JPH06261789A - 物質の測定法 - Google Patents
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 マルトースの影響を受けにくい物質の定量法
を提供する。 【構成】 試料中の定量すべき成分を酵素反応を利用し
て定量する方法において、反応液中にα−グルコシダ−
ゼ阻害剤を共存させることを特徴とする方法。
を提供する。 【構成】 試料中の定量すべき成分を酵素反応を利用し
て定量する方法において、反応液中にα−グルコシダ−
ゼ阻害剤を共存させることを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料中のマルトースから
のグルコースへの変換を阻止して、試料中の特定の成
分、例えば１，５−アンヒドログルシトール等を酵素反
応を利用して定量する方法に関する。
のグルコースへの変換を阻止して、試料中の特定の成
分、例えば１，５−アンヒドログルシトール等を酵素反
応を利用して定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中にはマルトースが存在し、こ
のマルトースが試料に混入しているα−グルコシダ−ゼ
により加水分解され２分子のグルコ−スとなり、成分を
分析定量する際に、測定結果に影響を与える場合がある
（臨床化学、２１巻、４３頁、１９９２年）。かかる場
合目的成分の定量に先だって、イオン交換カラムクロマ
トグラフィーでマルトースを分離する方法（特開昭６３
−１８５３９７号公報、特開昭６４−６７５６号公報）
が知られているが、該方法は操作が煩雑である。
のマルトースが試料に混入しているα−グルコシダ−ゼ
により加水分解され２分子のグルコ−スとなり、成分を
分析定量する際に、測定結果に影響を与える場合がある
（臨床化学、２１巻、４３頁、１９９２年）。かかる場
合目的成分の定量に先だって、イオン交換カラムクロマ
トグラフィーでマルトースを分離する方法（特開昭６３
−１８５３９７号公報、特開昭６４−６７５６号公報）
が知られているが、該方法は操作が煩雑である。
【０００３】１，５−アンヒドログルシトールは糖尿病
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。１，５−アンヒ
ドログルシトールを基質とする酸化酵素はいずれも基質
特異性が低く、試料中に共存するグルコースとも反応す
るため、マルトースとα−グルコシダーゼが共存し、グ
ルコースが生成する可能性がある試料では該方法により
正確に定量することができない。
の診断マーカーとして知られている。１，５−アンヒド
ログルシトールの定量法としては該物質に酸化酵素を作
用させた後、酸素の消費量、過酸化水素の生成量または
電子受容体の還元体の生成量を測定する方法が知られて
いる（特公平３−２４２００号公報）。１，５−アンヒ
ドログルシトールを基質とする酸化酵素はいずれも基質
特異性が低く、試料中に共存するグルコースとも反応す
るため、マルトースとα−グルコシダーゼが共存し、グ
ルコースが生成する可能性がある試料では該方法により
正確に定量することができない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】マルトースとα−グル
コシダーゼが共在する試料中の定量すべき成分を酵素反
応を利用して正確に定量する方法の開発が求められてい
る。
コシダーゼが共在する試料中の定量すべき成分を酵素反
応を利用して正確に定量する方法の開発が求められてい
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の定量
すべき成分を酵素反応を利用して定量する方法におい
て、反応液中にα−グルコシダ−ゼ阻害剤を共存させる
ことを特徴とする方法に関する。
すべき成分を酵素反応を利用して定量する方法におい
て、反応液中にα−グルコシダ−ゼ阻害剤を共存させる
ことを特徴とする方法に関する。
【０００６】本発明は、試料中の定量すべき成分の分析
において、試料中に存在するマルトースがα−グルコシ
ダーゼにより分解されて生じるグルコースが、定量すべ
き成分の酵素反応による分析に影響を与え、正確な定量
の妨げとなる場合に適用することによって大きな効果を
期待することができる。本発明は定量すべき成分の分析
に用いられる酵素がグルコースにも作用する場合のみな
らず、定量すべき成分をグルコースを経由して定量する
際にも適用できる。例えばグルコースと類似構造を有す
る１，５−アンヒドログルシトール（ＡＧ）の定量、あ
るいはグルコースを経由して定量するフラクトース、ア
ミラーゼ等の定量等に適用すると効果が著しい。
において、試料中に存在するマルトースがα−グルコシ
ダーゼにより分解されて生じるグルコースが、定量すべ
き成分の酵素反応による分析に影響を与え、正確な定量
の妨げとなる場合に適用することによって大きな効果を
期待することができる。本発明は定量すべき成分の分析
に用いられる酵素がグルコースにも作用する場合のみな
らず、定量すべき成分をグルコースを経由して定量する
際にも適用できる。例えばグルコースと類似構造を有す
る１，５−アンヒドログルシトール（ＡＧ）の定量、あ
るいはグルコースを経由して定量するフラクトース、ア
ミラーゼ等の定量等に適用すると効果が著しい。
【０００７】本発明を実施するに際しては、試料を加え
た緩衝液にα−グルコシダ−ゼ阻害剤を添加した後、該
