JPH06265698A

JPH06265698A - Ｘ線顕微鏡

Info

Publication number: JPH06265698A
Application number: JP5087393A
Authority: JP
Inventors: Yoshinori Iketaki; 慶記池滝
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1993-03-11
Publication date: 1994-09-22

Abstract

(57)【要約】【目的】試料に照射する励起用輻射線としての紫外線
の照射時間およびＸ線を照射するタイミングを適切にす
る決定方法および、その決定方法を適用したＸ線顕微鏡
を提供する。【構成】Ｘ線光源としてのＳＯＲ光源41と、紫外線光
源としての紫外線レーザ光源47と、Ｘ線パルスを検出す
るＭＣＰ43等を設ける。紫外線の照射を開始した時点を
基準にして（Ｔ＋３τ）以内にＸ線を照射するようにＸ
線照射のタイミングを設定し、サンプル45に照射する紫
外線の照射時間ＴをＴ＝３τとする。ただし、τ：励起
用輻射線に励起された状態の観察する分子もしくは原子
の寿命、Ｔ：励起用輻射線の照射時間。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、軟Ｘ線領域のＸ線を用
いて生体サンプル等の試料の透過Ｘ線顕微鏡像を撮像す
る、Ｘ線顕微鏡に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、Ｘ線光源やＸ線光学素子の研究開
発が進んでおり、それらを応用するシステムの１つとし
てＸ線顕微鏡が提案されている。このようなＸ線顕微鏡
としては、ウォルタ型の斜入射光学系や、回折を利用し
たフレネルゾーンプレートや、２枚の球面鏡に多層膜を
コーティングしたシュワルツシルド型の直入射光学系等
の、多種類の結像素子を利用した顕微鏡システムが提案
されている。このようなＸ線顕微鏡において、特に軟Ｘ
線を用いるものは、電子線を用いる場合に比べて生体試
料に与えるダメージが少ないため生体を生きたまま、無
染色、高分解能で観察可能であり、最近になって生物顕
微鏡への応用が注目されるようになり、生物分野のニー
ズが大きくなってきている。

【０００３】軟Ｘ線領域の中では特に、λ＝４３．７Å
〜２３．６Åの波長領域（いわゆる「水の窓」の波長領
域）は、炭素および窒素によく吸収され、かつ酸素およ
び水素より成る水分子に対して高い透過率を有している
ことから、主な構成要素が炭素であるタンパク質（生体
組織等）の透過顕微鏡像を水中であっても良好なコント
ラストで観察することができる。現在、各研究機関で
は、λ＝４３．７Å〜２３．６Åの波長領域で高いスペ
ックを有する光学素子、光源、検出器等の開発を進めて
いる。

【０００４】上記波長領域は、上述のように生体観察用
に適しているが、この波長領域において高いスペックを
有する光学素子等を製作するためには以下の問題点があ
り、その第１の問題点は、特に上記波長域において優れ
た特性を有するＸ線多層膜反射鏡やフィルタを製作する
のが後述するように難しいことである。すなわち、高い
反射率を有する多層膜反射鏡を設計する際には、可能な
限り屈折率の差が大きい２種類の物質を交互に堆積する
必要があるが、上記波長領域ではいかなる物質も屈折率
が１に近くなるため、屈折率の差が大きくなるように２
種類の物質を選択することが困難である。ここで、Ｎｉ
／Ｓｃ、Ｎｉ／Ｔｉ等、多少の反射率を期待し得る物質
を用いることも考えられているが、その場合、蒸着する
際に結晶化しやすいため均一に製膜するのが困難である
上に、現行の製膜技術においてはλ＝４３．７Å〜２
３．６Åの波長領域で直入射反射鏡を製作しようとする
と多層膜の１周期が２０Å以下となって多層膜自体の製
作が困難になる。また、この波長領域は、炭素のＸ線に
対する吸収率が高くなるので有機材料をフィルタとして
用いることができず、フィルタ材料の選択範囲が狭い。
したがって、Ｘ線顕微鏡システムにおいて、何らかの形
でＸ線多層膜鏡やフィルタを利用することが構成上避け
られないことから、上記多層膜鏡やフィルタの問題点が
上記波長域の軟Ｘ線を利用するときの障害となる。

【０００５】また仮に、上記第１の問題点を解決して生
体の透過顕微鏡像の撮像に最適な上記波長域のＸ線を結
像し得る光学系を実現したとしても、以下に述べるよう
に生体サンプルの観察時に、吸収によるコントラスト低
下の、第２の問題点が発生する。すなわち、生体サンプ
ルの軟Ｘ線吸収率は、サンプルの厚み、サンプル内に存
在する炭素の密度および使用するＸ線の波長によって決
定されるため、炭素密度が高くかつ厚い生体サンプルを
観察する場合には、生体サンプルに入射したＸ線の大部
分は吸収されてしまい、得られる生体透過顕微鏡像は、
全体的に暗くかつコントラストの無いものになってしま
う。逆に、炭素密度が低くかつ薄い生体サンプルを観察
する場合には、生体サンプルに入射したＸ線の大部分は
透過してしまい、得られる生体透過顕微鏡像は、全体的
に明るくかつコントラストの無いものになってしまう。

【０００６】上記コントラストの問題の対策としては、
生体サンプル内の炭素密度を人為的に変化させるのは不
可能なので、生体サンプルの厚みを調整するか、あるい
はλ＝４３．７Å〜２３．６Åの波長領域内で使用する
Ｘ線の波長を調整する方法が考えられる。ここで、観察
対象の生体サンプルの厚みを調整する方法は、ミクロト
ーム等の熟練を要する精密加工機を用いてサンプルを切
断し、試行錯誤によって最適なサンプル厚を決定する必
要があり、実用的ではない。また、使用するＸ線の波長
を調整する方法は、ゾーンプレートやシュワルツシルド
型光学系等の波長分散性を有する光学素子を使用する場
合に、光学素子の大幅な設計変更やレイアウト変更が避
けられず、現実的ではない。

