JPH0625765B2 - 標識付けしたおよび標識付けできるケイ光測定分析用試薬 - Google Patents
標識付けしたおよび標識付けできるケイ光測定分析用試薬Info
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- JPH0625765B2 JPH0625765B2 JP60503723A JP50372385A JPH0625765B2 JP H0625765 B2 JPH0625765 B2 JP H0625765B2 JP 60503723 A JP60503723 A JP 60503723A JP 50372385 A JP50372385 A JP 50372385A JP H0625765 B2 JPH0625765 B2 JP H0625765B2
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はヒトおよび動物の体液等中に見い出される有機
物質の分析に関する。さらに特に、本発明はケイ光測定
免疫分析およびこのような分析において標識付けした試
薬として使用する物質に関する。
物質の分析に関する。さらに特に、本発明はケイ光測定
免疫分析およびこのような分析において標識付けした試
薬として使用する物質に関する。
背景技術 現時点で多くの適用分野で抗体（またはその他の有機物
質、たとえばタンパク質およびハプテン類のような高分
子物質）を放射免疫分析法およびその他の核医薬品研究
に使用するための放射性金属イオンまたはケイ光測定免
疫分析法およびその他のケイ光を包含する研究用のラン
タニド金属イオンのどちらかの金属イオンで標識付けす
ることが要求される。これらの目的には、有機物質を通
常、キレートを介して金属イオンで標識付けする。従
来、キレートはこれらを二官能性反応体に変換する架橋
性反応剤で変性して、これらがそのキレート化作用性を
保持しながら、標識付けしようとする分子に共有結合す
ることにより容易に結合できるようにする。
質、たとえばタンパク質およびハプテン類のような高分
子物質）を放射免疫分析法およびその他の核医薬品研究
に使用するための放射性金属イオンまたはケイ光測定免
疫分析法およびその他のケイ光を包含する研究用のラン
タニド金属イオンのどちらかの金属イオンで標識付けす
ることが要求される。これらの目的には、有機物質を通
常、キレートを介して金属イオンで標識付けする。従
来、キレートはこれらを二官能性反応体に変換する架橋
性反応剤で変性して、これらがそのキレート化作用性を
保持しながら、標識付けしようとする分子に共有結合す
ることにより容易に結合できるようにする。
この目的に使用されているキレート化性反応剤の一群は
トリフルオルアセチルアセトンおよびベンゾイルのよう
なβ−ジケトン並びにα−およびβ−ナフトイルトリフ
ルオルアセトン群であり、このような反応剤とランタニ
ド金属イオンのキレートをＥＤＴＡ−同族体を用いて抗
体にカツプリングさせる（ヨーロツパ特許出願第０，０
６４，４８４号参照）。ＧＢ特許第１，５６０，４０２
号明細書ではテノイル−トリフルオルアセチルアセトン
のようなβ−ジケトンリガンドをアミノメチル置換基の
付加により変性させること、およびこの変性リガンド１
分子と未変化リガンド２分子とを使用して、アミノ基を
イソチオシアネート基に変換した後に抗体に容易にカツ
プリングするランタニド金属イオン錯体を生成させるこ
とが提案されている。
トリフルオルアセチルアセトンおよびベンゾイルのよう
なβ−ジケトン並びにα−およびβ−ナフトイルトリフ
ルオルアセトン群であり、このような反応剤とランタニ
ド金属イオンのキレートをＥＤＴＡ−同族体を用いて抗
体にカツプリングさせる（ヨーロツパ特許出願第０，０
６４，４８４号参照）。ＧＢ特許第１，５６０，４０２
号明細書ではテノイル−トリフルオルアセチルアセトン
のようなβ−ジケトンリガンドをアミノメチル置換基の
付加により変性させること、およびこの変性リガンド１
分子と未変化リガンド２分子とを使用して、アミノ基を
イソチオシアネート基に変換した後に抗体に容易にカツ
プリングするランタニド金属イオン錯体を生成させるこ
とが提案されている。
しかしながら、二官能性−キレート化剤は合成が困難で
あり、リガンド−金属イオン錯体を標識しようとする分
子に共有結合させるためのかなりの反応剤は所望の標識
付けした生成物を低い収率でしか生成させずおよびまた
標識付けした分子に対して望ましくない性質を付与する
ことがある。
あり、リガンド−金属イオン錯体を標識しようとする分
子に共有結合させるためのかなりの反応剤は所望の標識
付けした生成物を低い収率でしか生成させずおよびまた
標識付けした分子に対して望ましくない性質を付与する
ことがある。
発明の説明 本発明は有機分子に対する金属イオン錯体の満足な結合
を達成して、これにより標識付けした分子に対して特殊
化された機能を付与する別の方法を提供しようとするも
のである。
を達成して、これにより標識付けした分子に対して特殊
化された機能を付与する別の方法を提供しようとするも
のである。
本発明によるＮＨ２−含有高分子物質を金属イオンで標
識付けすることを可能にする方法はＮＨ２−含有高分子
物質をアルデヒドの存在下にβ−ジケトンと反応させ
て、環状縮合生成物を生成させることよりなる。
識付けすることを可能にする方法はＮＨ２−含有高分子
物質をアルデヒドの存在下にβ−ジケトンと反応させ
て、環状縮合生成物を生成させることよりなる。
本発明はまた有機高分子物質と反応できる活性基を有す
るＮＨ２−含有化合物をβ−ジケトンとアルデヒドの存
在下に反応させて、環状縮合生成物を生成させ、次いで
生成する生成物をこの活性基を経て有機高分子物質に結
合させることよりなる有機高分子物質を金属イオンで標
識付けすることを可能にする方法を提供する。
るＮＨ２−含有化合物をβ−ジケトンとアルデヒドの存
在下に反応させて、環状縮合生成物を生成させ、次いで
生成する生成物をこの活性基を経て有機高分子物質に結
合させることよりなる有機高分子物質を金属イオンで標