緩衝液を２５〜４０°Ｃで３〜１０分間加温させ、マル
トースからのグルコースの生成を抑制した後、試料中の
定量すべき成分の酵素反応による定量に必要な試薬を加
えて、生成した成分を定量する。
た緩衝液にα−グルコシダ−ゼ阻害剤を添加した後、該
緩衝液を２５〜４０°Ｃで３〜１０分間加温させ、マル
トースからのグルコースの生成を抑制した後、試料中の
定量すべき成分の酵素反応による定量に必要な試薬を加
えて、生成した成分を定量する。
【０００８】本発明に用いられるα−グルコシダ−ゼ阻
害剤としては、α−グルコシダ−ゼ阻害活性を示す化合
物であればどのようなものでもよいが、2-アミノ-2- ヒ
ドロキシメチル-1,3- プロパンジオール（以下Ｔｒｉｓ
と略す）、ビス（2-ヒドロキシメチル) イミノトリス(
ヒドロキシメチル）メタン（以下Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと略
す）、N-(2- アセタミド) イミノジ酢酸（以下ＡＤＡと
略す）、N-(2- アセタミド)-2-アミノエタンスルホン酸
（以下ＡＣＥＳと略す）、N,N-ビス (2-ヒドロキシエチ
ル)-2-アミノエタンスルホン酸（以下ＢＥＳと略す）、
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N′-2- エタンスルホ
ン酸（以下ＨＥＰＥＳと略す）、3-(N-モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略す）、グルコノラ
クトン、ヒスチジン、アルギニン、キニン、ベンジルア
ミン等が挙げられるが、α−グルコシダ−ゼ阻害能を有
する化合物であれば、これに限定されるものでない。
害剤としては、α−グルコシダ−ゼ阻害活性を示す化合
物であればどのようなものでもよいが、2-アミノ-2- ヒ
ドロキシメチル-1,3- プロパンジオール（以下Ｔｒｉｓ
と略す）、ビス（2-ヒドロキシメチル) イミノトリス(
ヒドロキシメチル）メタン（以下Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと略
す）、N-(2- アセタミド) イミノジ酢酸（以下ＡＤＡと
略す）、N-(2- アセタミド)-2-アミノエタンスルホン酸
（以下ＡＣＥＳと略す）、N,N-ビス (2-ヒドロキシエチ
ル)-2-アミノエタンスルホン酸（以下ＢＥＳと略す）、
N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N′-2- エタンスルホ
ン酸（以下ＨＥＰＥＳと略す）、3-(N-モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略す）、グルコノラ
クトン、ヒスチジン、アルギニン、キニン、ベンジルア
ミン等が挙げられるが、α−グルコシダ−ゼ阻害能を有
する化合物であれば、これに限定されるものでない。
【０００９】α−グルコシダ−ゼ阻害剤の反応液中の濃
度は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥ
Ｓ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等は０．０５〜１
Ｍ、グルコノラクトン、ヒスチジン、アルギニン、キニ
ン、ベンジルアミン等は１〜２０ｍｇ／ｍｌである。
度は、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥ
Ｓ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ等は０．０５〜１
Ｍ、グルコノラクトン、ヒスチジン、アルギニン、キニ
ン、ベンジルアミン等は１〜２０ｍｇ／ｍｌである。
【００１０】緩衝液としては、１ｍＭ〜０．０５Ｍのリ
ン酸緩衝液、グリシン緩衝液、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、グ
ッドの緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等があげられる。緩衝
液のｐＨは５．５〜８．５が好ましい。緩衝液中には、
塩化カルシウム、塩化ナトリウム等の塩類、ウシ血清ア
ルブミン等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤を
加えてもよい。
ン酸緩衝液、グリシン緩衝液、Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、グ
ッドの緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等があげられる。緩衝
液のｐＨは５．５〜８．５が好ましい。緩衝液中には、
塩化カルシウム、塩化ナトリウム等の塩類、ウシ血清ア
ルブミン等の安定化剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤を
加えてもよい。
【００１１】本発明においては、特開平２−１０４２９
８号公報等に開示されているグルコースの消去法または
グルコースにＡＴＰの存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホ
ヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナ
ーゼを作用させてグルコースをフラクトース−１，６−
