌および菌・カビにユニークであり、
そしてこれらは低レベルで存在している。ここに記述す
るスクリーニングはまた、動物の中に存在している酵
素、例えばグルタミンシンセターゼなども標的にし得
る。これらの酵素の形態、或は化合物の輸送、吸収また
は分解において植物と動物との間に有意な差が存在して
いることから、植物酵素の阻害剤が必ずしも動物形態の
酵素に活性を示すとは限らない。従って、これらの酵素
の阻害は、ヒトまたは動物にほとんどか或は全く毒性を
与えるべきでない。これらのスクリーニングは、試験化
合物が示す除草剤効力を評価するに有効な迅速方法を提
供する。この新規なスクリーニングプロトコルで同定さ
れた先頭に立つ化合物は、植物の成長を阻害する除草剤
として用いられ得る。
【０００４】ここに記述する方法では、理想的には必須
植物遺伝子産物の細菌同族体を発現する微生物株を用い
る。この微生物株は、その細菌同族体をコード化する遺
伝子の中に変異を有しており、その結果として、これ
は、その植物遺伝子産物の発現なしか或は栄養補足物の
添加なしには増殖することができない。本発明の１つの
具体例において、この微生物株を下記の２組の条件下に
維持する：その植物遺伝子産物を発現する微生物株の増
殖にとっては適切であるがこの植物遺伝子産物が欠乏し
ている状態の微生物株の増殖には不適切である試験条
件；およびその必須植物遺伝子産物が欠乏している状態
の微生物株の増殖に適切な条件である逆転条件。次に、
これらの２つの条件下で増殖させた微生物培養物を、植
物の成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ
る。この必須植物遺伝子産物を特異的に阻害する化合物
を、試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下では増殖を阻害しない化合物として同定する。
植物遺伝子産物の細菌同族体を発現する微生物株を用い
る。この微生物株は、その細菌同族体をコード化する遺
伝子の中に変異を有しており、その結果として、これ
は、その植物遺伝子産物の発現なしか或は栄養補足物の
添加なしには増殖することができない。本発明の１つの
具体例において、この微生物株を下記の２組の条件下に
維持する：その植物遺伝子産物を発現する微生物株の増
殖にとっては適切であるがこの植物遺伝子産物が欠乏し
ている状態の微生物株の増殖には不適切である試験条
件；およびその必須植物遺伝子産物が欠乏している状態
の微生物株の増殖に適切な条件である逆転条件。次に、
これらの２つの条件下で増殖させた微生物培養物を、植
物の成長阻害特性に関して試験すべき化合物と接触させ
る。この必須植物遺伝子産物を特異的に阻害する化合物
を、試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下では増殖を阻害しない化合物として同定する。
【０００５】本発明の方法では、その必須植物代謝経路
全体の酵素全てをその微生物株内で発現させる必要はな
い。本方法では、この微生物株の栄養的要求を補完する
に充分な１種のみの、標的植物経路の酵素の発現を必要
としている。
全体の酵素全てをその微生物株内で発現させる必要はな
い。本方法では、この微生物株の栄養的要求を補完する
に充分な１種のみの、標的植物経路の酵素の発現を必要
としている。
【０００６】加うるに、本発明の方法では、その微生物
株内でその必須植物遺伝子産物全体を発現させる必要は
ない。本方法では、その微生物株の栄養的要求を補完す
るに充分な、その植物遺伝子産物の一部のみの発現を必
要としている。例えば、この微生物株の栄養的要求を補
完するに充分なその植物遺伝子産物の部分は、その植物
遺伝子産物のフラグメントか或はホロ酵素のサブユニッ
トであってもよい。
株内でその必須植物遺伝子産物全体を発現させる必要は
ない。本方法では、その微生物株の栄養的要求を補完す
るに充分な、その植物遺伝子産物の一部のみの発現を必
要としている。例えば、この微生物株の栄養的要求を補
完するに充分なその植物遺伝子産物の部分は、その植物
遺伝子産物のフラグメントか或はホロ酵素のサブユニッ
トであってもよい。
【０００７】本発明の特別な具体例に従い、ホスホリボ
シルアントラニレートトランスフェラーゼが、阻害性を
示す化合物のためのスクリーニングで標的となる必須植
物遺伝子産物である。このスクリーニングで用いられる
微生物株は、トリプトファンなしか或は植物遺伝子産物
であるホスホリボシルアントラニレートトランスフェラ
ーゼなしでは増殖し得ない株である。この具体例に従う
試験条件は、トリプトファン、および他の、ホスホリボ
シルアントラニレートトランスフェラーゼ活性が欠乏し
ている微生物株の増殖を可能にする何らかの化合物、が
不足している条件である。逆転条件は、トリプトファン
か或はホスホリボシルアントラニレートトランスフェラ
ーゼ活性が欠乏している微生物株の増殖を可能にする他
の何らかの化合物が含まれている条件である。
シルアントラニレートトランスフェラーゼが、阻害性を
示す化合物のためのスクリーニングで標的となる必須植
物遺伝子産物である。このスクリーニングで用いられる
微生物株は、トリプトファンなしか或は植物遺伝子産物
であるホスホリボシルアントラニレートトランスフェラ
ーゼなしでは増殖し得ない株である。この具体例に従う
試験条件は、トリプトファン、および他の、ホスホリボ
シルアントラニレートトランスフェラーゼ活性が欠乏し
ている微生物株の増殖を可能にする何らかの化合物、が
不足している条件である。逆転条件は、トリプトファン
か或はホスホリボシルアントラニレートトランスフェラ
ーゼ活性が欠乏している微生物株の増殖を可能にする他
の何らかの化合物が含まれている条件である。
【０００８】本発明の別の具体例において、アセトヒド
ロキシアシッドシンターゼがその標的となる必須植物遺
伝子産物であり、そして用いられる微生物株は、アセト
ヒドロキシアシッドシンターゼまたは分枝アミノ酸類
（アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している
微生物株はこれらを作り出すことができない）なしでは
増殖し得ない株である。試験条件は、アセトヒドロキシ
アシッドシンターゼの存在なしで増殖するに必要とされ
る分枝鎖アミノ酸を含んでいないが、逆転条件は、その
必要とされる分枝鎖アミノ酸を含んでいる。
ロキシアシッドシンターゼがその標的となる必須植物遺
伝子産物であり、そして用いられる微生物株は、アセト
ヒドロキシアシッドシンターゼまたは分枝アミノ酸類
（アセトヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している
微生物株はこれらを作り出すことができない）なしでは
増殖し得ない株である。試験条件は、アセトヒドロキシ
アシッドシンターゼの存在なしで増殖するに必要とされ
る分枝鎖アミノ酸を含んでいないが、逆転条件は、その
必要とされる分枝鎖アミノ酸を含んでいる。
【０００９】本発明のさらなる具体例において、３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェ
ートシンターゼが、阻害性を示す化合物のためのスクリ
ーニングで標的となる必須植物遺伝子産物である。この
スクリーニングで用いられる微生物株は、３−デオキシ
−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシ
ンターゼなしか或はアミノ酸であるフェニルアラニン、
トリプトファンおよびチロシンなしでは増殖し得ない。
試験条件には、フェニルアラニン、トリプトファンおよ
びチロシンが含まれておらず、一方逆転条件には、これ
らのアミノ酸が含まれている。
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェ
ートシンターゼが、阻害性を示す化合物のためのスクリ
ーニングで標的となる必須植物遺伝子産物である。この
スクリーニングで用いられる微生物株は、３−デオキシ
−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシ
ンターゼなしか或はアミノ酸であるフェニルアラニン、
トリプトファンおよびチロシンなしでは増殖し得ない。
試験条件には、フェニルアラニン、トリプトファンおよ
びチロシンが含まれておらず、一方逆転条件には、これ
らのアミノ酸が含まれている。
【００１０】本発明のさらなる具体例において、グルタ
ミンシンセターゼがその標的となる必須植物遺伝子産物
である。この具体例に従うスクリーニングで用いられる
微生物株は、グルタミンシンセターゼの発現なしか或は
グルタミンの添加なしには増殖し得ない株である。試験
条件にはグルタミンが存在しておらず、一方その逆転条
件にはグルタミンが存在している。
ミンシンセターゼがその標的となる必須植物遺伝子産物
である。この具体例に従うスクリーニングで用いられる
微生物株は、グルタミンシンセターゼの発現なしか或は
グルタミンの添加なしには増殖し得ない株である。試験
条件にはグルタミンが存在しておらず、一方その逆転条
件にはグルタミンが存在している。
【００１１】本発明の更に別の具体例に従い、植物に特
異的な植物成長阻害剤のためのスクリーニングで標的と
なる植物必須遺伝子産物は、ジヒドロジピコリネートシ
ンターゼである。この具体例に従い、阻害剤のスクリー
ニングで用いられる微生物株は、ジヒドロジピコリネー
トシンターゼの発現なしか或はジアミノピメリン酸の添
加なしでは増殖し得ない。従って、試験条件にはジアミ
ノピメリン酸が含まれておらず、一方逆転条件にはジア
ミノピメリン酸が含まれている。
異的な植物成長阻害剤のためのスクリーニングで標的と
なる植物必須遺伝子産物は、ジヒドロジピコリネートシ
ンターゼである。この具体例に従い、阻害剤のスクリー
ニングで用いられる微生物株は、ジヒドロジピコリネー
トシンターゼの発現なしか或はジアミノピメリン酸の添
加なしでは増殖し得ない。従って、試験条件にはジアミ
ノピメリン酸が含まれておらず、一方逆転条件にはジア
ミノピメリン酸が含まれている。
【００１２】本発明の別の具体例は、変異遺伝子産物に
相対する野生型を阻害する化合物に耐性を示す変異必須
植物遺伝子産物を同定する方法に関する。上記変異遺伝
子産物を同定するか、或は該変異遺伝子産物を発現する
微生物株を同定することが可能なことは、その変異必須
遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発現する形質転
換植物の生産で有効性を示す。このような植物は、その
変異遺伝子を発現しない同様な植物（即ち野生型植物）
の成長を阻害する化合物に耐性を示す。この具体例に従
い、必須植物遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発
現する微生物株は、その野生型必須植物遺伝子産物が欠
乏している状態の微生物株を増殖させるに必要な栄養的
補足物なしに増殖する。このような条件下、この微生物
株は、その微生物株が発現する変異必須植物遺伝子産物
が、その株が栄養的補足に必要とされているものを補完
し得る場合、増殖する。次に、これらの条件下で増殖す
る微生物を、野生型遺伝子産物を発現する微生物株の増
殖阻害を生じさせるに充分な量の、この野生型必須植物
遺伝子産物の公知阻害剤に接触させる。この公知阻害剤
が存在している上記条件下で増殖し得る微生物細胞は、
その野生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性
を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である。
相対する野生型を阻害する化合物に耐性を示す変異必須
植物遺伝子産物を同定する方法に関する。上記変異遺伝
子産物を同定するか、或は該変異遺伝子産物を発現する
微生物株を同定することが可能なことは、その変異必須
遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発現する形質転
換植物の生産で有効性を示す。このような植物は、その
変異遺伝子を発現しない同様な植物（即ち野生型植物）
の成長を阻害する化合物に耐性を示す。この具体例に従
い、必須植物遺伝子産物をコード化する変異遺伝子を発
現する微生物株は、その野生型必須植物遺伝子産物が欠
乏している状態の微生物株を増殖させるに必要な栄養的
補足物なしに増殖する。このような条件下、この微生物
株は、その微生物株が発現する変異必須植物遺伝子産物
が、その株が栄養的補足に必要とされているものを補完
し得る場合、増殖する。次に、これらの条件下で増殖す
る微生物を、野生型遺伝子産物を発現する微生物株の増
殖阻害を生じさせるに充分な量の、この野生型必須植物
遺伝子産物の公知阻害剤に接触させる。この公知阻害剤
が存在している上記条件下で増殖し得る微生物細胞は、
その野生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性
を示す変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である。
【００１３】本発明の別の具体例は、新規な植物成長阻
害剤を同定する目的で変異植物遺伝子産物を用いること
に関する。公知阻害剤に耐性を示すように変化した形態
の必須植物酵素をコード化する変異植物遺伝子は、同じ
化学種の追加的一員（ここに記述したスクリーニング方
法で測定した）に耐性を示す可能性がある。しかしなが
ら、このような変異体は、前に発見した阻害剤とは化学
的に異なっている新規な阻害剤に必ずしも耐性を示すと
は限らない。従って、ここに記述するスクリーニング
は、変異体である、除草剤に耐性を示す必須植物遺伝子
産物の、新規な阻害剤を同定する目的で用いられ得る。
害剤を同定する目的で変異植物遺伝子産物を用いること
に関する。公知阻害剤に耐性を示すように変化した形態
の必須植物酵素をコード化する変異植物遺伝子は、同じ
化学種の追加的一員（ここに記述したスクリーニング方
法で測定した）に耐性を示す可能性がある。しかしなが
ら、このような変異体は、前に発見した阻害剤とは化学
的に異なっている新規な阻害剤に必ずしも耐性を示すと
は限らない。従って、ここに記述するスクリーニング
は、変異体である、除草剤に耐性を示す必須植物遺伝子
産物の、新規な阻害剤を同定する目的で用いられ得る。
【００１４】
【発明の詳細な記述】ここに記述する方法は、植物、細
菌および菌・カビに特異的な、予め決めた酵素または代
謝標的部位を特異的に阻害する化合物を迅速同定するこ
とを可能にするものである。更に、不活性な代謝産物に
対して化合物が示す偶発的な代謝を基にした選択または
特別な植物種による化合物の排除を基とした選択ではな
く、興味の持たれている作物植物が示す遺伝的修飾を基
とした差別的作物選択を可能にする、標的部位の変異体
に関する選択を行う目的で、化学的発見で用いたのと同
じ生物学剤を用いることができる。
菌および菌・カビに特異的な、予め決めた酵素または代
謝標的部位を特異的に阻害する化合物を迅速同定するこ
とを可能にするものである。更に、不活性な代謝産物に
対して化合物が示す偶発的な代謝を基にした選択または
特別な植物種による化合物の排除を基とした選択ではな
く、興味の持たれている作物植物が示す遺伝的修飾を基
とした差別的作物選択を可能にする、標的部位の変異体
に関する選択を行う目的で、化学的発見で用いたのと同
じ生物学剤を用いることができる。
【００１５】本発明の方法は、植物由来の遺伝子を用い
て微生物の欠陥を遺伝的に補完することに頼っている。
ここに記述する方法に従い、興味の持たれている酵素に
遺伝的な欠陥を有している結果として栄養的補足または
遺伝的修飾（例えば補完）なしでは増殖し得ない有機体
を生じさせるように、微生物株を選択して構築する。こ
の遺伝的欠陥は、外因的に添加された必須植物産物なし
では栄養素要求性を引き起こすものから選択される。こ
の微生物に対する原栄養性を回復させるように、その欠
陥のある微生物遺伝子を補完し得る植物遺伝子をその微
生物内で発現させ、それによって、その遺伝子欠陥で引
き起こされた欠乏を軽減する。その得られる微生物が最
小培地で増殖するか否かは、その植物遺伝子に依存して
いるか、或はその遺伝子がコード化する酵素の植物産物
に依存している。この微生物を用いて、その選択した植
物酵素を阻害する化合物に関するスクリーニングを行う
ことができる。これは、例えば、興味の持たれている酵
素の産物を含んでいるか或はその産物が不足している最
小栄養寒天プレートの上で特徴的な増殖を評価すること
によって行われ得る。これらのプレートの上で、特異的
に、この酵素の産物または経路を欠乏させて微生物の増
殖を阻害するがその産物を存在させて微生物の増殖を阻
害しない化合物が同定され得る。経路の最終産物を用い
ることで、増殖阻害の逆転を試験するようにこのスクリ
ーニングを修飾することができる。従って、本発明の方
法を用いることで、微生物の酵素のその場所に１種以上
の植物酵素を含んでいる特異的経路を阻害する化合物を
同定することができる。
て微生物の欠陥を遺伝的に補完することに頼っている。
ここに記述する方法に従い、興味の持たれている酵素に
遺伝的な欠陥を有している結果として栄養的補足または
遺伝的修飾（例えば補完）なしでは増殖し得ない有機体
を生じさせるように、微生物株を選択して構築する。こ
の遺伝的欠陥は、外因的に添加された必須植物産物なし
では栄養素要求性を引き起こすものから選択される。こ
の微生物に対する原栄養性を回復させるように、その欠
陥のある微生物遺伝子を補完し得る植物遺伝子をその微
生物内で発現させ、それによって、その遺伝子欠陥で引
き起こされた欠乏を軽減する。その得られる微生物が最
小培地で増殖するか否かは、その植物遺伝子に依存して
