JPH06261784A

JPH06261784A - メタンフェタミンの検知方法

Info

Publication number: JPH06261784A
Application number: JP25106793A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Shigeno; 俊也茂野; Hisayuki Shibazaki; 久幸柴崎; Haruo Oyama; 晴生大山; Toyoji Hozumi; 豊治穂積; Sumiko Hara; 澄子原; Takao Matsumoto; 孝夫松本
Original assignee: Showa Shell Sekiyu KK
Current assignee: Showa Shell Sekiyu KK
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-13
Publication date: 1994-09-20

Abstract

(57)【要約】【目的】ＭＡに対して特異的に反応するウレアーゼ標
識モノクローナル抗体を用い、ｐＨ指示薬による変色に
よりＭＡを簡便に検知する方法および携帯可能なＭＡ検
知用キットの提供。【構成】微工研菌寄第１３１４８号のハイブリドーマ
株、メタンフェタミンに対して特異的な免疫反応を示す
モノクローナル抗体を産生すハイブリドーマ株の製法、
メタンフェタミンに対して特異的な免疫反応を示すモノ
クローナル抗体とモノクローナル抗体の製法およびメタ
ンフェタミンの検知方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、覚醒剤であるメタンフェタミン
の検知方法、それに使用するモノクローナル抗体、モノ
クローナル抗体の産生に使用する菌株および携帯可能な
メタンフェタミン検知用キツトに関する。

【０００２】

【従来技術】覚醒剤に関連する事件の増加にともない、
メタンフェタミン（以下ＭＡと略称することがある）の
使用者を簡便、迅速かつ正確に認知する必要性が高ま
り、簡便、高感度、高選択的にメタンフェタミンを測定
する方法及び測定キットが望まれている。特開平１−９
６１９８号公報には、動物に免疫して得られた細胞株を
培養することによって、覚醒剤であるメタンフェタミン
（ＭＡ）に対して非常に高い特異的な反応性を示すモノ
クローナル抗体を得ることが提案されている。そして、
現在、ＭＡを特異的に認識するモノクローナル抗体を用
いた測定システムには、ＥＬＩＳＡ法を基本にした競合
法によるものが商品化されている。しかしこの方法で
は、結果の判定に分光光度計などの特殊な科学機器を必
要としており、また、操作が複雑なことからある程度特
殊な技術を要求される。

【０００３】

【目的】本発明の目的は、ＭＡに対して特異的に反応す
るウレアーゼ標識モノクローナル抗体を用い、ｐＨ指示
薬による変色によりＭＡを簡便に検知する方法および携
帯可能なＭＡ検知用キットを提供する点にある。

【０００４】

【構成】本発明の第１は、微工研菌寄第１３１４８号の
ハイブリドーマ株に関する。

【０００５】本発明の第２は、メタンフェタミンの免疫
用抗原を哺乳動物に接種し、抗メタンフェタミン抗体産
生能力を持つリンパ細胞を得、このリンパ細胞とミエロ
ーマ細胞とを細胞融合させ、得られた融合細胞を培養
し、そのなかからメタンフェタミンに対して特異的な免
疫反応を示すモノクローナル抗体を産生する前記ハイブ
リドーマ株の製法に関する。

【０００６】本発明の第３は、メタンフェタミンに対し
て特異的な免疫反応を示すモノクローナル抗体に関す
る。

【０００７】本発明の第４は、前記ハイブリドーマ株を
培養することを特徴とする前記モノクローナル抗体の製
法に関する。

【０００８】本発明の第５は、（イ）メタンフェタミン
と支持蛋白質との複合体を担持させた担体に、（ロ）メ
タンフェタミンに対して特異的な免疫反応を示すモノク
ローナル抗体をウレアーゼで標識化することにより得ら
れたウレアーゼ標識モノクローナル抗体と、（ハ）測定
試料中のメタンフェタミンとを、競合反応させ、反応終
了後、前記（イ）の担体に結合したウレアーゼ標識モノ
クローナル抗体に、（ニ）尿素を反応させ、生成したア
ンモニア成分を検知することを特徴とするメタンフェタ
ミンの検知方法に関する。

【０００９】前記アンモニア成分の検知は系のｐＨ変化
による方法が最も簡便であり、適当なｐＨ指示薬を使用
することができる。本発明は、ウレアーゼ標識モノクロ
ーナル抗体に基質として尿素を選択して組合せることに
より、検体中にＭＡが含まれていない陰性の場合にはウ
レアーゼにより尿素が分解されてアンモニアを発生し、
系のｐＨが上昇するのでこれを利用すれば、ｐＨ指示薬
の変色により素人でも検査を簡単に行うことができる。
したがって、アンモニア発生反応の利用が本発明の１つ
の要点である。

【００１０】本発明で使用できるｐＨ指示薬（ｐＨ試験
紙を含む）としては、ブロモクレゾールパープル、ブロ
モフェノールブルー、コンゴーレッド、メチルオレン
ジ、レザズリン、メチルレッド、クロロフェノールレッ
ド、ヘマトキシリン（アルカリ性）、ブリリアントイエ
ロー、ニュートラルレッド、フェノールレッド、ｍ−ク
レゾールレッド、ｍ−クレゾールレッドナトリウム塩、
ｍ−クレゾールパープル、チモールブルーなどを例示す
ることができる。

【００１１】本発明に用いる基質としては尿素を挙げる
ことができる。測定試料は、被検知者の尿または唾液を
使用することができる。

【００１２】前記担体は、試験管やピペットのような容
器、またはスティックであることが好ましいが、それ以
外にも球体状、立方体状、針状など任意の形状のものが
使用でき、材質としては格別の制限はないが、蛋白質が
付着しやすい性質をもつものが適当で、合成樹脂（例え
ば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ
リメチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエステルな
ど）、ゴム、ガラス、ニトロセルロースなどを挙げるこ
とができる。