識付けすることを可能にする方法を提供する。
さらにまた、本発明はケイ光測定分析技法で使用するた
めに金属イオンで標識付けできる物質を提供し、この物
質はＮＨ２−含有高分子物質、β−ジケトンおよびアル
デヒドの環状縮合生成物よりなる。
めに金属イオンで標識付けできる物質を提供し、この物
質はＮＨ２−含有高分子物質、β−ジケトンおよびアル
デヒドの環状縮合生成物よりなる。
本発明はまたアルデヒド、β−ジケトンおよびＮＨ２基
を有する有機物質の環状縮合生成物を含み、この縮合生
成物がランタニド金属イオンをキレート化してケイ光測
定評価できる錯体が生成されているケイ光測定分析に使
用するための標識付けした試薬およびこのような標識付
けした試薬を使用する有機物質のケイ光測定分析方法を
提供する。
を有する有機物質の環状縮合生成物を含み、この縮合生
成物がランタニド金属イオンをキレート化してケイ光測
定評価できる錯体が生成されているケイ光測定分析に使
用するための標識付けした試薬およびこのような標識付
けした試薬を使用する有機物質のケイ光測定分析方法を
提供する。
図面の簡単な説明 本発明を添付図面により説明する。添付図面は下記の例
に記載されているとおりのα−フエト−タンパク質（代
表的なＮＨ２−含有抗体を使用するものとして選ばれ
る）の分析に関するグラフである。第１図はトリフルオ
ルアセチルアセトンで直接に標識付けしたウサギ抗−α
−フエト−タンパク質（ＡＦＰ）を用いる検量曲線であ
る。第２図は抗−ＡＦＰを標識付けしたポリリジンを用
いて標識付けした場合の検量曲線であり、そして第３図
はＥｕ(III)ケイ光を充分に増強した場合の第２図に示
されている検量曲線である。
に記載されているとおりのα−フエト−タンパク質（代
表的なＮＨ２−含有抗体を使用するものとして選ばれ
る）の分析に関するグラフである。第１図はトリフルオ
ルアセチルアセトンで直接に標識付けしたウサギ抗−α
−フエト−タンパク質（ＡＦＰ）を用いる検量曲線であ
る。第２図は抗−ＡＦＰを標識付けしたポリリジンを用
いて標識付けした場合の検量曲線であり、そして第３図
はＥｕ(III)ケイ光を充分に増強した場合の第２図に示
されている検量曲線である。
本発明の詳細な説明 ＮＨ２−含有物質（Ｒ１−ＮＨ２）、β−ジケトン（Ｒ
３ＣＯＣＨ２ＣＯＲ３）およびアルデヒド（Ｒ２−ＣＨ
Ｏ）の環状縮合生成物を生成させる反応は次式で示すこ
とができる： 記号Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は原料物質の性質によつて変
わる略記号である。
３ＣＯＣＨ２ＣＯＲ３）およびアルデヒド（Ｒ２−ＣＨ
Ｏ）の環状縮合生成物を生成させる反応は次式で示すこ
とができる： 記号Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は原料物質の性質によつて変
わる略記号である。
上式から容易にわかるように、生成した環状縮合生成物
は１，４−ジヒドロピリジン環を含有する。
は１，４−ジヒドロピリジン環を含有する。
本発明の方法ではβ−ジケトンを事前に変性させる必要
はない。これがβ−ジケトンの基本的構造に依存するだ
けであり、いづれかの置換基の性質には依存しないの
で、広く種々の異なるβ−ジケトンを使用できる。従つ
て、その他の限界、たとえば充分な吸光スペクトルを有
する可溶性錯体の生成および免疫反応性を失なうことな
く標識付けの目的にまたは毒性作用を回避するために導
入される金属イオンとの生成定数にもとづいて最適のβ
−ジケトンを選択できる。成功裏に使用できるβ−ジケ
トンは芳香族および非芳香族の両方を包含し、ケイ光測
定目的にランタニド金属イオンで標識付けするための錯
体を生成させる場合には、フツ素置換物質を使用すると
好ましい。適当なβ−ジケトンの例にはトリフルオルア
セチルアセトン、テノイルトリフルオルアセトン、４，
４，４−トリフルオル−１，（２−フリル）１，３−ブ
タンジオンおよびα−およびβ−ナフトイルトリフルオ
ルアセトンがある。その他の適当なβ−ジケトンはヘミ
ラ他（Hemmila et al）によりアナリテイカル バイオ
ケミストリイ（Analytical Biochemistry）、１３７、
３３５〜３４３頁（１９８４年）の文献に、または英国
特許第１，５６０，４０２号明細書、あるいは前記であ
げたヨーロツパ特許出願第０，０６４，４８４号または
ヨーロツパ特許出願第０，００２，９６３号にあげられ
ている化合物である。
はない。これがβ−ジケトンの基本的構造に依存するだ
けであり、いづれかの置換基の性質には依存しないの
で、広く種々の異なるβ−ジケトンを使用できる。従つ
て、その他の限界、たとえば充分な吸光スペクトルを有
する可溶性錯体の生成および免疫反応性を失なうことな
く標識付けの目的にまたは毒性作用を回避するために導
入される金属イオンとの生成定数にもとづいて最適のβ
−ジケトンを選択できる。成功裏に使用できるβ−ジケ
トンは芳香族および非芳香族の両方を包含し、ケイ光測
定目的にランタニド金属イオンで標識付けするための錯
体を生成させる場合には、フツ素置換物質を使用すると
好ましい。適当なβ−ジケトンの例にはトリフルオルア
セチルアセトン、テノイルトリフルオルアセトン、４，
４，４−トリフルオル−１，（２−フリル）１，３−ブ
タンジオンおよびα−およびβ−ナフトイルトリフルオ
ルアセトンがある。その他の適当なβ−ジケトンはヘミ
ラ他（Hemmila et al）によりアナリテイカル バイオ
ケミストリイ（Analytical Biochemistry）、１３７、
３３５〜３４３頁（１９８４年）の文献に、または英国
特許第１，５６０，４０２号明細書、あるいは前記であ
げたヨーロツパ特許出願第０，０６４，４８４号または
ヨーロツパ特許出願第０，００２，９６３号にあげられ
ている化合物である。
β−ジケトンは最終生成物のキレート化性を促進するた
めに、問題の金属とのまたは別の金属（たとえば銅）と
の金属β−ジケトネートの形で使用すると有利である。