いるか、或はその遺伝子がコード化する酵素の植物産物
に依存している。この微生物を用いて、その選択した植
物酵素を阻害する化合物に関するスクリーニングを行う
ことができる。これは、例えば、興味の持たれている酵
素の産物を含んでいるか或はその産物が不足している最
小栄養寒天プレートの上で特徴的な増殖を評価すること
によって行われ得る。これらのプレートの上で、特異的
に、この酵素の産物または経路を欠乏させて微生物の増
殖を阻害するがその産物を存在させて微生物の増殖を阻
害しない化合物が同定され得る。経路の最終産物を用い
ることで、増殖阻害の逆転を試験するようにこのスクリ
ーニングを修飾することができる。従って、本発明の方
法を用いることで、微生物の酵素のその場所に１種以上
の植物酵素を含んでいる特異的経路を阻害する化合物を
同定することができる。
【００１６】野生型酵素が示す適当な機能を阻害するか
或はそれの邪魔をすることでその酵素を含んでいる有機
体の成育を防止する除草剤化合物を同定したならば、耐
性変異体を単離することができる。例えば、野生型有機
体の増殖を阻害するに充分な濃度の阻害剤の存在下で、
１つの集団を変異誘発させた後、増殖し得るか或は野生
型有機体よりも迅速に増殖する集団から個体を選択する
ことができる。
或はそれの邪魔をすることでその酵素を含んでいる有機
体の成育を防止する除草剤化合物を同定したならば、耐
性変異体を単離することができる。例えば、野生型有機
体の増殖を阻害するに充分な濃度の阻害剤の存在下で、
１つの集団を変異誘発させた後、増殖し得るか或は野生
型有機体よりも迅速に増殖する集団から個体を選択する
ことができる。
【００１７】ここに記述するスクリーニングを用いるこ
とで、植物に特異的な代謝過程の新規阻害剤を同定する
ことができると共に、現存している化学品を基として、
植物に特異的な産物の類似物の特徴付けを行うことがで
き、そして植物に特異的な酵素の、天然に存在している
阻害剤を検出することができる。効力を示す阻害剤のた
めの給源には、発酵ブロス、部分精製された発酵ブロ
ス、並びに天然および合成的に作られた化合物が含まれ
得る。
とで、植物に特異的な代謝過程の新規阻害剤を同定する
ことができると共に、現存している化学品を基として、
植物に特異的な産物の類似物の特徴付けを行うことがで
き、そして植物に特異的な酵素の、天然に存在している
阻害剤を検出することができる。効力を示す阻害剤のた
めの給源には、発酵ブロス、部分精製された発酵ブロ
ス、並びに天然および合成的に作られた化合物が含まれ
得る。
【００１８】この一次スクリーニングで陽性であるとし
て同定された効力を示す阻害剤、例えば有機分子または
発酵ブロスを更に、その植物遺伝子でまだ形質転換され
ていない（即ち発現していない）植物遺伝子が欠乏して
いる微生物株に対してその化合物を試験することによる
二次スクリーニングで評価することができる。この試験
では、真の植物産物に特異的な阻害剤は増殖阻害を引き
起こさない。しかしながら、これらの植物酵素の微生物
同族体の阻害剤は、まだ除草剤として有効であり得る。
て同定された効力を示す阻害剤、例えば有機分子または
発酵ブロスを更に、その植物遺伝子でまだ形質転換され
ていない（即ち発現していない）植物遺伝子が欠乏して
いる微生物株に対してその化合物を試験することによる
二次スクリーニングで評価することができる。この試験
では、真の植物産物に特異的な阻害剤は増殖阻害を引き
起こさない。しかしながら、これらの植物酵素の微生物
同族体の阻害剤は、まだ除草剤として有効であり得る。
【００１９】この一次スクリーニングおよび二次評価で
陽性であると評価された先頭に立つ阻害剤を更に植物に
関して試験することができる。
陽性であると評価された先頭に立つ阻害剤を更に植物に
関して試験することができる。
【００２０】以下に示す実施例において、５種の異なる
必須植物遺伝子産物を用いて、標的植物酵素の特異的阻
害剤のための生物学的スクリーニングを開発する。各標
的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階（これなしで植
物は成育することができない）を表している。このスク
リーニングでは、各場合共、その植物遺伝子産物なしか
或は栄養的補足物なしでは増殖し得ない微生物株を用い
る。これらのアッセイで用いる微生物株は、公知技術を
用いて必要以上の実験なしで容易に構築され得る。いく
つかの好適な微生物株の例には、細菌株（例えば大腸
菌、サルモネラ菌および藍細菌）および酵母菌が含まれ
る。
必須植物遺伝子産物を用いて、標的植物酵素の特異的阻
害剤のための生物学的スクリーニングを開発する。各標
的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階（これなしで植
物は成育することができない）を表している。このスク
リーニングでは、各場合共、その植物遺伝子産物なしか
或は栄養的補足物なしでは増殖し得ない微生物株を用い
る。これらのアッセイで用いる微生物株は、公知技術を
用いて必要以上の実験なしで容易に構築され得る。いく
つかの好適な微生物株の例には、細菌株（例えば大腸
菌、サルモネラ菌および藍細菌）および酵母菌が含まれ
る。
【００２１】変異体である、除草剤耐性を示す植物遺伝
子産物の阻害剤のための、機構を基にした生物学的スク
リーニングの例もまた記述する。この具体例に従い、標
的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階を表している
が、この酵素は、この変異酵素の野生型同族体の阻害剤
に耐性を示す変異酵素である。本方法に従うスクリーニ
ングでは、植物遺伝子産物なしか或は栄養的補足物なし
には増殖し得ない微生物株を用いる。これらの微生物株
は、多くの場合、野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤を
同定する目的で用いた菌株と同じであるか或は類似して
おり、そしてこれらは、公知技術に従って必要以上の実
験なしで容易に構築され得る。
子産物の阻害剤のための、機構を基にした生物学的スク
リーニングの例もまた記述する。この具体例に従い、標
的酵素は、正常な植物代謝に必須な段階を表している
が、この酵素は、この変異酵素の野生型同族体の阻害剤
に耐性を示す変異酵素である。本方法に従うスクリーニ
ングでは、植物遺伝子産物なしか或は栄養的補足物なし
には増殖し得ない微生物株を用いる。これらの微生物株
は、多くの場合、野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤を
同定する目的で用いた菌株と同じであるか或は類似して
おり、そしてこれらは、公知技術に従って必要以上の実
験なしで容易に構築され得る。
【００２２】アセトヒドロキシアシッドシンターゼ（Ａ
ＨＡＳ）が、分枝鎖アミノ酸生合成のための生合成経路
に特異的な第一酵素である。アセトヒドロキシアシッド
シンターゼは、２分子のピルベートを縮合させてアセト
ラクテートを生じさせるか或は１分子のピルベートと１
分子のα−ケトブチレートからアセトヒドロキシ−ブチ
レートを生じさせる縮合を触媒している。ＡＨＡＳは、
これらの基質に加えて、酵素活性および安定性のための
チアミンピロホスフェートおよびフラビンアデニンヌク
レオチドを必要としている。植物由来のＡＨＡＳは、イ
ソロイシン、ロイシンおよびバリンによってフィードバ
ック阻害される。これらの細菌の酵素同族体（ＡＨＡＳ
ＩおよびＩＩＩ）はバリンでフィードバック阻害され
るが、植物の同族体（ＡＨＡＳ ＩＩ）はフィードバッ
ク阻害されない。
ＨＡＳ）が、分枝鎖アミノ酸生合成のための生合成経路
に特異的な第一酵素である。アセトヒドロキシアシッド
シンターゼは、２分子のピルベートを縮合させてアセト
ラクテートを生じさせるか或は１分子のピルベートと１
分子のα−ケトブチレートからアセトヒドロキシ−ブチ
レートを生じさせる縮合を触媒している。ＡＨＡＳは、
これらの基質に加えて、酵素活性および安定性のための
チアミンピロホスフェートおよびフラビンアデニンヌク
レオチドを必要としている。植物由来のＡＨＡＳは、イ
ソロイシン、ロイシンおよびバリンによってフィードバ
ック阻害される。これらの細菌の酵素同族体（ＡＨＡＳ
ＩおよびＩＩＩ）はバリンでフィードバック阻害され
るが、植物の同族体（ＡＨＡＳ ＩＩ）はフィードバッ
ク阻害されない。
【００２３】ＡＨＡＳは、イミダゾリドン類、スルホニ
ル尿素類およびトリアゾロピリミジン類を含むいくつか
の公知および無関係な種類の除草剤の標的部位である。
これらのイミダゾリドン類およびスルホニル尿素類は、
この酵素を利用している本発明のスクリーニングのため
の正の対照として働く。動物は分枝鎖アミノ酸を合成す
るための酵素を有しておらずそして植物が成長するため
にはこの経路が必要であることから、これらの除草剤は
低い動物毒性を示す。加うるに、表Ｉに示す如き分枝鎖
アミノ酸の１種以上は数多くの天然に存在している抗代
謝産物（トキシン類）の影響を逆転することもまた報告
されている（Scannel、 J.P. およびDavis L. Preuss (1
974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」
（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Protein
s）、Boris Weinstein編集、 第3巻、189-224頁）。
ル尿素類およびトリアゾロピリミジン類を含むいくつか
の公知および無関係な種類の除草剤の標的部位である。
これらのイミダゾリドン類およびスルホニル尿素類は、
この酵素を利用している本発明のスクリーニングのため
の正の対照として働く。動物は分枝鎖アミノ酸を合成す
るための酵素を有しておらずそして植物が成長するため
にはこの経路が必要であることから、これらの除草剤は
低い動物毒性を示す。加うるに、表Ｉに示す如き分枝鎖
アミノ酸の１種以上は数多くの天然に存在している抗代
謝産物（トキシン類）の影響を逆転することもまた報告
されている（Scannel、 J.P. およびDavis L. Preuss (1
974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」
（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Protein
s）、Boris Weinstein編集、 第3巻、189-224頁）。
【００２４】 表Ｉ −− 分枝鎖アミノ酸によって逆転させられると報告されている天然トキ シン毒性化合物 リバーサント（Reversant） Ｌ−２−アミノ−４，４−ジクロロ酪酸 Ｌｅｕ Ｌ−４−アザロイシン Ｌｅｕ Ｌ−２−アミノ−４−メチル−４−カプロン酸 Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｌ−２−アミノ−４−メチル−５−カプロン酸 Ｌｅｕ＞Ｖａｌ、Ｉｌｅ プロパルギルグリシン Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ Ｌ−（トレオ）−３−ヒドロキシロイシン Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ など フラノマイシン、トレオマイシン Ｉｌｅ、Ｖａｌ １−アミノ−２−ニトロシクロペンタンカルボン酸 Ｌｅｕ ２−（１−シクロヘキセン−３（Ｒ）−イル） −Ｓ−グリシン Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ Ｔｈｒなど １−シクロヘキセン−３（Ｒ）−イルグリオキシル酸 上と同じ 両方共ＴＤ阻害剤 Ｌ−２−（２−メチレン−１−シクロプロピル） グリシン Ｌｅｕ イミダゾリドン耐性を示す雑草が存在していることは、
イミダゾリドン除草剤およびＡＨＡＳを阻害する他の除
草剤を用いる時の関心事である。耐性を示す形態のＡＨ
ＡＳを特異的に阻害する新規化合物を同定することによ
り、例えばイミダゾリドン耐性を示す雑草を特異的に根
絶するに有効な化合物を同定することが可能になる。Ａ
ＨＡＳ阻害剤を同定するためのこの機構を基としたスク
リーニングは、野生型形態ではなく耐性を示す形態のＡ
ＨＡＳによってその試験有機体の遺伝的欠陥が補完され
ることを除き、野生型ＡＨＡＳの阻害剤の同定で記述し
たスクリーニングと同じである。従って、このようなス
クリーニングを用いることで、新規なＡＨＡＳ阻害剤を
同定することが可能であると共に、現存化学品を基とす
る類似物の特徴付けを行うことができ、そして天然産物
由来の阻害剤を検出することができる。
イミダゾリドン除草剤およびＡＨＡＳを阻害する他の除
草剤を用いる時の関心事である。耐性を示す形態のＡＨ
ＡＳを特異的に阻害する新規化合物を同定することによ
り、例えばイミダゾリドン耐性を示す雑草を特異的に根
絶するに有効な化合物を同定することが可能になる。Ａ
ＨＡＳ阻害剤を同定するためのこの機構を基としたスク
リーニングは、野生型形態ではなく耐性を示す形態のＡ
ＨＡＳによってその試験有機体の遺伝的欠陥が補完され
ることを除き、野生型ＡＨＡＳの阻害剤の同定で記述し
たスクリーニングと同じである。従って、このようなス
クリーニングを用いることで、新規なＡＨＡＳ阻害剤を
同定することが可能であると共に、現存化学品を基とす
る類似物の特徴付けを行うことができ、そして天然産物
由来の阻害剤を検出することができる。
【００２５】３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソ
ネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シンターゼは、芳
香族アミノ酸生合成のための生合成経路中の第一酵素で
ある。この酵素を用いた、機構を基としたスクリーニン
グにより、試験サンプルからＤＡＨＰシンターゼ阻害剤
を同定することができ、従ってこれらは、除草性を示す
可能性がある。
ネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シンターゼは、芳
香族アミノ酸生合成のための生合成経路中の第一酵素で
ある。この酵素を用いた、機構を基としたスクリーニン
グにより、試験サンプルからＤＡＨＰシンターゼ阻害剤
を同定することができ、従ってこれらは、除草性を示す
可能性がある。
【００２６】ＤＡＨＰシンターゼが触媒する反応は、ホ
スホエノールピルベートとエリスロース−４−ホスフェ
ートとを縮合させて３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
ツロソネート７−ホスフェートを生じさせる縮合であ
る。この経路で得られる最終的な産物は、芳香族アミノ
酸であるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロ
シンである。しかしながら、植物におけるこの経路は、
リグニン、アントシアニン色素、オーキシンおよび抗菌
性フィトアレキシン類を含む多様な列の二次代謝産物を
もたらす（Weiss, U.およびJ.M. Edwards (1980）「芳
香族化合物の生合成」（The Biosynthesis of Aromatic
Compounds（Wiley、 New York）；Hahlbrock, K.および
D. Scheel (1989）、Annu. Rev. .Plant Physiol Plant
Mol. Biol40:347-369）。植物のＤＡＨＰシンターゼイ
ソ酵素は、芳香族アミノ酸類によって阻害されない。
スホエノールピルベートとエリスロース−４−ホスフェ
ートとを縮合させて３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
ツロソネート７−ホスフェートを生じさせる縮合であ
る。この経路で得られる最終的な産物は、芳香族アミノ
酸であるフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロ
シンである。しかしながら、植物におけるこの経路は、
リグニン、アントシアニン色素、オーキシンおよび抗菌
性フィトアレキシン類を含む多様な列の二次代謝産物を
もたらす（Weiss, U.およびJ.M. Edwards (1980）「芳
香族化合物の生合成」（The Biosynthesis of Aromatic
Compounds（Wiley、 New York）；Hahlbrock, K.および
D. Scheel (1989）、Annu. Rev. .Plant Physiol Plant
Mol. Biol40:347-369）。植物のＤＡＨＰシンターゼイ
ソ酵素は、芳香族アミノ酸類によって阻害されない。
【００２７】現在のところＤＡＨＰシンターゼを阻害す
ると同定されたただ１つの天然産物は、フェニルアラニ
ン類似物である２，５−ジヒドロフェニルアラニンであ
る（Scannel J.P.およびDavis L. Preuss (1974）著
「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemis
try of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris
Weinstein編集、 第3巻、 189-224頁）。しかしながら、
この化合物は微生物酵素のフィードバック阻害によって
機能する可能性があると共にその植物酵素に対して有効
性を示さない可能性があることから、そのスクリーニン
グでは別の対照が必要であり得る。芳香族アミノ酸類に
よる増殖阻害の逆転を示し得るがその作用部位がＤＡＨ
Ｐシンターゼでない他の化合物が同定された。
ると同定されたただ１つの天然産物は、フェニルアラニ
