JPH06261759A - 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、炭疽菌（Bacillus anthrac
is）を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを提
供し、それを用いて炭疽菌を検出する方法を提供するこ
とにある。 【構成】 検体中に存在する炭疽菌を選択的に検出する
ためのオリゴヌクレオチド、または、炭疽菌のプラズミ
ドのcapA遺伝子をコ−ドするヌクレオチド配列を標的と
し、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学合
成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチ
ドが以下の配列群またはそれらに対応する相補的配列か
らなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。及びその
合成ヌクレオチドを用いた炭疽菌の検出方法。 ５’＞ＧＣＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧ＜３’・・・・・・ＭＯ１ ５’＞ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＧ＜３’・・・・・・・・ＭＯ２

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、獣医臨床検
査、あるいは食品検査での炭疽菌の検出に用いるオリゴ
ヌクレオチド及びそれを用いた炭疽菌の検出法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】炭疽は草食獣における伝染病であるが、
ヒトにも発生し、人獣共通伝染病として公衆衛生上にも
極めて重要な疾病である。日本では、本病は家畜の法定
伝染病として指定されており、ヒトでは届出伝染病とな
っている。炭疽病の発生は近年少なくなってはいるが、
炭疽菌の芽胞で汚染された土壌を持つ地域では、常に炭
疽菌によるヒト及び家畜の汚染をモニタリングする必要
がある。従来、炭疽菌の検出はセレウス菌（Bacillus c
ereus ）の検出法に準じて行なわれていた。つまり、検
体にその９倍量の希釈水を加えストマッカ−あるいはブ
レンダ−で均質化する。生成したホモジネ−トをポリミ
キシン加トリプトケ−スソイブイヨン培地で、３２〜３
５℃、１８〜２４時間、選択増菌培養を行なう。培養
後、その液の１白金耳量を、マンニト−ル卵黄ポリミキ
シン寒天培地、キム・ゲッパ−ト寒天培地などのセレウ
ス菌選択分離培地に塗抹する。それをさらに３２〜３５
℃で１８〜２４時間培養して、寒天上に生じたマンニッ
ト非分解、卵黄反応陽性、灰白色ワックス状、表面が粗
く大きいコロニ−を釣菌する。これをさらに、普通寒天
培地またはハ−トインフュ−ジョン寒天培地に３２〜３
５℃、１８〜２４時間培養して生育した菌体について、
グラム染色、莢膜染色と免疫学的検査を行なう。あるい
はガンマファ−ジの感受性の試験を行なう。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、グラム
染色と莢膜染色は他の類縁菌、例えばバチルス メガテ
リウム（Bacillus megaterium）, バチルス リケニフ
ォルミス（Bacillus licheniformis）, バチルス ズブ
チリス（Bacillus subtilis）等も炭疽菌と同様の反応
を起こすこと、ガンマファ−ジ感受性試験は多量の菌体
を要することと試験に数日間を要することで、炭疽菌の
有効なモニタリングの手段ではない。感受性が高く、信
頼性に富み、迅速で簡便な炭疽菌の検出方法が公衆衛生
の見地から要請されているのが実状である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は下記の構成を有
する。 （１）検体中に存在する炭疽菌（Bacillus anthracis）
を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチド、また
は、炭疽菌のプラズミドのcapA遺伝子をコ−ドするヌク
レオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補
的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであ
って、合成ヌクレオチドが以下の配列群またはそれらに
対応する相補的配列からなることを特徴とするオリゴヌ
クオチド。 ５’＞ＧＣＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧ＜３’・・・・・・ＭＯ１ ５’＞ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＧ＜３’・・・・・・・・ＭＯ２ （２）前記第１項に記載された配列のうち、少なくとも
１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマ
−として機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増
幅させることを特徴とする方法であって、（ａ）検体中
の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプライマ−をハ
イブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重合反応により
鎖長反応を行わせ、（ｂ）得られた２本鎖ヌクレオチド
配列を１本鎖に分離した場合、その相補鎖は他方のプラ
イマ−による鎖長反応の鋳型として機能し、（ｃ）これ
ら２種のプライマ−による同時の鎖長反応、鎖長生成物
の鋳型からの分離、そして新たなプライマ−によるハイ
ブリダイゼ−ションを繰り返すことにより特定のヌクレ
オチド配列が増幅され、電気泳動、クロマトグラフィ−
で増幅されたヌクレオチド断片を検出し、（ｄ）前記検
体中に認識されるべき配列が存在しているか否かを判定
することことを特徴とする炭疽菌の検出方法。 （３）前記第２項に記載された方法における反応物を用
い、電気泳動および核酸染色を行なうことによる炭疽菌
の検出方法。

