JPH06253884A - 卵胞刺激ホルモンの生産方法 - Google Patents

卵胞刺激ホルモンの生産方法

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JPH06253884A
JPH06253884A JP5162603A JP16260393A JPH06253884A JP H06253884 A JPH06253884 A JP H06253884A JP 5162603 A JP5162603 A JP 5162603A JP 16260393 A JP16260393 A JP 16260393A JP H06253884 A JPH06253884 A JP H06253884A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ヘテ
ロダイマ−タンパク質である卵胞刺激ホルモン（ＦＳ
Ｈ）を生産する方法を提供する。 【構成】 本発明は、形質転換細胞の単一培養からの生
物学的に活性なヘテロダイマ−ＦＳＨの生産に関する。
ＦＳＨのα−サブユニツトおよびβ−サブユニツトそれ
ぞれをコードする異種ＤＮＡを含む発現ベクターを有す
る細胞により、単一培養物から生物学的に活性なヘテロ
ダイマ−ＦＳＨが生産される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技法を用い
てヘテロポリマ−タンパク質を生産することに関する。
【０００２】
【従来の技術】種々のポリペプチド鎖が、組換えＤＮＡ
技法を用いることにより、細菌、酵母、哺乳動物の培養
細胞のような宿主細胞内で発現されている。フイツデス
（Ｆｉｄｄｅｓ，Ｊ．Ｃ．）およびグツドマン（Ｇｏｏ
ｄｍａｎ，Ｈ．Ｍ．）のＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ，２８
１，ｐ．３５１−３５６（１９７９）ならびにフイツデ
スおよびグツドマンのＮａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８６，
ｐ．６８４−６８７（１９８０）はそれぞれヒト絨毛性
性腺刺激ホルモン（コリオゴナドトロピン；ｈＣＧと略
す）のα−及びβ−サブユニットのクローニングを開示
している。
【０００３】カナメ（Ｋａｎａｍｅ）の米国特許第４３
８３０３６号は、ヒトリンパ芽球を実験動物に移植し、
その動物からヒトリンパ芽球を採取してインビトロ培養
し、その培養物から蓄積されたｈＣＧを回収することに
よるｈＣＧの生産方法を開示している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般に本発明は生物学
的に活性なヘテロダイマ−ヒト生殖ホルモンである卵胞
刺激ホルモン（以後ＦＳＨと略す）のα−サブユニット
とβ−サブユニットの生産方法に関する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】それぞれのサブユニット
はそれらをコードする異種ＤＮＡを含む発現ベクターを
有する細胞によって合成される。
【０００６】“発現ベクター”という用語は宿主細胞内
での発現を可能にする配列の制御下にある異種（そのベ
クターに対して）ＤＮＡを含むクローニングベクターを
意味する。この種のベクターには複製しうるウイルス、
プラスミドおよびフアージが含まれる。好適なベクター
はウシパピローマ（乳頭腫）ウイルスゲノムの少なくと
も６９％の形質転換領域を含むもの、最も好ましくはウ
シパピロ−マウイルスゲノム全体を含むものである。
【０００７】本発明は形質転換細胞の単一培養からの生
物学的に活性なヘテロダイマーＦＳＨの生産を可能にす
る。同一細胞によるＦＳＨの両サブユニットの生産は、
別々の培養物から得られたサブユニットを再結合して活
性なヘテロダイマー分子を作製する必要性を排除する。
また、この系は活性化または安定化のために翻訳後修飾
（例えばグリコシル化や加水分解処理）を培養中に受け
るＦＳＨの単一培養による生産を可能にする。
【０００８】好適な実施態様において、各発現ベクター
は自律的に複製し、すなわち宿主細胞の染色体に組み込
まれることがない。自律的に複製する発現ベクターを使
用することにより、意図するコーデイング領域は宿主染
色体中の調節配列による望ましくない影響を受けずにす
む。
【０００９】本発明の他の利点および特徴はその好適な