ン類似物である２，５−ジヒドロフェニルアラニンであ
る（Scannel J.P.およびDavis L. Preuss (1974）著
「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の化学」（Chemis
try of Amino Acids, Peptides and Proteins）、Boris
Weinstein編集、 第3巻、 189-224頁）。しかしながら、
この化合物は微生物酵素のフィードバック阻害によって
機能する可能性があると共にその植物酵素に対して有効
性を示さない可能性があることから、そのスクリーニン
グでは別の対照が必要であり得る。芳香族アミノ酸類に
よる増殖阻害の逆転を示し得るがその作用部位がＤＡＨ
Ｐシンターゼでない他の化合物が同定された。
【００２８】グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）が、細
菌、菌・カビおよび植物細胞におけるアンモニアの同化
および再同化で機能する鍵となる酵素である。この酵素
は、グルタメートとアンモニアとＡＴＰからのグルタミ
ン生成を触媒し、そして除草剤化合物であるホスフィノ
トリシンおよびビアラホス（発酵産物）の標的部位であ
ることが見いだされた。ＧＳは、２種の市販除草剤、IN
CITE（商標）（ホスフィノトリシン）およびBASTA（商
標）（ビアラホス）の標的部位である。ビアラホスは、
ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis L. Pr
euss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の
化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Pro
teins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244頁）
（表ＩＩ参照）の中に詳述されている如き他のいくつか
の抗代謝産物（除草剤化合物）と同様、天然の発酵ブロ
スから発見された。ホスフィノトリシンおよびビアラホ
スは、植物遺伝子産物が示す拮抗作用のための正の対照
として働き得る。
菌、菌・カビおよび植物細胞におけるアンモニアの同化
および再同化で機能する鍵となる酵素である。この酵素
は、グルタメートとアンモニアとＡＴＰからのグルタミ
ン生成を触媒し、そして除草剤化合物であるホスフィノ
トリシンおよびビアラホス（発酵産物）の標的部位であ
ることが見いだされた。ＧＳは、２種の市販除草剤、IN
CITE（商標）（ホスフィノトリシン）およびBASTA（商
標）（ビアラホス）の標的部位である。ビアラホスは、
ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis L. Pr
euss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋白質の
化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides and Pro
teins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244頁）
（表ＩＩ参照）の中に詳述されている如き他のいくつか
の抗代謝産物（除草剤化合物）と同様、天然の発酵ブロ
スから発見された。ホスフィノトリシンおよびビアラホ
スは、植物遺伝子産物が示す拮抗作用のための正の対照
として働き得る。
【００２９】表ＩＩ −− 公知のＧＳ阻害剤 アンチカプシン（Anticapsin） アザセリン（Azaserine） ６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン（ＤＯＮ） タブトキシン（Tabtoxin） デュアゾマイシンＢ（Duazomycin B） ビアラホス（Bialaphos） メチオニンスルホキシミン（Methionine sulfoximine） ホサラシン（Phosalacine） オキセチン（Oxetin） ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰＳ）は、β
−アスパルテートセミアルデヒドとピルベートとを縮合
させて２，３−ジヒドロジピコリネートを生じさせる縮
合を触媒する。この反応において、ピルベートは、最初
にリジン残基と一緒にシッフ塩基を生じることによって
その酵素と結合する（Shedlarski, J.G.およびC. Gilva
rg (1970）、 J. Biol Chem. 245:1362-1373）。タバ
コ、小麦およびトウモロコシ由来の酵素は、リジンによ
ってフィードバック阻害され、そして低い度合であるが
リジン類似物によってフィードバック阻害される（Ghis
lain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs (1990) Plant
a 180:480-486；Kumpaisal,R.、 Hashimoto, T.およびY.
Yamada (1987)、 Plant Physiol. 85:145-151；Frisch,
D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.およびD.A. Som
ers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287-293）。１００
ｍＭのリジンはこの酵素活性を９０％阻害する。そのリ
ジン類似物であるＳ−（２−アミノエチル）Ｌ−システ
インは、タバコ酵素の最も強い阻害剤であり、０．１ｍ
Ｍで５０％阻害を示しそして０．５ｍＭで９０％阻害を
示した（Ghislain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs
(1990)Planta 180:480-486）。
−アスパルテートセミアルデヒドとピルベートとを縮合
させて２，３−ジヒドロジピコリネートを生じさせる縮
合を触媒する。この反応において、ピルベートは、最初
にリジン残基と一緒にシッフ塩基を生じることによって
その酵素と結合する（Shedlarski, J.G.およびC. Gilva
rg (1970）、 J. Biol Chem. 245:1362-1373）。タバ
コ、小麦およびトウモロコシ由来の酵素は、リジンによ
ってフィードバック阻害され、そして低い度合であるが
リジン類似物によってフィードバック阻害される（Ghis
lain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs (1990) Plant
a 180:480-486；Kumpaisal,R.、 Hashimoto, T.およびY.
Yamada (1987)、 Plant Physiol. 85:145-151；Frisch,
D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.およびD.A. Som
ers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287-293）。１００
ｍＭのリジンはこの酵素活性を９０％阻害する。そのリ
ジン類似物であるＳ−（２−アミノエチル）Ｌ−システ
インは、タバコ酵素の最も強い阻害剤であり、０．１ｍ
Ｍで５０％阻害を示しそして０．５ｍＭで９０％阻害を
示した（Ghislain, M.、 Frankard, V.およびM. Jacobs
(1990)Planta 180:480-486）。
【００３０】菌・カビ、細菌および植物細胞において、
酵素であるジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰ
Ｓ）は、栄養的に必須なアミノ酸であるリジンの合成で
機能する。現在利用できる市販除草剤のいずれも、ＤＨ
ＰＳの阻害による作用を示さない。この酵素は動物内に
存在していないと共に、リジン生合成のための菌・カビ
経路は植物の経路とは異なっていることから、ＤＨＰＳ
の阻害剤は動物にとって無毒であると共に植物に特異性
を示すと期待される。大腸菌の酵素は、そのアミノ酸レ
ベルで、その植物酵素に２２％のみの相同性を示す。ジ
アミノピメリン酸またはリジンによって逆転させられ
る、ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis
L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋
白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides a
nd Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244
頁）が言及した化合物の多くは、代替作用機構を有する
か或は微生物酵素のフィードバック阻害剤である。以下
の表ＩＩＩを参照のこと。
酵素であるジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤＨＰ
Ｓ）は、栄養的に必須なアミノ酸であるリジンの合成で
機能する。現在利用できる市販除草剤のいずれも、ＤＨ
ＰＳの阻害による作用を示さない。この酵素は動物内に
存在していないと共に、リジン生合成のための菌・カビ
経路は植物の経路とは異なっていることから、ＤＨＰＳ
の阻害剤は動物にとって無毒であると共に植物に特異性
を示すと期待される。大腸菌の酵素は、そのアミノ酸レ
ベルで、その植物酵素に２２％のみの相同性を示す。ジ
アミノピメリン酸またはリジンによって逆転させられ
る、ScannelおよびPreuss（Scannel J.P.およびDavis
L. Preuss (1974）著「アミノ酸、ペプチド類および蛋
白質の化学」（Chemistry of Amino Acids, Peptides a
nd Proteins）、Boris Weinstein編集、 第3巻、 189-244
頁）が言及した化合物の多くは、代替作用機構を有する
か或は微生物酵素のフィードバック阻害剤である。以下
の表ＩＩＩを参照のこと。
【００３１】表ＩＩＩ −− ジアミノピメリン酸また
はリジンによる拮抗作用を受ける（antagonized）抗代
謝産物 Ｌ−セレノメチオニン Ｌ−４−オキサリジン Ｌ−２−アミノ−４−（２−アミノエトキシ）−トラン
ス−３−酪酸 ホモアルギニン カナバニン アザセリン ６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン 酵素であるホスホリボシルアントラニレートトランスフ
ェラーゼ（ＰＡＴ）は、トリプトファンの生合成経路に
おいて、アントラニレートシンターゼの後の反応を触媒
する。この酵素は植物および微生物代謝にユニークであ
ることから、ＰＡＴの阻害剤は、最小限の哺乳動物毒性
を示す可能な除草剤であると期待される。この酵素が欠
如しているアラビドプシス（Arabidopsis）変異体は増
殖できず、このことは、この酵素が良好な除草剤標的部
位になり得ることを示唆している。
はリジンによる拮抗作用を受ける（antagonized）抗代
謝産物 Ｌ−セレノメチオニン Ｌ−４−オキサリジン Ｌ−２−アミノ−４−（２−アミノエトキシ）−トラン
ス−３−酪酸 ホモアルギニン カナバニン アザセリン ６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン 酵素であるホスホリボシルアントラニレートトランスフ
ェラーゼ（ＰＡＴ）は、トリプトファンの生合成経路に
おいて、アントラニレートシンターゼの後の反応を触媒
する。この酵素は植物および微生物代謝にユニークであ
ることから、ＰＡＴの阻害剤は、最小限の哺乳動物毒性
を示す可能な除草剤であると期待される。この酵素が欠
如しているアラビドプシス（Arabidopsis）変異体は増
殖できず、このことは、この酵素が良好な除草剤標的部
位になり得ることを示唆している。
【００３２】ＰＡＴは、ホスホリボシルピロホスフェー
トおよびアントラニレートからのＮ−５’−ホスホリボ
シルアントラニレート生成を触媒している。この酵素が
欠如している植物および微生物は、アントラニレート
（ｏ−アミノ安息香酸）が蓄積することが原因で青色発
光を示す。トリプトファンを補足した栄養寒天上におけ
るこれらの変異体が示す増殖の初期段階において、これ
らの植物は、正常な速度で成長し、野生型と同じに見え
る。しかしながら、発芽後３から４週間で、このＰＡＴ
変異体は、その野生型よりも劇的に小さくなり、縮れた
葉、小さい葉柄、手間（business）が増大しそして最終
的にねん性が大きく減少することを含む、形態学的異常
さを示し始める（Last, R.L.およびG.R. Fink (1988）S
cience 240:305-310）。植物界におけるこの酵素の調節
に関して利用できる情報は非常に少ない。
トおよびアントラニレートからのＮ−５’−ホスホリボ
シルアントラニレート生成を触媒している。この酵素が
欠如している植物および微生物は、アントラニレート
（ｏ−アミノ安息香酸）が蓄積することが原因で青色発
光を示す。トリプトファンを補足した栄養寒天上におけ
るこれらの変異体が示す増殖の初期段階において、これ
らの植物は、正常な速度で成長し、野生型と同じに見え
る。しかしながら、発芽後３から４週間で、このＰＡＴ
変異体は、その野生型よりも劇的に小さくなり、縮れた
葉、小さい葉柄、手間（business）が増大しそして最終
的にねん性が大きく減少することを含む、形態学的異常
さを示し始める（Last, R.L.およびG.R. Fink (1988）S
cience 240:305-310）。植物界におけるこの酵素の調節
に関して利用できる情報は非常に少ない。
【００３３】以下に示す非制限的実施例を用いてここに
本発明を更に説明する。
本発明を更に説明する。
【００３４】
【実施例】実施例１ − グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）の阻害
剤に関する機構を基としたスクリーニング 材料および方法 大腸菌株ＴＨ１６（Reitzer, L.J.およびB. Magasanik、
(1986)、 Cell 45:785-792）は、そのｇｌｎＡ遺伝子の
中にＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが挿入されているこ
とから、ＧＳ活性が欠如している。この挿入変異の結果
として、増殖に関してグルタミン要求を生じ、そしてま
たカナマイシンに耐性を示す（そのＴｎ１０Ｋａｎトラ
ンスポゾンによって与えられる）。
剤に関する機構を基としたスクリーニング 材料および方法 大腸菌株ＴＨ１６（Reitzer, L.J.およびB. Magasanik、
(1986)、 Cell 45:785-792）は、そのｇｌｎＡ遺伝子の
中にＴｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが挿入されているこ
とから、ＧＳ活性が欠如している。この挿入変異の結果
として、増殖に関してグルタミン要求を生じ、そしてま
たカナマイシンに耐性を示す（そのＴｎ１０Ｋａｎトラ
ンスポゾンによって与えられる）。
【００３５】細菌の膜による化合物の排除を低くする目
的（即ち膜透過性を増大させる目的）（Sampson, B.A.、
Misra, R.およびS.A. Benson (1989）、 Genetics 122:
491-501）で、Ｐ１ ｖｉｒ仲介形質導入（Miller, J.
H.、 (1972）著「分子遺伝学における実験」（Experimen
ts in Molecular Genetics)、 CSH Laboratory、 Cold Sp
ring Harbor、 NY）により、そのＴＨ１６からのＧＳ欠
陥をｉｍｐ大腸菌株（ＢＡＳ８４９）の中に移動させ
た。このｉｍｐ変異により膜透過率が上昇する。ＳＣ３
と表示するその得られる菌株は、グルタミン栄養素要求
性を示すと共にテトラシクリンに耐性を示す（Ｔｎ１０
トランスポゾンによって与えられる）。
的（即ち膜透過性を増大させる目的）（Sampson, B.A.、
Misra, R.およびS.A. Benson (1989）、 Genetics 122:
491-501）で、Ｐ１ ｖｉｒ仲介形質導入（Miller, J.
H.、 (1972）著「分子遺伝学における実験」（Experimen
ts in Molecular Genetics)、 CSH Laboratory、 Cold Sp
ring Harbor、 NY）により、そのＴＨ１６からのＧＳ欠
陥をｉｍｐ大腸菌株（ＢＡＳ８４９）の中に移動させ
た。このｉｍｐ変異により膜透過率が上昇する。ＳＣ３
と表示するその得られる菌株は、グルタミン栄養素要求
性を示すと共にテトラシクリンに耐性を示す（Ｔｎ１０
トランスポゾンによって与えられる）。
【００３６】このＳＣ３が示すＧＳ欠乏は、ＳＣ３をプ
ラスミドｐＧＳ１２で形質転換することによって補完さ
れた。このプラスミドは、ベクターｐＫＫ２３３−２
（Pharmacia）を基にしており、これは、プロモーター
の下流に沿ってクローン化した遺伝子を高レベルで発現
させるためのキメラ細菌プロモーターｔｒｃを有する低
コピー数のプラスミドである。このプラスミドはまた、
アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有し
ている。葉緑体形態のPisum sativum ＧＳ遺伝子（Ting
ey, S.V.、 Tsai, F.-Y.、 Edwards, J.W.、 Walker, E.L.