二リン酸に変換する方法（ヘキソキナーゼ法）を併用し
て、試料中のグルコースを消去した後に、目的の成分を
定量することもできる。
８号公報等に開示されているグルコースの消去法または
グルコースにＡＴＰの存在下、ヘキソキナーゼ、ホスホ
ヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナ
ーゼを作用させてグルコースをフラクトース−１，６−
二リン酸に変換する方法（ヘキソキナーゼ法）を併用し
て、試料中のグルコースを消去した後に、目的の成分を
定量することもできる。
【００１２】ヘキソキナーゼ法によるグルコースの消去
を実施するに際しては、グルコースが共存する試料にア
デノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ヘキソキナーゼ、ホスホ
ヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナ
ーゼを加え、要すればマグネシウム塩の存在下に、１５
〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間反応
させる。
を実施するに際しては、グルコースが共存する試料にア
デノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ヘキソキナーゼ、ホスホ
ヘキソースイソメラーゼおよび６−ホスホフラクトキナ
ーゼを加え、要すればマグネシウム塩の存在下に、１５
〜５０℃で１〜３０分間、好ましくは３〜１０分間反応
させる。
【００１３】ヘキソキナーゼ法における酵素およびその
使用量は、ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ．２．７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩ
Ｖ〔グルコキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．
５〜５０Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとし
て、Ｄ−グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメ
ーラゼ（ＥＣ．５．３．１．９）を１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、６−ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソ
キナーゼ（ＥＣ．２．７．１．１１）を１〜１００Ｕ／
ｍｌが用いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能で
ある。またＡＴＰは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用
いる。
使用量は、ヘキソキナーゼとして、ヘキソキナーゼ（Ｅ
Ｃ．２．７．１．１）またはヘキソキナーゼ タイプＩ
Ｖ〔グルコキナーゼ（ＥＣ．２．７．１．２）〕を０．
５〜５０Ｕ／ｍｌ、ホスホヘキソースイソメラーゼとし
て、Ｄ−グルコース−６−ホスフェイトケトールイソメ
ーラゼ（ＥＣ．５．３．１．９）を１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、６−ホスホフラクトキナーゼとして、ホスホヘキソ
キナーゼ（ＥＣ．２．７．１．１１）を１〜１００Ｕ／
ｍｌが用いられ、各酵素とも市販品が容易に入手可能で
ある。またＡＴＰは０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で用
いる。
【００１４】また本発明は、例えばガラクトースによる
測定法への影響を同時に防止するために、ガラクトース
を基質とする酵素を作用させた後、試料中の定量すべき
成分を酵素反応を利用して定量する方法と併用すること
もできる。
測定法への影響を同時に防止するために、ガラクトース
を基質とする酵素を作用させた後、試料中の定量すべき
成分を酵素反応を利用して定量する方法と併用すること
もできる。
【００１５】ガラクトースを基質とする酵素反応を用い
る方法としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在
下にガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕を用い
る方法（ガラクトキナーゼ法）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）またはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下にガラ
クトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８；
ＥＣ．１．１．１．１２０〕を作用させる方法（ＮＡＤ
依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法）、酸素の存在
下にガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．
９〕を作用させる方法（ガラクトースオキシダーゼ法）
等があげられる。
る方法としては、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在
下にガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．１．６〕を用い
る方法（ガラクトキナーゼ法）、ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）またはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下にガラ
クトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８；
ＥＣ．１．１．１．１２０〕を作用させる方法（ＮＡＤ
依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法）、酸素の存在
下にガラクトースオキシダーゼ〔ＥＣ．１．１．３．
９〕を作用させる方法（ガラクトースオキシダーゼ法）
等があげられる。
【００１６】これらの方法を実施するに際しては、試料
に（１）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＡＴＰおよび１〜１
００単位／ｍｌのガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．
１．６〕（ガラクトキナーゼ法）、（２）０．１〜１０
ｍｇ／ｍｌのＮＡＤおよび１〜１００単位／ｍｌのガラ
クトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８〕
（ＮＡＤ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法）、
（３）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰおよび１〜１
００単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔Ｅ
Ｃ．１．１．１．１２０〕（ＮＡＤＰ依存性ガラクトー
スデヒドロゲナーゼ法）または（４）酸素存在下に、１
〜１００単位／ｍｌのガラクトースオキシダーゼ〔Ｅ
Ｃ．１．１．３．９〕（ガラクトースオキシダーゼ法）
を加え、５〜４０℃で１〜３０分間、好ましくは３〜１
０分間反応させる。以上の酵素および基質はいずれも市
販されており容易に入手できる。
に（１）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＡＴＰおよび１〜１
００単位／ｍｌのガラクトキナーゼ〔ＥＣ．２．７．
１．６〕（ガラクトキナーゼ法）、（２）０．１〜１０
ｍｇ／ｍｌのＮＡＤおよび１〜１００単位／ｍｌのガラ
クトースデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．１．１．１．４８〕
（ＮＡＤ依存性ガラクトースデヒドロゲナーゼ法）、
（３）０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰおよび１〜１
００単位／ｍｌのガラクトースデヒドロゲナーゼ〔Ｅ
Ｃ．１．１．１．１２０〕（ＮＡＤＰ依存性ガラクトー
スデヒドロゲナーゼ法）または（４）酸素存在下に、１
〜１００単位／ｍｌのガラクトースオキシダーゼ〔Ｅ
Ｃ．１．１．３．９〕（ガラクトースオキシダーゼ法）
を加え、５〜４０℃で１〜３０分間、好ましくは３〜１
０分間反応させる。以上の酵素および基質はいずれも市
販されており容易に入手できる。
【００１７】試料中のガラクトースは、上述の酵素反応
のうちガラクトキナーゼ法によりガラクトース−１−リ
ン酸、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性ガラクトース
デヒドロゲナーゼ法によりガラクトノ−１，４−ラクト
ン、ガラクトースオキシダーゼ法によりガラクト−ヘキ
ソジアルドースに変換される。またガラクトキナーゼ法
の系においては、ピルビン酸キナーゼ（０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ）とホスホエノールピルベート（０．１〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ）〔特開平２−１０４２９８号公報〕またはク
レアチンキナーゼ（１〜１００Ｕ／ｍｌ）等ＡＴＰの生
成系を添加することにより反応液中にＡＴＰを生成さ
せ、ＡＴＰの添加量を抑制することができる。
のうちガラクトキナーゼ法によりガラクトース−１−リ
ン酸、ＮＡＤ依存性またはＮＡＤＰ依存性ガラクトース
デヒドロゲナーゼ法によりガラクトノ−１，４−ラクト
ン、ガラクトースオキシダーゼ法によりガラクト−ヘキ
ソジアルドースに変換される。またガラクトキナーゼ法
の系においては、ピルビン酸キナーゼ（０．５〜５０Ｕ
／ｍｌ）とホスホエノールピルベート（０．１〜１０ｍ
ｇ／ｍｌ）〔特開平２−１０４２９８号公報〕またはク
レアチンキナーゼ（１〜１００Ｕ／ｍｌ）等ＡＴＰの生
成系を添加することにより反応液中にＡＴＰを生成さ
せ、ＡＴＰの添加量を抑制することができる。
【００１８】該酵素反応によりガラクトースを消去した
後、試料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加え
て、生成した成分を定量するか、反応前試料中に存在し
た成分の変化を定量することによって目的の成分を定量
できる。