最初の金属が問題の金属でない場合には、これは問題の
金属、たとえばランタニド金属と置き換えて標識付けし
た生成物を生成させることができる。
めに、問題の金属とのまたは別の金属（たとえば銅）と
の金属β−ジケトネートの形で使用すると有利である。
最初の金属が問題の金属でない場合には、これは問題の
金属、たとえばランタニド金属と置き換えて標識付けし
た生成物を生成させることができる。
使用されるアルデヒドは特殊機能、たとえばキレート化
が必要でない場合には、ホルムアルデヒドが好ましい
が、所望によりその他のアルデヒド、たとえば場合によ
り不活性置換基を有するＣ１〜Ｃ４−アルキルアルデヒ
ドを使用でき、これは生成する環状縮合生成物の性質を
変えるもう一つの手段を与える。アルデヒドそれ自体は
その化学構造中に故意に構築されているキレート化性を
有することができる。
が必要でない場合には、ホルムアルデヒドが好ましい
が、所望によりその他のアルデヒド、たとえば場合によ
り不活性置換基を有するＣ１〜Ｃ４−アルキルアルデヒ
ドを使用でき、これは生成する環状縮合生成物の性質を
変えるもう一つの手段を与える。アルデヒドそれ自体は
その化学構造中に故意に構築されているキレート化性を
有することができる。
本発明は、これらが初期に環状縮合生成物の生成に充分
なＮＨ２基を含有しているかあるいはいないかに関係な
く、有機物質から標識付けした試薬およびそのための先
駆化合物を提供するために使用できる。有機物質が初期
にＮＨ２基を含有していないかまたは不充分に含有して
いる場合に、環状縮合生成物は始めに、β−ジケトンと
アルデヒドとを高分子物質と反応できる基を有するアミ
ンまたはアミノ酸あるいはＮＨ２−含有重合体（たとえ
ばポリリジン）のようなその他のＮＨ２−含有化合物を
使用して反応させることにより生成できる。生成する環
状縮合生成物を次いでこれを有機物質に結合させる活性
基を経る温和な反応により標識付けしようとする有機物
質と反応させる。このような反応の例にはカルボジイミ
ド反応がある。別法として、活性エステル、たとえばポ
リ−Ｌ−リジンのヒドロキシスクシンイミド活性エステ
ルを作ることができる。ポリリジンの代りに、リジン−
含有キレートを使用することができ、これは最終生成物
における金属のキレート化のもう一つの補助手段を提供
する。このようなキレートの例にはサイドロフイリン
［トランスフエリン（transferrin）］がある。
なＮＨ２基を含有しているかあるいはいないかに関係な
く、有機物質から標識付けした試薬およびそのための先
駆化合物を提供するために使用できる。有機物質が初期
にＮＨ２基を含有していないかまたは不充分に含有して
いる場合に、環状縮合生成物は始めに、β−ジケトンと
アルデヒドとを高分子物質と反応できる基を有するアミ
ンまたはアミノ酸あるいはＮＨ２−含有重合体（たとえ
ばポリリジン）のようなその他のＮＨ２−含有化合物を
使用して反応させることにより生成できる。生成する環
状縮合生成物を次いでこれを有機物質に結合させる活性
基を経る温和な反応により標識付けしようとする有機物
質と反応させる。このような反応の例にはカルボジイミ
ド反応がある。別法として、活性エステル、たとえばポ
リ−Ｌ−リジンのヒドロキシスクシンイミド活性エステ
ルを作ることができる。ポリリジンの代りに、リジン−
含有キレートを使用することができ、これは最終生成物
における金属のキレート化のもう一つの補助手段を提供
する。このようなキレートの例にはサイドロフイリン
［トランスフエリン（transferrin）］がある。
従つて、本発明はヒトおよび動物の体液中に天然に生じ
るか、あるいは人口的に培養または発生される広く種種
の有機物質、たとえば抗原、抗体、ホルモン（たとえば
Ｔ４）、酵素およびその他のタンパク質およびハプテン
を金属イオンで標識付けすることを可能にするために使
用でき、本明細書で使用するかぎり、有機高分子物質の
用語の範囲内にこれらの全ての物質が包含されるものと
する。問題のこれらの物質は一般に３００を超える分子
量を有するが、さらに低い分子量の物質も除外されな
い。これらの物質は一般にアミノ酸のような結合サブユ
ニットを含有するが、これは必須ではない。
るか、あるいは人口的に培養または発生される広く種種
の有機物質、たとえば抗原、抗体、ホルモン（たとえば
Ｔ４）、酵素およびその他のタンパク質およびハプテン
を金属イオンで標識付けすることを可能にするために使
用でき、本明細書で使用するかぎり、有機高分子物質の
用語の範囲内にこれらの全ての物質が包含されるものと
する。問題のこれらの物質は一般に３００を超える分子
量を有するが、さらに低い分子量の物質も除外されな
い。これらの物質は一般にアミノ酸のような結合サブユ
ニットを含有するが、これは必須ではない。
環状縮合生成物を生成させる反応は好ましくは温和な酸
pH、たとえば５．５〜６．５で行なうが、アルカリ性pH
も除外されない。好ましくは、この反応は温和に上昇さ
せた温度、たとえば３０〜５０℃で行なう。ＮＨ２−含
有物質に有害である高温の使用は、後で分析に使用する
ための縮合生成物を製造する場合には、避けるべきであ
る。さらに低い温度の使用は反応速度を減じ、延長され
たインキユベーシヨン期間を必要とすることがある。
pH、たとえば５．５〜６．５で行なうが、アルカリ性pH
も除外されない。好ましくは、この反応は温和に上昇さ
せた温度、たとえば３０〜５０℃で行なう。ＮＨ２−含
有物質に有害である高温の使用は、後で分析に使用する
ための縮合生成物を製造する場合には、避けるべきであ
る。さらに低い温度の使用は反応速度を減じ、延長され
たインキユベーシヨン期間を必要とすることがある。
本発明による環状縮合生成物は安定であり、ランタニド
金属イオンのような金属イオンを強力にキレート化す
る。従つて、これらは反応してＥｕ（III）またはその
他のケイ光錯体を生成できるＴｂ（III）のようなラン
タニド金属の錯体を生成させることができ、生成する錯
体は一般に、外部からβ−ジケトンを添加する必要な
く、溶液中でケイ光を発する。この反応はいづれか既知
