JPH06261708A - ステビオシド誘導体糖付加物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ステビオシド誘導体に１個または２個のグル
コース分子が結合しているステビオシド誘導体糖付加物
を効率的に製造する方法を提供すること。 【構成】 澱粉または澱粉分解物にデキストリンデキス
トラナーゼを作用させてステビオシド誘導体にグルコー
スを付加することを包含する、ステビオシド誘導体糖付
加物混合物の製造方法であって、枝切り酵素を併用する
ことを包含する。得られたステビオシド誘導体糖付加物
混合物は、グルコース分子を１個または２個有するステ
ビオシド誘導体糖付加物を主成分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は甘味料として利用されて
いるステビオシド誘導体糖付加物を効果的に製造する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ステビオシド誘導体は、キク科の植物で
あるステビア・レバウディアナ・ベルトーニ（Stevia r
ebaudiana BERTONI）の葉または茎などから抽出するこ
とにより得られる天然の配糖体であり、例えば、ステビ
オシド、レバウディオシドＡ、レバウディオシドＣなど
が挙げられる。ステビオシドは、非常に強い甘味を呈す
ることから、低カロリー甘味料として飲食物に使用され
ている。レバウディオシドＡは、ステビオシドより甘味
度が高く、味質も優れている。しかし、これらのステビ
オシド誘導体は、甘味以外に強い苦味などの嫌味を呈す
ること、甘味の切れが悪く残味として尾を引くことなど
の欠点を有する。そこで、これらの欠点を改良する目的
で、ステビオシド誘導体に糖を付加したステビオシド誘
導体糖付加物が多く開発され、使用されている。具体的
には、グルコース供与体とステビオシド誘導体とを混合
し、ステビオシド誘導体にグルコース転移能を有する種
々の酵素を作用させることにより、種々の長さの糖が付
加したステビオシド誘導体糖付加物を含有する混合物
（以下、ステビオシド誘導体糖付加物混合物という）が
製造され、使用されている。ここで、グルコース供与体
としては、マルトオリゴ糖、澱粉または澱粉分解物など
が挙げられる。

【０００３】このうち最も多く製造され、使用されてい
るステビオシド糖付加物混合物は、澱粉にシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、CGTa
seという）を作用させて、ステビオシドにグルコースを
転移することにより製造されるステビオシド糖付加物混
合物である。このステビオシド糖付加物混合物は、ステ
ビオシドに約１個〜１５個のグルコース分子がα-1,4結
合した構造のステビオシド糖付加物の混合物である。こ
のステビオシド糖付加物混合物は、未反応のステビオシ
ドを１０％以上含有している。ステビオシドに付加され
ているグルコース鎖は、長ければ長いほど味質は良好と
なるが、甘味度は急激に減退することが知られており、
ステビオシドにグルコース分子が１個または２個結合し
たステビオシド糖付加物を多く含有するステビオシド糖
付加物混合物が好ましい。そのため、ステビオシドへの
糖転移数の調節が行われている。CGTaseの反応を制御す
ることによってグルコースの付加数を調節することは困
難であるため、上記ステビオシド糖付加物混合物に、β
-アミラーゼを適当な条件で反応させ、主に１個〜４個
と比較的少数のグルコース分子鎖を有するステビオシド
糖付加物の混合物を得る。未反応のステビオシドは樹脂
処理を行うことにより分離除去する。樹脂処理によって
除去される未反応のステビオシドは、ステビオシド糖付
加物の製造の原料として再使用される。このようにして
製造されたステビオシド糖付加物混合物は、甘味度およ
び味質ともに良好であり、残存するステビオシドは３〜
４％である。しかし、上記の方法でステビオシド糖付加
物混合物を製造するには工程が多く、コストがかかる。
しかも、一回の製造で得られるステビオシド糖付加物の
収率は少ない。

【０００４】一方、ステビオシドにグルコース分子が１
個以上α-1,6結合した構造を有するステビオシド糖付加
物（以下、α-1,6結合ステビオシド糖付加物という）も
また知られており、これはグルコースがα-1,4結合した
ステビオシド糖付加物（以下、α-1,4結合糖付加物とい
う）に比べて味質が良好であると言われている。このよ
うなα-1,6結合ステビオシド糖付加物は、ステビオシド
と蔗糖との混合物にデキストランスクラーゼを作用させ
ることにより製造できる。しかし、この方法は工業化さ
れるに至っていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来の問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、ステ
ビオシド誘導体に１個または２個のグルコース分子が結
合しているステビオシド誘導体糖付加物を効率的に製造
する方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、澱粉または澱
粉分解物にデキストリンデキストラナーゼを作用させて
ステビオシド誘導体にグルコースを付加することを包含
するステビオシド誘導体糖付加物混合物の製造方法であ
って、枝切り酵素を併用することを包含し、かつ、この
ステビオシド誘導体糖付加物混合物は、グルコース分子
を１個または２個有するステビオシド誘導体糖付加物を
主成分として含有する。