【００１３】容器の場合には、その内壁に、スティック
等の場合はその表面に前記複合体の層またはそれを含有
する層を形成することにより担持させる。

【００１４】本発明の第６は、（ｉ）メタンフェタミン
に対して特異的な免疫反応を示すモノクローナル抗体を
ウレアーゼで標識化することにより得られたウレアーゼ
標識モノクローナル抗体含有容器、（ii）メタンフェタ
ミンと支持蛋白質との複合体を担持した担体、（iii)尿
素とｐＨ指示薬を含む基質溶液含有容器、または尿素を
含む基質溶液含有容器とｐＨ指示薬含有容器、を含有す
る携帯可能なメタンフェタミン検知用キットに関する。
前記キットには、定量用スポイトや検体採取用容器を入
れておくことが好ましい。

【００１５】Ａ．免疫用抗原の調製メタンフェタミン（ＭＡ）をアミノブチル化またはカル
ボキシメチル化してアミノブチル化またはカルボキシメ
チル化メタンフェタミンを作り、これに任意の支持蛋白
質を結合させて複合体を得、これを免疫用抗原とした。
前記支持蛋白質としては、ウシ血清アルブミン、卵白ア
ルブミン、笠貝（陣笠貝、すかし貝）ヘモシアニン、サ
イログロブリン、γ−グロブリン等を挙げることができ
る。また、アミノブチル化もしくはカルボキシメチル化
メタンフェタミンと支持蛋白質を結合させる架橋剤とし
ては、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジメチルホル
ムアミド、マレイミドベンゾイルオキシサクシンイミド
等が用いられる。

【００１６】Ｂ．リンパ細胞の調製前記免疫用抗原を哺乳動物（例えば、マウス、ラット
等）に１週間おきに４〜１２回、腹腔、皮下または直接
脾臓に投与し、抗原に対する抗体が十分生成しているの
を確認後、その動物の血液、リンパ節、脾臓等からリン
パ細胞を得る。この時、免疫賦活剤として、アジュバン
ド（ミョウバン、結核死菌、核酸等を含む）を抗原物質
とともにエマルジョンとして動物に投与することが好ま
しい。抗体の生成を確認する手段としては、免疫した動
物から静脈血を採取し、後述のハイブリドーマ細胞の選
択の項にあるＥＬＩＳＡ法を用いることにより判定する
手段が挙げられる。

【００１７】Ｃ．細胞融合とハイブリドーマ株の選択細胞融合に用いたミエローマ細胞としては、例えばマウ
ス由来のＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）、Ｓ
Ｐ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）、Ｐ３−ＮＳ１／１−
Ａｇ４．１（ＮＳ−１）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５
３（６５３）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＭＰ
Ｃ−１１、ラット由来の２１０、ＲＣＹ３、ＡＧ１、
２、３（Ｙ３）、ヒト由来のＳＫＯ−００７、ＧＨ１５
００６ＴＧ−Ａ１２などを挙げることができる。

【００１８】細胞融合は、前述したような免疫された動
物のリンパ球とミエローマ細胞を約２〜１０：１になる
ように混合し、これを遠心分離してリンパ球とミエロー
マ細胞の混合沈澱物を得、これにポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）を含む
細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ
等）を加え、懸濁することにより行なうことができる
が、操作上の点から、３０％〜６０％のＰＥＧ（分子量
１０００〜８０００）を用いることが好ましい。

【００１９】ハイブリドーマ株の選択は、融合後の細胞
懸濁液を遠心して上清を除き、これにヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン（ＨＡＴ）と１０％〜２０％
のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培地に再懸
濁して、この懸濁液を培養用プレートに分注することに
より行なうことができる。この操作により選択されたハ
イブリドーマ細胞をさらにヒポキサンチン、チミジン
（ＨＴ）と１０％〜２０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を
含む細胞培養用培地で培養し、最終的には１０％〜２０
％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む細胞培養用培地で培
養する。この間、増殖したハイブリドーマ細胞は培地上
清中に抗体を産生するため、ＥＬＩＳＡ（酸素免疫測
定）法、ＲＩＡ（ラジオアイソトープ免疫測定）法、プ
ラーク測定法、凝集反応法等を用いて目的の抗体の有無
を調べることができるが、ＥＬＩＳＡ法を用いることが
望ましい。このＥＬＩＳＡ法は以下のようにして行なう
ことができる。

【００２０】前記Ａ．で調整した免疫用抗原をＥＬＩＳ
Ａプレートの各ウェルに固定化して、次にブロッキング
剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミ
ン（ＯＶＡ）、笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロ
ブリン等の生体高分子タンパク質を各ウェルに固定化す
る。これは次の操作中、ハイブリドーマ細胞の産生した
抗体がウェルに非特異的に吸着するのを防ぐためであ
る。一定時間静置した後、上清液を捨て洗浄液（リン酸
緩衝液と生理食塩水溶液の混合液、界面活性剤を含む場
合もある）で各ウェルを洗浄する。これに、ハイブリド
ーマ細胞培養上清液を添加し一定時間静置する。同様に
洗浄液で各ウェルを洗浄し、次に酵素標識抗体、例えば
マウスを用いた場合には抗マウスＩｇＧ抗体にアルカリ
フォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガ
ラクトシダーゼ等の酵素が結合したものを各ウェルに添
加し、一定時間静置する。洗浄液で各ウェルを洗浄し、
次に、用いた酵素に各々対応した基質溶液を添加し反応
させる。培養上清液中に目的とする抗体が存在していた
場合、酵素反応により生じた基質の色の変化を、肉眼か
もしくはプレートリーダーにより確認することができ
る。このようにして、抗体を産生しているハイブリドー
マ細胞を得ることができる。