【０００７】現在、上記方法とは異なる方法として、λ
＝４３．７Å〜２３．６Åの波長領域以外の領域（例え
ばλ＝６５〜４３．７Åの波長領域）のＸ線を使用して
コントラストが非常に高く、かつ特定のタンパク質の分
子の顕微鏡像を選択的に得られる方法が提案されてお
り、その原理を図４および図５によって説明する。図４
（ａ）〜（ｆ）は夫々、炭素原子がＸ線を吸収する際の
電子の状態の遷移を経時的に表わしており、同図（ａ）
は基底状態の炭素原子の電子配列を示している。この状
態からＸ線照射により１Ｓ電子を電離させると、第１遷
移により同図（ｂ）に示すように炭素原子は１Ｓ軌道に
空孔を残した状態になる。この状態は同図（ｃ）に示す
ようにエネルギー的に極めて不安定であるため、２Ｐ電
子が１Ｓ軌道に遷移する第２遷移により同図（ｄ）に示
す安定状態になる。さらに、炭素原子が例えばタンパク
質等の分子の構成要素である場合には、同図（ｅ）に示
すように２Ｐ軌道に空孔を生じた状態になっているの
で、炭素原子は第３遷移により周囲の元素等から電子を
捕獲し、同図（ｆ）に示すように当初と同一の基底状態
に復帰する。このような遷移の過程において、通常は第
１遷移による吸収を利用してタンパク質の透過顕微鏡像
を撮像して観察するが、その際にＸ線波長が炭素の吸収
端波長よりも長いと、Ｘ線がタンパク質に吸収されない
ため、得られる透過顕微鏡像のコントラストが極端に劣
化する。

【０００８】ここで、上記遷移の順序を逆にした場合に
ついて考察してみると、以下に述べるようにＸ線波長が
炭素の吸収端波長よりも長い場合であってもコントラス
トの極めて良好な透過顕微鏡像を撮像することができ
る。すなわち、まず、図５（ａ）に示す基底状態から上
記第３遷移の逆過程により２Ｐ電子を電離または励起さ
せて同図（ｂ）の電子状態を実現する。次に、この状態
から上記第２遷移の逆過程により同図（ｃ）に示すよう
にＸ線によって１Ｓ電子をまだ空いている２Ｐ軌道に励
起する。この遷移過程は、炭素の吸収端波長よりも低い
光子エネルギーのＸ線（つまり炭素の吸収端波長よりも
長波長のＸ線）により実現可能であり、この遷移過程を
経た後は同図（ｄ）に示す状態になる。

【０００９】この状態は、上記第１遷移により基底状態
から直接１Ｓ電子を電離させた図４（ｂ）の場合と全く
同一になるが、この方法において電子を電離または励起
させるのに要するエネルギーは数ｅＶ〜２０ｅＶ（波長
に換算すると１００ｎｍ〜３００ｎｍ）程度であるの
で、紫外線レーザ等を利用することができる。一方、１
Ｓ電子を２Ｐ軌道に励起するために要するエネルギーは
電離させる場合よりも数ｅＶ〜２０ｅＶ程度低い値にな
る。したがって、基底状態の炭素原子の２Ｐ電子を電離
する過程と、１Ｓの電子を２Ｐ軌道に励起する過程の２
段階の過程により、炭素の吸収端波長よりも長い波長の
Ｘ線を用いた場合にもタンパク質の透過顕微鏡像を得る
ことができる。

【００１０】上記遷移の順序を逆にした方法は、J.H.Kl
ems によって下記の優位性を定量的に確認されている
（J.K.Klems Phys.Rew Vol 43 (1991) p2041〜2045参
照）。第１に、炭素吸収端波長よりも長い波長のＸ線を
利用できるので、多層膜を製作する際に、光学定数が優
れかつ製膜しやすいＷ／Ｃ等の材料が選択可能であり、
しかもこれらの材料はその性質等の研究が進んでおり使
用実績もある。第２に、タンパク質の種類により，２Ｐ
電子の電離または励起エネルギーが異なるので、特定の
タンパク質の炭素原子のみを選択的に電離または励起す
ることができる。さらに、その電離に続く１Ｓから２Ｐ
への電子遷移のエネルギーが量子的に一義的に決まるこ
とから、この大きさの光子エネルギーを有するＸ線をプ
ローブとすることにより、特定のタンパク質の透過顕微
鏡像を観察することができる。その際、コントラスト
は、図６に示すような特性を示し、λ＝４３．７Å〜２
３．６Åの波長領域を用いる従来の方法に比べて１桁以
上高くなる。

【００１１】上述した原理を用いる方法は、今までに提
案されている従来のＸ線顕微鏡システムに若干の変更を
加えることにより容易に実現することができる。すなわ
ち、従来のＸ線顕微鏡は、図７の基本概念図に示すよう
に、光源１、集光レンズ２、サンプル３、対物レンズ
４、フィルタ５および検出器６を同一光路上に配置して
成る。この中で使用する対物レンズとしては、一般に、
ゾーンプレートやシュワルツシルド光学系等の波長分散
型と、ウォルタ型のような白色光を集光する斜入射鏡型
との２種類に分かれるが、白色光源およびウォルタ型対
物レンズを用いるシステムの場合、検出器に至る光路中
に分光器を設ける必要がある。また、検出器としては、
マイクロチャンネルプレート（ＭＣＰ）やＣＣＤ等の撮
像素子が使用されるが、白色光源を使用する場合には、
紫外領域より長い波長の迷光をカットするためにＢｅ等
の薄膜フィルタを設けるのが一般的である。なお、上記
光学系は真空容器内に収納される。