実施態様の以下の記述、ならびに特許請求の範囲から明
らかになるであろう。
【００１０】本発明者らは今、本発明の好適な実施態様
について説明する。
【００１１】
【実施例】構造 本発明のクローニングベクターは上で列挙した一般的構
造を有する。好適なベクターは図面に示される構造を有
し、以下でより詳細に説明する。
【００１２】クローニングベクターの作製 共通のα−サブユニツトをコードするｃＤＮＡクローン
の単離 本発明のヘテロダイマーＦＳＨを製造するために、まず
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のα−サブユニ
ツトを単離する。このα−サブユニツトは生殖ホルモン
ｈＣＧ、黄体形成ホルモン（ＬＨ）およびＦＳＨに共通
している。
【００１３】本明細書において用いる技法はすべてマニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クロー
ニング：実験マニユアル（コールド・スプリング・ハー
バー研究所）に詳しく記載されており、それを参考とし
てここに引用する。
【００１４】ＲＮＡは胎盤組織から以下の方法によって
抽出する。１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ酢酸Ｎａ
（ｐＨ５．５）：フエノールの１：１混合物中で組織の
均質化（ホモジナイゼーシヨン）を行い、次いでそれを
６０℃で２０分間温める。氷上で１０分間冷却した後、
相を遠心分離する。熱フエノール抽出を２回以上繰り返
し、続いてクロロホルムで２回抽出する。
【００１５】ＲＮＡは２．５倍容量のエタノールを添加
することにより、最後の水相から沈殿する。
【００１６】ポリＡ＋ｍＲＮＡを濃縮化するために、胎
盤ＲＮＡを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝
化０．５Ｍ Ｎａｃｌで平衡化したオリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムにかけ、同じ溶液でカラムを洗う。ポリＡ
＋ｍＲＮＡは１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＳＤＳで溶離し、エタノ
ールで２回沈殿させる。一般的な初期収量は組織１ｇ当
たり全ＲＮＡ１．５〜２．０ｍｇであり、そのうちの約
２％がポリＡ＋ｍＲＮＡに相当する。
【００１７】胎盤ｃＤＮＡのライブラリーは胎盤ｍＲＮ
Ａの逆転写、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（大フラグメント）を用いる第二鎖合成、ＳＩヌク
レアーゼ処理、およびターミナル・デオキシヌクレオチ
ジル・トランスフエラーゼによるホモポリマー（ｄＣ）
付加により作製され、これらの手法はすべて慣用方法を
用いて行われる。
【００１８】一般的な調製法では、ｍＲＮＡの一本鎖
（ｓｓ）ｃＤＮＡへの逆転写効率２０〜３０％；第二鎖
合成後のヌクレアーゼＳＩ消化に対する抵抗性７０％；
および１０〜２５塩基鎖長のｄＣ“尾部”が得られる。
その後これらのｃＤＮＡ分子はあらかじめＰｓｔＩで消
化し且つｄＧ“尾部”を付加しておいたプラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＤＮＡ断片とアニーリングさせる。これらの
組換え体プラスミドを用いて大腸菌細胞を形質転換し、
それによりｃＤＮＡライブラリーを作成する（形質転換
細胞はテトラサイクリン耐性に基づいて選択される）。
【００１９】ヒトα−ｈＣＧクローンを同定するため
に、ハイブリダイゼーシヨン用プローブとしてマウスα
−甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）クローンの２１９ｂｐ
断片を使用する。このプローブはヒトクローンと７７％
の塩基配列相同性を有する。それをニツクトランスレー
シヨンで放射性標識し、相同の程度を考慮する条件下で
ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせる。強くハ
イブリダイズするクローンを制限マツピングにより分析
し、α−ｈＣＧの全コーデイング配列を含むクローンを
ＤＮＡ塩基配列決定法により確かめる。
【００２０】プラスミドｐＲＦ３７５の作製 図１に示すように、ネズミメタロチオインプロモータ