【０００７】好適な実施態様においては、上記デキスト
リンデキストラナーゼ、上記枝切り酵素および上記ステ
ビオシド誘導体は、任意の順序で混合される。

【０００８】本明細書において、「ステビオシド誘導
体」とは、ステビオシドおよびその類似体の天然物をさ
していう。それには例えば、ステビオシド、ステビオシ
ドにグルコースがβ-1,3結合で１個付加したレバウディ
オシドＡ、ステビオシドにラムノースがβ-1,3結合で１
個付加したレバウディオシドＣなどが包含される。いず
れもステビア乾燥葉中の甘味成分である。

【０００９】本発明に用いる澱粉とは、アミラーゼなど
の澱粉分解酵素や酸などによる分解処理をしていない未
分解の澱粉をいう。澱粉の分解物とは、ここでは澱粉の
酸加水分解物、またはアミラーゼなどの酵素処理による
分解物をいい、澱粉分解物の分解限度は特に限定されな
い。本発明において、澱粉および澱粉分解物はグルコー
ス供与体として用いられる。

【００１０】本発明に用いられるデキストリンデキスト
ラナーゼ(DDase)は、グルコノバクターオキシダンスＡ
ＴＣＣ１１８９４株(Gluconobacter oxydans; American
Type Culture Collection strain No.11894)、グルコ
ノバクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９５株(Glucono
bacter oxydans; American Type Culture Collectionst
rain No.11895)などの酢酸菌に存在する酵素として従来
から知られている。これら酢酸菌においては、病原性な
どは知られておらず、従ってこれらの菌由来のDDaseを
食品原料加工に用いても安全である。本発明においては
好ましくは、上記DDaseは、本発明者らによる精製法
（特願平3-69590号において詳細に記載されている）精
製されたものが用いられる。

【００１１】本発明に用いられるDDaseの製造および精
製法は例えば次のとおりである。

【００１２】まず、グルコノバクターオキシダンスＡＴ
ＣＣ１１８９４株(Gluconobacter oxydans; American T
ype Culture Collection strain No.11894)、グルコノ
バクターオキシダンスＡＴＣＣ１１８９５株(Gluconoba
cter oxydans; American Type Culture Collection str
ain No.11895)、またはグルコノバクターに属するその
他のDDase生産菌を、常法により培養する。培養後、採
取した菌体をそのままあるいは細胞破壊した後、緩衝液
に懸濁する。緩衝液としては、酢酸緩衝液などDDaseが
安定に存在できるｐＨの水溶液を用いることが望まし
い。必要に応じて菌体を除去することにより、粗酵素液
が得られる。

【００１３】この粗酵素液は、次のようにして精製され
る。まず、上記粗酵素液（菌体を含んでいてもよい）
を、極性の低い有機溶媒で抽出し、これを除去する。水
層を集め、透析した後、疎水クロマトグラフィーに供す
る。次に、吸着したタンパク質を、水と容易に混合し得
るアルコール類（例えば、エチレングリコール）などを
含有する緩衝液で溶出した後、これを濃縮し、同じく緩
衝液で平衡化したゲル濾過カラムに供し回収する。上記
低い極性の有機溶媒とは、ヘキサンの極性を０、水の極
性を９としたときに５より低いものをさしていう。例え
ば、n-ブタノール、クロロホルムなどが好適に用いられ
る。上記疎水クロマトグラフィーに吸着した酵素を溶出
する際には、例えば、極性が５以上の有機溶媒が好適に
用いられる。このような有機溶媒としては、アルコール
類（例えば、n-ブタノール、エチレングリコールな
ど）、アセトンなどが挙げられる。

【００１４】本発明に用いられ得る精製DDaseは以下の
特徴を有する。

【００１５】１）作用 本酵素はグルコース供与体となる化合物の構造中の非還
元末端にα-1,4結合あるいはα-1,6結合しているグルコ
ース残基を、α-1,6結合の様式で受容体へ転移させる。
このDDaseの作用はグルコース供与体の還元末端に位置
するグルコースが水素添加などの修飾を受けていても同
様である。