およびG,N, Coruzzi (1988）J. Biol Chem. 263:9651-9
657）をそのｔｒｃプロモーターの背後にクローン化
し、その結果として、このプラスミドを有する大腸菌の
中で植物ＧＳ蛋白質の産生が行われる。ＧＳが欠乏して
いる大腸菌株を豆のＧＳで補完した菌株を、ＳＣ３（Ｇ
Ｓ１２）と表示する。
ラスミドｐＧＳ１２で形質転換することによって補完さ
れた。このプラスミドは、ベクターｐＫＫ２３３−２
（Pharmacia）を基にしており、これは、プロモーター
の下流に沿ってクローン化した遺伝子を高レベルで発現
させるためのキメラ細菌プロモーターｔｒｃを有する低
コピー数のプラスミドである。このプラスミドはまた、
アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有し
ている。葉緑体形態のPisum sativum ＧＳ遺伝子（Ting
ey, S.V.、 Tsai, F.-Y.、 Edwards, J.W.、 Walker, E.L.
およびG,N, Coruzzi (1988）J. Biol Chem. 263:9651-9
657）をそのｔｒｃプロモーターの背後にクローン化
し、その結果として、このプラスミドを有する大腸菌の
中で植物ＧＳ蛋白質の産生が行われる。ＧＳが欠乏して
いる大腸菌株を豆のＧＳで補完した菌株を、ＳＣ３（Ｇ
Ｓ１２）と表示する。
【００３７】大腸菌菌株ＳＣ３（ＧＳ１２）の培養物を
グリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発
させるか、或はプレートからの単一コロニーから出発さ
せた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫ液体培地中３０℃で一晩
増殖させる。
グリセロールストック（−８０℃に貯蔵した）から出発
させるか、或はプレートからの単一コロニーから出発さ
せた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫ液体培地中３０℃で一晩
増殖させる。
【００３８】以下に示すように、試験プレートは、Ｍ９
ＡＴＫ寒天で構成されており、そして逆転プレートは、
Ｍ９ＡＴＫＧ寒天で構成されている。
ＡＴＫ寒天で構成されており、そして逆転プレートは、
Ｍ９ＡＴＫＧ寒天で構成されている。
【００３９】培地： 完成したＭ９ＡＴＫ液体： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ９７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間オートクレーブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン 完成したＭ９ＡＴＫ寒天： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ４７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン Ｍ９ＡＴＫＧ：上述した如くＭ９ＡＴＫ培地を製造。
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン Ｍ９ＡＴＫＧ：上述した如くＭ９ＡＴＫ培地を製造。
【００４０】他のものをボトル１に添加すると共に２５
ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬグルタミンを加える。
ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬグルタミンを加える。
【００４１】試験プレート： １． Ｍ９ＡＴＫボトル１と２（溶融）を一緒にするこ
とで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
とで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００４２】２． ５０℃に冷却する。
【００４３】３． ＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物（Ｏ
Ｄ600≒４）を１０ｍＬ加える。
Ｄ600≒４）を１０ｍＬ加える。
【００４４】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００４５】逆転プレート： １． Ｍ９ＡＴＫＧボトル１と２（溶融）を一緒にする
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００４６】２． ５０℃に冷却する。
【００４７】３． ＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物（Ｏ
Ｄ600≒４）を１０ｍＬ加える。
Ｄ600≒４）を１０ｍＬ加える。
【００４８】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００４９】これらのプレート内の培地を固化させた後
３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ
１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレー
トの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照
除草剤であるビアラホスを、そのストックの５μＬを用
いて、各プレートに塗布する。これらのプレートを３０
℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻
害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、
その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大
きな阻害ゾーンを示す。
３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ
１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレー
トの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照
除草剤であるビアラホスを、そのストックの５μＬを用
いて、各プレートに塗布する。これらのプレートを３０
℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレート上の阻
害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す化合物は、
その逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大
きな阻害ゾーンを示す。
【００５０】スクリーニング結果 １００倍希釈した後のＳＣ３（ＧＳ１２）一晩培養物が
示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３０
℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレ
ートは、完全集密したＳＣ３（ＧＳ１２）増殖を示して
いる。正の除草剤対照であるビアラホスが示す阻害ゾー
ンは８−１２ｍｍである。
示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３０
℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレ
ートは、完全集密したＳＣ３（ＧＳ１２）増殖を示して
いる。正の除草剤対照であるビアラホスが示す阻害ゾー
ンは８−１２ｍｍである。
【００５１】１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる２
３種の抗菌化合物を用いてＳＣ３（ＧＳ１２）を試験す
る。表ＩＶを参照のこと。これらの化合物のいずれも、
グルタミンによる拮抗作用を受けない。
３種の抗菌化合物を用いてＳＣ３（ＧＳ１２）を試験す
る。表ＩＶを参照のこと。これらの化合物のいずれも、
グルタミンによる拮抗作用を受けない。
【００５２】加うるに、多様な天然産物である抗生物質
を代表する化合物の一団を、ＳＣ３（ＧＳ１２）に対し
て試験する。表Ｖを参照のこと。これらの化合物のいず
れもグルタミンによる拮抗作用を受けない。
を代表する化合物の一団を、ＳＣ３（ＧＳ１２）に対し
て試験する。表Ｖを参照のこと。これらの化合物のいず
れもグルタミンによる拮抗作用を受けない。
【００５３】種々の有機体を培養する目的で用いられて
いる培地の代表的な１組の異なる発酵培地またはブロス
もまた試験する。補完を行っていないＳＣ３が示す最小
培地内増殖を支持する能力に関して、これらの培地を試
験する。ミクロタイタープレートの中でこれらの培地を
試験する。
いる培地の代表的な１組の異なる発酵培地またはブロス
もまた試験する。補完を行っていないＳＣ３が示す最小
培地内増殖を支持する能力に関して、これらの培地を試
験する。ミクロタイタープレートの中でこれらの培地を
試験する。
【００５４】実施例２ − アセトヒドロキシアシッド
シンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に関する機構を基とし
たスクリーニング 材料および方法 ｌｅｕＢ（リンゴ酸イソプロピルデヒドロゲナーゼ）、
ｉｌｖＩＨ（ＡＨＡＳＩＩＩの大型および小型サブユニ
ット）およびｉｌｖＢ（ＡＨＡＳ Ｉの大型サブユニッ
ト）に関する欠失を含んでおりそしてまたｉｍｐ（上昇
した膜透過率）変異を有する大腸菌株を構築した。この
ｉｍｐ変異を有する細菌株の構築に関しては実施例１に
詳述してある。ｉｌｖＧＭ座位（ＡＨＡＳ ＩＩの大型
および小型サブユニット）は、全てのＫ−１２大腸菌株
において不活性である。従って、このＳＣ２と表示する
大腸菌株は、ＡＨＡＳ活性が欠乏しており、最小培地上
で増殖するには、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシ
ンおよびバリンを必要としている。これらの細菌の細胞
はまた、このＳＣ２株の構築で用いたＴｎ１０およびＴ
ｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが存在していることで、テ
トラシクリンとカナマイシンに耐性を示す。
シンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に関する機構を基とし
たスクリーニング 材料および方法 ｌｅｕＢ（リンゴ酸イソプロピルデヒドロゲナーゼ）、
ｉｌｖＩＨ（ＡＨＡＳＩＩＩの大型および小型サブユニ
ット）およびｉｌｖＢ（ＡＨＡＳ Ｉの大型サブユニッ
ト）に関する欠失を含んでおりそしてまたｉｍｐ（上昇
した膜透過率）変異を有する大腸菌株を構築した。この
ｉｍｐ変異を有する細菌株の構築に関しては実施例１に
詳述してある。ｉｌｖＧＭ座位（ＡＨＡＳ ＩＩの大型
および小型サブユニット）は、全てのＫ−１２大腸菌株
において不活性である。従って、このＳＣ２と表示する
大腸菌株は、ＡＨＡＳ活性が欠乏しており、最小培地上
で増殖するには、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシ
ンおよびバリンを必要としている。これらの細菌の細胞
はまた、このＳＣ２株の構築で用いたＴｎ１０およびＴ
ｎ１０Ｋａｎトランスポゾンが存在していることで、テ
トラシクリンとカナマイシンに耐性を示す。
【００５５】アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子（これの単
離および特徴付けはPlant Physiol.85:1110-1117 (198
7)）の中に記述されている）を、細菌の発現プラスミド
ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）にクローン化した。こ
のプラスミドは、ｔｒｃキメラ細菌プロモーターの背後
にクローン化したＡＨＡＳ遺伝子を含んでいる低コピー
数のプラスミドである。このプラスミドはまた、アンピ
シリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有してい
る。ＡＨＡＳ発現ベクターを用いてＳＣ２細胞を形質転
換することで菌株ＳＣ２／ＡＣ２０１を生じさせ、その
結果として、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子によるＳＣ
２ ＡＨＡＳ変異の補完が生じる。補完により、ロイシ
ン（これは、ｌｅｕＢ変異が存在していることから必要
である）のみを補った最小培地上におけるその細胞の増
殖が可能になる。
離および特徴付けはPlant Physiol.85:1110-1117 (198
7)）の中に記述されている）を、細菌の発現プラスミド
ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia）にクローン化した。こ
のプラスミドは、ｔｒｃキメラ細菌プロモーターの背後
にクローン化したＡＨＡＳ遺伝子を含んでいる低コピー
数のプラスミドである。このプラスミドはまた、アンピ
シリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を有してい
る。ＡＨＡＳ発現ベクターを用いてＳＣ２細胞を形質転
換することで菌株ＳＣ２／ＡＣ２０１を生じさせ、その
結果として、アラビドプシスＡＨＡＳ遺伝子によるＳＣ
２ ＡＨＡＳ変異の補完が生じる。補完により、ロイシ
ン（これは、ｌｅｕＢ変異が存在していることから必要
である）のみを補った最小培地上におけるその細胞の増
殖が可能になる。
【００５６】大腸菌株ＳＣ２／ＡＣ２０１をグリセロー
ルストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させるか、
或はＭ９ＡＴＫＬプレートからの単一コロニー（２週才
未満）から出発させた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫＬ液体
培地中３７℃で一晩増殖させる。Ｍ９ＡＴＫＬ寒天で構
成されている試験プレート、およびＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒
天で構成されている逆転プレートを下記の如く調製す
る。
ルストック（−８０℃に貯蔵した）から出発させるか、
或はＭ９ＡＴＫＬプレートからの単一コロニー（２週才
未満）から出発させた後、５０ｍＬのＭ９ＡＴＫＬ液体
培地中３７℃で一晩増殖させる。Ｍ９ＡＴＫＬ寒天で構
成されている試験プレート、およびＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒
天で構成されている逆転プレートを下記の如く調製す
る。
【００５７】培地： 完成したＭ９ＡＴＫＬ液体： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ９７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間オートクレーブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン ２．０ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−ロイシン 完成したＭ９ＡＴＫＬ寒天： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ４７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン ２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−ロイシン 完成したＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒天：上述した如くＭ９ＡＴ
ＫＬ培地を製造。
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン １．０ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬカナマイシン ２ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−ロイシン 完成したＭ９ＡＴＫＩＬＶ寒天：上述した如くＭ９ＡＴ
ＫＬ培地を製造。
【００５８】他のものをボトル１に添加すると共に２ｍ
Ｌの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリ
ンを加える。
Ｌの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−イソロイシンおよびＬ−バリ
ンを加える。
【００５９】試験プレート： １． Ｍ９ＡＴＫＬボトル１と２（溶融）を一緒にする
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００６０】２． ５０℃に冷却する。
【００６１】３． ＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物（Ｏ
Ｄ600≒１）を１０ｍＬ加える。
Ｄ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００６２】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００６３】逆転プレート： １． Ｍ９ＡＴＫＩＬＶボトル１と２（溶融）を一緒に
することで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
することで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００６４】２． ５０℃に冷却する。
【００６５】３． ＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物（Ｏ
Ｄ600≒１）を１０ｍＬ加える。
Ｄ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００６６】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００６７】プレート内の培地を固化させた後、約３０
分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ１２
列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの
両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照であ
るイマゼタピル（imazethapyr）を、そのストック（４
℃の５０％ＤＭＳＯ／水中１０μＭのイマゼタピル）の
５μＬを用いて、各プレートに塗布する。これらのプレ
ートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレ
ート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す
化合物（即ちＡＨＡＳ活性を阻害する化合物）は、その
逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな
阻害ゾーンを示す。