ー、ＳＶ４０ＤＮＡおよびｐＢＲ３２２配列を含むプラ
スミドＣＬ２８［プラスミドＪＹＭＭＴ（Ｅ）と同じ；
ハマー（Ｈａｍｅｒ）らのＪ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｇｅｎ．，１，２７３−２８８（１９８３）を参照］
を制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩで切断する。この
部位にα−ｈＣＧのｃＤＮＡクローン（その５′末端と
３′末端にそれぞれ約１０ｂｐと約２２０ｂｐの非翻訳
領域を含む）を挿入する。このクローンはその末端に合
成ＢａｍＨＩリンカーを付加することにより遺伝子工学
的に処理された。
【００２１】得られたプラスミドｐＲＦ３０２を制限酵
素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化してＳＶ４０ＤＮＡ配列
を放出させる。
【００２２】全ＢＰＶゲノムと若干のｐＢＲ３２２配列
を含むプラスミドｐＢ２−２をＢａｍＨＩとＳａｌＩで
消化して、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ末端を有するＢＰＶゲ
ノムを得、この断片をメタロチオネイン−ｈＣＧ配列を
含むｐＲＦ３０２に連結する。
【００２３】大腸菌を形質転換した後、プラスミドＣＲ
Ｆ３７５を同定して単離する。それはマウスメタロチオ
ネインプロモーターの制限下にある共通のα−サブユニ
ツトをコードしている。
【００２４】ヒト−βＦＳＨ遺伝子の単離 フアージラムダにおけるヒトゲノムライブラリー［ロー
ン（Ｌａｗｎ）らのＣｅｌｌ，１５，ｐ．１１５７−１
１７４（１９７８）を参照］は“推量された”長鎖プロ
ーブを用いてスクリーニングする。このようなプローブ
の背後にある考え［ジエイ（Ｊａｙｅ）らのＮｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１（８），２
３２５（１９８３）を参照］は目的とするタンパク質の
アミノ酸配列が少なくとも一部既知である場合に、一個
以上でしかも４個以下の異なるトリプレツトによってコ
ードされうるアミノ酸のそのトリプレツトを経験をふま
えて推量することにより長鎖プローブを作製することが
できるということにある。正確な推量は相同の程度を増
し、かつ結果の特異性を高める。
【００２５】意図するＤＮＡ領域を単離するために、２
種類の標識した４５−ｍｅｒプローブ：すなわちヒトβ
−ＦＳＨのアミノ酸５６−７０と相同性のＴＢ３６；お
よびアミノ酸７３−８７と相同性のＴＢ２１を使用す
る。これらのプローブは次のヌクレオチド組成を有する
（対応するアミノ酸も示す）： ＴＢ３６： Val-Tyr-Glu-Thr-Val-Lys-Val- （ＡＡ５６−７０）３′CAC ATG CTC TGG CAC TCT CAC Pro-Gly-Cys-Ala-His-His-Ala-Asp GGT CCG ACG CGG GTG GTG CGA CTG５′ ＴＢ２１： Tyr-Thr-Tyr-Pro-Val-Ala-Thr- （ＡＡ７３−８７）３′ATG TGC ATG GGT CAC CGA TGT Glu-Cys-His-Cys-Gly-Lys-Cys-Asp CTC ACA GTG ACG CCG TTT ACG CTG５′ 上記プローブを使用してヒトゲノムライブラリーを次の
ようにスクリーニングする。ＴＢ２１を32Ｐで標識し、
これを用いてベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデービス
（Ｄａｖｉｓ）のＳｃｉｅｎｃｅ，１９６，１８０−１
８２（１９７７）に記載されるｉｎ ｓｉｔｕプラーク
ハイブリダイゼイシヨン法により２通りのフイルター上
の約５×１０５個のラムダプラークをスクリーニングす
る。プレハイブリダイゼーシヨン溶液は数時間５５℃に
保ち、次の組成：すなわち０．７５Ｍ ＮａＣｌ；０．
１５Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ；５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ溶液；０．１％ピロリ
ン酸ナトリウム；０．１％ＳＤＳ；１００μｇ／ｍｌ大
腸菌ｔ−ＲＮＡを有する。ハイブリダイゼーシヨン溶液
も同じ組成であるが、一晩４５℃に保ち、さらに約０．