後、試料中の定量すべき成分の定量に必要な試薬を加え
て、生成した成分を定量するか、反応前試料中に存在し
た成分の変化を定量することによって目的の成分を定量
できる。
【００１９】また糖類の影響を完全に除去するため、本
発明方法、グルコースおよびガラクトースの消去法の３
種の方法を併用してもよい。
発明方法、グルコースおよびガラクトースの消去法の３
種の方法を併用してもよい。
【００２０】つぎに試料中の１，５−アンヒドログルシ
トールの定量について説明する。
トールの定量について説明する。
【００２１】１，５−アンヒドログルシトールの定量は
それ自体公知の方法が何れも適用できる。例えば緩衝液
中、１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵素を作用
させて生成する過酸化水素と色源体とをペルオキシダー
ゼ（ＰＲＯＤ）の存在下に反応させ、生成する色素によ
り呈色する反応液の可視部の吸収を測定することによ
り、１，５−アンヒドログルシトールを定量することが
できる。
それ自体公知の方法が何れも適用できる。例えば緩衝液
中、１，５−アンヒドログルシトールに酸化酵素を作用
させて生成する過酸化水素と色源体とをペルオキシダー
ゼ（ＰＲＯＤ）の存在下に反応させ、生成する色素によ
り呈色する反応液の可視部の吸収を測定することによ
り、１，５−アンヒドログルシトールを定量することが
できる。
【００２２】本反応における酸化酵素（その使用量）と
しては、例えばソルボースオキシダーゼ（ＥＣ．１．
１．３．１１）（１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、ピラノー
スオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）（１〜１０
０Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダーゼ（ＥＣ．
１．１１．１．７）は１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度で用い
られる。緩衝液の種類およびｐＨは前記と同義である。
しては、例えばソルボースオキシダーゼ（ＥＣ．１．
１．３．１１）（１０〜１０００Ｕ／ｍｌ）、ピラノー
スオキシダーゼ（ＥＣ．１．１．３．１０）（１〜１０
０Ｕ／ｍｌ）が用いられる。ペルオキシダーゼ（ＥＣ．
１．１１．１．７）は１〜１００Ｕ／ｍｌの濃度で用い
られる。緩衝液の種類およびｐＨは前記と同義である。
【００２３】色源体はペルオキシダーゼの存在下に酸化
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量〜１０００倍
モル量を用いる。
されて発色する化合物であれば何れも用いることができ
る。例えば、４−アミノアンチピリンまたは３−メチル
−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとフェノールもし
くはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体のカ
ップリング系が使用できる。好ましくは生成する色素の
感度の高いものが良く、例えば２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ビ
ス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメ
チルアミノフェニル〕アミン（以下ＢＣＭＡと略す）
〔特開昭５９−１８２３６１号公報〕、ビス〔３−ビス
（４−クロロフェニル）メチル−４−カルボキシエチル
アミノフェニル〕アミン〔特開昭５９−１８２３６１号
公報〕、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメ
チルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＭＣＤＰと
略す）〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕、１０−Ｎ
−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ジメチルア
ミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（以下ＣＣＡＰと略す）
〔特開昭５６−１４５３５２号公報〕が使用できる。使
用する色源体の量は過酸化水素と等モル量〜１０００倍
モル量を用いる。
【００２４】反応温度は１５〜５０℃で、反応時間は３
〜３０分間、好ましくは５〜１０分間である。
〜３０分間、好ましくは５〜１０分間である。
【００２５】以下に実施例で本発明の態様を説明する。
【００２６】
実施例１ （ヘキソキナ−ゼ法によるグルコ−スの消去とα−グル
コシダ−ゼ阻害を併用した場合の１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量法）下記成分を含有する試薬液を調製
し、以下の反応に用いた。
コシダ−ゼ阻害を併用した場合の１，５−アンヒドログ
ルシトールの定量法）下記成分を含有する試薬液を調製
し、以下の反応に用いた。