分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１２ｘ１２
列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プレートの
両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。対照であ
るイマゼタピル（imazethapyr）を、そのストック（４
℃の５０％ＤＭＳＯ／水中１０μＭのイマゼタピル）の
５μＬを用いて、各プレートに塗布する。これらのプレ
ートを３７℃で一晩培養した後、これらの対抗するプレ
ート上の阻害ゾーンを比較する試験を行う。活性を示す
化合物（即ちＡＨＡＳ活性を阻害する化合物）は、その
逆転プレート上よりも試験プレート上の方により大きな
阻害ゾーンを示す。
【００６８】スクリーニング結果 １００倍希釈した後のＳＣ２／ＡＣ２０１一晩培養物が
示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３７
℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレ
ートは、完全集密したＳＣ２／ＡＣ２０１増殖を示して
いる。正の除草剤対照であるイマゼタピルが示す増殖阻
害ゾーンは約１０ｍｍである。
示す吸収（ＯＤ600）は約１．０±０．１である。３７
℃で一晩増殖させた後、上に記述した如く調製したプレ
ートは、完全集密したＳＣ２／ＡＣ２０１増殖を示して
いる。正の除草剤対照であるイマゼタピルが示す増殖阻
害ゾーンは約１０ｍｍである。
【００６９】１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる、
実施例１の表ＩＶに挙げる２３種の抗菌化合物（これら
のいずれも、ＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を
示さない）を対照として用いて、ＳＣ２／ＡＣ２０１の
増殖阻害に関する試験を行う。試験したこれらの化合物
のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用
を受けない。言い換えれば、これらの化合物のいずれ
も、試験プレートを逆転プレートと比較した時、増殖に
関して差別的効果を示さない。
実施例１の表ＩＶに挙げる２３種の抗菌化合物（これら
のいずれも、ＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を
示さない）を対照として用いて、ＳＣ２／ＡＣ２０１の
増殖阻害に関する試験を行う。試験したこれらの化合物
のいずれも、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用
を受けない。言い換えれば、これらの化合物のいずれ
も、試験プレートを逆転プレートと比較した時、増殖に
関して差別的効果を示さない。
【００７０】上に挙げた抗菌化合物に加えて、多様な天
然産物である抗生物質を代表する化合物の一団を、ＳＣ
２／ＡＣ２０１に対して試験した。実施例１の表Ｖを参
照のこと。この挙げた化合物のいずれも、イソロイシン
およびバリンによる拮抗作用を受けない。
然産物である抗生物質を代表する化合物の一団を、ＳＣ
２／ＡＣ２０１に対して試験した。実施例１の表Ｖを参
照のこと。この挙げた化合物のいずれも、イソロイシン
およびバリンによる拮抗作用を受けない。
【００７１】 表ＩＶ −− 試験した抗菌化合物 化合物 Ａｍｔ／盤 カナマイシン（Kanamycin） ３０μｇ ニトロフラントイン（Nitrofurantoin） ３０μｇ ナリジクス酸（Nalidixic Acid） ３０μｇ ゲンタマイシン（Gentamycin） １０μｇ セフォキシチン（Cefoxitin） ３０μｇ クリンダマイシン（Clindamycin） ２μｇ スルフィソキサゾール（Sulfisoxazole） ２ｍｇ トリメトプリム（Trimethoprim） ５μｇ クロラムフェニコール（Chloramphenicol） ３０μｇ トリプルサルファ（Triple Sulfa） １ｍｇ アンピシリン（Ampicillin） １０μｇ リンコマイシン（Lincomycin） ２μｇ ポリミキシンＢ（Polymixin B） ３００Ｕ セファマンドール（Cefamandole） ３０μｇ ノボビオシン（Novobiocin） ３０μｇ セファロリジン（Cephaloridine） ３０μｇ コリスチン（Colistin） １０μｇ エリスロマイシン（Erythromycin） １５μｇ アミカシン（Amikacin） ３０μｇ テトラサイクリン（Tetracycline） ３０μｇ ペニシリン（Penicillin） １０Ｕ バンコマイシン（Vancomycin） ３０ｍｇ 表Ｖ −− 天然産物である抗生物質化合物 フェナジンアルファ−ＣＯＯＨ（Phenazine Alpha-COO
H） テレイックアシッド（Terric Acid） カルブラリン（Curvularin） ミトマイシンＡ（Mitomycin A） カルダリオマイシン（Caldariomycin） ４−デジメチルアミノ−４−メチルアミノ−アンヒドロ
テトラシクリン バリノマイシン（Valinomycin）／ミチシド（Miticid
e） ブラスチシジン”Ｓ”（Blasticidin "S"） アクチチアジックアシッド（Actithiazic Acid）／ミコ
バシジン（Mycobacidin） フレノリシン（Frenolicin）（ＡＣ８６０アルファ） グリセオフルビン（Griseofulvin）、−５−ＯＨ パリタンチン（Palitantin） アスパルトシン（Aspartocin）、Ｎａ塩 抗生物質Ｚ−１２２０Ａ＃３ クラシンアセテート（Crassin Acetate） 抗生物質ＢＬ５８０アルファ 抗生物質ＢＭ７８２アルファ−１ 抗生物質Ｃ２３０２４アルファ 抗生物質Ｃ０８０７８アルファ アヴィラマイシン（Avilamycin） 抗生物質Ｄ４９１９４アルファ 抗生物質Ｄ４９１９４ベータ−１ 抗生物質Ｆ２８２４９オメガ オーレオチン（Aureothin） パロモマイシン（Paromomycin）、スルフェート クラバシン（Clavacin）／パツリン（Patuli） コプラゲンＩ（Copragen I） カスガマイシン（Kasugamycin） クロラムフェニコール（Chloramphenicol） バシトラシン（Bacitracin） ポリミキシン（Polymyxin）−Ｂ−ＳＯ４ ビオマイシン（Viomycin）、スルフェート 抗生物質Ｅ１９０８５アルファ Ｄ４２０６７アルファ 抗生物質Ｆ２８２４９アルファ 抗生物質Ｅ１９０２０アルファ 抗生物質Ｆ４２２４８アルファ サイクロセリン（Cycloserine） イソキノシクリン（Isoquinocycline）ＨＣｌ（ＡＡ５
７５ガンマ） モキシデクチン（Moxidectin） リンコマイシン（Lincomycin）ＨＣｌ 抗生物質Ａ０３４１ベータ、塩酸塩 ストレプトグラミン（Streptogramin）／ベルチマイシ
ン（Vertimycin） モナゾマイシン（Monazomycin） 抗生物質ＡＣ５４１、スルフェート 抗生物質Ａ１５３１ アングストマイシン（Angustmycin） エタマイシン（Etamycin）、Ｎａ塩 抗生物質Ｂ０２９６４コンプレックス モシマイシン（Mocimycin） 抗生物質Ａ７３６３ 抗生物質Ａ９５３７ アクチノマイシンクルード（Actinomycin Crude） レボマイシン（Levomycin） 抗生物質ＡＭ３７４ ＃２２ アンチプロトゾイン（Antiprotozoin）／アンチプロト
ゾイン（Antiprotozoin） フサリニックアシッド（Fusarinic Acid） 抗生物質Ａ４８２５ 抗生物質Ｖ２４１Ｗ 抗生物質Ｖ２１４Ｘ レロマイシン（Relomycin）、ＬＬ−ＡＭ６８４ベータ アンフォマイシン（Amphomysin）、Ｃａ ノボビオシン（Novobiocin） ヒグロマイシンＡ（Hygromycin A） プロマイシン アミノヌクレオシド（Puromycin Aminonu
cleoside） プロマイシン（Puromycin）ＨＣｌ ヌクレオシジン（Nucleocidin） 抗生物質ＢＰ１２アルファ ロイカニシジン（Leucanicidin） 抗生物質ＢＭ１２３アルファ、ＳＯ４ デクロマイシン（Declomycin）ＨＣｌ ギベレリックアシッド（Gibberellic Acid） アラゾペプチン（Alazopeptin） ニスタチン（Nystatin） カルボマイシン（Carbomycin） ノシヘプチド（Nosiheptide） ネトロプシン（Netropsin）、ＨＣｌ アボパルシン（Avoparcin）、スルフェート ミコルホジン（Mycorhodin） 抗生物質Ｃ１９００４アルファ ボトロマイシン（Bottromycin） 抗生物質ＡＦ２８３アルファ 抗生物質ＡＦ２８３ベータ レモノマイシン（Lemonomycin） 抗生物質ＢＯ４０６８ センフォロマイシン（Senfolomycin）（ＲＡ６９５０ベ
ータ−Ａ） 抗生物質ＲＡ６９５０ベータ−Ｂ 抗生物質１５Ｅ０３８アルファ ノナクチン（Nonactin）（ＡＥ４０９ガンマ） 抗生物質ＡＭ３１ベータ＆ガンマ ロイコマイシン（Leucomycin） ウスニックアシッド（Usnic Acid） ニュートラムシン（Neutramcin） シトリニン（Citrinin） ゲルダマイシン（Geldamycin） 抗生物質ＢＭ１２３ガンマ、ＨＣｌ実施例３ − イミダゾリドン耐性を示す形態のアセト
ヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に
関する機構を基としたスクリーニング 材料および方法 イミダゾリドン耐性を示す形態の植物アセトヒドロキシ
アシッドシンターゼの阻害剤のためのスクリーニングで
用いるには、実施例２に記述した大腸菌株ＳＣ２が適当
な株である。この株は、ｌｅｕＢ、ｉｌｖＩＨおよびｉ
ｌｖＢに関する欠失を含んでいると共に、不活性なｉｌ
ｖＧＭ座位を含んでいる。加うるに、この菌株は、上昇
した透過率変異、即ちｉｍｐを有している。この株のよ
り詳細な記述に関しては実施例２を参照のこと。
H） テレイックアシッド（Terric Acid） カルブラリン（Curvularin） ミトマイシンＡ（Mitomycin A） カルダリオマイシン（Caldariomycin） ４−デジメチルアミノ−４−メチルアミノ−アンヒドロ
テトラシクリン バリノマイシン（Valinomycin）／ミチシド（Miticid
e） ブラスチシジン”Ｓ”（Blasticidin "S"） アクチチアジックアシッド（Actithiazic Acid）／ミコ
バシジン（Mycobacidin） フレノリシン（Frenolicin）（ＡＣ８６０アルファ） グリセオフルビン（Griseofulvin）、−５−ＯＨ パリタンチン（Palitantin） アスパルトシン（Aspartocin）、Ｎａ塩 抗生物質Ｚ−１２２０Ａ＃３ クラシンアセテート（Crassin Acetate） 抗生物質ＢＬ５８０アルファ 抗生物質ＢＭ７８２アルファ−１ 抗生物質Ｃ２３０２４アルファ 抗生物質Ｃ０８０７８アルファ アヴィラマイシン（Avilamycin） 抗生物質Ｄ４９１９４アルファ 抗生物質Ｄ４９１９４ベータ−１ 抗生物質Ｆ２８２４９オメガ オーレオチン（Aureothin） パロモマイシン（Paromomycin）、スルフェート クラバシン（Clavacin）／パツリン（Patuli） コプラゲンＩ（Copragen I） カスガマイシン（Kasugamycin） クロラムフェニコール（Chloramphenicol） バシトラシン（Bacitracin） ポリミキシン（Polymyxin）−Ｂ−ＳＯ４ ビオマイシン（Viomycin）、スルフェート 抗生物質Ｅ１９０８５アルファ Ｄ４２０６７アルファ 抗生物質Ｆ２８２４９アルファ 抗生物質Ｅ１９０２０アルファ 抗生物質Ｆ４２２４８アルファ サイクロセリン（Cycloserine） イソキノシクリン（Isoquinocycline）ＨＣｌ（ＡＡ５
７５ガンマ） モキシデクチン（Moxidectin） リンコマイシン（Lincomycin）ＨＣｌ 抗生物質Ａ０３４１ベータ、塩酸塩 ストレプトグラミン（Streptogramin）／ベルチマイシ
ン（Vertimycin） モナゾマイシン（Monazomycin） 抗生物質ＡＣ５４１、スルフェート 抗生物質Ａ１５３１ アングストマイシン（Angustmycin） エタマイシン（Etamycin）、Ｎａ塩 抗生物質Ｂ０２９６４コンプレックス モシマイシン（Mocimycin） 抗生物質Ａ７３６３ 抗生物質Ａ９５３７ アクチノマイシンクルード（Actinomycin Crude） レボマイシン（Levomycin） 抗生物質ＡＭ３７４ ＃２２ アンチプロトゾイン（Antiprotozoin）／アンチプロト
ゾイン（Antiprotozoin） フサリニックアシッド（Fusarinic Acid） 抗生物質Ａ４８２５ 抗生物質Ｖ２４１Ｗ 抗生物質Ｖ２１４Ｘ レロマイシン（Relomycin）、ＬＬ−ＡＭ６８４ベータ アンフォマイシン（Amphomysin）、Ｃａ ノボビオシン（Novobiocin） ヒグロマイシンＡ（Hygromycin A） プロマイシン アミノヌクレオシド（Puromycin Aminonu
cleoside） プロマイシン（Puromycin）ＨＣｌ ヌクレオシジン（Nucleocidin） 抗生物質ＢＰ１２アルファ ロイカニシジン（Leucanicidin） 抗生物質ＢＭ１２３アルファ、ＳＯ４ デクロマイシン（Declomycin）ＨＣｌ ギベレリックアシッド（Gibberellic Acid） アラゾペプチン（Alazopeptin） ニスタチン（Nystatin） カルボマイシン（Carbomycin） ノシヘプチド（Nosiheptide） ネトロプシン（Netropsin）、ＨＣｌ アボパルシン（Avoparcin）、スルフェート ミコルホジン（Mycorhodin） 抗生物質Ｃ１９００４アルファ ボトロマイシン（Bottromycin） 抗生物質ＡＦ２８３アルファ 抗生物質ＡＦ２８３ベータ レモノマイシン（Lemonomycin） 抗生物質ＢＯ４０６８ センフォロマイシン（Senfolomycin）（ＲＡ６９５０ベ
ータ−Ａ） 抗生物質ＲＡ６９５０ベータ−Ｂ 抗生物質１５Ｅ０３８アルファ ノナクチン（Nonactin）（ＡＥ４０９ガンマ） 抗生物質ＡＭ３１ベータ＆ガンマ ロイコマイシン（Leucomycin） ウスニックアシッド（Usnic Acid） ニュートラムシン（Neutramcin） シトリニン（Citrinin） ゲルダマイシン（Geldamycin） 抗生物質ＢＭ１２３ガンマ、ＨＣｌ実施例３ − イミダゾリドン耐性を示す形態のアセト
ヒドロキシアシッドシンターゼ（ＡＨＡＳ）の阻害剤に
関する機構を基としたスクリーニング 材料および方法 イミダゾリドン耐性を示す形態の植物アセトヒドロキシ
アシッドシンターゼの阻害剤のためのスクリーニングで
用いるには、実施例２に記述した大腸菌株ＳＣ２が適当
な株である。この株は、ｌｅｕＢ、ｉｌｖＩＨおよびｉ
ｌｖＢに関する欠失を含んでいると共に、不活性なｉｌ
ｖＧＭ座位を含んでいる。加うるに、この菌株は、上昇
した透過率変異、即ちｉｍｐを有している。この株のよ
り詳細な記述に関しては実施例２を参照のこと。
【００７２】イミダゾリドン耐性を示すＡＨＡＳ遺伝子
によるＳＣ２のＡＨＡＳ欠乏の補完により、ロイシン
（ｌｅｕＢ変異で必要とされている）のみを補った最小
培地上でその菌株が増殖することが可能になる。ＳＣ２
内のＡＨＡＳ欠乏を補完する目的で用いた変異ＡＨＡＳ
遺伝子を、例えば容易に利用できる細菌発現プラスミド
内でクローン化するか或はサブクローン化する。
によるＳＣ２のＡＨＡＳ欠乏の補完により、ロイシン
（ｌｅｕＢ変異で必要とされている）のみを補った最小
培地上でその菌株が増殖することが可能になる。ＳＣ２
内のＡＨＡＳ欠乏を補完する目的で用いた変異ＡＨＡＳ
遺伝子を、例えば容易に利用できる細菌発現プラスミド
内でクローン化するか或はサブクローン化する。
【００７３】このスクリーニングにおける試験および逆
転プレートで用いた培地は、植物ＡＨＡＳの阻害剤に関
するスクリーニングで記述した実施例２に記述したのと
同じである。その方法もまた実施例２に記述したのと同
じであるが、但し、ＡＨＡＳ活性は欠乏しているがイミ
ダゾリドン耐性植物ＡＨＡＳ遺伝子によってその変異が
補完される変異細菌株（例えば菌株ＳＣ２／ＡＣ１５
２）の一晩培養物をその試験および逆転プレートに接種
する。
転プレートで用いた培地は、植物ＡＨＡＳの阻害剤に関
するスクリーニングで記述した実施例２に記述したのと
同じである。その方法もまた実施例２に記述したのと同
じであるが、但し、ＡＨＡＳ活性は欠乏しているがイミ
ダゾリドン耐性植物ＡＨＡＳ遺伝子によってその変異が
補完される変異細菌株（例えば菌株ＳＣ２／ＡＣ１５
２）の一晩培養物をその試験および逆転プレートに接種
する。
【００７４】スクリーニング結果 １００倍希釈した後のＳＣ２／ＡＣ１５２一晩培養物が
示す吸収（ＯＤ600）は約０．９５０±０．０７であ
る。３７℃で一晩増殖させた後、実施例２および上に記
述した如く調製したプレートは、完全集密したＳＣ２／
ＡＣ１５２増殖を示している。
示す吸収（ＯＤ600）は約０．９５０±０．０７であ
る。３７℃で一晩増殖させた後、実施例２および上に記
述した如く調製したプレートは、完全集密したＳＣ２／
ＡＣ１５２増殖を示している。
【００７５】ＢＢＬから得られる２３種の抗菌化合物
（実施例１の表ＩＶに挙げる）（これらのいずれも、野
生型植物のＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を示
さない）を用いて、ＳＣ２／ＡＣ１５２を試験する。こ
れらの化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンに
よる拮抗作用を受けない。表ＩＶに挙げた抗菌化合物に
加えて、多様な天然産物である抗生物質を代表する化合
物の一団を、ＳＣ２／ＡＣ１５２に対して試験した。実
施例１の表Ｖを参照のこと。この挙げた化合物のいずれ
も、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けな
い。
（実施例１の表ＩＶに挙げる）（これらのいずれも、野
生型植物のＡＨＡＳ活性を阻害することによる活性を示
さない）を用いて、ＳＣ２／ＡＣ１５２を試験する。こ
れらの化合物のいずれも、イソロイシンおよびバリンに
よる拮抗作用を受けない。表ＩＶに挙げた抗菌化合物に
加えて、多様な天然産物である抗生物質を代表する化合
物の一団を、ＳＣ２／ＡＣ１５２に対して試験した。実
施例１の表Ｖを参照のこと。この挙げた化合物のいずれ
も、イソロイシンおよびバリンによる拮抗作用を受けな
い。
【００７６】実施例４ − ３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプツロソネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シ
ンターゼの阻害剤に関する機構を基としたスクリーニン
グ 材料および方法 大腸菌株ＨＥ６２８は、ａｒｏＦ（チロシン抑制性ＤＡ
ＨＰシンターゼ）、ａｒｏＧ（フェニルアラニン抑制性
ＤＡＨＰシンターゼ）およびｔｙｒＡ（コリスメートム
ターゼ（chorismate mutase）／プレフェネート（preph
enate）デヒドロゲナーゼ）に関する欠失を含んでいる
（Garner, C.C.およびK.M. Herrmann (1985) J. Biol.