のまたは慣用の方法で、たとえば結合させようとする金
属のイオンを含有する緩衝液に対して透析することによ
り実施できる。
金属イオンのような金属イオンを強力にキレート化す
る。従つて、これらは反応してＥｕ（III）またはその
他のケイ光錯体を生成できるＴｂ（III）のようなラン
タニド金属の錯体を生成させることができ、生成する錯
体は一般に、外部からβ−ジケトンを添加する必要な
く、溶液中でケイ光を発する。この反応はいづれか既知
のまたは慣用の方法で、たとえば結合させようとする金
属のイオンを含有する緩衝液に対して透析することによ
り実施できる。
キレート化性アルデヒドを用いて生成された縮合生成物
はその他のアルデヒドからの生成物に比較してさらに完
全なランタニド金属の配位能力を満足させる。従つて、
このような生成物は良好に金属をキレート化し、ランタ
ニドキレートの形である場合には、さらにケイ光性であ
る。
はその他のアルデヒドからの生成物に比較してさらに完
全なランタニド金属の配位能力を満足させる。従つて、
このような生成物は良好に金属をキレート化し、ランタ
ニドキレートの形である場合には、さらにケイ光性であ
る。
この縮合生成物の吸収最大波長は通常、原料β−ジケト
ンに応じてβ−ジケトンのものから僅かにいづれかに移
動する。これは波長で移動し、従つて励起最大を縮合生
成物の生成の指針として使用できる。
ンに応じてβ−ジケトンのものから僅かにいづれかに移
動する。これは波長で移動し、従つて励起最大を縮合生
成物の生成の指針として使用できる。
ランタニド金属イオンで標識付けした環状縮合生成物は
広く種々の物質のケイ光測定分析における標識付けした
試薬として使用できるが、天然に、または病気あるいは
機能不全の結果として、あるいは病気または機能不全の
処置の結果としてのどちらかにより体液中に生じる有機
物質およびハプテン、たとえば抗体、抗原およびその他
のタンパク質、ホルモン、酵素、医薬品およびウイルス
粒子の分析に主として向けられる。ケイ光測定分析は既
知のまたは標準的技法のいづれかを使用して実施でき
る。適当な技法の例は前記で引用した特許明細書および
特許出願に並びにそこにあげられている参考文献に記載
されている。また、ダクブ エス．（Dakubu S.）、エ
キンス アール ピー（Ekins R.P）他の“ハイ−セン
シテイビテイ、パルスドーライト タイム−リゾルブド
フルオロイムノアツセイ（High-sensitivity，pulsed
-light time-resolved fluoroimmunoassay）”［プラク
テイカル イムノアツセイ（Praltical Immunoassa
y）、ダブリユー．バツト（W.Butt）編集、マーセル
デツカー出版社（Marcel Dekker Inc.）、７１〜１０１
頁を参照できる。この分析は存在しうる抗体またはその
他の物質の検出に純粋に使用される定性分析、あるいは
分析しようとする物質の濃度を測定するために使用され
る定量分析であることができる。
広く種々の物質のケイ光測定分析における標識付けした
試薬として使用できるが、天然に、または病気あるいは
機能不全の結果として、あるいは病気または機能不全の
処置の結果としてのどちらかにより体液中に生じる有機
物質およびハプテン、たとえば抗体、抗原およびその他
のタンパク質、ホルモン、酵素、医薬品およびウイルス
粒子の分析に主として向けられる。ケイ光測定分析は既
知のまたは標準的技法のいづれかを使用して実施でき
る。適当な技法の例は前記で引用した特許明細書および
特許出願に並びにそこにあげられている参考文献に記載
されている。また、ダクブ エス．（Dakubu S.）、エ
キンス アール ピー（Ekins R.P）他の“ハイ−セン
シテイビテイ、パルスドーライト タイム−リゾルブド
フルオロイムノアツセイ（High-sensitivity，pulsed
-light time-resolved fluoroimmunoassay）”［プラク
テイカル イムノアツセイ（Praltical Immunoassa
y）、ダブリユー．バツト（W.Butt）編集、マーセル
デツカー出版社（Marcel Dekker Inc.）、７１〜１０１
頁を参照できる。この分析は存在しうる抗体またはその
他の物質の検出に純粋に使用される定性分析、あるいは
分析しようとする物質の濃度を測定するために使用され
る定量分析であることができる。
一つの好ましい分析方法は２部位（サンドイツチ）法で
あり、この方法では分析しようとする物質（たとえば抗
体または抗原）を初めに、その補体（たとえば対応する
抗原または対応する抗体）と、後者を固体基体に結合さ
せておいて適当に反応させる。生成物を次いで分析する
結合されている物質と相互反応できる標識付けした試薬
（たとえば標識付けした抗原または標識付けした抗体）
と反応させる。
あり、この方法では分析しようとする物質（たとえば抗
体または抗原）を初めに、その補体（たとえば対応する
抗原または対応する抗体）と、後者を固体基体に結合さ
せておいて適当に反応させる。生成物を次いで分析する
結合されている物質と相互反応できる標識付けした試薬
（たとえば標識付けした抗原または標識付けした抗体）
と反応させる。
別のケイ光測定分析法は標準的放射免疫分析法と方法論
的に同類の方法を包含し、この方法では分析しようとす
る物質（たとえば抗原または抗体）と標識付けした試薬
とを通常、固体基体に結合されている補体（たとえば抗
体または抗原）上で反応性部位を競合させる。
的に同類の方法を包含し、この方法では分析しようとす
る物質（たとえば抗原または抗体）と標識付けした試薬
とを通常、固体基体に結合されている補体（たとえば抗
体または抗原）上で反応性部位を競合させる。
環状縮合生成物をケイ光測定免疫分析に使用する場合
に、これは溶液中のまたは標識付けした分子が固体支持
体に結合されている場合のどちらかのランタニド金属イ
オン［たとえばＥｕ（III）］の測定にケイ光を測定す
ることにより実施できる。測定を溶液中で行なう場合