【００２７】試薬液１ ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌ、 Ｔｒｉｓ ０．２Ｍ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ヘキソキナ−ゼ ３．２Ｕ／ｍｌ ＡＴＰ ５ｍｇ／ｍｌ ホスホヘキソ−スイソメラ−ゼ ２０Ｕ／ｍｌ ６−ホスホフルクトキナ−ゼ ２０Ｕ／ｍｌ 塩化マグネシウム ４．９ｍＭ パ−オキシダ−ゼ １０Ｕ／ｍｌ 試薬液２ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌ、 フェノ−ル ０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＲＯＤ １００Ｕ／ｍｌ ＢＣＭＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００２８】１，５−アンヒドログルシトール標準液
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
または０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液およびブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定した。得られた検量
線を図１に示す。
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
または０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液およびブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定した。得られた検量
線を図１に示す。
【００２９】実施例２ １，５−アンヒドログルシトール２．５３ｍｇ／ｄｌ
（カラムを用いた比色法により定量）を含む血清を１，
５−アンヒドログルシトール標準希釈液の代わりに用い
る以外は実施例１と同様にして、７５５ｎｍでの吸光度
を測定した。血清中の１，５−アンヒドログルシトール
量を、実施例１で得た検量線を用いて算出したところ
２．５６ｍｇ／ｄｌであった。
（カラムを用いた比色法により定量）を含む血清を１，
５−アンヒドログルシトール標準希釈液の代わりに用い
る以外は実施例１と同様にして、７５５ｎｍでの吸光度
を測定した。血清中の１，５−アンヒドログルシトール
量を、実施例１で得た検量線を用いて算出したところ
２．５６ｍｇ／ｄｌであった。
【００３０】実施例３ （マルトース存在下において、ヘキソキナ−ゼ法とα−
グルコシダ−ゼ阻害を併用した場合の１，５−アンヒド
ログルシトール定量法への効果）１，５−アンヒドログ
ルシトール標準希釈液の代わりに、試料として（ａ）精
製水（ｂ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄ
ｌ〔ＡＧ単独〕または（ｃ）１，５−アンヒドログルシ
トール２ｍｇ／ｄｌとマルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌ
〔ＡＧ＋マルトース〕を用い、α−グルコシダ−ゼ阻害
剤として試薬液１に０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ ＡＤＡ、０．２Ｍ ＡＣＥ
Ｓ、０．２Ｍ ＢＥＳ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２
Ｍ ＭＯＰＳ、５ｍｇ／ｍｌ ヒスチジン、５ｍｇ／ｍ
ｌ アルギニン、５ｍｇ／ｍｌ キニンまたは５ｍｇ／
ｍｌ ベンジルアミン（対照は阻害剤無添加）を用いる
以外は実施例１と同様の方法にして各試料中の１，５−
アンヒドログルシトール量を測定した。結果を第１表に
示した。
グルコシダ−ゼ阻害を併用した場合の１，５−アンヒド
ログルシトール定量法への効果）１，５−アンヒドログ
ルシトール標準希釈液の代わりに、試料として（ａ）精
製水（ｂ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄ
ｌ〔ＡＧ単独〕または（ｃ）１，５−アンヒドログルシ
トール２ｍｇ／ｄｌとマルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌ
〔ＡＧ＋マルトース〕を用い、α−グルコシダ−ゼ阻害
剤として試薬液１に０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ ＡＤＡ、０．２Ｍ ＡＣＥ
Ｓ、０．２Ｍ ＢＥＳ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２
Ｍ ＭＯＰＳ、５ｍｇ／ｍｌ ヒスチジン、５ｍｇ／ｍ
ｌ アルギニン、５ｍｇ／ｍｌ キニンまたは５ｍｇ／
ｍｌ ベンジルアミン（対照は阻害剤無添加）を用いる
以外は実施例１と同様の方法にして各試料中の１，５−
アンヒドログルシトール量を測定した。結果を第１表に
示した。
【００３１】
【表１】
【００３２】第１表によれば、阻害剤無添加の対照では
著しい誤差が生じたのに対して、阻害剤を添加した方法
ではほとんど誤差がなかった。
著しい誤差が生じたのに対して、阻害剤を添加した方法
ではほとんど誤差がなかった。
【００３３】実施例４ （α−グルコシダ−ゼ阻害剤を添加した場合の１，５−
アンヒドログルシトールの定量法）下記成分を含有する