【００１６】２）最適ｐＨおよび安定ｐＨ DDaseの最適作用ｐＨは4.0〜4.5であり、各種ｐＨ条件
下で30分置いた時にｐＨ2.5〜6.0で安定である。

【００１７】３）最適温度および安定温度 DDaseの最適作用温度は37〜45℃であり、各種温度条件
下で30分置いた時に45℃以下で安定である。本酵素は55
℃まで活性を有する。

【００１８】４）分子量 電気泳動によるDDaseの分子量は約30万である。

【００１９】５）力価測定法 酵素反応基質には還元低加水分解澱粉を用い、反応によ
って生成したデキストランをデキストラナーゼを用いて
分解後、この時生じる還元力を測定することによりデキ
ストラン生成量を求める。力価は、１分間に１μmolの
グルコース単位がデキストランとなる時の酵素量を１Ｕ
とする。

【００２０】本発明に用いられる枝切り酵素とは、澱粉
の構造中に存在するα-1,6グルコシル結合している分枝
部分に作用し、これを切断する酵素であり、例えば、イ
ソアミラーゼまたはプルラナーゼが挙げられる。イソア
ミラーゼを澱粉またはα-1,6結合を有する澱粉分解物に
作用させることにより、非還元末端にα-1,4結合を有す
るアミロース様多糖を生成する。プルラナーゼは澱粉分
子の外側に存在する分枝部分のみに作用し、内部の分枝
部分には作用しない。しかし、澱粉の外側の直鎖部分が
DDaseにより分解されて短くなるにつれて、澱粉の内部
に存在する分枝部分が露出するため、その分枝部分にプ
ルラナーゼが作用し、同様にしてアミロース様多糖が生
成する。従って、プルラナーゼとDDaseとを併用する
と、澱粉分子の外側に存在するα-1,6結合に対してプル
ラナーゼが作用してα-1,4結合を有するアミロース様多
糖が有効なグルコース供与体として生成する。

【００２１】グルコース供与体として澱粉または澱粉分
解物を用い、それにDDaseを作用させることによって、
ステビオシド誘導体糖付加物を製造する際に、イソアミ
ラーゼまたはプルラナーゼのような枝切り酵素を併用す
ることにより、グルコース分子が１個または２個結合し
た糖付加物を多く含有するステビオシド誘導体糖付加物
混合物を製造することができる。枝切り酵素を添加しな
い場合には、糖付加物はあまり生成されないが、枝切り
酵素を添加すると、DDaseのみの場合よりも未反応のス
テビオシド誘導体が減少し、グルコース分子が１個また
は２個結合した糖付加物を含有するステビオシド誘導体
糖付加物混合物を効率よく製造することができる。

【００２２】本発明においてもっとも有効なグルコース
供与体は、アミロース（枝切り酵素により澱粉の構造中
に存在するα-1,6結合している分枝部分が切断されたグ
ルコースがα-1,4結合した直鎖化合物）であり、分枝構
造を有する化合物は、優れたグルコース供与体とはなら
ない。しかし、アミロースは、きわめてすみやかに老化
を起こし、反応系外へでてしまい効率よく反応させるこ
とは容易ではない。そこで、澱粉または澱粉分解物（こ
れらは、構造中にα-1,6結合している分枝部分を有す
る）をグルコース供与体として用いる際に、枝切り酵素
を併用すれば、連続的にアミロースを反応系に供給する
ことができる。アミロースは、DDaseによりグルコース
供与体として効率よく消費されるので、アミロースの老
化を引き起こすことなく、グルコース分子が１個または
２個結合した糖付加物を含有するステビオシド誘導体糖
付加物を効率よく製造することができる。このようにし
て製造されたステビオシド誘導体糖付加物混合物は、グ
ルコース分子が１個または２個結合した糖付加物を多く
含有する。すなわち、本発明によれば、β-アミラーゼ
処理または樹脂処理の工程を経なくても、グルコース分
子が１個または２個結合したステビオシド誘導体糖付加
物を大量に効率よく製造することができる。

【００２３】上記DDaseをグルコース供与体に酵素化学
的に作用させるには通常の酵素反応の条件が採用され得
る。例えば、本発明で用いる酵素反応の条件は、好まし
くはｐＨ3.0〜5.5、温度２０〜４５℃、そして反応時間
１〜７２時間である。この反応系に、さらに上記枝切り
酵素が加えられる。このときに用いるDDaseおよび枝切
り酵素は粗精製のものでも良く、その精製の度合は特に
限定されない。DDaseに加えてさらに枝切り酵素を併用
することにより、味質が優れている、１個または２個の
グルコース分子が結合したα-1,6結合ステビオシド誘導
体糖付加物を非常に効率よく製造することができる。α
-1,6結合ステビオシド誘導体糖付加物は、α-1,4結合ス
テビオシド誘導体糖付加物に比べて味質が優れている。