【００１２】このような従来のＸ線顕微鏡システムに、
J.H.Klems の提案している方法を適用するのは極めて容
易であり、図８の基本概念図に示すように、紫外線光源
８、集光レンズ７および紫外線反射鏡９を追加するだけ
でよい。このシステムは、基本的には、サンプル３およ
び対物レンズ４間に紫外線反射鏡９を挿入したこと以外
は上記従来システムと同一であり、紫外線反射鏡９とし
ては、Ｂｅ等の薄膜より成り６５〜４３．７Åの波長領
域で十分な透過率を有しかつ紫外域の光線に対して十分
な反射率を有するものを選択するものとし、それにより
紫外線反射鏡９はＸ線フィルタとしての機能を有するこ
とになる。なお、シュワルツシルド光学系４には６５〜
４３．７Åにおいて高い反射率を有するＷ／Ｃ多層膜が
コーティングされている。このシステムにおいて図４の
第２遷移の逆過程に対応する光子エネルギーのＸ線を用
いて透過顕微鏡像を撮像する際には、同時に外部の紫外
線光源８からの紫外線を紫外線反射鏡９で反射させてサ
ンプルに照射することにより、特定のタンパク質の炭素
２Ｐ電子を電離または励起することができ、J.H.Klems
の提案したＸ線顕微法が実現可能となる。この場合、紫
外線反射鏡９は、検出器６にとってはノイズとなる、紫
外領域よりも長い波長の迷光をカットする作用を果たす
ことになる。

【００１３】上記システムはさらに、生体サンプルに対
するＸ線の吸収率を人為的かつ簡易に調整し得るので、
生体サンプルの厚みや使用するＸ線の波長を調整せずに
透過Ｘ線顕微鏡像のコントラストを任意に選択し得る利
点を有している。すなわち、上記方法によれば、生体サ
ンプルのＸ線吸収率は、図５（ｃ）に示すような紫外線
照射を経た後に２Ｐ軌道に空孔を有する炭素の数に比例
し、２Ｐ軌道に空孔を有する炭素の数は、照射した紫外
線の強度に比例することから、生体サンプルに照射する
紫外線の強度（光量）を調整することにより容易に生体
サンプルのＸ線吸収率を変化させることができ、その調
整によって最適なコントラストを有する透過Ｘ線顕微鏡
像が得られる。なお、紫外線光源によりサンプルに紫外
線照射を行った場合の透過Ｘ線顕微鏡像と、紫外線照射
を行なわなかった場合の透過Ｘ線顕微鏡像とを夫々撮像
して、それらから差分画像を作成することにより、炭素
以外の元素による吸収に起因するバックグラウンド（ノ
イズ）を除去することが可能になり、純粋な炭素のみの
透過Ｘ線顕微鏡像を優れたコントラスト比で得ることが
できる。

【００１４】上記J.H.Klems の提案したＸ線顕微法の原
理を応用した従来例としては、例えば図９および図10に
示すものがある。図９の従来例は、シンクロトロン放射
光源（ＳＯＲ光源）11をＸ線光源とし、Ｘ線光学系とし
てフレネルゾーンプレートを使用して構成したものであ
り、ＳＯＲ光源11、分光器12、コンデンサレンズ14、サ
ンプル13、対物レンズ15および検出器16より成るＸ線光
路中のコンデンサレンズ14および対物レンズ15はフレネ
ルゾーンプレートより成るものを用いている。この従来
例はさらに、サンプル13および対物レンズ15間に厚さ３
０００Å程度のＢｅ薄膜19をＸ線光軸に対し４５°をな
すように配置するとともに、顕微鏡外部に紫外線レーザ
光源18、集光レンズ17およびウェッジ10より成る紫外線
光路を設け、紫外線レーザ光をＢｅ薄膜19で反射させて
サンプル13を背面より照射するようにしてある。このと
きＢｅ薄膜19は、検出器（ＭＣＰ）16に紫外線等の迷光
が入射しないように遮蔽する作用も果たす。

【００１５】上記システムは、紫外線光路中に紫外線光
軸と直交方向に移動し得るウェッジ10を設け、このウェ
ッジ10を紫外線に対する吸収率が十分高い物質（例えば
ＢＫ７；ガラス）としているので、ウェッジ10を移動す
ることによりウェッジ21を通過する紫外線の光路長を変
化させて、サンプルに照射する紫外線量を調整すること
ができる。したがって、Ｘ線照射と同時に光量を調整し
た紫外線をサンプルに照射することにより、上記原理に
基づく良好なコントラスト比でタンパク質の透過Ｘ線顕
微鏡像を得ることができる。