Chem. 260:3820-3825）。これらの細胞は、増殖に関し
てチロシンを要求するが、トリプトファンによるａｒｏ
Ｈ（トリプトファン抑制性を示すＤＡＨＰシンターゼ）
のフィードバック阻害のため、チロシンとトリプトファ
ンを４０μｇ／ｍＬ補った最小培地上で増殖することは
できない。これらの細胞を、実施例１に記述した如きｉ
ｍｐ表現型を有するようにした。植物ＤＡＨＰシンター
ゼでＨＥ６２８を補完して菌株ＨＥ８２８／ｐＬＷ３−
２１０を生じさせると、これらの細胞はトリプトファン
およびチロシン上で増殖することが可能になる。細菌の
発現プラスミドｐＫＫ２３３−２にクローン化した大腸
菌株およびジャガイモＤＡＨＰシンターゼの供給を、Pu
rdue UniversityのDr. Klaus Herrmannから受けた。こ
の発現プラスミドはｔｒｃキメラ細菌プロモーターの制
御下にあるジャガイモＤＡＨＰシンターゼを含んでいる
低コピー数のプラスミドである。このプラスミドはま
た、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を
有している。
ノ−ヘプツロソネート７−ホスフェート（ＤＡＨＰ）シ
ンターゼの阻害剤に関する機構を基としたスクリーニン
グ 材料および方法 大腸菌株ＨＥ６２８は、ａｒｏＦ（チロシン抑制性ＤＡ
ＨＰシンターゼ）、ａｒｏＧ（フェニルアラニン抑制性
ＤＡＨＰシンターゼ）およびｔｙｒＡ（コリスメートム
ターゼ（chorismate mutase）／プレフェネート（preph
enate）デヒドロゲナーゼ）に関する欠失を含んでいる
（Garner, C.C.およびK.M. Herrmann (1985) J. Biol.
Chem. 260:3820-3825）。これらの細胞は、増殖に関し
てチロシンを要求するが、トリプトファンによるａｒｏ
Ｈ（トリプトファン抑制性を示すＤＡＨＰシンターゼ）
のフィードバック阻害のため、チロシンとトリプトファ
ンを４０μｇ／ｍＬ補った最小培地上で増殖することは
できない。これらの細胞を、実施例１に記述した如きｉ
ｍｐ表現型を有するようにした。植物ＤＡＨＰシンター
ゼでＨＥ６２８を補完して菌株ＨＥ８２８／ｐＬＷ３−
２１０を生じさせると、これらの細胞はトリプトファン
およびチロシン上で増殖することが可能になる。細菌の
発現プラスミドｐＫＫ２３３−２にクローン化した大腸
菌株およびジャガイモＤＡＨＰシンターゼの供給を、Pu
rdue UniversityのDr. Klaus Herrmannから受けた。こ
の発現プラスミドはｔｒｃキメラ細菌プロモーターの制
御下にあるジャガイモＤＡＨＰシンターゼを含んでいる
低コピー数のプラスミドである。このプラスミドはま
た、アンピシリンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を
有している。
【００７７】グリセロールストック（−８０℃に貯蔵し
た）から出発させるか或はＭ９ＡＴＴプレートからの単
一コロニーから出発させた５０ｍＬのＭ９ＡＴＴ液体培
地中３７℃で、振とうしながら、大腸菌細胞（ＨＥ６２
８／ｐＬＷ３−２１０）の一晩培養物を増殖させる。Ｍ
９ＡＴＴ寒天で構成されている試験プレート、およびＭ
９ＡＴＴＦ寒天で構成されている逆転プレートを下記の
如く調製する。
た）から出発させるか或はＭ９ＡＴＴプレートからの単
一コロニーから出発させた５０ｍＬのＭ９ＡＴＴ液体培
地中３７℃で、振とうしながら、大腸菌細胞（ＨＥ６２
８／ｐＬＷ３−２１０）の一晩培養物を増殖させる。Ｍ
９ＡＴＴ寒天で構成されている試験プレート、およびＭ
９ＡＴＴＦ寒天で構成されている逆転プレートを下記の
如く調製する。
【００７８】培地： 完成したＭ９ＡＴＴ液体： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ９７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間オートクレーブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン １．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−トリプトファンおよ
びＬ−チロシン 完成したＭ９ＡＴＴ寒天： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ４７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン １．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−トリプトファンおよ
びＬ−チロシン 完成したＭ９ＡＴＴＦ寒天：上述した如くＭ９ＡＴＴ培
地を製造。
びＬ−チロシン 完成したＭ９ＡＴＴ寒天： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ４７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン １．６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−トリプトファンおよ
びＬ−チロシン 完成したＭ９ＡＴＴＦ寒天：上述した如くＭ９ＡＴＴ培
地を製造。
【００７９】他のものをボトル１に添加すると共に１．
６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−フェニルアラニンを加え
る。
６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ Ｌ−フェニルアラニンを加え
る。
【００８０】試験プレート： １． Ｍ９ＡＴＴボトル１と２（溶融）を一緒にするこ
とで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
とで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００８１】２． ５０℃に冷却する。
【００８２】３． ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一晩
培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００８３】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００８４】逆転プレート： １． Ｍ９ＡＴＴＦボトル１と２（溶融）を一緒にする
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
ことで、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【００８５】２． ５０℃に冷却する。
【００８６】３． ＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一晩
培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
培養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【００８７】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
トレー（カタログ番号MS12450）の各々に１５０ｍＬ注
ぎ込む。
【００８８】これらのプレート内の培地を固化させた
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１
２ｘ１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プ
レートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。
これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの
対抗する試験および逆転プレート上の阻害ゾーンを比較
する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレー
ト上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーン
を示す。
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個、１
２ｘ１２列、直径５ｍｍ）内の該試験プレートと逆転プ
レートの両方に試験サンプル（２５μＬ）を塗布する。
これらのプレートを３７℃で一晩培養した後、これらの
対抗する試験および逆転プレート上の阻害ゾーンを比較
する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プレー
ト上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾーン
を示す。
【００８９】スクリーニング結果 １００倍希釈した後のＨＥ６２８／ｐＬＷ３−２１０一
晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約１．２１±０．０
４である。３７℃で一晩増殖させた後、上に記述した如
く調製したプレートは、完全集密したＨＥ６２８／ｐＬ
Ｗ３−２１０増殖を示している。
晩培養物が示す吸収（ＯＤ600）は約１．２１±０．０
４である。３７℃で一晩増殖させた後、上に記述した如
く調製したプレートは、完全集密したＨＥ６２８／ｐＬ
Ｗ３−２１０増殖を示している。
【００９０】１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる、
２３種の抗菌化合物（ＤＡＨＰシンターゼの阻害を含ま
ない公知様式の作用を示す）を対照として用いて、ＨＥ
６２８／ｐＬＷ３−２１０を試験する。実施例１の表Ｉ
Ｖを参照のこと。試験したこれらの化合物のいずれも、
フェニルアラニンによる拮抗作用を受けない。
２３種の抗菌化合物（ＤＡＨＰシンターゼの阻害を含ま
ない公知様式の作用を示す）を対照として用いて、ＨＥ
６２８／ｐＬＷ３−２１０を試験する。実施例１の表Ｉ
Ｖを参照のこと。試験したこれらの化合物のいずれも、
フェニルアラニンによる拮抗作用を受けない。
【００９１】加うるに、多様な天然産物である抗生物質
および種々の化学的構造を代表する化合物の一団を、Ｈ
Ｅ６２８／ｐＬＷ３−２１０に対して試験した。実施例
１の表Ｖを参照のこと。これらの化合物が示す効果のい
ずれも、フェニルアラニンによる拮抗作用を受けなかっ
た。
および種々の化学的構造を代表する化合物の一団を、Ｈ
Ｅ６２８／ｐＬＷ３−２１０に対して試験した。実施例
１の表Ｖを参照のこと。これらの化合物が示す効果のい
ずれも、フェニルアラニンによる拮抗作用を受けなかっ
た。
【００９２】実施例５ − ジヒドロジピコリネートシ
ンターゼ（ＤＨＰＳ）の阻害剤に関する機構を基とした
スクリーニング 材料および方法 大腸菌株ＡＴ９９７（Yeh, P.、 Sicard, A.M.およびA.
J. Sinskey (1988)、 Mol. Gen. Genet. 212:105ー111）
は、ｄａｐＡ遺伝子内の変異が原因でＤＨＰＳ活性が欠
如している。その結果として、この菌株の増殖にはジア
ミノピメリン酸が必要である。この欠乏は、細胞壁の生
合成でもジアミノピメレートが必要とされていることか
ら、リジンでは補完されない。従って、このスクリーニ
ングは、最小培地ではなく豊富なブロス上で行われ得
る。この菌株はまた、ｉｍｐ変異を有しており、その結
果として増大した膜透過性を示す。ｉｍｐ株の構築に関
しては実施例１に記述してある。この菌株におけるｄａ
ｐＡ遺伝子内の遺伝的欠陥を、プラスミドｐＺＭＤＨＰ
Ｓ５（Frisch, D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.
およびD.A. Somers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287
-293）、即ちｌａｃプロモーター制御下のＤＨＰＳのた
めのトウモロコシｃＤＮＡを含んでいるｐＵＣ１９ベク
ターでこの菌株を形質転換することによって補完した。
ｐＺＭＤＨＰＳ５はまた、アンピシリンに対する耐性の
ためのｂｌａ遺伝子も有している。このｐＺＭＤＨＰＳ
５プラスミドを有する変異大腸菌株をＤＨＰＳ／ＡＴ９
９７と表示した。
ンターゼ（ＤＨＰＳ）の阻害剤に関する機構を基とした
スクリーニング 材料および方法 大腸菌株ＡＴ９９７（Yeh, P.、 Sicard, A.M.およびA.
J. Sinskey (1988)、 Mol. Gen. Genet. 212:105ー111）
は、ｄａｐＡ遺伝子内の変異が原因でＤＨＰＳ活性が欠
如している。その結果として、この菌株の増殖にはジア
ミノピメリン酸が必要である。この欠乏は、細胞壁の生
合成でもジアミノピメレートが必要とされていることか
ら、リジンでは補完されない。従って、このスクリーニ
ングは、最小培地ではなく豊富なブロス上で行われ得
る。この菌株はまた、ｉｍｐ変異を有しており、その結
果として増大した膜透過性を示す。ｉｍｐ株の構築に関
しては実施例１に記述してある。この菌株におけるｄａ
ｐＡ遺伝子内の遺伝的欠陥を、プラスミドｐＺＭＤＨＰ
Ｓ５（Frisch, D.A.、 Tommey, A.M.、 Gegenbach, B.G.