５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの濃度で標識プローブを含む。
ハイブリダイゼーシヨン後フイルターを１×ＳＳＣ（＝
０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３）
で４回洗い、Ｘ線フイルムを感光させる。
【００２６】このスクリーニング法は両方のフイルター
上でＴＢ２１とハイブリダイズする５０個のプラークを
もたらす。これら５０個のそれぞれのプラークを採取
し、各々５個のプラークを含む１０の培養プールに分け
る。これらの１０の培養プールを増殖させ、５０ｍｌの
フアージ溶菌液からＤＮＡを単離する。次にこのＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで消化し、２つの同じ１％のアガロースゲ
ル上で分画化し、その後サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７
５）に記載される方法に従ってニトロセルロース紙へＤ
ＮＡを移行させる。
【００２７】２枚のフイルター上のＤＮＡはそれぞれ
３２Ｐで標識したＴＢ２１およびＴＢ３６とハイブリダ
イズさせる。両方のプローブと強くハイブリダイズする
制限断片を含むプールから得られる個々のプラークはそ
の後上記の方法に従ってスクリーニングするが、但しＤ
ＮＡをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ＋Ｂａ
ｍＨＩで消化する。この方法においてヒトαＦＳＨを含
む６．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を単離す
る。
【００２８】６．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩを含
むクローン１５Ｂの部分的制限地図を図２に示す。その
クローン１５Ｂ内のβ−ＦＳＨ配列を決めるために、ク
ローン１５Ｂの６．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断
片をｐＢＲ３２２にサブクローニングし、それによりプ
ラスミドｐ１５Ｂ６．８Ｒ／Ｂ（図２参照）を得る。次
いでｐ１５Ｂ６．８Ｒ／Ｂを種々の制限酵素で消化し、
消化産物を慣用方法によりアガロース電気泳動で分画化
する。ＤＮＡをニトロセルロース紙へブロツテイングし
て、ニックトランスレーシヨンにより32Ｐで標識したブ
タβ−ＦＳＨｃＤＮＡクローンの断片とハイブリダイズ
させる。
【００２９】図２に示すように、ブタβ−ＦＳＨプロ−
ブはひとＤＮＡの２つの断片、すなわち１．１ｋｂ Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩおよび１．４ｋｂ ＰｓｔＩ断
片とのみハイブリダイズする。これらの２つの断片の部
分的ＤＮＡ塩基配列決定は、このＤＮＡがまさしくひと
β−ＦＳＨをコードし且つβ−ＦＳＨの全コーデイング
領域がこれらの２つの断片に含まれることを示す。
【００３０】図３の制限地図に示すように、β−ＦＳＨ
コーデイング配列は成熟β−ＦＳＨのアミノ酸３５と３
６との間に約１．６ｋｂの介在配列（イントロン）が割
り込んでいる。全ヒトβ−ＦＳＨコーデイング領域のヌ
クレオチド配列および若干の周辺配列と介在配列を図５
に示す。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列
はコーデイング領域に対して示される。
【００３１】図５の配列に示すように、１８個のアミノ
酸からなるシグナルペプチドの四角で囲ったＡＴＧ開始
コドンが存在し、これは翻訳後に切断される。成熟タン
パク質は円で囲ったトリプレットＡＡＴによりコードさ
れるアミノ酸Ａｓｎから始まる。エキソン−イントロン
境界は矢印により示され、それらはスプライス供与部位
のためのＧＴおよびスプライス受容部位のためのＡＧと
いう共通配列（コンセンサス配列）が存在する。コーデ
イング領域の終りに四角で囲った停止コドンＴＡＡが存
在する。
【００３２】図５の配列をトリプレツトごとに分けずに
再度図６に示す。ここには制限部位、ＡＴＧ開始コドン
およびＴＡＡ終止コドンが示され、コーデイング領域は
四角で囲まれ、そしてエキソン−イントロン境界点は矢
印で示される。
【００３３】ＢＰＶに基づく発現ベクターへのβ−ＦＳ