【００１６】また、図10の従来例は、光源をＮｄ：ＹＡ
Ｇレーザ等を用いたレーザプラズマ光源とし、Ｘ線コン
デンサレンズ22をウォルタ型ミラーとし、Ｘ線対物レン
ズ24をシュワルツシルド光学系とし、光検出器26をマイ
クロチャンネルプレート（ＭＣＰ）としてＸ線光路を構
成したものであり、上記以外の部分の作用は基本的には
上記図７の従来例と同様である。この従来例の上記従来
例との相違点は、Ｘ線発生のために集光レンズ30を介し
てターゲット21を撃つＮｄ：ＹＡＧレーザ20からのレー
ザ光の一部をハーフミラー27で分岐して利用するように
紫外線光路を構成していることであり、ハーフミラー27
で分岐したレーザ光は、偏光子32で光量を調整され、Ｋ
ＤＰ結晶25で紫外波長域の４倍高調波に変換されてから
ミラー28、集光レンズ31を経て紫外線反射ミラー29に照
射される。この従来例は、上記従来例に比べて紫外線レ
ーザ等の光源が不要になる利点がある他、上記シュワル
ツシルド光学系に優れた特性を有するＷ／Ｃ多層膜を用
いることにより、波長４５Åの直入射において２００層
を積層した場合、ほぼ３０％の反射率が得られ、明るい
Ｘ線光学系を構成することができる。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】このような励起用輻射
線としての紫外線および軟Ｘ線を照射する軟Ｘ線顕微鏡
法（以下、紫外線励起型軟Ｘ線顕微鏡法と称す）は、上
述したような優位性を有しているが、その優位性を発揮
させるためには、以下の問題が解決されることが前提と
なる。すなわち、適切なコントラストで軟Ｘ線顕微鏡像
を撮像するためには、試料に照射する紫外線の照射時間
およびＸ線を照射するタイミングを、どのようにして最
適化すればよいかを定量的に把握する必要がある。ま
た、その際、必要とする紫外線の強度が把握できれば、
その紫外線の強度に応じて適切な紫外線光源が選択され
ることとなる。そして、レーザ等の紫外線光源の選択
は、製品化の際の、極めて重要なファクタであり、製品
の価格および機能に大きく影響を与える。しかしなが
ら、試料に照射すべき励起用輻射線の照射時間およびＸ
線を照射するタイミングをどのようにして決定したら適
切になるかを定量的に解析した研究は今までのところな
されていない。

【００１８】本発明は、上記問題に鑑み、試料に照射す
る励起用輻射線の照射時間およびＸ線を照射するタイミ
ングを適切にする決定方法および、その決定方法を適用
したＸ線顕微鏡を提供することを目的とする。

【００１９】

【課題を解決するための手段および作用】この目的のた
め、本発明の請求項１の構成は、試料に対し励起用輻射
線および軟Ｘ線を照射して該試料の透過Ｘ線顕微鏡像を
撮像するＸ線顕微鏡において、前記励起用輻射線の照射
を開始した時点を基準にして（Ｔ＋３τ）以内にＸ線を
照射するようにしたことを特徴とする。ただし、 τ：励起用輻射線に励起された状態の観察する分子もし
くは原子の寿命Ｔ：励起用輻射線の照射時間また、請求項２の構成は、上記請求項１の構成におい
て、励起用輻射線光源の照射時間が３τとなるようにし
たことを特徴とする。これにより、試料に照射する励起
用輻射線の照射時間およびＸ線を照射するタイミングが
適切になり、良好な画質の透過Ｘ線顕微鏡像が得られ
る。

【００２０】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面に基づき詳細に
説明する。図１は本発明のＸ線顕微鏡の第１実施例の構
成を示すシステム図である。この実施例のＸ線顕微鏡
は、Ｘ線光源としてシンクロトロン放射光源（ＳＯＲ光
源）41を用いており、ＳＯＲ光源41は、可視光〜Ｘ線を
含む極めて広い波長範囲に及ぶ連続スペクトルを発生す
るパルス光源である。ＳＯＲ光源41から発せられた光ビ
ームは紫外線カットフィルタＡを介して回折格子からな
る分光器42に入射され、分光器42は必要とする波長域の
Ｘ線を取り出してドーナツ状のＭＣＰ43に入射する。Ｍ
ＣＰ43の中央には観察に用いる入射ビーム（Ｘ線）が通
過し得るように穴をあけてあり、観察に支障のない範囲
で入射ビームの周辺部を検出し、図３に示すようなＳＯ
Ｒ光源41の発光と同期したパルス信号を発生し、そのパ
ルス信号は後述するホストコンピュータに入力される。

【００２１】ＭＣＰ43を通過したＸ線はコンデンサレン
ズ44を介してサンプル45に照射され、その後、対物レン
ズ46を介して検出器57に入力される。なお、この例では
上記Ｘ線光路中のコンデンサレンズ44としてウォルター
光学系、対物レンズ46はシュワルツシルド光学系を用い
ている。この実施例はさらに、顕微鏡外部に紫外線レー
ザ光源47および集光レンズ48より成る紫外線光路を設
け、紫外線レーザ光をサンプル45に斜めから照射するよ
うにしてある。なお、上記各構成要素の内、ＳＯＲ光源
41、紫外線レーザ光源47および集光レンズ48以外の構成
要素は真空容器62内に収容され、真空容器62は、ＳＯＲ
光源41のビーム射出口に直結されていて、励起用輻射線
としての紫外光が透過する部分には、透過窓62b が設け
られている。また、上記構成においては、Ｘ線光軸と紫
外線光軸とはサンプル照射部において所定の角度をな
し、サンプル45はＸ線光軸に対し９０°をなすように配
置されている。

【００２２】次に、検出器（ＭＣＰ）57からの画像信号
を処理する、画像信号処理システムを図２によって説明
する。この画像信号処理システムは、Ｘ線顕微鏡システ
ム全体を制御するホストコンピュータ71を具えるととも
に、入射したＸ線をＭＣＰ57、フォスファ72で可視化
し、レンズ73を介して透過Ｘ線顕微鏡像を撮像するＴＶ
カメラシステム74と、ゲート回路82の選択的開閉に応じ
てＴＶカメラシステム74からの２種類（紫外線を照射し
たものおよび照射しないもの）の映像信号をＡ／Ｄコン
バータ75-1および75ー2でデジタル化した画像データを夫
々格納するフレームメモリ76ー1および76ー2と、フレーム
メモリ76ー1および76ー2の画像データの各画素の差分を取
って得られたデジタル差分信号をホストコンピュータ71
に入力する差分回路77と、ホストコンピュータ71からの
指令信号に基づきフレームメモリ76ー1および76ー2にデー
タ出力タイミングのトリガ信号を出力するデータセレク
タ回路78と、ホストコンピュータ71からの入力信号に基
づいてタンパク質等の透過Ｘ線顕微鏡像を表示するＣＲ
Ｔ79を具えて成る。