【００２１】Ｄ．ハイブリドーマ細胞のクローニング前記Ｃ．で確認されたウェル中には、遺伝的に異なるハ
イブリドーマ細胞の混合物である可能性があるため、ク
ローニング操作により単一な遺伝子からなるハイブリド
ーマ細胞群を得る必要がある。この方法には限界希釈
法、シングルセルマニュピュレーション法、軟寒天上の
コロニーを一つずつ拾い上げる方法、ＦＡＣＳ法（Ｆｌ
ｕｏｒｅｃｅｎｔＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅｌｌＳ
ｏｒｔｅｒ）が挙げられるが、特別な装置を使わない点
で限界希釈法を用いることが望ましい。この限界希釈法
は以下のようにして行なうことができる。

【００２２】上記ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍ
ｌ、５０個／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように０〜２０
％ＦＣＳを含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｍ
ＥＭ、ＤＭＥＭ等）で調整し、各々の調整液を９６ウェ
ルプレート上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌずつ
分注する。このプレートをＣＯ₂インキュベータ中で培
養し、一つのコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由来
であることが確認されるようなウェルを選択する。これ
らのウェルの上清液中に存在するモノクローナル抗体が
ＭＡを認識するかどうかを、前記Ｃ．のＥＬＩＳＡ法に
より再検討する。このようにして、単一な遺伝子からな
るハイブリドーマ細胞群が得られ、この細胞から産生さ
れた抗体はモノクローナル抗体であるといえる。

【００２３】Ｅ．モノクローナル抗体の調整ＭＡに対するモノクローナル抗体の調整には、前記Ｄ．
で得たハイブリドーマ細胞をフラスコ内、もしくは腹腔
内で培養することにより行なうことができる。ハイブリ
ドーマ細胞のフラスコ内での培養は、０〜２０％のＦＣ
Ｓを含む細胞培養用培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、
ＤＭＥＭ等）を用いて行う。この時、ハイブリドーマ細
胞を最大限増殖させ、その後遠心分離を行えば、分泌さ
れたモノクローナル抗体が上清中に得られる。

【００２４】ハイブリドーマ細胞の腹腔内での培養は、
１〜１０×１０⁶個の細胞を、プリスタン等の鉱物油を
投与した動物の腹腔内に注入する。この時用いる動物種
は、ハイブリドーマ細胞の作成に用いたミエローマ細胞
が増殖し易いように、由来となっているミエローマ細胞
と同種、同系の動物を用いることが望ましい。例えばマ
ウスを用いた場合、この操作により１〜２週間後から腹
腔内にハイブリドーマ細胞の増殖が認められ、それにと
もない腹腔内に腹水が蓄積する。目的のモノクローナル
抗体は腹水中に存在しているため腹腔より腹水を回収
し、さらに、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニテイクロマトグラフィー等の操作によりモ
ノクローナル抗体を分離精製することができる。

【００２５】Ｆ．ウレアーゼ標識モノクローナル抗体の調整精製したモノクローナル抗体とウレアーゼを緩衝液中で
処理し、酵素標識モノクローナル抗体を得た。抗体とウ
レアーゼを結合させる処理としては、グルタールアルデ
ヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、ジメチルホルムアミド、マレイン
イミドベンゾイルオキシサクシンイミド等の架橋剤を用
いることにより行なうことができる。緩衝液としてはリ
ン酸、トリス塩酸、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等
を用いることができ、ｐＨは中性付近が望ましい。

【００２６】Ｇ．担体上へのＭＡ−支持蛋白質複合体の固定（１）ＭＡ−支持蛋白質複合体の合成アミノブチル化またはカルボキシメチル化メタンフェタ
ミンを作り、これに任意の支持蛋白質を結合させて複合
体を得た。前記支持蛋白質としては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、笠貝ヘモシアニン、サイログロブ
リン、γ−グロブリン等を挙げることができる。また、
架橋剤としては、グルタルアルデヒド、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジ
メチルホルムアミド、マレイミドベンゾイルオキシサク
シンイミド等が用いられる。

【００２７】（２）ＭＡ−支持蛋白質複合体の担体への固定ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメ
チルメタクリレート、スチレン等の合成樹脂は蛋白質を
吸着するため、これらを材質とする容器、またはスティ
ック等の担体の表面上に、前記ＭＡ−支持蛋白質複合体
を効率よく結合させることができる。この反応は室温、
５〜１５分で終了するが、反応終了後、グルタールアル
デヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、ジメチルホルムアミド、マレイン
イミドベンゾイルオキシサクシンイミド等の架橋剤を用
いることにより、複合体あるいはモノクローナル抗体が
担体から剥離しないように、また、複合体がより多く担
体に吸着するように調整することもできる。