【００２４】

【作用】DDaseは、グルコース供与体となる化合物の構
造中の非還元末端にα-1,4結合あるいはα-1,6結合して
いるグルコース残基を、α-1,6結合の様式で受容体へ転
移させる。従来においてはDDaseはα-1,4結合にのみ作
用すると考えられてきたが、本発明者らによってDDase
がα-1,6結合にも作用して、α-1,6結合の様式で受容体
へ転移することが明らかになった。すなわち、DDaseが
ステビオシド誘導体にグルコースを付加する際、グルコ
ース供与体としてα-1,4結合を非還元末端に有する化合
物だけでなく、デキストランまたはイソマルトオリゴ糖
などのα-1,6グリコシル基を非還元末端に有する化合物
も利用できることがわかった。一方、この転移反応にお
いて受容体としては、ステビオシド誘導体（その構造中
に１個から数個のグルコース残基および／またはラムノ
ース残基を非還元末端に有する）が用いられるが、上記
DDaseの酵素反応においては、グルコースが非還元末端
に結合した構造の化合物のいずれも（オリゴ糖、配糖
体、多糖類など）が受容体となり得る。

【００２５】このように、デキストランのようなα-1,6
結合を有するグルコース供与体とステビオシド誘導体と
の混合物にDDaseを作用させることによっても、ステビ
オシド誘導体糖付加物混合物を製造することができるこ
とが明らかとなった。デキストランは、澱粉または澱粉
分解物に枝切り酵素およびDDaseを作用させることによ
り効率的に製造することができるため、安価にステビオ
シド誘導体糖付加物が製造され得る。一方、ステビオシ
ド誘導体糖付加物混合物は、澱粉または澱粉分解物に枝
切り酵素およびDDaseを適当な時間作用させた後、これ
にステビオシド誘導体を添加することによっても製造さ
れ得る。それぞれの酵素およびステビオシド誘導体の添
加の順序および時期は限定されない。

【００２６】以下に実施例を挙げ本発明を説明する。特
に指示のない限り、本実施例において、％は重量％を示
す。

【００２７】

【実施例】

（実施例１）２％ステビオシド25μｌおよび２％とうも
ろこし澱粉25μｌに特願平3-69590号の方法で得られた1
0U/mlDDase50μｌを加え、ｐＨ4.8で４０℃にて２時間
反応させた後、これに全容量と等容のエタノールを加え
て４℃で２時間放置した。これを遠心分離して得られた
上清を分析したところ、反応に用いたステビオシドの重
量に対して、それぞれ残存ステビオシド27.9％、Ｇ-α-
1,6-ステビオシド42.2％、Ｇ-α-1,6-Ｇ-α-1,6-ステビ
オシド23.0％が含有されていた。

【００２８】（実施例２）10％ステビオシドおよび10％
低糖化水飴を含む溶液２mlに、実施例１と同様の23U/ml
DDase0.5mlおよび1,250,000U/mlイソアミラーゼ（天野
製薬製、商品名「イソアミラーゼ「アマノ」」）を加
え、ｐＨ4.8で４０℃にて２時間反応させた後、これに
全容量の３倍容のエタノールを加え、４℃で２時間放置
した。これを遠心分離して得られた上清を濃縮し、ステ
ビオシド糖付加物混合物を得た。得られた糖付加物混合
物を分析したところ、反応に用いたステビオシド重量に
対して、それぞれ残存ステビオシド3.3％、Ｇ-α-1,6-
ステビオシド36.1％、Ｇ-α-1,6-Ｇ-α-1,6-ステビオシ
ド51.7％が含有されていた。この結果を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】（実施例３）10％ステビオシドおよび10％
とうもろこし澱粉を含む溶液２mlに、実施例１と同様の
23U/mlDDase0.5mlおよび400U/mlプルラナーゼ（林原生
物化学研究所製、商品名「プルラナーゼ」）を加え、ｐ
Ｈ4.8で４０℃にて２時間反応させた後、これに全容量
の３倍容のエタノールを加えて４℃で２時間放置した。
これを遠心分離して得られた上清を濃縮し、ステビオシ
ド糖付加物混合物を得た。得られたステビオシド糖付加
物混合物を分析したところ、反応に用いたステビオシド
重量に対して、それぞれ残存ステビオシド2.8％、Ｇ-α
-1,6-ステビオシド36.7％、Ｇ-α-1,6-Ｇ-α-1,6-ステ
ビオシド51.6％が含有されていた。