【００２３】この画像信号処理システムはさらに、ＭＣ
Ｐ43から入力されるパルス信号に応じて紫外線レーザ光
源47を駆動するタイミングを決定するディレイ回路81を
具えており、そのタイミングに応じてディレイ回路81か
ら紫外線レーザ用Ｑスイッチ信号が紫外線レーザ光源47
に出力される。なお、ホストコンピュータ71は、上記各
信号に加え、ＴＶカメラシステム74のトリガ信号および
ゲート回路82のトリガ信号をも出力し、ゲート回路82の
トリガ信号の出力のタイミング（したがって映像信号の
取り込みのタイミング）は上記ＭＣＰ43から入力される
パルス信号に応じて決定される。

【００２４】次に、この第１実施例のＸ線顕微鏡によ
る、透過Ｘ線顕微鏡像の撮像について説明する。この実
施例では、ＳＯＲ光源41がパルス状のビームを出力し、
分光器42で単色化されたパルス状Ｘ線が取り出されるの
で、ホストコンピュータ71はＳＯＲ光源41に対し駆動タ
イミングの制御を行う必要はない。したがって、この画
像信号処理システムでは図３に示すＸ線パルスを照射さ
れたサンプル45からのＸ線がＭＣＰ57によって絶えず取
り込まれている。その間、ホストコンピュータ71は、Ｍ
ＣＰ43からのパルス信号をカウントしており、あるパル
ス信号が出力された時点（図３の瞬時ｔ₃ ）からパルス
信号を３つカウントした時点（ｔ₀ ）がディレイ回路81
のトリガのタイミング、言い換えれば紫外線レーザ光源
47にＱスイッチ信号を出力するタイミングとなる。した
がって、このタイミングでサンプル45に紫外線が照射さ
れることになり、Ｘ線パルスおよび紫外線パルスの発生
のタイミングが決定される。

【００２５】ホストコンピュータ71は、上記紫外線の発
生に同期させて、ＴＶカメラシステム74、フレームメモ
リ76ー1、76-2およびゲート回路82に夫々トリガ信号を出
力することにより、フレームメモリ76ー1には、紫外線を
照射した場合に得られる映像信号である、生体サンプル
の炭素の透過Ｘ線顕微鏡像をデジタル化した画像データ
ａが格納され、フレームメモリ76ー2には、紫外線を照射
しない場合に得られる映像信号である、生体サンプルの
炭素以外の元素の透過Ｘ線顕微鏡像をデジタル化した画
像データｂが格納される。なお、図３から明らかなよう
に、紫外線パルスの方がＸ線パルスよりもパルス幅が広
くなっている場合は、１つの紫外線ドルスの発生中に複
数のＸ線パルスが発生されることになるので、その中か
ら１つのＸ線パルスによる映像信号のみを取り込んで多
重像になるのを防止するために、上記ゲート回路82をＴ
Ｖカメラ74およびＡ／Ｄコンバータ75-1、75ー2間に設け
ている。

【００２６】上記フレームメモリ76ー1の画像データは、
最終的に抽出したい炭素の透過Ｘ線顕微鏡像にノイズが
加わった信号であり、フレームメモリ76ー2の画像データ
ｂは、フレームメモリ76ー1の画像データａのバックグラ
ウンド（ノイズ）信号である。したがって、差分回路77
において各画素について両者の差分を取ることにより上
記ノイズが除去されることになり、純粋に炭素の透過Ｘ
線顕微鏡像のみを含む差分信号（ａ−ｂ）が得られる。
この差分信号（画像データ）は、ホストコンピュータ71
からＣＲＴ79に出力され、炭素の透過Ｘ線顕微鏡像が表
示される。なお、上記ではまずＸ線と紫外線とを照射し
て画像を取り、次にＸ線のみを照射して画像を取る、と
いう順序にしたが、観察対象が紫外線に弱いものである
場合などでは、この順序を逆にするとよい。

【００２７】次に、上記透過Ｘ線顕微鏡像の撮像の際に
サンプルに照射する紫外線の照射時間およびＸ線を照射
するタイミングが適切になるようにする、紫外線の照射
時間およびＸ線を照射するタイミングの決定の原理につ
いて、紫外線の吸収と緩和の基礎過程を考察しながら詳
細に説明する。なお、以下の説明は数式を用いて定量的
に展開するので、数式中に用いる記号の意味を以下のよ
うに定義しておく。

【００２８】N₀ ：単位体積あたりの観察しようとする
分子もしくは原子の数Ｎ：単位体積あたりの観察しようとする基底状態の分
子もしくは原子の数ｎ：単位体積あたりの観察しようとする紫外線に励起
された状態の分子もしくは原子の数 τ ：紫外線に励起された状態の分子もしくは原子の寿
命 σ_uv：観察する分子もしくは原子の紫外線による励起断
面積Ｔ：紫外線の照射時間Ｉ₀ ：単位時間、単位面積あたりに試料を照射する光子
数（フォトンフラックス）