【００２８】Ｈ．ウレアーゼ標識モノクローナル抗体を
用いたＭＡ測定法本発明のＭＡ測定法では、Ｇ．（２）で調整したＭＡ−
支持蛋白質複合体結合担体（以下、ＭＡ支持担体と略
す）を、１〜１００μｇ／ｍｌのウレアーゼ標識モノク
ローナル抗体溶液と０．１〜２％の蛋白質、例えばウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、笠貝ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）等の生体高分子を含む
緩衝液中にて、尿や唾液等のサンプルとともに反応させ
る。サンプル中にＭＡが存在しなければ（陰性）ウレア
ーゼ標識モノクローナル抗体は抗原抗体反応によりＭＡ
−支持担体に結合する。この担体を洗浄液（リン酸、ト
リス塩酸緩衝液、０．０１〜１％の界面活性剤を含む場
合もある）を用いて洗浄し、次に標識されているウレア
ーゼに対応する基質、すなわち尿素溶液中で反応させ、
その変化を発色の程度で肉眼あるいは分析装置にて確認
する。この反応において、サンプル中にＭＡが存在して
いる（陽性）場合には、反応溶液中のウレアーゼ標識モ
ノクローナル抗体がＭＡに結合してしまい、ＭＡ支持担
体への結合が阻害される。従って、基質の変換も阻害さ
れ、基質が十分に変換する陰性の場合と比較して、陽性
の場合のサンプル中のＭＡの存在が確認できる。すなわ
ち、サンプル中にＭＡがなければ、ウレアーゼ標識モノ
クローナル抗体は、ＭＡ−支持蛋白質複合体と反応し、
その結果、尿素を分解してアンモニアを発生する。した
がって、反応系のｐＨが上昇するので、これをｐＨ指示
薬（ｐＨ試薬紙を含む）で検知する。サンプル中にＭＡ
が存在する場合には、ＭＡが抗体と反応するため、坑体
がＭＡ−支持担体に結合できず、したがって尿素のほと
んどを分解することができない。その結果、系のｐＨは
ほとんど上昇せず、ｐＨ指示薬の変色がおこらない。

【００２９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を具体的に説明す
る。尚、これらの実施例は本発明を例示するためのもの
であって、本発明の範囲を限定するものではない。

【００３０】実施例１−免疫用抗原の調整（１）アミノブチル化メタンフェタミンの調整メタンフェタミン（ＭＡ）を適当なタンパク質に結合さ
せるために、例えばＣｈｅｎｇらの方法〔ＦＥＢＳＬ
ＥＴＴＥＲＳ３６，３３９（１９７３）〕、Ｉｗａｓ
ａｋｉらの方法〔日法医誌４１（３）、２１７−２２
３，１９８７〕に準じ、ＭＡにアミノ基の導入を行っ
た。まず、０．５ｇのメタンフェタミン（ＭＡ）の塩酸
塩粉末（商品名ヒロポン）を１０ｍｌの蒸留水に溶解さ
せ、２ＮのＮａＯＨを滴下してｐＨを約１０にした。こ
れに等量のクロロホルムを加え、３回抽出した。得られ
たクロロホルム層を合し脱水後、濃縮した。この操作に
より塩酸基がはずれ、０．３５ｇのメタンフェタミンが
得られた。

【００３１】このメタンフェタミン全量を１０ｍｌの脱
水したベンゼンに溶解し、０．８６ｇのＮ−（４−ブロ
モブチル）フタルイミドと０．４ｇの炭酸ナトリウムを
添加して、窒素ガス存在下で８０℃、４０時間還流し
た。次に、炭酸ナトリウムを濾過により除去し、等量の
１ＭのＨＣｌを加え、更に等量のベンゼンで３回抽出し
た。水層に等量のクロロホルムを加え、３回抽出した。
得られたクロロホルム層を合し、脱水後、濃縮した。こ
の操作により、メタンフェタミン−Ｎ−ブチルフタルイ
ミドが得られた。これに１０ｍｌのエタノールと０．１
ｍｌの９０％の抱水ヒドラジンを添加して窒素ガス存在
下で２時間、８０℃で反応させた。反応終了後、エタノ
ールを留去し１Ｎの塩酸を２０ｍｌ添加した。この水溶
液を等量のクロロホルムを用いて３回抽出し、水層に２
Ｎの水酸化ナトリウムを滴下してｐＨ１０に調整した。
この水溶液を等量のクロロホルムを用いて３回抽出し、
クロロホルム層を合し脱水後、濃縮した。このようにし
て、７４ｍｇのＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタ
ミン（ＡＢ−ＭＡ）を得た。また、マススペクトル、核
磁気共鳴分析機を用いて、このＡＢ−ＭＡの構造を確認
した。

【００３２】免疫用抗原は上記のアミノブチル化メタン
フェタミンを用いて行った。１０ｍｇのＮ−（４−アミ
ノブチル）メタンフェタミンを１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ
７．２のリン酸緩衝液）に溶解後、１０ｍｇのＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を添加し、更に１９．２ｍｇの
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（以下ＥＤＣと略）を添加し、４℃で１６時
間撹拌した。全反応液をＰＢＳに対して透析して未反応
のＥＤＣとＮ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン
を除き、Ｎ−（４−アミノブチル）メタンフェタミン−
ＢＳＡ（ＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＥＤＣと略）を得た。ま
た、同様の操作で、ＢＳＡの代わりにＫＬＨ（笠貝ヘモ
シアニン）を用いて、ＭＡ−ＡＢ−ＫＬＨ−ＥＤＣを得
た。また、ＥＤＣの代わりに０．１％のグルタールアル
デヒド（ＧＡ）を用いて、Ｎ−（４−アミノブチル）メ
タンフェタミンとＢＳＡもしくはＫＬＨを結合させ、Ｍ
Ａ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡ、ＭＡ−ＡＢ−ＫＬＨ−ＧＡを
それぞれ得た。