に、ランタニド金属イオンは標識付けした錯体から、た
とえば添加β−ジケトン（これは錯体の生成に使用され
たβ−ジケトンと同一である必要はない）との反応によ
り抽出できる。添加β−ジケトンは金属イオンと複合
し、それによつて縮合生成物を追い出し、生成する錯体
は縮合生成物から分離できる。しかしながら、ケイ光の
測定にこのような増強された溶液を使用する必要はな
く、縮合生成物のランタニド金属イオンとの錯体が固有
のケイ光を有し、そのケイ光を反応生成物に結合されて
いるままの状態で直接的に測定できることは本発明の利
点である。
に、これは溶液中のまたは標識付けした分子が固体支持
体に結合されている場合のどちらかのランタニド金属イ
オン［たとえばＥｕ（III）］の測定にケイ光を測定す
ることにより実施できる。測定を溶液中で行なう場合
に、ランタニド金属イオンは標識付けした錯体から、た
とえば添加β−ジケトン（これは錯体の生成に使用され
たβ−ジケトンと同一である必要はない）との反応によ
り抽出できる。添加β−ジケトンは金属イオンと複合
し、それによつて縮合生成物を追い出し、生成する錯体
は縮合生成物から分離できる。しかしながら、ケイ光の
測定にこのような増強された溶液を使用する必要はな
く、縮合生成物のランタニド金属イオンとの錯体が固有
のケイ光を有し、そのケイ光を反応生成物に結合されて
いるままの状態で直接的に測定できることは本発明の利
点である。
固体形でまたは溶液中でケイ光の量を測定する場合に、
ヨーロツパ特許出願０，０６４，４８４に記載されてい
るように、トリオクチルホスフイン オキシド（ＴＯＰ
Ｏ）を添加することにより改善された結果を得ることが
できる。これは標識付けした高分子物質を１０-10Ｍ濃
度より良好にまでケイ光測定できるようにする。
ヨーロツパ特許出願０，０６４，４８４に記載されてい
るように、トリオクチルホスフイン オキシド（ＴＯＰ
Ｏ）を添加することにより改善された結果を得ることが
できる。これは標識付けした高分子物質を１０-10Ｍ濃
度より良好にまでケイ光測定できるようにする。
適当には緩衝液中の溶液中の環状縮合生成物はケイ光測
定分析を行なうためのキツトの一部分を形成でき、縮合
生成物中に加えられている（直接にまたは実際に配合さ
れているＮＨ２−含有物質の活性基との後続の反応によ
る）有機物質は分析しようとする物質またはその補体、
たとえば適当な抗体または抗原のどちらかと相互反応で
きるように、分析しようとする物質に適当に対応して選
択する。このキツトは好ましくはＥｕ（III）またはＴ
ｂ（III）のようなランタニド金属イオンと縮合生成物
とのすでにキレート化されている錯体を包含する。この
キツトはまた、分離部品として、分析しようとする物質
に対する補体を含むことができ、この補体は固体支持体
上に結合させる。
定分析を行なうためのキツトの一部分を形成でき、縮合
生成物中に加えられている（直接にまたは実際に配合さ
れているＮＨ２−含有物質の活性基との後続の反応によ
る）有機物質は分析しようとする物質またはその補体、
たとえば適当な抗体または抗原のどちらかと相互反応で
きるように、分析しようとする物質に適当に対応して選
択する。このキツトは好ましくはＥｕ（III）またはＴ
ｂ（III）のようなランタニド金属イオンと縮合生成物
とのすでにキレート化されている錯体を包含する。この
キツトはまた、分離部品として、分析しようとする物質
に対する補体を含むことができ、この補体は固体支持体
上に結合させる。
本発明の実施態様 次例では下記の試薬を使用した。これらの例は例示の目
的だけで示すものであり、本発明の範囲を制限しようと
するものではない。
的だけで示すものであり、本発明の範囲を制限しようと
するものではない。
1)約１mg／ｍを含有する市販のウサギ抗−ＡＦＰ溶
液。
液。
2)ホルムアルデヒドが初めに３７〜４０重量／容量％で
あるホルムアルデヒド溶液の１：１０希釈液、すなわち
約１．４×１０-3モル／の濃度を有するホルムアルデ
ヒド溶液。
あるホルムアルデヒド溶液の１：１０希釈液、すなわち
約１．４×１０-3モル／の濃度を有するホルムアルデ
ヒド溶液。
3)１６０mM濃度のメタノール中のトリフルオルアセチル
アセトン銅（ＣｕＴＦＡＡ）の原液。
アセトン銅（ＣｕＴＦＡＡ）の原液。
例１ 抗−ＡＦＰ溶液４００μ（すなわち抗−ＡＦＰ２．７
×１０-8モル）をホルムアルデヒド稀釈溶液２００μ
（すなわちホルムアルデヒド２．７×１０-7モル）およ
びＣｕＴＦＡＡ ４μ（すなわちＣｕＴＦＡＡ５．４
×１０-7モル）とともにアセテート緩衝液（０．２Ｍ）
中で５．７のpHにおいて３７℃で１時間インキユベート
した。反応生成物をアセテート緩衝液に対して透析して
未反応の低分子物質を除去し、次いで１０-7Ｍ濃度でＥ
ｕ（III）イオンを含有するアセテート緩衝液に対して
透析してキレート化生成物（標識付けした抗体）を生成
させ、最後にアセテート緩衝液に対して透析して過剰の
Ｅｕ（III）を除去した。この標識付けした抗体をトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩類溶液／アジ
ド緩衝液（０．０２Ｍ）中の７．６のpHで分析の目的で
溶解した（ＮａＣｌ中５０mM）。所望により、これはク
ロマトグラフイによりさらに精製することができた。
×１０-8モル）をホルムアルデヒド稀釈溶液２００μ
（すなわちホルムアルデヒド２．７×１０-7モル）およ
びＣｕＴＦＡＡ ４μ（すなわちＣｕＴＦＡＡ５．４
×１０-7モル）とともにアセテート緩衝液（０．２Ｍ）
中で５．７のpHにおいて３７℃で１時間インキユベート
した。反応生成物をアセテート緩衝液に対して透析して
未反応の低分子物質を除去し、次いで１０-7Ｍ濃度でＥ
ｕ（III）イオンを含有するアセテート緩衝液に対して
透析してキレート化生成物（標識付けした抗体）を生成
させ、最後にアセテート緩衝液に対して透析して過剰の
Ｅｕ（III）を除去した。この標識付けした抗体をトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／塩類溶液／アジ