およびD.A. Somers (1991)、 Mol. Gen. Genet. 228:287
-293）、即ちｌａｃプロモーター制御下のＤＨＰＳのた
めのトウモロコシｃＤＮＡを含んでいるｐＵＣ１９ベク
ターでこの菌株を形質転換することによって補完した。
ｐＺＭＤＨＰＳ５はまた、アンピシリンに対する耐性の
ためのｂｌａ遺伝子も有している。このｐＺＭＤＨＰＳ
５プラスミドを有する変異大腸菌株をＤＨＰＳ／ＡＴ９
９７と表示した。
【００９３】ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７大腸菌細胞の一晩培
養物を単一コロニーからか或はグリセロールストック
（−８０℃に貯蔵した）から出発させた後、３７℃の５
０ｍＬＬＢＡ（Luria Broth Base）中で振とうしながら
増殖させる。
養物を単一コロニーからか或はグリセロールストック
（−８０℃に貯蔵した）から出発させた後、３７℃の５
０ｍＬＬＢＡ（Luria Broth Base）中で振とうしながら
増殖させる。
【００９４】ＬＢＡ寒天から成る試験プレート、および
ＬＢＡＤａｐ寒天から成る逆転プレートを下記の如く調
製した。
ＬＢＡＤａｐ寒天から成る逆転プレートを下記の如く調
製した。
【００９５】培地： ＬＢＡ： ２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末 １Ｌの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬを
オートクレーブ 冷却した時点で、各ボトルに０．５ｍＬの１００ｍｇ／
ｍＬアンピシリンストックを加える。
オートクレーブ 冷却した時点で、各ボトルに０．５ｍＬの１００ｍｇ／
ｍＬアンピシリンストックを加える。
【００９６】ＬＢＡ寒天： ２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末 １５ｇのBacto寒天 １Ｌの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬを
オートクレーブ プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１
００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックを加える。
オートクレーブ プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１
００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックを加える。
【００９７】ＬＢＡａｐ寒天： ２５ｇのGIBCO／ＢＲＬ Luria Broth Base粉末 １５ｇのBacto寒天 １Ｌの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中の５００ｍＬを
オートクレーブ プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１
００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックと２５ｍｇのＤ，
Ｌ−α，ε−ジアミノピメリン酸（Sigma）を加える。
オートクレーブ プレートに注ぐに先立って、各ボトルに０．５ｍＬの１
００ｍｇ／ｍＬアンピシリンストックと２５ｍｇのＤ，
Ｌ−α，ε−ジアミノピメリン酸（Sigma）を加える。
【００９８】試験プレート： １． ５００ｍＬのＬＢＡ寒天、溶融。
【００９９】２． ５０℃に冷却する。
【０１００】３． 各ボトルにＤＨＰＳ／ＡＴ９９７一
晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
【０１０１】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１０２】逆転プレート： １． ５００ｍＬのＬＢＡａｐ寒天、溶融。
【０１０３】２． ５０℃に冷却する。
【０１０４】３． 各ボトルにＤＨＰＳ／ＡＴ９９７一
晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
晩培養物（ＯＤ600＝１）を５ｍＬ加える。
【０１０５】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１０６】これらのプレート上の培地を固化させた
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウ
エル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試
験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５
μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培
養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを
比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プ
レート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾ
ーンを示す。
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウ
エル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試
験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５
μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培
養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを
比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プ
レート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾ
ーンを示す。
【０１０７】スクリーニング結果 上述した如く培養したＬＢＡ中のＤＨＰＳ／ＡＴ９９７
一晩培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±
０．１１である。３７℃で一晩培養した後、記述した如
く調製したプレートは、集密したＤＨＰＳ／ＡＴ９９７
増殖を示している。
一晩培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±
０．１１である。３７℃で一晩培養した後、記述した如
く調製したプレートは、集密したＤＨＰＳ／ＡＴ９９７
増殖を示している。
【０１０８】１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる１
組の標準抗菌化合物を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７に対して
試験する。実施例１の表ＩＶを参照のこと。これらの化
合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗作用を
受けない。加うるに、多様な抗生物質および化学品を代
表する天然産物化合物の一団を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７
に対して試験する。実施例１の表Ｖを参照のこと。これ
らの化合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗
作用を受けない。
組の標準抗菌化合物を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７に対して
試験する。実施例１の表ＩＶを参照のこと。これらの化
合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗作用を
受けない。加うるに、多様な抗生物質および化学品を代
表する天然産物化合物の一団を、ＤＨＰＳ／ＡＴ９９７
に対して試験する。実施例１の表Ｖを参照のこと。これ
らの化合物のいずれも、ジアミノピメリン酸による拮抗
作用を受けない。
【０１０９】実施例６ − ホスホリボシルアントラニ
レートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の阻害剤に関する
機構を基としたスクリーニング 材料および方法 E. coli Genetics Stock Center、 Yale Universityから
入手した大腸菌株ｔｒｐＤ９９２３は、ｔｒｐＤ遺伝子
内に変異を有することから、ＰＡＴ活性が欠乏してい
る。この菌株は増殖に関してトリプトファンを要求す
る。この遺伝的欠乏は、Dr. Rob Last（Boyce Tompson
Institute）から入手したプラスミドｐＡＣＴ１３でこ
のｔｒｐＤ大腸菌株を形質転換することによって補完さ
れた。ｐＡＣＴ１３は、ｌａｃプロモーター制御下のＰ
ＡＴのためのアラビドプシスｃＤＮＡを含んでいるλＹ
ＥＳベクターである（Rose, A.B.他、 Plant Physiol. 1
00:582-592 (1992)）。このＰＡＴ遺伝子を有する変異
大腸菌株はまた、膜透過性を増大させるためのｉｍｐ変
異を包含するように修飾されている（実施例１により詳
しく記述してある）。ｐＡＣＴ１３はまた、アンピシリ
ンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を含んでいる。こ
のｐＡＣＴ１３プラスミドを有する変異大腸菌株をＰＡ
Ｔ／ｔｒｐＤと表示した。
レートトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）の阻害剤に関する
機構を基としたスクリーニング 材料および方法 E. coli Genetics Stock Center、 Yale Universityから
入手した大腸菌株ｔｒｐＤ９９２３は、ｔｒｐＤ遺伝子
内に変異を有することから、ＰＡＴ活性が欠乏してい
る。この菌株は増殖に関してトリプトファンを要求す
る。この遺伝的欠乏は、Dr. Rob Last（Boyce Tompson
Institute）から入手したプラスミドｐＡＣＴ１３でこ
のｔｒｐＤ大腸菌株を形質転換することによって補完さ
れた。ｐＡＣＴ１３は、ｌａｃプロモーター制御下のＰ
ＡＴのためのアラビドプシスｃＤＮＡを含んでいるλＹ
ＥＳベクターである（Rose, A.B.他、 Plant Physiol. 1
00:582-592 (1992)）。このＰＡＴ遺伝子を有する変異
大腸菌株はまた、膜透過性を増大させるためのｉｍｐ変
異を包含するように修飾されている（実施例１により詳
しく記述してある）。ｐＡＣＴ１３はまた、アンピシリ
ンに対する耐性のためのｂｌａ遺伝子を含んでいる。こ
のｐＡＣＴ１３プラスミドを有する変異大腸菌株をＰＡ
Ｔ／ｔｒｐＤと表示した。
【０１１０】単一のコロニーからか或はグリセロールス
トック（−８０℃に貯蔵した）からＰＡＴ／ｔｒｐＤ大
腸菌細胞の一晩培養物を開始させた後、５０ｍＬのＭ９
Ａ中３７℃で振とうしながら増殖させる。Ｍ９Ａ寒天か
ら成る試験プレート、およびＭ９ＡＷ寒天から成る逆転
プレートを下記の如く調製する。
トック（−８０℃に貯蔵した）からＰＡＴ／ｔｒｐＤ大
腸菌細胞の一晩培養物を開始させた後、５０ｍＬのＭ９
Ａ中３７℃で振とうしながら増殖させる。Ｍ９Ａ寒天か
ら成る試験プレート、およびＭ９ＡＷ寒天から成る逆転
プレートを下記の如く調製する。
【０１１１】培地： 完成したＭ９Ａ液体： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ９７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間オートクレーブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン 完成したＭ９Ａ寒天： ボトル１： １０ｇのＭ９ベース粉末（GIBCO） ４７０ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン 完成したＭ９ＡＷ寒天：上述した如くＭ９Ａ培地を製
造。
ブ ボトル２： １５ｇのＤＩＦＣＯ寒天 ５００ｍＬの蒸留水 ２０＃で３０分間１リットルのボトル中でオートクレー
ブ 使用前のボトル１に下記を添加： １０ｍＬの２０％グルコース １０ｍＬの５％ＮａＣｌ １０ｍＬの０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 １ｍＬの１Ｍ ＭｇＳＯ4 ２．２５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬチアミン ０．７５ｍＬの１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン ２．０ｍＬの５ｍｇ／ｍＬテトラシクリン 完成したＭ９ＡＷ寒天：上述した如くＭ９Ａ培地を製
造。
【０１１２】他のものをボトル１に添加すると共に１．
６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬトリプトファンを加える。
６ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬトリプトファンを加える。
【０１１３】試験プレート： １． Ｍ９Ａボトル１と２（溶融）を一緒にすること
で、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
で、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【０１１４】２． ５０℃に冷却する。
【０１１５】３． 各ボトルにＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩培
養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【０１１６】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１１７】逆転プレート： １． Ｍ９ＡＷボトル１と２（溶融）を一緒にすること
で、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
で、溶融した寒天培地を１リットル調製する。
【０１１８】２． ５０℃に冷却する。
【０１１９】３． 各ボトルにＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩培
養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
養物（ＯＤ600≒１）を１０ｍＬ加える。
【０１２０】４． ９ｘ９インチの無菌Sumilonバイオ
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
トレーの各々に１５０ｍＬ注ぎ込む。
【０１２１】これらのプレート上の培地を固化させた
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウ
エル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試
験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５
μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培
養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを
比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プ
レート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾ
ーンを示す。
後、３０分間乾燥する。サンプルウエル（１４４個のウ
エル／プレート、１２ｘ１２列、直径５ｃｍ）内の該試
験プレートと逆転プレートの両方に試験サンプル（２５
μＬ）を塗布する。これらのプレートを３７℃で一晩培
養した後、これらの対抗するプレート上の阻害ゾーンを
比較する試験を行う。活性を示す化合物は、その逆転プ
レート上よりも試験プレート上の方により大きな阻害ゾ
ーンを示す。
【０１２２】スクリーニング結果 上述した如く培養したＭ９Ａ中のＰＡＴ／ｔｒｐＤ一晩
培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±０．
１４である。３７℃で一晩培養した後、記述した如く調
製したプレートは、集密したＰＡＴ／ｔｒｐＤ増殖を示
している。
培養物が示す６００ｎｍにおける吸収は約１．０±０．
１４である。３７℃で一晩培養した後、記述した如く調
製したプレートは、集密したＰＡＴ／ｔｒｐＤ増殖を示
している。
【０１２３】１／４”の紙盤上のＢＢＬから得られる１
組の標準抗菌化合物（実施例１の表ＩＶ参照）を、ＰＡ
Ｔ／ｔｒｐＤに対して試験する。これらの化合物のいず
れも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。加う
るに、多様な抗生物質および化学品を代表する天然に存
在している化合物の一団を、ＰＡＴ／ｔｒｐＤ（実施例
１の表Ｖを参照）に対して試験する。これらの化合物の
いずれも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。
組の標準抗菌化合物（実施例１の表ＩＶ参照）を、ＰＡ
Ｔ／ｔｒｐＤに対して試験する。これらの化合物のいず
れも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。加う
るに、多様な抗生物質および化学品を代表する天然に存
在している化合物の一団を、ＰＡＴ／ｔｒｐＤ（実施例
１の表Ｖを参照）に対して試験する。これらの化合物の
いずれも、トリプトファンによる拮抗作用を受けない。
【０１２４】更に、多様な発酵培地の集団も試験する。
これらの培地のいずれも、形質転換していないｔｒｐＤ
大腸菌株の増殖を支持せず、またこれらは、ｔｒｐＤま
たはＰＡＴ／ｔｒｐＤ株の増殖も阻害しない。
これらの培地のいずれも、形質転換していないｔｒｐＤ
大腸菌株の増殖を支持せず、またこれらは、ｔｒｐＤま
たはＰＡＴ／ｔｒｐＤ株の増殖も阻害しない。
【０１２５】最後に、標準的除草剤団を代表する種々の
化合物のスクリーニングを行う。（以下の表ＶＩを参
照）。ここに挙げた化合物のいずれも、このスクリーニ
ングでは、活性を示す阻害剤ではない。
化合物のスクリーニングを行う。（以下の表ＶＩを参
照）。ここに挙げた化合物のいずれも、このスクリーニ
ングでは、活性を示す阻害剤ではない。
【０１２６】表ＶＩ −− 除草剤化合物 Ｆ３８１４−５２５パーフルイドン（Perfluidone） ２−０１４−１オキサジアゾン（Oxadiazon） シマジン（Simazine）（ＣＬ１５３９５） ノレア（Norea）（ＣＬ２６０８） モヌロン（Monuron） フェヌロン（Fenuron） プラナビン（Planavin） メフルイジド（Mefluidide） ＣＭＵ（ＣＬ１４２５５） パラクアット（Paraquat） ネブロン（Neburon） マレイン酸ヒドラジド（ＣＬ６３７４） シルベックスアシッド（Silvex Acid）（ＣＬ３５８６
１） ジフェナミド（Diphenamid）（ＣＬ８７４１７） テブツイロン（Tebuthuiron） ノルフルラゾン（Norflurazon） シプロミド（Cypromid） ＣＩＰＣ シデュロン（Siduron） ノルフルラゾン（Norflurazon） ＩＰＣ メフルイジド（Mefluidide）（ＣＬ１１７２０４）、Ｅ
ＭＢＡＲＫ ベネフィン（Benefin） ２，３，５−トリクロロ安息香酸 ＤＡＣＴＨＡＬ デスメジファム（Desmedipham） トリフルラリン（Trifluralin） ＤＤＴ（ＣＬ２０１３） アトラトン（Atratone） コンセプＩＩ（Concep II） プロパジン（Propazine） トリアレート（Triallate） フェンメジファム（Phenmedipham） ビフェノックス（Bifenox） ＰＰＧ８４４ ＣＤＥＣ（Vegedex） ビアラホス（Bialaphos） チオベンカルブ（Thiobencarb）（Bolero tech） イソプロパリン（Isopropalin） プレファー（Prefar） ジアレート（Diallate）（Avadex tech） チラム（Tillam） ＣＤＥＡ（ＣＬ２５２２４） 本分野の技術者は、常規のみの実験を用いることで、こ
こに記述した特定具体例に対する数多くの相当物を認識
するか或は確かめることができるであろう。上記相当物
を請求の範囲に包含させることを意図している。 本発
明の特徴および態様は以下のとうりである。
１） ジフェナミド（Diphenamid）（ＣＬ８７４１７） テブツイロン（Tebuthuiron） ノルフルラゾン（Norflurazon） シプロミド（Cypromid） ＣＩＰＣ シデュロン（Siduron） ノルフルラゾン（Norflurazon） ＩＰＣ メフルイジド（Mefluidide）（ＣＬ１１７２０４）、Ｅ
ＭＢＡＲＫ ベネフィン（Benefin） ２，３，５−トリクロロ安息香酸 ＤＡＣＴＨＡＬ デスメジファム（Desmedipham） トリフルラリン（Trifluralin） ＤＤＴ（ＣＬ２０１３） アトラトン（Atratone） コンセプＩＩ（Concep II） プロパジン（Propazine） トリアレート（Triallate） フェンメジファム（Phenmedipham） ビフェノックス（Bifenox） ＰＰＧ８４４ ＣＤＥＣ（Vegedex） ビアラホス（Bialaphos） チオベンカルブ（Thiobencarb）（Bolero tech） イソプロパリン（Isopropalin） プレファー（Prefar） ジアレート（Diallate）（Avadex tech） チラム（Tillam） ＣＤＥＡ（ＣＬ２５２２４） 本分野の技術者は、常規のみの実験を用いることで、こ
こに記述した特定具体例に対する数多くの相当物を認識
するか或は確かめることができるであろう。上記相当物
を請求の範囲に包含させることを意図している。 本発
明の特徴および態様は以下のとうりである。
【０１２７】１． ａ）微生物株の増殖にさもなくば必
要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖さ
せ得る必須植物産物をコード化する植物遺伝子を微生物
株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その必須植物
遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切で
あるがこの必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微
生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）
その必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物であ
る、植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖さ
せ得る必須植物産物をコード化する植物遺伝子を微生物
株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その必須植物
遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切で
あるがこの必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微
生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）
その必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物であ
る、植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１２８】２． 該必須植物産物をコード化する遺伝
子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェ
ラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物
をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッド
シンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物
産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセター
ゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコ
ード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てま
たは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する
遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全て
または一部をコード化する、第１項記載の方法。
子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェ
ラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物
をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッド
シンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物
産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセター
ゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコ
ード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てま
たは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する
遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全て
または一部をコード化する、第１項記載の方法。
【０１２９】３． ａ）ホスホリボシルアントラニレー
トトランスフェラーゼをコード化する植物遺伝子を発現
する微生物株を、（１）ホスホリボシルアントラニレー
トトランスフェラーゼが欠乏しているか或はアントラニ
レートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファン
のための生合成経路で作り出される化合物が欠乏してい
る状態の微生物株は増殖できないところの、ホスホリボ
シルアントラニレートトランスフェラーゼを発現する微
生物株の増殖にとっては適切であるが、トリプトファ
ン、および他の、アントラニレートシンターゼが触媒す
る反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り
出される化合物、が不足している試験条件、および
（２）トリプトファンか、或は他の、アントラニレート
シンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのため
の生合成経路で作り出される化合物、を含んでいる逆転
条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養
物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ホス
ホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ阻害特
性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、ホスホ
リボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害す
る化合物である、植物ホスホリボシルアントラニレート
トランスフェラーゼを阻害する化合物をスクリーニング
および同定する方法。
トトランスフェラーゼをコード化する植物遺伝子を発現
する微生物株を、（１）ホスホリボシルアントラニレー
トトランスフェラーゼが欠乏しているか或はアントラニ
レートシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファン
のための生合成経路で作り出される化合物が欠乏してい
る状態の微生物株は増殖できないところの、ホスホリボ
シルアントラニレートトランスフェラーゼを発現する微
生物株の増殖にとっては適切であるが、トリプトファ
ン、および他の、アントラニレートシンターゼが触媒す
る反応の後のトリプトファンのための生合成経路で作り
出される化合物、が不足している試験条件、および
（２）トリプトファンか、或は他の、アントラニレート
シンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのため
の生合成経路で作り出される化合物、を含んでいる逆転
条件、の下で維持することにより、試験および逆転培養
物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ホス
ホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ阻害特
性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、ホスホ
リボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害す
る化合物である、植物ホスホリボシルアントラニレート
トランスフェラーゼを阻害する化合物をスクリーニング
および同定する方法。
【０１３０】４． ａ）植物アセトヒドロキシアシッド
シンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株
を、（１）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを
発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセト
ヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微
生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試
験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンタ
ーゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝
鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持するこ
とにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して
試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ア
セトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物で
ある、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害
する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
シンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株
を、（１）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを
発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセト
ヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微
生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試
験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンタ
ーゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝
鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持するこ
とにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して
試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ア
セトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物で
ある、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害
する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３１】５． ａ）植物３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコ
ード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェ
ートシンターゼ、フェニルアラニン、トリプトファンお
よびチロシンが欠乏している状態の微生物株は増殖でき
ないところの、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソネート７−ホスフェートシンターゼを発現する微生物
株の増殖にとっては適切であるが３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ
が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である
試験条件、および（２）フェニルアラニン、トリプトフ