【００３３】実施例２−ＭＡに対するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ株の作製（１）マウスへの抗原の投与と脾臓細胞の調整実施例１で調整したメタンフェタミンと支持タンパク質
との複合体をマウスに投与した。１００ｍｇのＭＡ−Ａ
Ｂ−ＫＬＨ−ＥＤＣを０．１ｍｌのＰＢＳに溶かし、
０．１ｍｌのフロイントの完全アジュバンドとよく混合
し、この乳化混合液をＢＡＬＢ／ｃ系、♀、８週齢のマ
ウスの皮下に、１匹あたり０．２ｍｌ投与した。この操
作を６匹のマウスに２週間に一度、３〜６カ月間にわた
り行った。投与後の各々のマウスから無菌的に脾臓を摘
出し、ＲＰＭＩ１６４０組織培養用培地中で洗浄し、余
分な脂肪組織を除いた。次に、新しいＲＰＭＩ１６４０
培地に移してハサミで細断後、脾臓内のリンパ細胞を押
しだした。培地中に浮遊しているリンパ細胞を遠心し
（１，０００ｒｐｍ、５分間、室温）集め、ＲＰＭＩ１
６４０培地で再懸濁し、次の細胞融合に用いた。この操
作により、マウス一匹から約１×１０⁸個のリンパ細胞
が得られた。

【００３４】（２）細胞融合約４×１０⁷個の対数増殖期にあるミエローマ細胞（６
５３株）と（１）で得られた約１×１０⁸個リンパ細胞
をＲＰＭＩ１６４０培地中で混合し、遠心後（１，００
０ｒｐｍ、５分間、室温）上清液を除いた。沈降したミ
エローマ細胞とリンパ細胞に、１ｍｌの５０％ポリエチ
レングリコール−ＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌ容ピペ
ットを用いて、３０秒間徐々に加えながら激しく振とう
し混合した。次に、１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を１
分間かけて添加しながら激しく振とうし、更に、８ｍｌ
のＲＰＭＩ１６４０培地を３分間かけて添加し、遠心
後、上清液を除いた。３０ｍｌのＨＡＴ選択培地（１×
１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリ
ン、１．６×１０^-5Ｍチミジン、２０％ウシ胎児血清を
含むＲＰＭＩ１６４０培地）を添加し、細胞をよく懸濁
した後、９６ウェルの培養プレート３枚に分注した。す
なわち、１ウェルあたり４．７×１０⁵個の細胞を分注
し、ＣＯ₂インキュベータ（５％ＣＯ₂、９５％空気、３
７℃、湿度１００％）を用いて培養した。

【００３５】（３）ハイブリドーマの選択各ウェルに細胞が増殖しているかどうかを、肉眼にて確
認し、更に、このウェルの上清液中にメタンフェタミン
を認識する抗体が存在しているかどうかを、次に示すＥ
ＬＩＳＡ法を用いて検討した。９６ウェルのＥＬＩＳＡ
用プレート（ポリスチレン製）に、実施例１で調整した
０．１ｍｇのＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを１０ｍｌのＰ
ＢＳに溶解させ、各ウェルに０．１ｍｌずつ分注し、４
℃で一晩静置した。すなわち、１ウェルあたり１μｇの
ＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡが存在していることになり、
この操作によりウェルの内壁にＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−Ｇ
Ａが吸着する。

【００３６】次に、このプレートの各ウェルを洗浄用Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）
を用いて４回洗浄し、未吸着のＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−Ｇ
Ａを除いた。更に、各ウェルに１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を０．１ｍｌずつ分注し、３７℃で１時間静置した。各
ウェルを洗浄用ＰＢＳで４回洗浄し、細胞の増殖が確認
されたウェルの上清液を０．１ｍｌ添加した。３７℃、
２時間静置した後、各ウェルを洗浄用ＰＢＳで４回洗浄
し、マウス免疫グロブリンに対する抗体溶液（アルカリ
フォスファターゼ結合、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳに
１／５００になるように希釈した）を０．１ｍｌ添加
し、３７℃、１時間静置した。各ウェルを洗浄用ＰＢＳ
で４回洗浄し、Ｐ−ニトロフェニルリン酸ナトリウム・
６Ｈ₂Ｏを１ｍｇ／ｍｌに調整した基質溶液を０．１ｍ
ｌずつ添加後、室温で３０分間静置した。陽性ウェルは
アルカリフォスファターゼの酵素活性により、ｐ−ニト
ロフェニルリン酸ナトリウムが分解され、黄色発色を呈
する。各ウェルに５０μｌの３ＭのＮａＯＨを添加して
反応を停止し、マイクロプレート用吸光度測定器を用い
て４０５ｎｍの吸光度を測定した。このＥＬＩＳＡ法に
より、抗ＭＡ抗体を産生している５１個の陽性ウェルが
得られた。

【００３７】（４）ハイブリドーマのクローニング（３）で得られた５１個の陽性ウェル中のハイブリドー
マ細胞を、限界希釈法を用いてモノクローン化した。す
なわち、ハイブリドーマ細胞を２００個／ｍｌ、５０個
／ｍｌ、１０個／ｍｌとなるように２０％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し、各々の希釈液を９６ウ
ェルプレート上の３、４５、４８ウェルに０．１ｍｌず
つ分注した。このプレートをＣＯ₂インキュベータ中で
培養し、一つのコロニーが一つのハイブリドーマ細胞由
来であることが確認されるようなウェルを選択した。こ
れらのウェルの上清液中に存在する抗体（モノクローナ
ル抗体）がＭＡを認識するかどうかを、先述のＥＬＩＳ
Ａ法により再検討した。この操作により、ＭＡに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が、
２４個得られた。