【０００５】本発明は、オリゴヌクレオチド及び該オリ
ゴヌクレオチドをプライマ−として機能させた遺伝子増
幅法により炭疽菌を選択的に検出することを特徴として
いる。遺伝子増幅法としていろいろな方法が報告されて
いるが、最も一般的なものはSaiki らが開発したポリメ
ラ−ゼ・チェイン反応（以下ＰＣＲ法と略す。Science
230:1350-1354(1985))が挙げられる。この方法は、ある
特定のヌクレオチドの配列を検出する場合、その配列の
両端の核酸の一方に相補する配列の合成ヌクレオチドを
それぞれ用意しこれをプライマ−とする。一方、９０〜
９５℃で熱変性して一本鎖にした試料の核酸に、３７〜
６５℃でプライマ−をハイブリダイズさせる。つぎにＤ
ＮＡ合成酵素と基質を加え、５０〜７５℃でヌクレオチ
ド重合反応を行なわしめる。生成した２本鎖ＤＮＡを再
び熱変性によって一本鎖にし、同様な反応を行なわしめ
ると、その一本鎖に相補する配列のＤＮＡが得られ２本
鎖になる。このサイクルを約２０〜４０回繰り返すと目
的の塩基配列を持つ核酸が増幅してくるので、これを電
気泳動等の手段で検出する。

【０００６】検体として、尿、血液、糞便、組織切片な
どの臨床材料、獣医臨床材料、あるいは食肉等の食品材
料でも良い。または、それらの材料から分離した微生物
の菌体あるいは培養液でも良い。これらの検体を溶菌酵
素、界面活性剤、アルカリ等で短時間処理することによ
り、ＰＣＲに必要な核酸を含んだ試料液を得る。

【０００７】プライマ−としては１０塩基以上の長さを
持った核酸フラグメントであれば、化学合成したもので
も天然物でも、どちらでも良いが、炭疽菌の染色体ある
いはプラズミドの特定の遺伝子に相補し、炭疽菌の類縁
菌を含めた炭疽菌以外の生物種の遺伝子に相補しない配
列を持つことが好ましい。より好ましくは、炭疽菌の野
生株の持つ病原性プラズミドｐＴＥ７０２中に存在する
莢膜形成の遺伝子capAのいずれか一部の塩基配列と相補
する配列を持つものが良い。

【０００８】ＰＣＲ反応には耐熱性のＤＮＡポリメラ−
ゼが必要である。この酵素は９０〜９５℃の温度で耐熱
性を保持していれば、どの生物種の由来のものでも良
い。

【０００９】ＰＣＲ反応によって増幅された核酸はいか
なる手段で検出しても良いが、好ましくはポリアクリル
アミドまたはアガロ−スを担体とし、臭化エチジウムを
核酸の染色剤とした電気泳動で検出するのが好ましい。

【００１０】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００１１】実施例１ 炭疽菌としてバチルス アントラキス デイビス（Baci
llus anthracis Davis）及びバチルス アントラキス
パスツールII（Bacillus anthracis PasteurII）を用い
た。その他、表１に示すようにグラム陽性菌として１６
種、グラム陰性菌として２２種の菌株を用いた。それら
の菌株をそれぞれブイヨン培地で３７℃で１夜培養し、
生成した菌体を遠心分離で集めた。その菌体をリゾチ−
ムが10mg/mL の濃度で入ったＴＥＳバッファ−（ｐＨ8.
0 ）、つまりトリス塩酸塩５０ミリモル濃度、ＥＤＴＡ
５ミリモル濃度、塩化ナトリウム５０ミリモル濃度に懸
濁し て、ドデシル硫酸ナトリウムとプロテイナ−ゼＫ
を加えた。５５℃で保温した 後、リボヌクレア−ゼ処
理でＲＮＡを取り除いた。ＤＮＡをフェノ−ル−クロロ
フォルム法で除タンパクをして３回抽出し、エタノ−ル
で沈殿して、集めたＤＮＡをＴＥバッファ−（ｐＨ8.0
）、つまりトリス塩酸塩１０ミリモル濃度、ＥＤＴＡ
１ミリモル濃度に懸濁した。