試薬液を調製し、以下の反応に用いた。 試薬液１ ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌ Ｔｒｉｓ ０．２Ｍ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ パ−オキシダ−ゼ １０Ｕ／ｍｌ 試薬液２ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌ フェノ−ル ０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＲＯＤ １００Ｕ／ｍｌ ＢＣＭＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ
アンヒドログルシトールの定量法）下記成分を含有する
試薬液を調製し、以下の反応に用いた。 試薬液１ ２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌ Ｔｒｉｓ ０．２Ｍ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ パ−オキシダ−ゼ １０Ｕ／ｍｌ 試薬液２ ２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌ フェノ−ル ０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＲＯＤ １００Ｕ／ｍｌ ＢＣＭＡ ０．１ｍｇ／ｍｌ
【００３４】１，５−アンヒドログルシトール標準液
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
または０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液およびブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定した。得られた検量
線を図２に示す。
（シグマ社製）を精製水で希釈し、５，２，１，０．５
または０．２５ｍｇ／ｄｌの１，５−アンヒドログルシ
トール標準液希釈液を作成した。得られた各標準液希釈
液およびブランクとしての精製水０．０５ｍｌに試薬液
１を２．２５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた
後、試薬液２を０．７５ｍｌ加え、３７℃で５分間反応
させ、７５５ｎｍでの吸光度を測定した。得られた検量
線を図２に示す。
【００３５】実施例５ （マルトース存在下にいて、α−グルコシダ−ゼ阻害剤
を添加した場合の１，５−アンヒドログルシトール定量
法への効果）１，５−アンヒドログルシトール標準希釈
液の代わりに、試料として（ａ）精製水（ｂ）１，５−
アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ〔ＡＧ単独〕また
は（ｃ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ
とマルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌ〔ＡＧ＋マルトース〕
を用い、α−グルコシダ−ゼ阻害剤として試薬液１に
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、
０．２Ｍ ＡＤＡ、０．２Ｍ ＡＣＥＳ、０．２Ｍ Ｂ
ＥＳ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ ＭＯＰＳ、５
ｍｇ／ｍｌ ヒスチジン、５ｍｇ／ｍｌ アルギニン、
５ｍｇ／ｍｌ キニンまたは５ｍｇ／ｍｌ ベンジルア
ミン（対照は阻害剤無添加）を用いる以外は実施例４と
同様の方法にして各種試料中の１，５−アンヒドログル
シトール量を測定した。結果を第２表に示した。
を添加した場合の１，５−アンヒドログルシトール定量
法への効果）１，５−アンヒドログルシトール標準希釈
液の代わりに、試料として（ａ）精製水（ｂ）１，５−
アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ〔ＡＧ単独〕また
は（ｃ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌ
とマルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌ〔ＡＧ＋マルトース〕
を用い、α−グルコシダ−ゼ阻害剤として試薬液１に
０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、０．２Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、
０．２Ｍ ＡＤＡ、０．２Ｍ ＡＣＥＳ、０．２Ｍ Ｂ
ＥＳ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．２Ｍ ＭＯＰＳ、５
ｍｇ／ｍｌ ヒスチジン、５ｍｇ／ｍｌ アルギニン、
５ｍｇ／ｍｌ キニンまたは５ｍｇ／ｍｌ ベンジルア
ミン（対照は阻害剤無添加）を用いる以外は実施例４と
同様の方法にして各種試料中の１，５−アンヒドログル
シトール量を測定した。結果を第２表に示した。
【００３６】
【表２】
【００３７】第２表によれば、阻害剤無添加の対照では
著しい誤差が生じたのに対して、阻害剤を添加した方法
ではほとんど誤差がなかった。
著しい誤差が生じたのに対して、阻害剤を添加した方法
ではほとんど誤差がなかった。
【００３８】実施例６ （マルトースの影響に対するＴｒｉｓの効果）阻害剤に