【００３８】実施例３−ＭＡの類似化合物に対する抗Ｍ
Ａモノクローナル抗体の選択性２４種のハイブリドーマ細胞の産生する抗ＭＡモノクロ
ーナル抗体がＭＡの構造類似化合物に対してどのような
反応性を有するかについて、実施例２の（３）の行程で
用いたＥＬＩＳＡ法により検討した。すなわち、各ハイ
ブリドーマの産生するモノクローナル抗体を添加すると
きに、多段階に希釈した類似化合物を添加し、ウェル内
壁に結合したＭＡとモノクローナル抗体の抗原抗体反応
に対して、この類似化合物がどの程度、競合的に阻害反
応を起こすかを調べたものである。２４種のハイブリド
ーマ細胞のうちもっともメタンフェタミンに特異的に反
応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞として８Ｃ１株を選択した。この８Ｃ１株の倍化時間
はおよそ２４時間であった。このハイブリドーマ細胞８
Ｃ１株（微工研菌寄第１３１４８号）の産生する抗ＭＡ
モノクローナル抗体の結果については、表１に示した。
この表では、まずサンプル中のフリーのＭＡが、ウェル
内壁中に結合したＭＡとモノクローナル抗体の結合を５
０％阻害する濃度を求め、この値を１００％とした。そ
して、他の類似化合物がやはりこの結合を５０％阻害す
る濃度を求め、ＭＡでの場合との比率を各々示した。

【表１】表中ＭＡは、メタンフェタミンＤＢＥＤは、Ｎ−Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンＡは、アンフェタミンＭＰＡは、メトキシフェナミンＮＯＲ−ＥＰ（＋）は、ノルエフェドリン（＋）ＯＨ−ＭＡは、ｐ−ヒドロキシメタンフェタミンＯＨ−ＮＯＲ−ＥＰは、ｐ−ヒドロキシノルエフェドリ
ンＯＨ−ＥＰは、ｐ−ヒドロキシエフェドリンＯＨ−Ａは、ｐ−ヒドロキシアンフェタミンＭＥは、メチルエフェドリンＮＯＲ−ＥＰ−（−）は、ノルエフェドリン（−）ＥＰは、エフェドリンＭＥＳは、メスカリンである。これにより、ハイブリドーマ細胞８Ｃ１株の産
生するモノクローナル抗体は、ＭＡ以外の他の類似化合
物に対して反応性が低く、ＭＡの測定に適していること
がわかった。また、ハイブリドーマ細胞８Ｃ１株の産生
する抗モノクローナル抗体は、λ型軽鎖とγ１型重鎖を
もつ抗体である。

【００３９】実施例４−マウス腹腔内でのハイブリドー
マ細胞の培養とモノクローナル抗体の精製１週間前にプリスタン処理をしたマウス（ＢＡＬＢ／ｃ
系、♀、６週齢）に、実施例３で得られたハイブリドー
マ細胞を腹腔内に１×１０⁷個注入した。１−２週間
後、ハイブリドーマ細胞の増殖とともに、マウス腹部の
肥大化が確認され、シリンジを用いて腹腔中より腹水を
採取した。この操作を１日おきに１−２週間程度行なう
ことにより、一匹のマウスから１０−２０ｍｌの腹水が
得られた。この腹水に飽和硫酸アンモニウム溶液を４０
％になるように添加し、ＩｇＧを含むタンパク質画分を
沈澱させた。この沈澱物を遠心（１２，０００ｒｐｍ、
４℃、２０分間）により回収し、２０ｍｌのＰＢＳに再
懸濁した。懸濁液をＰＢＳに対して一晩透析し、硫酸ア
ンモニウムを除いた。この状態で、７−８ｍｇのモノク
ローナル抗体が得られ、ＭＡの判定、定量に十分使用で
きるが、更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交
換樹脂、Ｇ−１５０Ｓｅｐｈａｄｅｘゲル濾過樹脂等
を用いて精製することもできる。

【００４０】実施例５−ウレアーゼ標識モノクローナル
抗体を用いたＭＡの測定法（１）酵素ウレアーゼのモノクローナル抗体への結合Ａｖｒａｍｅａｓらの方法（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．８Ｓｕｐｐｌ．７．７．１９７８）に準じ、
グルタールアルデヒドを用いて、ウレアーゼとモノクロ
ーナル抗体を以下の方法で結合させた。実施例４で得ら
れたこのモノクローナル抗体５ｍｇとウレアーゼ２．５
ｍｇ（酵素活性６００−１，２００Ｕ／ｍｇ）を６ｍｌ
のＰＢＳに懸濁し、０．０５％になるようにグルタール
アルデヒドを添加した。室温で、３時静置し、ウレアー
ゼ標識抗ＭＡモノクローナル抗体とした。

【００４１】（２）ＥＬＩＳＡ法を用いたＭＡの測定法実施例１（１）で作成したＭＡ−ＡＢ−ＢＳＡ−ＧＡを
ウェルあたり０．４μｇになるように５０ｍＭ炭酸緩衝
液（ｐＨ９．６）で調整し、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレ
ートに０．１ｍｌずつ分注した。４℃、一晩静置した
後、洗浄用ＰＢＳ（ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０）で３回洗浄し、次に、タンパク質の非特異的吸着
を防ぐために、各ウェルに１％ＢＳＡ、０．０５％アジ
化ナトリウムを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）を０．２ｍｌ
ずつ分注した。３７℃で２時間静置した後、洗浄用ＰＢ
Ｓで３回洗浄した。実施例５（１）で調整した５０μｌ
のウレアーゼ標識モノクローナル抗体（濃度２μｇ／ｍ
ｌ）と、標準サンプルとして様々な濃度のＭＡに調整し
たＰＢＳ（０．５％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウ
ムを含む）を５０μｌ混合し、計０．１ｍｌの反応液を
３７℃、８分間静置した。次に、洗浄用ＰＢＳで３回洗
浄し、０．１ｍｌの基質溶液（ブロモクレゾールパープ
ル、尿素、ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）を添加した。仮に、
サンプル中にＭＡがなければ、ウレアーゼ標識モノクロ
ーナル抗体はそのほとんどがウェルの内壁に結合したＭ
Ａと反応しウェル中に残るため、尿素を分解しアンモニ
アが生成する。そのため、基質溶液中のｐＨを上昇さ
せ、その結果ブロモクレゾールパープルが黄色から紫色
に変化する。