【００１２】プライマ−の合成は、発明者らが以前に明
らかにした炭疽菌のcapA遺伝子内の288個の塩基配列(Ma
kino, S. et al.: J. Bacteriol. 171, 722-730(1989))
からグアニンとシトシン残基の含量の高い、前記した
２種の合成オリゴヌクレオチド（Ｍ０１及びＭ０２）
を、Applied Biosystems社のＤＮＡ合成器で、トリエス
テル法によって化学合成した。合成したヌクレオチドは
Ｃ１８逆相カラムで精製した。

【００１３】ＰＣＲ反応は、100 μL 中に、トリス塩酸
塩（pH 8.3) １０ミリモル濃度、塩化カリウム６０ミリ
モル濃度、塩化マグネシウム1.5 ミリモル濃度、ゼラチ
ン１mg、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰそ
れぞれ２００ミリモル濃度、プライマ−５０ピコモル濃
度、Taq ポリメラ−ゼ2.5 ユニット、及び0.01〜0.1μ
ｇのＤＮＡをそれぞれ含む反応液を調製して行なった。
熱変性は９５℃で１分間、アニ−リングは６５℃で２分
間、重合は７２℃で1.5 分間行なわれた。 熱変性の開
始から重合反応の終わりまでを１サイクルとして、３０
サイクルの反応を行なった。増幅された反応産物を６％
（Ｗ／Ｖ）のポリアクリルアミド・ゲルによる電気泳動
で分離し、臭化エチジウムによる染色によって紫外線照
射で光るバンドを検出した。

【００１４】電気泳動の結果、炭疽菌であるバチルス
アントラキス パスツールII（Bacillus anthracis Dav
is）及びバチルス アントラキス パスツールII(Bacil
lusanthracis Pasteur II）のレ−ンのみで、288 塩基
対に相当するバンドが検出された。表１に示す菌株では
バンドは検出されなかった。

【００１５】

【表１】

【００１６】この結果、従来法では炭疽菌との区別が困
難であったバチルス セレウス（Bacillus cereus）,
バチルス リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s）,バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）,
バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）, バチル
ス チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensi
s）では288 塩基対に相当するバンドが検出されず、こ
の方法で炭疽菌を特異的に検出できることが分かった。

【００１７】実施例２ マウスの脾臓組織１００ｍｇに滅菌水１００μＬを加え
細砕してホモジネ−トにした。このホモジネ−トに，種
々の濃度の炭疽菌Bacillus anthracis PasteurIIの芽胞
の懸濁液を加えた。このホモジネ−トに、プロテイナ−
ゼＫを200 μg/mLの濃度で含んだ100 μL のＴＥＳバッ
ファ−２倍濃度液（pH 8.0）、つまりトリス塩酸塩100
ミリモル濃度、ＥＤＴＡ10ミリモル濃度、塩化ナトリウ
ム１００ミリモル濃度の溶液を混合して、それに２０％
（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを５０μL と２０％
（ｗ／ｖ）ザルコシル５０μL を加えた。加えた。これ
を５５℃で液が澄んでくるまで、約３時間、 加熱した。
この液から、フェノ−ル−クロロフォルム法で３回除タ
ンパク処理をしてＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡをエタ
ノ−ルで沈殿させて集め、それを５００μL のＴＥバッ
ファ−で溶解した。この１μL をＰＣＲ反応に用いた。

【００１８】プライマ−は実施例１と同じものを用い
た。試料のＤＮＡは１μg をＰＣＲ反応に用いた。ＰＣ
Ｒ反応も実施例１と同じ条件で行なった。

【００１９】その結果、試料のＤＮＡ中に芽胞がそれぞ
れ約１，１０³,１０⁶ 個分に相当する量入った試料でＰ
ＣＲ反応を行なった試料の内、約１０³,１０⁶ 個の芽胞
を加えた試料を入れた電気泳動のレ−ンで、炭疽菌のca
pA遺伝子の288 塩基対に相当する明らかなバンドが認め
られた。約１個分の芽胞を入れて処理した試料でも炭疽
菌のcapA遺伝子の288 塩基対に相当する、かすかなバン
ドが認められた。

【００２０】実施例３ マウスの腹腔内に炭疽菌を接種した。４８時間後、脾臓
組織を採取した。このとき、従来の方法で炭疽菌数を測
定したところ 1.8×１０⁸ 個／ｇであった。この脾臓組
織を実施例２と同様にしてＤＮＡを抽出しＰＣＲ反応を
行なった。