【００２９】まず、観察する分子もしくは原子に紫外線
を照射したとき、時間ｔに関する基底状態および励起状
態の平衡方程式は、式（１）で与えられる。

【数１】 −ｄＮ／ｄｔ＝I₀σ_uvＮ−（N₀−Ｎ）／τ ・・・（１）初期条件ｔ＝０でＮ＝N₀の下で（１）を解いてｎ＝N₀−
Ｎを求めると、（２）式を得る。

【数２】ｎ＝［１−ｅｘｐ｛−（I₀σ_uv＋１／τ）ｔ｝］・｛I₀σ_uvN₀τ ／（１＋I₀σ_uvτ）｝・・・（２）

【００３０】さらに（２）式を変形し、紫外線により励
起された分子もしくは原子の割合αを求めると、（３）
式を得る。

【数３】 α＝ｎ／N₀＝［１−ｅｘｐ｛−（I₀σ_uv＋１／τ）ｔ｝］・｛I₀σ_uvτ ／（１＋I₀σ_uvτ）｝・・・（３）

【００３１】この（３）式を考察すると、紫外光のフォ
トンフラックスが一定の場合、照射時間が長いほどαが
大きくなることがわかる。紫外線励起型軟Ｘ線顕微鏡法
においては、αが大きいほど、吸収係数が大きくなり、
コントラストのある画像が得られることになる。上記
（３）式において、αの値を左右する項は、Ｃ＝ｅｘｐ
｛−（I₀σ_uv＋１／τ）ｔ｝であり、このＣの値をでき
るだけ小さくすればよいが、Ｔ＝３τにおいてＣはほぼ
０．０５以下になる。すなわち、紫外線の照射時間Ｔが
３τ以内であれば励起は能率的に行われる。

【００３２】したがって、紫外線に励起された状態の分
子もしくは原子の寿命τに応じて紫外線光源照射時間を
設定すれば、外殻電子を短時間で能率的に励起すること
ができる。また、脱励起の逆過程を考えた場合、反対
に、紫外線光源の照射停止後３τが経過した時点で励起
された分子もしくは原子の９５％以上が基底状態に戻っ
てしまう。以上のことを総合すると、良好なコントラス
トで透過Ｘ線顕微鏡像を撮像するためには、少なくとも
紫外線を照射し始めた時点を基準にして（Ｔ＋３τ）以
内にＸ線を照射すればよいことがわかる。上記の実施例
ではＸ線の照射のタイミングを基準として紫外線を照射
するタイミングを決めているが、両者がほぼ同時にサン
プルに照射されるようになっており、上記の条件を満た
している。

【００３３】次に、生体のタンパク質をＸ線顕微鏡によ
り観察する場合を想定して紫外線光源について考察す
る。生体のタンパク質をＸ線顕微鏡により観察する際に
は、主に、炭素の吸収を観察することになる。その際、
Klems によれば、波長２００〜３００ｎｍの領域に強い
吸収帯が存在し、その励起状態の寿命は３ｎｓｅｃ前後
であるとの報告がなされている。したがって、紫外線光
源としては、例えば１０〜６ｎｓｅｃのパルス幅を有す
るＮｄ：ＹＡＧレーザの高調波を用いるのが最適であ
る。さらに、タンパク分子の振動緩和によって寿命の短
い（例えば数百ｐｓｅｃ）励起状態を発生させる場合に
は、短いパルス幅を有するＴｉサファイヤレーザの高調
波を用いたり、ＳＯＲ光源を用いるのが適切である。

【００３４】以上の条件において、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ
の高調波でタンパク質の分子（寿命３ｎｓｅｃ）を励起
する場合には、紫外線を照射し始めた時点を基準にして
２０ｎｓｅｃ以内にＸ線を照射すれば、良好なコントラ
ストの透過Ｘ線顕微鏡像が得られることになる。なお、
この実施例ではホストコンピュータによってＸ線照射と
紫外光照射のタイミングを取るようにしたが、次のよう
な簡便な方法を用いても良い。すなわち、図１１
（ａ）、（ｂ）に示すように、ＭＣＰ４３からの出力パ
ルスをゲート回路１００で適当に間引いてワンショット
マルチバイブレータ１０１に供給する。そして、マルチ
バイブレータ１０１の出力をその立下がりでパルスを出
すパルス発生器１０２に供給する。パルス発生器１０２
の出力はスイッチ１０３を介して紫外線レーザＱスイッ
チ信号として紫外線レーザに供給される。ワンショット
マルチバイブレータ１０１は外部から手動により時定数
を調整できるようになっており、これを調整することに
よりパルス発生器１０２から発生するパルスのタイミン
グが変化する。

【００３５】したがって、ＭＣＰ４３からの出力パルス
Ｓ１、ゲート回路１００の出力パルスＳ２、およびパル
ス発生器１０２からの出力パルスＳ４をオッシロスコー
プに供給し、画面を見ながらワンショットマルチバイブ
レータ１０１の時定数を調整してＳ１パルスとＳ４パル
スとが所定のタイミングになったところでスイッチ１０
３をオンにすれば、次のＳ４パルスでＸ線と紫外光とを
サンプルに照射することができる。実際は、電気系統の
ケーブル等により数ｎｓｅｃ〜１０ｎｓｅｃ程度の電気
信号の遅れがあるので、得られる顕微鏡画像を見ながら
マルチバイブレータ１０１の時定数の微調整を行うこと
が望ましい。

【００３６】なお、上記実施例では、試料として生体の
タンパク質を用いる場合について説明したが、紫外線励
起型軟Ｘ線顕微鏡法において、上記式（４）により試料
に照射する励起用輻射線の照射時間およびＸ線を照射す
るタイミングを決定する方法は全ての分子もしくは原子
に適用可能であり、その場合にも上記と同様の有効性が
得られる。また、上記実施例では、画像処理を直接、ハ
ードウエアの差分回路77で行うようにしているが、差分
回路を省略して、ホストコンピュータ71がフレームメモ
リ76-1、76ー2から画像データを読み出してソフトウエア
上で画像処理を行うようにしてもよい。