【００４２】一方、サンプル中にＭＡが存在する場合
は、競合的に抗体と反応するため、ウェル中に残るウレ
アーゼ標識モノクローナル抗体が減少する。そのため、
基質溶液の色の変化は確認できない。すなわち、ブロモ
クレゾールパープルを用いた今回の実験系では、黄色の
基質溶液が陰性の場合紫色に変化し、陽性の場合では黄
色のまま変化しない。上記の発色反応は２分以内に終了
し、１０μｌの１％チメロザール溶液を添加することに
より酵素反応を停止することができ、色の変化を肉眼観
察か、もしくはマイクロプレート用の吸光度測定器を用
いて５７０ｎｍの吸光度を測定した。以上の操作によ
り、すべての工程を１１−１３分間で行なうことがで
き、また測定感度としては、肉眼観察（ｐＨ指示薬によ
る変色）では２μｇ／ｍｌ濃度程度までのＭＡを判定す
ることができた。

【００４３】〔測定用簡易キットとその使用法〕（１）担体として容器を使用する場合について通常の容器を使用する場合について（図１、２参
照）容器内壁にＭＡ−支持蛋白質（この支持蛋白質について
はＭＡの支持蛋白質についての説明と同じである）との
複合体及び支持蛋白質よりなる組成物を付着させる。好
ましくは、ポリスチレン製試験管に塗着させる。一方、
本発明のウレアーゼ標識モノクローナル抗体を用意す
る。測定用簡易キットは、少なくとも、前記ＭＡ−支持
体複合体を容器内壁に塗着した試験用容器、ウレアーゼ
標識モノクローナル抗体液含有容器および尿素とｐＨ指
示薬を含む基質溶液含有容器を含む。

【００４４】好ましい測定用簡易キットとしては、１、ＭＡ−支持蛋白質複合体含有層で内壁がコーティン
グされている試験管（１〜５ｍｌ、とくに２〜３ｍｌ）２、本発明のウレアーゼ標識モノクローナル抗体液含有
容器３、基質溶液含有容器４、洗浄液含有洗浄びん５、定量用スポイト（０．１〜０．５ｍｌ、とくに０．
２〜０．３ｍｌ）６、採尿用カップまたは唾液採取用容器よりなる。

【００４５】覚醒剤使用容疑者から採取した尿または唾
液（適当濃度に希釈しても良い）とウレアーゼ標識モノ
クローナル抗体液とを前記試験用容器にいれ、７〜１０
分間反応させる（図１参照）。反応終了後、内溶液を捨
て洗浄液で充分洗浄して未反応のウレアーゼ標識モノク
ローナル抗体を除去する。ついで、アンモニア検知用の
溶液、例えばｐＨ指示薬と尿素含有液を加えて反応させ
る。ｐＨ指示薬としてブロモクレゾールパープルを用い
た場合には約１分後に陽性（ＭＡ含有）の場合には、初
めの黄色のまま変化せず、陰性の場合には紫色に変化す
る（図２参照）。なお、発色を固定したい場合には例え
ば１％チメロザール溶液を加えることができる。

【００４６】担体として吸引可能な容器を使用する
場合について（図３、４参照）図３、４に示すような吸引可能な容器内壁にＭＡ−支持
蛋白質（この支持蛋白質については、ＭＡの支持蛋白質
についての説明と同じである）との複合体および支持蛋
白質よりなる組成物を塗着させる。好ましくは、ポリス
チレン製のピペット用容器の内壁に塗着させる。一方、
本発明の酵素標識モノクローナル抗体液（例えば、ウレ
アーゼ標識モノクローナル抗体）を用意する。測定用簡
易キットは、少なくとも、前記ＭＡ−支持蛋白質複合体
をその内壁に塗着したピペット用容器と酵素標識モノク
ローナル抗体液含有容器を含む。

【００４７】好ましい測定用簡易キットとしては、１、ＭＡ−支持蛋白質複合体含有層で内壁がコーティン
グされているピペット型容器２、本発明の酵素標識モノクローナル抗体液含有容器３、基質溶液含有容器４、洗浄液含有洗浄びん５、定量用スポイト６、採尿用カップまたは唾液採取用容器よりなる。

【００４８】覚醒剤使用容疑者から採取した尿または唾
液（適当濃度に希釈しても良い）と酵素標識モノクロー
ナル抗体液とを前記ピペット用容器を注射器などに接続
して吸引、注入し、７〜１０分間反応させる（図３参
照）。反応終了後、内溶液を捨て洗浄液で充分洗浄して
未反応の酵素標識モノクローナル抗体を除去する。つい
で、アンモニア検知用の溶液、例えば、ｐＨ指示薬と尿
素含有溶液を加えて反応させる。ｐＨ指示薬としてブロ
モクレゾールパープルを用いた場合には約１分後に、陽
性（ＭＡ含有）の場合は初めの黄色のまま変化せず、陰
性の場合には紫色に変化する（図４参照）。なお、発色
を固定したい場合には例えば１％チメロザール溶液を加
えることができる。