Ｈ ＤＮＡの挿入 図３に示すように、ｐ１５Ｂ６．８Ｒ／ＢのＤｄｅＩ部
位に合成ＢａｍＨＩリンカーを挿入し、これによりＡＴ
Ｇ開始コドンの５′側に４２個のヌクレオチドを配置す
る。図４に示すように、ｐ１５Ｂ６．８Ｒ／ＢをＤｄｅ
Ｉで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ）で
処理し、その後それを合成ＢａｍＨＩリンカーに連結し
てＢａｍＨＩで消化する。ＦＳＨの第一エキソンを含む
２９５ｂｐ断片を単離し、ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部
位にクローニングする。得られたプラスミドｐＢＲ２９
５ＢａｍをＫｐｎＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＡｖａＩで消化し、
あらかじめＫｐｎＩ＋ＥｃｏＲＩ＋ＳｍａＩで消化して
おいたｐ１５Ｂ６．８Ｒ／Ｂに連結する。次いでこの連
結混合物を用いて大腸菌を形質転換し、これらの形質転
換細胞の中から制限マツピングによりＢａｍＨＩ断片と
してヒトβ−ＦＳＨＤＮＡ配列を含むプラスミドｐＢＲ
２．８Ｂａｍを同定する。
【００３４】図４に示すように、発現プラスミドＣＬ２
８ＦＳＨ２．８ＢＰＶは、ｐＲＦ３７５（図１参照）を
作製するのに用いた方法と同じ方法で作られる。但し、
α−ｈＣＧ ｃＤＮＡクローンの変わりにｐＢＲ２．８
Ｂａｍの２．８ｋｂ ＢａｍＨＩ断片を使用する。プラ
スミドＣＬ２８ＦＳＨ２．８ＢＰＶを用いて哺乳動物宿
主細胞を慣用方法により形質転換することができ、ひと
β−ＦＳＨを単離および精製することが可能である。
【００３５】マウス細胞のトランスフエクシヨン 混合トランスフエクシヨンを使用してヘテロダイマーＦ
ＳＨを生産させるために、各ＢＰＶプラスミド、すなわ
ちｐＲＦ３７５（α−サブユニツト）およびＣＬ２８Ｆ
ＳＨ２．８ＢＰＶ（β−ＦＳＨ）を５μｇずつ混合し、
それをキヤリアーとしてのサケ精子ＤＮＡ１０μｇを含
む２５０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液０．５ｍｌに加える。こ
の混合物を０．５ｍｌの２８０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍ
Ｍ Ｈｅｐｅｓおよび１．５ｍＭリン酸ナトリウムに加
えて、リン酸カルシウムの沈殿物を室温で３０〜４０分
間形成させる。
【００３６】トランスフエクシヨンの２４時間前に、５
×１０５個のマウスＣ１２７細胞［メリーランド州ベテ
スダ，ＮＩＨ，国立がん研究所のデイーン・ハマー（Ｄ
ｅａｎ Ｈａｍｅｒ）博士から入手］を１００ｍｍ皿ま
たはＴ−７５フラスコに置く。外来ＤＮＡを加える直前
に、細胞に新しい培地（ダルベツコ修飾培地、１０％ウ
シ胎児血清）を供給する。リン酸カルシウム沈殿物１ｍ
ｌを各皿（１０ｍｌ）に加え、細胞を３７℃で６〜８時
間インキユベートする。
【００３７】培地を吸引して除き、その代わりにリン酸
緩衝塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）中の２０％グリセロ
ール５ｍｌを室温で２分間加える。細胞をＰＢＳで洗
い、培地１０ｍｌを供給して３７℃でインキユベートす
る。２０〜２４時間後に培地を変え、その後３〜４日ご
とに細胞の栄養補給を行う。個々のクローンはＴ−２５
フラスコ内で増殖させる。７〜２１日後に、分析のため
にさらに大きなフラスコへ細胞クローンを移すことがで
きる。
【００３８】寄託 先に述べた大腸菌内のＣＬ２８ＦＳＨ２．８ＢＰＶは６
１６０４イリノイ州ペオリア、アグリカルチュラル・リ
サーチ・カルチャー・コレクシヨン（Ａｇｒｉｃｕｌｔ
ｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ；ＮＲＲＬ）にＮＲＲＬ Ｂ−１５９２
３として寄託された。
【００３９】先に述べたＣ１２７細胞内のｐＲＦ３７５
はメリーランド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）
にＡＴＣＣ ＣＲＬ８４０１として寄託された。
【００４０】本発明の譲受人であるインテグレーデイツ
ド・ジエネテイクス社（Ｉｎｔｅｒｇａｔｅｄ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）はここに交付される特許の期間