【００３７】図12は本発明のＸ線顕微鏡の第２実施例の
構成を示すシステム図である。この実施例のＸ線顕微鏡
は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ51が発生するレーザ光を集光レ
ンズ52で集光してターゲット53に衝突させることにより
Ｘ線を発生するレーザプラズマＸ線光源と、コンデンサ
レンズ54、対物レンズ55、紫外線カットフィルタ61およ
び検出器57を有しＸ線をサンプル58に照射して透過Ｘ線
顕微鏡像を得るＸ線光路と、紫外レーザ64が発生したレ
ーザ光をガラス楔（ウェッジ）65で光量調整した後に集
光レンズ60で集光して真空容器62内のサンプル58に照射
する紫外線光路とを具え、結像型Ｘ線顕微鏡として構成
されている。なお、上記各光路の構成要素の内、Ｎｄ：
ＹＡＧレーザ51、集光レンズ52、紫外レーザ64、ガラス
楔65、および集光レンズ60以外の構成要素は真空容器62
内に収容され、真空容器62の、レーザ光および紫外光が
透過する部分には夫々、透過窓62a および62b が設けら
れている。

【００３８】上記構成においては、Ｘ線光軸と紫外線光
軸とはサンプル照射部において直交し、サンプル58はＸ
線光軸および紫外線光軸に対し所定の角度（例えば４５
°）をなすように傾けられ、サンプル面の法線がＸ線光
軸と平行にならないように配置されており、この構成は
Ｘ線光路上でコンデンサレンズ〜サンプル〜対物レンズ
間の間隔が極めて狭い場合に適している。なお、この構
成によって得られる、例えば４５°傾けたサンプルの透
過Ｘ線顕微鏡像は、検出器57の結像面にサンプルの１：
（１／√２）の斜影像が結像するので、取り込んだ画像
をデジタル化した後に、ソフトウエアまたは別に設けた
図示しない演算回路により、座標変換等を用いて１：１
の元の画像に復元する必要があり、その復元処理の実施
によってＸ線光学系とサンプルとが近接した構成でも十
分な紫外線をサンプルに照射することが可能になる。

【００３９】また、上記構成において、コンデンサレン
ズ54としては、斜入射型の回転楕円鏡を使用するものと
し、また対物レンズとしてはシュワルツシルド光学系を
使用するものとし、その表面にはＮｉ／Ｃ、Ｗ／Ｃ等の
炭素系の多層膜をコーティングして、６５〜４３．７Å
の波長領域において該光学系の透過率が最大になるよう
にしてある。さらに上記光学窓62b としては、約２００
ｎｍ以上の長波長の紫外線の透過率が高い物質（ダイヤ
モンド、蛍石等）を用いて構成している。

【００４０】次に、検出器（ＭＣＰ）57からの画像信号
を処理する、画像信号処理システムを図13によって説明
する。この画像信号処理システムは、Ｘ線顕微鏡システ
ム全体を制御するホストコンピュータ71を具えるととも
に、入射したＸ線をＭＣＰ57、フォスファ72で可視化
し、レンズ73を介して透過Ｘ線顕微鏡像を撮像するＴＶ
カメラシステム74と、ＴＶカメラシステム74からの２種
類（紫外線を照射したものおよび照射しないもの）の映
像信号をＡ／Ｄコンバータ75-1および75ー2でデジタル化
した画像データを夫々格納するフレームメモリ76ー1およ
び76ー2と、フレームメモリ76ー1および76ー2の画像データ
の各画素の差分を取って得られたデジタル差分信号をホ
ストコンピュータ71に入力する差分回路77と、ホストコ
ンピュータ71からの指令信号に基づきフレームメモリ76
ー1および76ー2にデータ出力タイミングのトリガ信号を出
力するデータセレクタ回路78と、ホストコンピュータ71
からの入力信号に基づいてタンパク質等の透過Ｘ線顕微
鏡像を表示するＣＲＴ79を具えて成り、さらに、Ｘ線発
生用のレーザ光源と紫外線発生用のレーザ光源の発光の
タイミングを調整するためのタイミング回路80を具えて
いる。なお、タイミング回路はＱスイッチ信号に対する
ゲート回路の作用も持っている。

【００４１】上記タイミング回路80は、ホストコンピュ
ータ71からの指令信号によって制御され、サンプルに照
射される紫外線とＸ線の照射のタイミングが（Ｔ＋３
τ）以内になるようにＮｄ：ＹＡＧレーザへのＱスイッ
チ信号と紫外レーザへのＱスイッチ信号の出力タイミン
グを調整する作用をなす。なお、ホストコンピュータ71
は、ＴＶカメラシステム74のトリガ信号も出力する。

【００４２】次に、この第１実施例のＸ線顕微鏡によ
る、透過Ｘ線顕微鏡像の撮像について説明する。まず、
ホストコンピュータ71は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ51にＱス
イッチ信号を出力し、その信号を受けたＮｄ：ＹＡＧレ
ーザ51はレーザ光を発生する。このレーザ光は集光レン
ズ52および透過窓62a を経てターゲット53に衝突し、Ｘ
線を発生させる。一方、ホストコンピュータ71は、この
Ｘ線の発生に同期させて、ＴＶカメラシステム74および
フレームメモリ76ー1に夫々トリガ信号を出力するととも
に、良好なコントラストの透過Ｘ線顕微鏡像が得られる
ような紫外線がサンプル58に照射されるように紫外レー
ザ64を駆動するための指令信号をタイミング回路80に発
する。これにより、Ｘ線と紫外線とが所望のタイミング
でサンプルに照射され、フレームメモリ76ー1には、紫外
線を照射した場合に得られる映像信号である、生体サン
プルの炭素の透過Ｘ線顕微鏡像をデジタル化した画像デ
ータａが格納される。