ド緩衝液（０．０２Ｍ）中の７．６のpHで分析の目的で
溶解した（ＮａＣｌ中５０mM）。所望により、これはク
ロマトグラフイによりさらに精製することができた。
例２ ウサギ抗体−ＡＦＰの代りに、分子量８０，０００のポ
リリジン使用して、前記例を繰返した。生成する標識付
けしたポリリジンを１−エチル−３（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を用いて抗体にカ
ツプリングさせた。
リリジン使用して、前記例を繰返した。生成する標識付
けしたポリリジンを１−エチル−３（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を用いて抗体にカ
ツプリングさせた。
例１および２で得られた標識付けした生成物を標準二部
位（“サンドイツチ”）分析法によるＡＦＰについての
分析に使用した。
位（“サンドイツチ”）分析法によるＡＦＰについての
分析に使用した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダクブ，サリフ アメリカ合衆国 01890 マサチユーセツ ツ州，ウインチエスター，ベルクナツプ テラス 19 (56)参考文献 特開 昭50−117779（ＪＰ，Ａ) 米国特許4374120（ＵＳ，Ａ)
Claims (20)
- 【請求項１】ケイ光測定分析技術で標識付けした試薬と
して使用するためのランタニド金属イオンとキレート化
することのできる物質であって、該物質は１，４−ジヒ
ドロピリジン環を含有し、かつβ−ジケトン、アルデヒ
ド及びNH2−含有有機物質の環状縮合生成物を含み、該
縮合生成物は抗原、抗体、ホルモン、酵素、タンパク
質、ハプテン及び結合されたサブユニットを含有する有
機化合物から選ばれた有機材料に結合されているか、又
は該縮合物は該有機材料にそれを介して結合することの
できる活性基を有している、ことを特徴とする上記物
質。 - 【請求項２】前記NH2−含有有機物質が抗原、抗体又は
結合されたサブユニットを含有する有機化合物である、
請求項１記載の物質。 - 【請求項３】前記NH2−含有有機物質は抗体又は抗原に
活性基を介して結合されたNH2−含有化合物である、請
求項１記載の物質。 - 【請求項４】前記NH2−含有有機物質は抗体又は抗原に
それを介して結合することのできる活性基を有している
リジン含有キレート又はポリリジンである、請求項１記
載の物質。 - 【請求項５】前記β−ジケトンはフッ素置換化合物であ
る、請求項１〜４のいずれかに記載の物質。 - 【請求項６】前記アルデヒドはホルムアルデヒドであ
る、請求項１〜５のいずれかに記載の物質。 - 【請求項７】前記β−ジケトン又はアルデヒドのいずれ
かはキレート特性を有している、請求項１〜５のいずれ
かに記載の物質。 - 【請求項８】抗原、抗体、ホルモン、酵素、タンパク
質、ハプテン及び結合されたサブユニットを含有する有
機化合物から選ばれたNH2−含有有機物質を、ケイ光測
定分析技術で用いるランタニド金属イオンで標識付けす
ることを可能にする方法であって、該NH2−含有有機物
質をβ−ジケトン及びアルデヒドと反応させて、１，４
−ジヒドロピリジン環を含有し、かつランタニド金属イ
オンにキレートし得る環状縮合生成物を形成することを
含む上記方法。 - 【請求項９】前記NH2−含有有機物質は抗体、抗原又は
結合されたサブユニットを含有する有機化合物である、
請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】抗原、抗体、ホルモン、酵素、タンパク
質、ハプテン及び結合されたサブユニットを含有する有
機化合物から選ばれた有機材料を、ケイ光測定分析技術
で用いるランタニド金属イオンで標識付けすることを可
能にする方法であって、該有機材料と反応し得る活性基
を有しているNH2−含有化合物をβ−ジケトン及びアル
デヒドと反応させて、１，４−ジヒドロピリジン環を含
有する環状縮合生成物を形成し、得られた生成物を該有
機材料に活性基を介して結合させて、これによりランタ
ニド金属イオンにキレートし得る物質を形成することを
含む上記方法。 - 【請求項１１】前記有機材料は抗原、抗体又は結合され
たサブユニットを含有する有機化合物である、請求項１
０記載の方法。 - 【請求項１２】ケイ光測定分析に用いる標識付けした試
薬であって、アルデヒド、β−ジケトンおよびNH2−含
有有機物質の環状縮合生成物を含み、該縮合生成物は、
１，４−ジヒドロピリジン環を含有し、かつランタニド
金属イオンをキレート化して、ケイ光分析的に評価し得
る錯体を形成していることを特徴とする上記試薬。 - 【請求項１３】前記環状縮合生成物中の１，４−ジヒド
ロピリジン環は、抗原、抗体、ホルモン、酵素、タンパ
ク質、ハプテン及び結合されたサブユニットを含有する
有機化合物から選ばれた有機材料に結合している、請求
項１２記載の標識付けした試薬。 - 【請求項１４】前記NH2−含有有機物質は抗原、抗体又
は結合されたサブユニットを含有する有機化合物であ
る、請求項１３記載の標識付けした試薬。 - 【請求項１５】前記ランタニド金属イオンはユーロピウ
ム(III)又はテルビウム(III)である、請求項１２〜１４
のいずれかに記載の標識付けした試薬。 - 【請求項１６】アルデヒド、β−ジケトン及びNH2−含
有有機物質の環状縮合生成物であって、１，４−ジヒド
ロピリジン環を含有し、かつランタニド金属イオンにキ
レートして、ケイ光測定的に評価し得る錯体を形成して
いる上記縮合生成物を標識付けした試薬として用いる、
有機物質のケイ光測定分析方法。 - 【請求項１７】前記分析は、分析すべき物質を初めにそ
の補体と反応させて、これを該補体に結合させ、次いで
標識付けした試薬と反応させる技術を用いて行い、該標
識付けした試薬は、分析しようとする物質が補体に結合
しながら相互作用することのできる有機残基を含むもの
であるか、又は、前記分析は、分析しようとする物質と
標識付けした試薬とが補体上の反応部位に対して競合す