終了以前にこれらの培養物が死滅する場合それらを取り
換える責任と、この種の特許の交付をＡＴＣＣおよびＮ
ＲＲＬに通知する責任とを負う。特許の交付時にこれら
の寄託物は一般の人々に利用可能となるであろう。その
時までこれらの寄託物は３７ＣＦＲ§１．１４および３
５ＵＳＣ§１１２のもとに特許局長官が利用し得るであ
ろう。
【００４１】
【発明の効果】本発明の形質転換細胞株はグリコシル化
された、生物学的に活性な、ヘテロダイマーヒトＦＳＨ
（慣用精製法を用いて細胞および／またはそれらの培地
から精製される）を生産するために使用される。ＦＳＨ
はヒトの生殖に関連した多くのよく知られた医療用途を
有する。例えばＦＳＨは単独でまたはｈＣＧやＬＨと組
合わせて排卵を誘発するために、あるいはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ受精のための過剰排卵を誘発するために使用でき
る。
【００４２】さらにヘテロダイマーＦＳＨまたはそのβ
−サブユニツト単独は生殖機能および下垂体機能に対す
る診断テストに使用しうる。
【００４３】組換え細胞によって生産されるＦＳＨは、
天然源から得られるＦＳＨに比べて、他のヒトタンパク
質（特に他の生殖ホルモン類）による汚染を受けつけな
いという点で利点を有する。
【００４４】その他の実施態様としては、例えば、２種
類の別個の発現ベクター（一方はα−サブユニツトをコ
ードし、他方はβ−サブユニツトをコードする）を含む
細胞を培養することによってヘテロダイマーＦＳＨを生
産する以外に、両方のサブユニツトをコードするＤＮＡ
を同じ発現ベクターに挿入することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はプラスミドｐＲＦ３７５の作製を示す模
式図である。
【図２】図２はランダムクローン１５ＢおよびｐＢＲ３
２２に挿入されるβ−ＦＳＨを含有する６．８ｋｂＥｃ
ｏＲ１−ＢａｍＨ１断片の部分的制限地図である。
【図３】図３はβ−ＦＳＨコーデイング領域およびＢＰ
Ｖに基づく発現ベクターに挿入されるＢａｍＨ１断片の
部分的制限地図である。
【図４】図４ＦＳＨのβ−サブユニツトをコードするＢ
ＰＶ含有プラスミドＣＬ２８ＦＳＨ２．８ＢＰＶの作製
を示す模式図である。
【図５】図５は全ｔ１−β−ＦＳＨコーデイング領域の
ヌクレオチド配列およびそれにより推定されるアミノ酸
配列を示す。
【図６】図６は図５のヌクレオチド配列の制限部位およ
びエキソンーイントロン境界点を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 // Ａ６１Ｋ 37/38 ＡＣＶ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 593126259 ベック，アントン・カー ＢＥＣＫ，ＡＮＴＯＮ Ｋ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02181, ウェルズリー，ドナ・セット・ストリート 32 (71)出願人 593126260 バーンスティン，エドワード・ジョージ ＢＥＲＮＳＴＩＮＥ，ＥＤＷＡＲＤ ＧＥ ＯＲＧＥ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ロングフェロー・プレイス ４，ナンバー 2005 (72)発明者 レッディ，ヴェムリ・ビー アメリカ合衆国マサチューセッツ州01581, ウェストボロ，スリー・マクタガート・ス トリート（番地なし) (72)発明者 ヒュング，ナンシー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02181, ウェルズリー，ワシントン・ストリート 590 ４エイ (72)発明者 ベック，アントン・カー アメリカ合衆国マサチューセッツ州02181, ウェルズリー，ドナ・セット・ストリート 32 (72)発明者 バーンスティン，エドワード・ジョージ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02114, ボストン，ロングフェロー・プレイス ４，ナンバー 2005

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルファサブユニットおよびベータサブ
    ユニットのヘテロダイマーからなる、生物学的活性を有
    するヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の製造方法であっ
    て、成熟ベータサブユニットが配列： 【化１】 を有し、上記各サブユニットをコードする外来ＤＮＡか
    らなる一つ以上の発現ベクターによりトランスフェクト
    された真核生物細胞中で各々のサブユニットを共に合成
    することからなる、製造方法。
  2. 【請求項２】 上記細胞が一つ以上の発現ベクターでト
    ランスフェクトされるが、その際、各ベクターが各々の
    サブユニットをコードする外来ＤＮＡを有する、請求項
    １記載の製造方法。
  3. 【請求項３】 上記細胞が、各サブユニットをコードす
    る外来ＤＮＡを有する単一の発現ベクターによりトラン
    スフェクトされる、請求項１記載の製造方法。
  4. 【請求項４】 ＦＳＨのベータサブユニットをコードす
    る外来ＤＮＡを有する１つの発現ベクターによりトラン
    スフェクトされている宿主細胞を培養することからなる
    ヒトＦＳＨのベータサブユニットの製造方法であって、
    成熟ベータサブユニットが配列： 【化２】 を有する製造方法。
  5. 【請求項５】 ＦＳＨの未成熟ベータサブユニットをコ
    ードする外来ＤＮＡを有する１つの発現ベクターにより
    トランスフェクトされた宿主細胞を培養することからな
    る、ヒトＦＳＨの未成熟ベータサブユニットの製造方法
    であって、その際、該未成熟ベータサブユニットが、請
    求項４記載の成熟ベータサブユニット配列およびさらに
    リーダー配列： 【化３】 を有する製造方法。
  6. 【請求項６】 上記細胞の培養物からＦＳＨを回収する
    工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし請求項６のいずれか１項
    に記載の方法により組換えＦＳＨを製造し、そして該組
    換えＦＳＨをキャリアーと混合することからなる、医薬
    組成物の製造方法。
  8. 【請求項８】 アルファサブユニットおよびベータサブ
    ユニットのヘテロダイマーからなる、生物学的活性を有
    するヒトＦＳＨであって、成熟ベータサブユニットが配
    列： 【化４】 を有し、かつ、各サブユニットは各サブユニットをコー
    ドする外来ＤＮＡを有する発現ベクターによりトランス
    フェクトされた細胞により合成されたものである、上記
    ヒトＦＳＨ。
  9. 【請求項９】 上記ベータサブユニットがリーダー配
    列： 【化５】 をさらに有する未成熟ベータサブユニットである、請求
    項８記載のヒトＦＳＨ。
  10. 【請求項１０】 ＦＳＨのベータサブユニットをコード
    する外来ＤＮＡからなる一つの発現ベクターによりトラ
    ンスフェクトされた細胞により合成され、未成熟ベータ
    サブユニットが配列： 【化６】 を有する、ヒトＦＳＨのベータサブユニット。
  11. 【請求項１１】 上記ベータサブユニットがリーダー配
    列： 【化７】 をさらに有する未成熟ベータサブユニットである、請求
    項１０記載のヒトＦＳＨ。
  12. 【請求項１２】 ヒトＦＳＨベータサブユニットをコー
    ドする外来ＤＮＡを有し、成熟ベータサブユニットは以
    下の配列： 【化８】 を有する第１発現ベクター、およびヒトＦＳＨアルファ
    サブユニットをコードする外来ＤＮＡを有する第２発現
    ベクターからなる発現ベクターの組み合わせ。
  13. 【請求項１３】 上記第１および第２ベクターが真核細
    胞をトランスフェクションすることができるものであ
    る、請求項１２記載の発現ベクターの組み合わせ。
  14. 【請求項１４】 第１発現ベクターがＮＲＲＬ寄託番号
    Ｂ−１５９２３を有するベクターである、請求項１２記
    載の発現ベクターの組み合わせ。
  15. 【請求項１５】 第１発現ベクターが以下のリーダー配
    列： 【化９】 を有する未成熟ベータサブユニットをコードするベクタ
    ーである、請求項１２または１３記載の発現ベクターの
    組み合わせ。
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