【００２１】電気泳動の結果、炭疽菌のcapA遺伝子の28
8 塩基対に相当する明らかなバンドが認められた。

【００２２】実施例４ マウスの腹腔内に炭疽菌(Bacillus anthracis Pasteur
II)の芽胞の懸濁液を接種し、４８時間後に脾臓組織を
採取した。このとき、従来の方法で炭疽菌数を測定した
ところ、 1.8×１０⁸ 個／ｇであった。この脾臓組織10
0 ｍｇに滅菌水100 μＬを加えて細砕しホモジネ−トに
した。このホモジネ−トを１５分間熱湯で煮沸し、冷ま
した後４℃で10,000×g １０分間遠心分離した。この上
清液１μＬをＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応は実施例
１に準拠して行なった。

【００２３】電気泳動の結果、炭疽菌のcapA遺伝子の28
8 塩基対に相当する明らかなバンドが認められた。

【００２４】実施例５ マウスの腹腔内に炭疽菌(Bacillus anthracis Pasteur
II)の芽胞の懸濁液を接種し、４８時間後に血液を採取
した。このとき、従来の方法で炭疽菌数を測定したとこ
ろ、７×１０⁶ 個／ｇであった。その血液100 μL とプ
ロテイナ−ゼＫを200 μg/mLの濃度で含んだ100 μL の
ＴＥＳバッファ−２倍濃度液（pH 8.0）、つまりトリス
塩酸塩100 ミリモル濃度、ＥＤＴＡ１０ミリモル濃度、
塩化ナトリウム１００ミリモル濃度の溶液を混合して、
それに２０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを２０
μL を加えた。これを５５℃で６０分間の加熱処理をし
た後、フェノ−ル−クロロフォルム法で３回除タンパク
をしＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡをエタノ−ルで沈殿
させて集め、それを１００μL のＴＥバッファ−で溶解
した。この１μL をＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応は
実施例１に準拠して行なった。

【００２５】電気泳動の結果、炭疽菌のcapA遺伝子の28
8 塩基対に相当する明らかなバンドが認められた。

【００２６】実施例６ マウスの腹腔内に炭疽菌(Bacillus anthracis Pasteur
II)の芽胞の懸濁液を接種し、４８時間後に血液を採取
した。このとき、従来の方法で炭疽菌数を測定したとこ
ろ、７×１０⁶ 個／ｇであった。この血液100 μＬを１
５分間熱湯で煮沸し、冷ました後４℃で10,000×g １０
分間遠心分離した。この上清液１μＬをＰＣＲ反応に用
いた。ＰＣＲ反応は実施例１に準拠して行なった。

【００２７】電気泳動の結果、炭疽菌のcapA遺伝子の28
8 塩基対に相当する明らかなバンドが認められた。

【００２８】

【発明の効果】本発明のオリゴヌクレオチドは炭疽菌の
検出用のプライマ−として特異性が高く、該オリゴヌク
レオチドを用いた検出方法は炭疽菌を特異的に検出する
ことができる優れた検出方法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 7055−2Ｊ 33/569 Ｆ 8310−2Ｊ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中に存在する炭疽菌（Bacillus anthr
   acis）を選択的に検出するためのオリゴヌクレオチド、
   または、炭疽菌のプラズミドのcapA遺伝子をコ−ドする
   ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と
   相補的となるように化学合成されたオリゴヌクレオチド
   であって、合成ヌクレオチドが以下の配列群またはそれ
   らに対応する相補的配列からなることを特徴とするオリ
   ゴヌクオチド。 ５’＞ＧＣＴＧＡＴＣＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧ＜３’・・・・・・ＭＯ１ ５’＞ＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＣＴＴＣＧＧ＜３’・・・・・・・・ＭＯ２
2. 【請求項２】請求項１に記載された配列のうち、少なく
   とも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプラ
   イマ−として機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的
   に増幅させることを特徴とする方法であって、（ａ）検
   体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプライマ−
   をハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重合反応に
   より鎖長反応を行わせ、（ｂ）得られた２本鎖ヌクレオ
   チド配列を１本鎖に分離した場合、その相補鎖は他方の
   プライマ−による鎖長反応の鋳型として機能し、（ｃ）
   これら２種のプライマ−による同時の鎖長反応、鎖長生
   成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマ−による
   ハイブリダイゼ−ションを繰り返すことにより特定のヌ
   クレオチド配列が増幅され、電気泳動、クロマトグラフ
   ィ−で増幅されたヌクレオチド断片を検出し、（ｄ）前
   記検体中に認識されるべき配列が存在しているか否かを
   判定することことを特徴とする炭疽菌の検出方法。
3. 【請求項３】請求項２に記載された方法における反応物
   を用い、電気泳動および核酸染色を行なうことによる炭
   疽菌の検出方法。