ァンおよびチロシンが含まれている逆転条件、の下で維
持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホ
スフェートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合
物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物３
−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホス
フェートシンターゼを阻害する化合物である、３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェー
トシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび
同定する方法。
ノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコ
ード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）３−デ
オキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェ
ートシンターゼ、フェニルアラニン、トリプトファンお
よびチロシンが欠乏している状態の微生物株は増殖でき
ないところの、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソネート７−ホスフェートシンターゼを発現する微生物
株の増殖にとっては適切であるが３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼ
が欠乏している状態の微生物株の増殖には不適切である
試験条件、および（２）フェニルアラニン、トリプトフ
ァンおよびチロシンが含まれている逆転条件、の下で維
持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホ
スフェートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合
物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物３
−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホス
フェートシンターゼを阻害する化合物である、３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェー
トシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび
同定する方法。
【０１３２】６． ａ）植物グルタミンシンセターゼを
コード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）グル
タミンシンセターゼおよびグルタミン両方が欠乏してい
る状態の微生物株は増殖できないところの、グルタミン
シンセターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切
である、グルタミンが不足している試験条件、および
（２）グルタミンが含まれている逆転条件、の下で維持
することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、グル
タミンシンセターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物
と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物である、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物をスクリーニン
グおよび同定する方法。
コード化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）グル
タミンシンセターゼおよびグルタミン両方が欠乏してい
る状態の微生物株は増殖できないところの、グルタミン
シンセターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切
である、グルタミンが不足している試験条件、および
（２）グルタミンが含まれている逆転条件、の下で維持
することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、グル
タミンシンセターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物
と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物である、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物をスクリーニン
グおよび同定する方法。
【０１３３】７． ａ）植物ジヒドロジピコリネートシ
ンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、
（１）ジヒドロジピコリネートシンターゼおよびジアミ
ノピメリン酸両方が欠乏している状態の微生物株は増殖
できないところの、ジヒドロジピコリネートシンターゼ
を発現する微生物株の増殖にとっては適切である、ジア
ミノピメリン酸が不足している試験条件、および（２）
ジアミノピメリン酸が含まれている逆転条件、の下で維
持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ジヒ
ドロジピコリネートシンターゼ阻害特性に関して試験す
べき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ジ
ヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物であ
る、植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
ンターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、
（１）ジヒドロジピコリネートシンターゼおよびジアミ
ノピメリン酸両方が欠乏している状態の微生物株は増殖
できないところの、ジヒドロジピコリネートシンターゼ
を発現する微生物株の増殖にとっては適切である、ジア
ミノピメリン酸が不足している試験条件、および（２）
ジアミノピメリン酸が含まれている逆転条件、の下で維
持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ジヒ
ドロジピコリネートシンターゼ阻害特性に関して試験す
べき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ジ
ヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物であ
る、植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３４】８． 必須植物産物をコード化する植物遺
伝子の全てまたは一部を発現する能力を有しており、こ
こで、この発現により、この微生物株の増殖にさもなく
ば必要とされる栄養的補足物の存在なしでもこの微生物
株の増殖が可能になるところの、必須植物遺伝子産物を
阻害する化合物の同定で有効な微生物株。
伝子の全てまたは一部を発現する能力を有しており、こ
こで、この発現により、この微生物株の増殖にさもなく
ば必要とされる栄養的補足物の存在なしでもこの微生物
株の増殖が可能になるところの、必須植物遺伝子産物を
阻害する化合物の同定で有効な微生物株。
【０１３５】９． 該必須植物産物をコード化する遺伝
子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェ
ラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物
をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッド
シンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物
産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセター
ゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコ
ード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てま
たは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する
遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全て
または一部をコード化する、第８項記載の微生物株。
子が植物ホスホリボシルアントラニレートトランスフェ
ラーゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物
をコード化する遺伝子が植物アセトヒドロキシアシッド
シンターゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物
産物をコード化する遺伝子が植物グルタミンシンセター
ゼの全てまたは一部をコード化し；該必須植物産物をコ
ード化する遺伝子が植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼの全てま
たは一部をコード化し；該必須植物産物をコード化する
遺伝子が植物ジヒドロジピコリネートシンターゼの全て
または一部をコード化する、第８項記載の微生物株。
【０１３６】１０． ａ）微生物株の増殖にさもなくば
必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖
させ得る必須植物産物をコード化する変異植物遺伝子を
微生物株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、その必須植物遺伝子
産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが
この必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖には不適切である試験条件下で維持することによ
り、その微生物株が増殖している培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している培養物を、野生型
必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生
じさせるに充分な量の、その野生型必須植物遺伝子産物
の阻害剤と接触させ；そして ｄ）その野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤存在下の
（ｂ）に記述した条件下で増殖する微生物細胞を同定す
る；ことを含み、ここで、上記同定した細胞は、その野
生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す
変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である、野生型
植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須
植物遺伝子産物を発現する微生物細胞を同定する方法。
必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖
させ得る必須植物産物をコード化する変異植物遺伝子を
微生物株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、その必須植物遺伝子
産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが
この必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖には不適切である試験条件下で維持することによ
り、その微生物株が増殖している培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している培養物を、野生型
必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生
じさせるに充分な量の、その野生型必須植物遺伝子産物
の阻害剤と接触させ；そして ｄ）その野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤存在下の
（ｂ）に記述した条件下で増殖する微生物細胞を同定す
る；ことを含み、ここで、上記同定した細胞は、その野
生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す
変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である、野生型
植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須
植物遺伝子産物を発現する微生物細胞を同定する方法。
【０１３７】１１． ａ）微生物株の増殖にさもなくば
必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖
させ得る除草剤耐性を示す必須植物産物をコード化する
変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その除草剤耐
性を示す必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖
にとっては適切であるがこの除草剤耐性を示す必須植物
遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不
適切である試験条件、および（２）その除草剤耐性を示
す必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の
増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻
害する化合物である、植物の成長に必要な除草剤耐性を
示す変異必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリ
ーニングおよび同定する方法。
必要とされる栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖
させ得る除草剤耐性を示す必須植物産物をコード化する
変異植物遺伝子を微生物株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その除草剤耐
性を示す必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖
にとっては適切であるがこの除草剤耐性を示す必須植物
遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不
適切である試験条件、および（２）その除草剤耐性を示
す必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の
増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻
害する化合物である、植物の成長に必要な除草剤耐性を
示す変異必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリ
ーニングおよび同定する方法。
【０１３８】１２． ａ）イミダゾリドン耐性を示す植
物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する
植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）イミダゾリド
ン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
を発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセ
トヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の
微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している
試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分
枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持する
ことにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、イミ
ダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシ
ンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触さ
せ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、イミダ
ゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼを阻害する化合物である、イミダゾリドン耐性を
示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害す
る化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
物アセトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する
植物遺伝子を発現する微生物株を、（１）イミダゾリド
ン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
を発現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセ
トヒドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の
微生物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している
試験条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分
枝鎖アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持する
ことにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、イミ
ダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシ
ンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触さ
せ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、イミダ
ゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼを阻害する化合物である、イミダゾリドン耐性を
示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害す
る化合物をスクリーニングおよび同定する方法。
【０１３９】１３． 除草剤耐性を示す必須植物産物の
全てまたは一部をコード化する植物遺伝子を発現する能
力を有しており、ここで、この発現により、この微生物
株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在
なしでもこの微生物株の増殖が可能になるところの、除
草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物の
同定で有効な微生物株。
全てまたは一部をコード化する植物遺伝子を発現する能
力を有しており、ここで、この発現により、この微生物
株の増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在
なしでもこの微生物株の増殖が可能になるところの、除
草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物の
同定で有効な微生物株。
【０１４０】１４． 該除草剤耐性を示す必須植物産物
の全てまたは一部をコード化する遺伝子がイミダゾリド
ン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
の全てまたは一部をコード化する第１３項記載の微生物
株。
の全てまたは一部をコード化する遺伝子がイミダゾリド
ン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
の全てまたは一部をコード化する第１３項記載の微生物
株。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (11)
- 【請求項１】 ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要と
される栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得
る必須植物産物をコード化する植物遺伝子を微生物株内
で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その必須植物
遺伝子産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切で
あるがこの必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微
生物株の増殖には不適切である試験条件、および（２）
その必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する化合物であ
る、植物の成長に必要な必須植物遺伝子産物を阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。 - 【請求項２】 ａ）ホスホリボシルアントラニレートト
ランスフェラーゼをコード化する植物遺伝子を発現する
微生物株を、（１）ホスホリボシルアントラニレートト
ランスフェラーゼが欠乏しているか或はアントラニレー
トシンターゼが触媒する反応の後のトリプトファンのた
めの生合成経路で作り出される化合物が欠乏している状
態の微生物株は増殖できないところの、ホスホリボシル
アントラニレートトランスフェラーゼを発現する微生物
株の増殖にとっては適切であるが、トリプトファン、お
よび他の、アントラニレートシンターゼが触媒する反応
の後のトリプトファンのための生合成経路で作り出され
る化合物、が不足している試験条件、および（２）トリ
プトファンか、或は他の、アントラニレートシンターゼ
が触媒する反応の後のトリプトファンのための生合成経
路で作り出される化合物、を含んでいる逆転条件、の下
で維持することにより、試験および逆転培養物を生じさ
せ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ホス
ホリボシルアントラニレートトランスフェラーゼ阻害特
性に関して試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、ホスホ
リボシルアントラニレートトランスフェラーゼを阻害す
る化合物である、植物ホスホリボシルアントラニレート
トランスフェラーゼを阻害する化合物をスクリーニング
および同定する方法。 - 【請求項３】 ａ）植物アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、
（１）植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発現
する微生物株の増殖にとっては適切である、アセトヒド
ロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生物
株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試験条
件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンターゼ
が欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖ア
ミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持することに
より、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
アセトヒドロキシアシッドシンターゼ阻害特性に関して
試験すべき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ア
セトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害する化合物で
ある、植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害
する化合物をスクリーニングおよび同定する方法。 - 【請求項４】 ａ）植物３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼをコード
化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）３−デオキ
シ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェート
シンターゼ、フェニルアラニン、トリプトファンおよび
チロシンが欠乏している状態の微生物株は増殖できない
ところの、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネ
ート７−ホスフェートシンターゼを発現する微生物株の
増殖にとっては適切であるが３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプツロソネート７−ホスフェートシンターゼが欠
乏している状態の微生物株の増殖には不適切である試験
条件、および（２）フェニルアラニン、トリプトファン
およびチロシンが含まれている逆転条件、の下で維持す
ることにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、植物
３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホ
スフェートシンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合
物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物３
−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホス
フェートシンターゼを阻害する化合物である、３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７−ホスフェー
トシンターゼを阻害する化合物をスクリーニングおよび
同定する方法。 - 【請求項５】 ａ）植物グルタミンシンセターゼをコー
ド化する遺伝子を発現する微生物株を、（１）グルタミ
ンシンセターゼおよびグルタミン両方が欠乏している状
態の微生物株は増殖できないところの、グルタミンシン
セターゼを発現する微生物株の増殖にとっては適切であ
る、グルタミンが不足している試験条件、および（２）
グルタミンが含まれている逆転条件、の下で維持するこ
とにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、グル
タミンシンセターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物
と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物である、植物グ
ルタミンシンセターゼを阻害する化合物をスクリーニン
グおよび同定する方法。 - 【請求項６】 ａ）植物ジヒドロジピコリネートシンタ
ーゼをコード化する遺伝子を発現する微生物株を、
（１）ジヒドロジピコリネートシンターゼおよびジアミ
ノピメリン酸両方が欠乏している状態の微生物株は増殖
できないところの、ジヒドロジピコリネートシンターゼ
を発現する微生物株の増殖にとっては適切である、ジア
ミノピメリン酸が不足している試験条件、および（２）
ジアミノピメリン酸が含まれている逆転条件、の下で維
持することにより、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、ジヒ
ドロジピコリネートシンターゼ阻害特性に関して試験す
べき化合物と接触させ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物ジ
ヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する化合物であ
る、植物ジヒドロジピコリネートシンターゼを阻害する
化合物をスクリーニングおよび同定する方法。 - 【請求項７】 必須植物産物をコード化する植物遺伝子
の全てまたは一部を発現する能力を有しており、ここ
で、この発現により、この微生物株の増殖にさもなくば
必要とされる栄養的補足物の存在なしでもこの微生物株
の増殖が可能になるところの、必須植物遺伝子産物を阻
害する化合物の同定で有効な微生物株。 - 【請求項８】 ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要と
される栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得
る必須植物産物をコード化する変異植物遺伝子を微生物
株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、その必須植物遺伝子
産物を発現する微生物株の増殖にとっては適切であるが
この必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株
の増殖には不適切である試験条件下で維持することによ
り、その微生物株が増殖している培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している培養物を、野生型
必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖阻害を生
じさせるに充分な量の、その野生型必須植物遺伝子産物
の阻害剤と接触させ；そして ｄ）その野生型必須植物遺伝子産物の阻害剤存在下の
（ｂ）に記述した条件下で増殖する微生物細胞を同定す
る；ことを含み、ここで、上記同定した細胞は、その野
生型必須植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す
変異必須植物遺伝子産物を発現する細胞である、野生型
植物遺伝子産物を阻害する化合物に耐性を示す変異必須
植物遺伝子産物を発現する微生物細胞を同定する方法。 - 【請求項９】 ａ）微生物株の増殖にさもなくば必要と
される栄養的補足物の存在なしで微生物株を増殖させ得
る除草剤耐性を示す必須植物産物をコード化する変異植
物遺伝子を微生物株内で発現させ； ｂ）（ａ）で記述した微生物株を、（１）その除草剤耐
性を示す必須植物遺伝子産物を発現する微生物株の増殖
にとっては適切であるがこの除草剤耐性を示す必須植物
遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の増殖には不
適切である試験条件、および（２）その除草剤耐性を示
す必須植物遺伝子産物が欠乏している状態の微生物株の
増殖に適切な逆転条件、の下で維持することにより、
（ａ）で記述した微生物株が増殖している試験および逆
転培養物を生じさせ； ｃ）（ｂ）で生じさせた増殖している試験および逆転培
養物を、植物成長阻害特性に関して試験すべき化合物と
接触させ；そして ｄ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、植物の
成長に必要な除草剤耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻
害する化合物である、植物の成長に必要な除草剤耐性を
示す変異必須植物遺伝子産物を阻害する化合物をスクリ
ーニングおよび同定する方法。 - 【請求項１０】 ａ）イミダゾリドン耐性を示す植物ア
セトヒドロキシアシッドシンターゼをコード化する植物
遺伝子を発現する微生物株を、（１）イミダゾリドン耐
性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを発
現する微生物株の増殖にとっては適切である、アセトヒ
ドロキシアシッドシンターゼが欠乏している状態の微生
物株の増殖に必要な分枝鎖アミノ酸が不足している試験
条件、および（２）アセトヒドロキシアシッドシンター
ゼが欠乏している状態の微生物株の増殖に必要な分枝鎖
アミノ酸が含まれている逆転条件、の下で維持すること
により、試験および逆転培養物を生じさせ； ｂ）（ａ）で生じさせた試験および逆転培養物を、イミ
ダゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシ
ンターゼ阻害特性に関して試験すべき化合物と接触さ
せ；そして ｃ）試験条件下ではその微生物株の増殖を阻害するが逆
転条件下ではその微生物株の増殖を阻害しない化合物を
同定する；ことを含み、ここで、上記化合物は、イミダ
ゾリドン耐性を示す植物アセトヒドロキシアシッドシン
ターゼを阻害する化合物である、イミダゾリドン耐性を
示す植物アセトヒドロキシアシッドシンターゼを阻害す
る化合物をスクリーニングおよび同定する方法。 - 【請求項１１】 除草剤耐性を示す必須植物産物の全て
または一部をコード化する植物遺伝子を発現する能力を
有しており、ここで、この発現により、この微生物株の
増殖にさもなくば必要とされる栄養的補足物の存在なし
でもこの微生物株の増殖が可能になるところの、除草剤
耐性を示す必須植物遺伝子産物を阻害する化合物の同定
で有効な微生物株。
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