【００４３】次に、ホストコンピュータ71は、紫外線が
サンプル58に全く照射されないようにＱスイッチ信号を
遮断する指令信号をタイミング回路80に発するととも
に、上記と同様にしてＴＶカメラシステム74およびフレ
ームメモリ76ー2に夫々トリガ信号を出力する。これによ
り、フレームメモリ76ー2には、紫外線を照射しない場合
に得られる映像信号である、生体サンプルの炭素以外の
元素の透過Ｘ線顕微鏡像をデジタル化した画像データｂ
が格納される。

【００４４】上記フレームメモリ76ー1の画像データは、
最終的に抽出したい炭素の透過Ｘ線顕微鏡像にノイズが
加わった信号であり、フレームメモリ76ー2の画像データ
ｂは、フレームメモリ76ー1の画像データａのバックグラ
ウンド（ノイズ）信号である。したがって、差分回路77
において各画素について両者の差分を取ることにより上
記ノイズが除去されることになり、純粋に炭素の透過Ｘ
線顕微鏡像のみを含む差分信号（ａ−ｂ）が得られる。
この差分信号（画像データ）は、ホストコンピュータ71
からＣＲＴ79に出力され、炭素の透過Ｘ線顕微鏡像が表
示される。

【００４５】なお、以上は励起光として紫外線を用いる
ものについて説明したが、観察対象によっては励起光と
してＸ線、可視光等、紫外域以外の波長域の光が必要と
なる場合もある。本発明はそのような場合でも当然適用
でき、ケースバイケースで必要な励起光を選べばよい。

【００４６】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、試
料に対し励起用輻射線および軟Ｘ線を照射して該試料の
透過Ｘ線顕微鏡像を撮像する際に、前記励起用輻射線の
照射を開始した時点を基準にして（Ｔ＋３τ）以内にＸ
線を照射するから（ただし、 τ：励起用輻射線に励起された状態の観察する分子もし
くは原子の寿命Ｔ：励起用輻射線の照射時間である）、試料に照射する励起用輻射線の照射時間およ
びＸ線を照射するタイミングが適切になり、良好な画質
の透過Ｘ線顕微鏡像が得られる。また、その際、前記励
起用輻射線光源の照射時間が３τとなるようにしたか
ら、試料に照射する紫外線の強度が適切になり、良好な
画質の透過Ｘ線顕微鏡像が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＸ線顕微鏡の第１実施例の構成を示す
システム図である。

【図２】第１実施例に用いる画像処理システムの構成を
示す図である。

【図３】第１実施例における、試料に照射する励起用輻
射線の照射時間およびＸ線を照射するタイミングを説明
するための図である。

【図４】（ａ）〜（ｆ）は、Ｘ線顕微鏡の原理を説明す
るための図である。

【図５】（ａ）〜（ｄ）は、Ｘ線顕微鏡の原理を説明す
るための図である。

【図６】図５の原理の有効性を表わす特性図である。

【図７】図４に対応するＸ線顕微鏡システムの基本概念
図である。

【図８】図５に対応するＸ線顕微鏡システムの基本概念
図である。

【図９】図７のＸ線顕微鏡システムを具体化した従来例
の構成を示す図である。

【図１０】図７のＸ線顕微鏡システムを具体化した他の
従来例の構成を示す図である。

【図１１】（ａ）、（ｂ）は第１実施例におけるＸ線照
射および紫外線照射のタイミングを決定する方法の他の
構成を示す図である。

【図１２】本発明のＸ線顕微鏡の第２実施例の構成を示
すシステム図である。

【図１３】第２実施例に用いる画像処理システムの構成
を示す図である。

【符号の説明】

41 シンクロトロン放射光源（ＳＯＲ光源） 42 分光器 43 ＭＣＰ 44 コンデンサレンズ 45 サンプル（生体サンプル） 46 対物レンズ 47 紫外線レーザ光源 48 集光レンズ 57 検出器 62 真空容器 62a 、62b 透過窓（光学窓）

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年５月１２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３２】したがって、紫外線に励起された状態の分
子もしくは原子の寿命τに応じて紫外線光源照射時間を
設定すれば、外殻電子を短時間で能率的に励起すること
ができる。また、脱励起の逆過程を考えた場合、反対
に、紫外線光源の照射停止後３τが経過した時点で励起
された分子もしくは原子の９５％以上が基底状態に戻っ
てしまう。以上のことを総合すると、良好なコントラス
トで透過Ｘ線顕微鏡像を撮像するためには、少なくとも
紫外線を照射し始めた時点を基準にして（Ｔ＋３τ）以
内にパルス幅（Ｔ＋３τ）以内のＸ線を照射すればよい
ことがわかる。上記の実施例ではＸ線の照射のタイミン
グを基準として紫外線を照射するタイミングを決めてい
るが、両者がほぼ同時にサンプルに照射されるようにな
っており、上記の条件を満たしている。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料に対し励起用輻射線および軟Ｘ線を
照射して該試料の透過Ｘ線顕微鏡像を撮像するＸ線顕微
鏡において、前記励起用輻射線の照射を開始した時点を基準にして
（Ｔ＋３τ）以内にＸ線を照射するようにしたことを特
徴とするＸ線顕微鏡。ただし、 τ：励起用輻射線に励起された状態の観察する分子もし
くは原子の寿命Ｔ：励起用輻射線の照射時間
【請求項２】励起用輻射線光源の照射時間が３τとな
るようにしたことを特徴とする請求項１記載のＸ線顕微
鏡。