る技術を用いて行い、該標識付けした試薬は、補体と結
合することのできる有機残基を含むものである、請求項
１６記載の方法。 - 【請求項１８】ランタニド金属イオンが、標識付けした
試薬と、分析しようとする物質、又はその補体、又は分
析しようとする物質とその補体、との反応生成物中にま
だ存在しているうちに、ケイ光を測定する請求項１６又
は１７記載の方法。 - 【請求項１９】標識付けした試薬と、分析しようとする
物質、又はその補体、又は分析しようとする物質とその
補体、との反応生成物から、ランタニド金属イオンを抽
出した後に、ケイ光を測定する請求項１６又は１７記載
の方法。 - 【請求項２０】抗体又は抗原のケイ光測定分析に用いる
キットであって、β−ジケトン、アルデヒド、及び分析
しようとする抗体もしくは抗原又はその補体のいずれか
と相互作用することができる有機物質の環状縮合生成物
の緩衝液溶液を含み、該有機物質は、それがNH2を含有
している場合は該環状縮合生成物中に直接的に付加され
ているか、又は該有機物質は、それ自体ではNH2を含有
していない場合は該環状縮合生成物中に直接的に付加す
るNH2−含有化合物に結合しており、該縮合生成物は
１，４−ジヒドロピリジン環を含有し、かつランタニド
金属イオンをキレートして標識付けした試薬を形成する
ことを特徴とする上記キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8421318 | 1984-08-22 | ||
| GB848421318A GB8421318D0 (en) | 1984-08-22 | 1984-08-22 | Potentiating antibodies/other macro-molecules |
| PCT/GB1985/000377 WO1986001604A1 (en) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | Labelled and labellable reagents for fluorometric assays |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501442A JPS62501442A (ja) | 1987-06-11 |
| JPH0625765B2 true JPH0625765B2 (ja) | 1994-04-06 |
Family
ID=10565671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60503723A Expired - Lifetime JPH0625765B2 (ja) | 1984-08-22 | 1985-08-22 | 標識付けしたおよび標識付けできるケイ光測定分析用試薬 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4857475A (ja) |
| EP (1) | EP0222766B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0625765B2 (ja) |
| AU (1) | AU4724185A (ja) |
| DE (1) | DE3583507D1 (ja) |
| DK (1) | DK184586D0 (ja) |
| FI (1) | FI87022C (ja) |
| GB (1) | GB8421318D0 (ja) |
| NO (1) | NO861555L (ja) |
| WO (1) | WO1986001604A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4886744A (en) * | 1985-04-25 | 1989-12-12 | Polaroid Corporation | Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay system |
| GB8602304D0 (en) * | 1986-01-30 | 1986-03-05 | Dakubu S | Dihydropyridine condensation products |
| GB8622855D0 (en) * | 1986-09-23 | 1986-10-29 | Ekins R P | Determining biological substance |
| US5089423A (en) * | 1987-05-06 | 1992-02-18 | Cyberfluor Inc. | Immunoassay methods and reagents and methods for producing the latter |
| GB8803000D0 (en) * | 1988-02-10 | 1988-03-09 | Ekins Roger Philip | Determination of ambient concentrations of several analytes |
| SE8703682L (sv) * | 1987-09-24 | 1989-03-25 | Wallac Oy | Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner |
| US5308754A (en) * | 1988-03-21 | 1994-05-03 | Kankare Jouko J | Electrogenerated luminescence in solution |
| SE8801702D0 (sv) * | 1988-05-05 | 1988-05-05 | Pharmacia Ab | Sett vid bestemning av enzymatisk aktivitet |