０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．４
Ｍまたは０．５ＭのＴｒｉｓを用い、試料として（ｂ）
１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌまたは
（ｃ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌと
マルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌを用いる以外は実施例５
と同様の方法により、各試料中の１，５−アンヒドログ
ルシトール量を定量した。得られた結果を以下の式
（１）
０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．４
Ｍまたは０．５ＭのＴｒｉｓを用い、試料として（ｂ）
１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌまたは
（ｃ）１，５−アンヒドログルシトール２ｍｇ／ｄｌと
マルト−ス２０００ｍｇ／ｄｌを用いる以外は実施例５
と同様の方法により、各試料中の１，５−アンヒドログ
ルシトール量を定量した。得られた結果を以下の式
（１）
【００３９】
【数１】
【００４０】に代入して、各種Ｔｒｉｓ濃度におけるマ
ルトースの１，５−アンヒドログルシトール測定への影
響度を測定した。結果を図３に示した。
ルトースの１，５−アンヒドログルシトール測定への影
響度を測定した。結果を図３に示した。
【００４１】実施例７ （マルトースの影響に対するアルギニンの効果）阻害剤
に０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５
ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのアルギニンを用いる
以外は実施例６と同様の方法により、各種アルギニン濃
度におけるマルトースの１，５−アンヒドログルシトー
ル測定への影響度を測定した。結果を図４に示した。
に０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５
ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌのアルギニンを用いる
以外は実施例６と同様の方法により、各種アルギニン濃
度におけるマルトースの１，５−アンヒドログルシトー
ル測定への影響度を測定した。結果を図４に示した。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、多量のマルトース存在下
においても、煩雑なカラム操作が不用で、簡便な１，５
−アンヒドログルシト−ルの測定法が提供される。
においても、煩雑なカラム操作が不用で、簡便な１，５
−アンヒドログルシト−ルの測定法が提供される。
【図１】 ヘキソキナ−ゼ法によるグルコ−スの消去と
α−グルコシダ−ゼ阻害剤を併用したときの１，５−ア
ンヒドログルシト−ルの検量線。
α−グルコシダ−ゼ阻害剤を併用したときの１，５−ア
ンヒドログルシト−ルの検量線。
【図２】 α−グルコシダ−ゼ阻害剤を添加したときの
１，５−アンヒドログルシト−ルの検量線。
１，５−アンヒドログルシト−ルの検量線。
【図３】 Ｔｒｉｓ存在下におけるマルトースの１，５
−アンヒドログルシトール測定への影響。
−アンヒドログルシトール測定への影響。
【図４】 アルギニン存在下のマルトースの１，５−ア
ンヒドログルシトール測定への影響。
ンヒドログルシトール測定への影響。
Claims (1)
- 【請求項１】 試料中の定量すべき成分を酵素反応を利
用して定量する方法において、反応液中にα−グルコシ
ダ−ゼ阻害剤を共存させることを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5179293A JPH06261789A (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | 物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5179293A JPH06261789A (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | 物質の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261789A true JPH06261789A (ja) | 1994-09-20 |
Family
ID=12896797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5179293A Withdrawn JPH06261789A (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | 物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06261789A (ja) |
-
1993
- 1993-03-12 JP JP5179293A patent/JPH06261789A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000530 |