【００３１】（実施例４）10％とうもろこし澱粉を含む
溶液２mlに、実施例１と同様の23U/mlDDase0.5mlおよび
400U/mlプルラナーゼ（林原生物化学研究所製、商品名
「プルラナーゼ」）を加え、ｐＨ4.8で４０℃にて２時
間反応させた後、最終濃度が10％となるようにステビオ
シドを加え、さらにｐＨ4.8で４０℃にて１３０時間反
応させた。これに全容量の３倍容のエタノールを加えて
４℃で２時間放置した。これを遠心分離して得られた上
清を濃縮し、ステビオシド糖付加物混合物を得た。得ら
れたステビオシド糖付加物混合物を分析したところ、反
応に用いたステビオシド重量に対して、それぞれ残存ス
テビオシド7.3％、Ｇ-α-1,6-ステビオシド35.8％、Ｇ-
α-1,6-Ｇ-α-1,6-ステビオシド48.4％が含有されてい
た。

【００３２】（実施例５）10％ステビオシドおよび５、
10、または25％の低糖化水飴を含む溶液0.4mlの各々
に、10U/mlDDase0.1mlおよび125,000U/mlイソアミラー
ゼ（天野製薬製、商品名「イソアミラーゼ「アマ
ノ」」）を加え、ｐＨ4.8で４０℃にて４時間反応させ
た。これとは別に、10％ステビオシドおよび10％低糖化
水飴を含む溶液0.4mlに、10U/mlCGTase（天野製薬製、
商品名「コンチザイム」）を加え、ｐＨ6.0で４０℃に
て４時間反応させた。これらの条件において反応は全て
ほぼ定常状態になっている。これらそれぞれに全容量と
等容のエタノールを加え、４℃で１時間放置した後、こ
れらを遠心分離して得られた上清を分析した。その結果
を表２に示す。

【００３３】

【表２】

【００３４】（実施例６）１％レバウディオシドＡおよ
び２％の低糖化水飴を含む溶液１ｍｌに、１U/mlDDase2
00μｌを加え、ｐＨ4.8で４０℃にて７時間反応させ
た。これに、全容量の３倍容のエタノールを加え、２時
間放置した後、これを遠心分離して得られた上清を濃縮
し、レバウディオシドＡ糖付加物混合物を得た。得られ
たレバウディオシドＡ糖付加物混合物を分析したとこ
ろ、反応に用いたレバウディオシドＡ重量に対して、そ
れぞれ残存レバウディオシドＡ13.8％、Ｇ-α-1,6-レバ
ウディオシドＡ52.7％、Ｇ-α-1,6-Ｇ-α-1,6-レバウデ
ィオシドＡ27.3％が、含有されていた。

【００３５】（実施例７）10％レバウディオシドＡおよ
び10％の低糖化水飴を含む溶液８ｍｌに、５U/mlDDase2
8mlおよび125,000U/mlイソアミラーゼ（天野製薬製、商
品名「イソアミラーゼ「アマノ」」）を加え、ｐＨ4.8
で４０℃にて22時間反応させた。これに全容量の３倍容
のエタノールを加え、２時間放置した後、これを遠心分
離して得られた上清を濃縮し、レバウディオシドＡ糖付
加物混合物を得た。得られたレバウディオシドＡ糖付加
物混合物を分析したところ、反応に用いたレバウディオ
シドＡ重量に対して、それぞれ残存レバウディオシドＡ
12.4％、Ｇ-α-1,6-レバウディオシドＡ49.0％、Ｇ-α-
1,6-Ｇ-α-1,6-レバウディオシドＡ25.3％が含有されて
いた。

【００３６】

【発明の効果】本発明により、味質が優れている、１個
または２個のグルコース分子が結合しているステビオシ
ド誘導体糖付加物を効率的に製造することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】澱粉または澱粉分解物にデキストリンデキ
   ストラナーゼを作用させてステビオシド誘導体にグルコ
   ースを付加することを包含する、ステビオシド誘導体糖
   付加物混合物の製造方法であって、 枝切り酵素を併用することを包含し、かつ、 該ステビオシド誘導体糖付加物混合物が、グルコース分
   子を１個または２個有するステビオシド誘導体糖付加物
   を主成分として含有する、 方法。
2. 【請求項２】前記デキストリンデキストラナーゼ、前記
   枝切り酵素および前記ステビオシド誘導体が任意の順序
   で混合される、請求項１に記載の方法。