| US5240867A (en) * | 1989-02-09 | 1993-08-31 | Fujitsu Limited | Semiconductor integrated circuit having interconnection with improved design flexibility, and method of production |
| FI88654C (fi) * | 1991-03-15 | 1993-06-10 | Datacity Center Oy | Fluorescenshoejningsmetod |
| US5312922A (en) * | 1992-04-06 | 1994-05-17 | Nordion International Inc. | Europium and terbium chelators for time-resolved fluorometric assays |
| GB0210535D0 (en) * | 2002-05-08 | 2002-06-19 | Novartis Ag | Organic compounds |
| US7906343B2 (en) * | 2005-01-24 | 2011-03-15 | Sri International | Surface-enhanced lanthanide chelates |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374120A (en) * | 1979-03-08 | 1983-02-15 | Wallac Oy | Fluorescence spectroscopy assay means with fluorescent chelate of a lanthanide |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3956341A (en) * | 1974-02-21 | 1976-05-11 | Smithkline Corporation | 1,3,5-Tricarbo-1,4-dihydropyridines |
| US4352751A (en) * | 1979-09-10 | 1982-10-05 | Analytical Radiation Corporation | Species-linked diamine triacetic acids and their chelates |
-
1984
- 1984-08-22 GB GB848421318A patent/GB8421318D0/en active Pending
-
1985
- 1985-08-22 US US06/862,215 patent/US4857475A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-22 AU AU47241/85A patent/AU4724185A/en not_active Abandoned
- 1985-08-22 DE DE8585904129T patent/DE3583507D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-08-22 JP JP60503723A patent/JPH0625765B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-22 EP EP85904129A patent/EP0222766B1/en not_active Expired
- 1985-08-22 WO PCT/GB1985/000377 patent/WO1986001604A1/en not_active Ceased
-
1986
- 1986-04-18 NO NO861555A patent/NO861555L/no unknown
- 1986-04-22 DK DK184586A patent/DK184586D0/da not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-02-20 FI FI870716A patent/FI87022C/fi not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4374120A (en) * | 1979-03-08 | 1983-02-15 | Wallac Oy | Fluorescence spectroscopy assay means with fluorescent chelate of a lanthanide |
Also Published As
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|---|---|
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| EP0222766B1 (en) | 1991-07-17 |
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| DK184586A (da) | 1986-04-22 |
| JPS62501442A (ja) | 1987-06-11 |
| FI87022C (fi) | 1992-11-10 |
| FI87022B (fi) | 1992-07-31 |
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| FI870716A0 (fi) | 1987-02-20 |
| US4857475A (en) | 1989-08-15 |
| NO861555L (no) | 1986-04-18 |
| FI870716L (fi) | 1987-02-20 |
| WO1986001604A1 (en) | 1986-03-13 |
| DK184586D0 (da) | 1986-04-22 |
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