【００４９】（２）担体としてスティックを使用する場
合（図５〜６参照）スティック例えばポリスチレン製スティックに、ＭＡ−
支持蛋白質複合体および支持蛋白質よりなる組成物を塗
着し、測定用スティックとする。一方、本発明のウレア
ーゼ標識モノクローナル抗体を用意する。測定用簡易キ
ットは、少なくとも、前記ＭＡ−支持体複合体を容器内
壁に塗着した測定用スティック、本発明のウレアーゼ標
識モノクローナル抗体液を含有する容器および尿素とｐ
Ｈ指示薬を含む基質溶液含有容器を含む。好ましい測定
用簡易キットとしては、１、ＭＡ−支持蛋白質複合体含有層を持つスティック２、本発明の酵素標識モノクローナル抗体含有容器３、基質溶液含有容器４、洗浄用試験管５、定量用スポイト６、採尿用カップまたは唾液採取用容器よりなる。

【００５０】覚醒剤使用容疑者から採取した尿または唾
液（適当濃度に希釈しても良い）と酵素標識モノクロー
ナル抗体液とを任意の試験用容器、例えば、試験管に入
れ、ここへ前記スティックを浸す。浸漬時間は７〜１０
分間で充分反応する（図５〜６参照）。反応終了後、洗
浄液を含む試験管内に前記スティックを浸漬して洗浄す
る。この洗浄方法を１〜４回繰り返す。ついで、別途、
基質溶液を試験管に入れ、この中に前記洗浄ずみのステ
ィックを浸漬処理する。前記浸漬処理約１分間で試験管
内の溶液は陽性の場合は黄色のまま、陰性の場合は紫色
に変化する（図６参照）。なお、発色を固定したい場合
には、たとえば１％チメロザール溶液を加えることがで
きる。

【００５１】

【効果】本発明は、ウレアーゼ標識モノクローナル抗体
と尿素との反応により系にアンモニアが発生するという
反応を巧みに利用し、ｐＨ指示薬の変色という簡便な呈
色反応によりメタンフェタミンの検出を行う方法を提供
するものである。ｐＨ指示薬の使用により検知ができる
ため、その検知用キットは携帯可能なサイズであり、パ
トカーなどに常時搭載しておくことができ、その使用方
法も簡単であるから、特別の訓練をすることなく、すべ
ての警官に正しく使用することができ、覚醒剤使用者を
たゞちに検査し、検挙することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＭＡ測定用簡易キットの１使用態様を
示す図面であり、図１と図２により、その使用手順の全
体を示すものである。

【図２】図１の使用手順の続きを示す。

【図３】本発明のＭＡ測定用簡易キットの他の使用態様
を示す図面であり、図３と図４により、その使用手順の
全体を示すものである。

【図４】図３の使用手順の続きを示す。

【図５】本発明のＭＡ測定用簡易キットのもう１つの使
用態様を示す図面であり、図５と図６により、その使用
手順の全体を示すものである。

【図６】図５の使用手順の続きを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 8310−2Ｊ 33/543 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者穂積豊治東京都千代田区霞が関３丁目２番５号昭和シェル石油株式会社内 (72)発明者原澄子東京都千代田区霞が関３丁目２番５号昭和シェル石油株式会社内 (72)発明者松本孝夫東京都千代田区霞が関３丁目２番５号昭和シェル石油株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微工研菌寄第１３１４８号のハイブリド
ーマ株。
【請求項２】メタンフェタミンの免疫用抗原を哺乳動
物に接種し、抗メタンフェタミン抗体産生能力を持つリ
ンパ細胞を得、このリンパ細胞とミエローマ細胞とを細
胞融合させ、得られた融合細胞を培養し、そのなかから
メタンフェタミンに対して特異的な免疫反応を示すモノ
クローナル抗体を産生する請求項１記載のハイブリドー
マ株の製法。
【請求項３】請求項１記載のハイブリドーマ株が産生
する抗体であって、メタンフェタミンに対して特異的な
免疫反応を示すモノクローナル抗体。
【請求項４】請求項１記載のハイブリドーマ株を培養
することを特徴とする請求項３記載のモノクローナル抗
体の製法。
【請求項５】（イ）メタンフェタミンと支持蛋白質と
の複合体を担持させた担体に、（ロ）メタンフェタミンに対して特異的な免疫反応を示
すモノクローナル抗体をウレアーゼで標識化することに
より得られたウレアーゼ標識モノクローナル抗体と、（ハ）測定試料中のメタンフェタミンとを、競合反応さ
せ、反応終了後、前記（イ）の担体に結合したウレアー
ゼ標識モノクローナル抗体に、（ニ）尿素を反応させ、生成したアンモニア成分を検知
することを特徴とするメタンフェタミンの検知方法。
【請求項６】生成したアンモニア成分の検知がｐＨ指
示薬によるものである請求項５記載のメタンフェタミン
の検知方法。
【請求項７】測定試料が被検知者の尿または唾液であ
る請求項５または６記載メタンフェタミンの検知方法。
【請求項８】（ｉ）メタンフェタミンに対して特異的
な免疫反応を示すモノクローナル抗体をウレアーゼで標
識化することにより得られたウレアーゼ標識モノクロー
ナル抗体含有容器、（ii）メタンフェタミンと支持蛋白質との複合体を担持
した担体、（iii)尿素とｐＨ指示薬を含む基質溶液含有容器、また
は尿素を含む基質溶液含有容器とｐＨ指示薬含有容器、
を含有する携帯可能なメタンフェタミン検知用キット。
【請求項９】定量用スポイトおよび／または検体採取
用容器を含有する請求項８記載の携帯可能なメタンフェ
タミン検知用キット。
【請求項１０】前記（ii）がメタンフェタミンと支持
蛋白質との複合体をその内壁に固定した容器である請求
項８または９記載の携帯可能なメタンフェタミン検知用
キット。
【請求項１１】前記（ii）がメタンフェタミンと支持
蛋白質との複合体をその表面層に固定したスティックで
ある請求項８または９記載の携帯可能なメタンフェタミ
ン検知用キット。