JPH06292583A

JPH06292583A - マレック病ウイルス由来の抗原タンパク質、その遺伝子組み換え体、及びそれを用いたワクチン

Info

Publication number: JPH06292583A
Application number: JP5056066A
Authority: JP
Inventors: Keyvan Nazerian; ナゼリアンキィバン; Lucy F Lee; エフ．リールーシィ; Noboru Yanagida; 昇柳田
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd; Government of the United States of America
Current assignee: Zeon Corp; Government of the United States of America
Priority date: 1992-03-17
Filing date: 1993-03-16
Publication date: 1994-10-21

Abstract

(57)【要約】【目的】マレック病ウイルスに対するワクチンの提供【構成】マレック病ウイルスのデクメント・プロテイ
ンをコードする遺伝子を利用して、組み換え体を得、そ
の組み換え体を利用してワクチンを得ることにより上記
目的を達成するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレック病ウイルス由
来の抗原タンパク質、その遺伝子、その遺伝子を有する
組み換え体、及び該組み換え体または抗原タンパク質を
有効成分とする抗マレック病ワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヘルペスウイルスの一種であるマレック
病ウイルス（ＭＤＶ）は、若年及び成鶏において伝染性
のリンパ球増殖性の病気を引き起こし、感染した鶏は神
経障害とリンパ腫を呈する。マレック病は、最初に一価
のワクチン接種により効果的にコントロールされた自然
発症的な悪性腫瘍である。しかしながら、ある地域では
従来のワクチンが充分な感染防御効果を提供できないと
いうことに伴って、マレック病による損害は世界中で増
加し続けている。商業用に飼育された鶏においてワクチ
ンブレイクが起きる主な原因のひとつは、現在用いられ
ているワクチンが新たに出現したＭＤＶ強毒株に対して
充分な防御を与えることができないからである。非常に
強毒なｖｖＭＤＶｓ株のような毒性の高いＭＤＶ株は、
フィールドより単離されたものであるが、現在のワクチ
ンではこれらの強毒株に対して殆ど防御能を有しない。
毒性を高めたＭＤＶ変異株は、最終的に現在のワクチン
を効果のないものにしてしまう恐れがある。これに加え
て現在のワクチンは、細胞依存性、即ち細胞に感染さ
せ、この感染細胞を液体窒素中で凍結させて、保存・輸
送を行う必要があるという点で理想的ではない。ヘルペ
スウイルスのＨＳＶのいくつかの糖タンパク質（例えば
ｇＢ、ｇＣ、ｇＤなど）は、免疫応答を誘導することが
知られている（Ｂｌａｃｋｌａｗｓら、Ｖｉｌｏｒｏｇ
ｙ、１７７、７２７−７３６（１９９０）、Ｍａｒｔｉ
ｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、１３５９−１
３７０（１９８９））。また、他のヘルペスウイルスに
ついても同様であることが、Ｇｕｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．ｖ
ｉｒｏｌ．、６４、２３９９−２４０６（１９９０）、
Ｂｒｉｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４、１０７９−１
０８５（１９９０）やＫｅｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．、５２、２９３−２９７（１９８４）などに記載さ
れている。このほかいくつかの構造または非構造タンパ
ク質もまたヘルペスウイルスに対して防御免疫を誘導し
うる可能性を有している。ヘルペスウイルス粒子のテグ
メント領域は、普通電子密度の高い部分として定義さ
れ、ウイルスエンベロープとカプシドの間に位置するア
モルファス領域である。この領域に属するタンパク質
は、これらが非イオン性界面活性剤によって放出され
ず、かつ、ウイルスのカプシドに存在しないことを確認
することで明らかにされてきた（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、２３２０−２３２６（１
９９１））。テグメント遺伝子の産物は、ヘルペスウイ
ルスのアルファ遺伝子と呼ばれ、感染後最初の遺伝子発
現をトランスに制御する。最初にクローニングされたヘ
ルペスウイルスのテグメント遺伝子は、α−トランス−
インデューシングファクター（α−ＴＩＦ）遺伝子とい
う、α−ＴＩＦの主成分をコードする遺伝子であった。
ＵＬ４７、ＵＬ４６のような他のテグメント遺伝子にコ
ードされているタンパク質もまた、アルファ遺伝子の発
現調節において役割を担っている（ＭｃＫｎｉｇｈｔ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１、９９２−１００１（１９
８７））。しかし、この方法はＭＤＶテグメント遺伝子
のクローニングに使うことはできなかった。なぜなら
ば、ＭＤＶタンパク質を多量に取り出すことが困難であ
ったからである。それ故、天然のＭＤＶテグメント・プ
ロテインに対するモノクローナル抗体やポリクローナル
抗血清を作出するのは、有効な方法でないことが明かで
ある。また、実際にこのようなタンパク質は、まだ同定
されていない。これに加えて、ＭＤＶとＨＳＶは、免疫
学的な交差反応が余り起こらないため、ＨＳＶや他のヘ
ルペスウイルスのテグメント・プロテインに対するポリ
クローナル抗血清を用いてＭＤＶのテグメント・プロテ
インを見いだすことは困難であるだろう。Ｂｕｃｋｍａ
ｓｔｅｒｓらは、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６９、２
０３３−２０４２（１９８８）で、ＶＺＶの第１２番目
の遺伝子に相同な遺伝子がＭＤＶのｇＣｈと近い位置に
あることを示唆したが、その配列に関するデータは、ま
だ知られていない。また、最近、ＵＬ４９遺伝子にコー
ドされたＨＳＶ−１のテグメント・プロテインＶＰ２２
が開示された（ＥｌｌｉｏｔとＭｅｒｅｄｉｔｈ、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、７２３−７２６（１９９
２））。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、新たな
抗マレック病ワクチンを得るべく、鋭意研究の結果、単
純ヘルペスウイルスのテグメント・プロテインに相当す
るマレック病ウイルスのテグメント・プロテインとそれ
をコードする遺伝子を見いだし、本発明を完成するに到
った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】かくして本発明は、マレ
ック病ウイルス由来の抗原タンパク質、その遺伝子、そ
の遺伝子を有する組み換え体、及び抗原タンパク質また
は該組み換え体を有効成分とする抗マレック病ワクチン
に関する。

【０００５】（ＤＮＡ分子）本発明のＤＮＡ分子は、配
列番号５、４、３、及び２に示されるアミノ酸配列を有
する３つのテグメント・プロテインＵＬ４６ｈ、ＵＬ４
７ｈ、ＵＬ４８ｈ、ＵＬ４９ｈをコードする遺伝子、ま
たはこれと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好
ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコ
ードするものである。

【０００６】ここで云う相同性は、ＤＮＡＳＩＳ法によ
り計算されるものである。ＭＤＶの３つのセロタイプの
どの株もテグメント遺伝子のクローニングに適してい
る。中でもセロタイプ１に属するウイルスが好ましく、
このようなウイルスの例としては、ＧＡ株（Ｅｄｉｓｏ
ｎｅｔａｌ、ＡｖｉａｎＤｉｓ．、１２、４６７
−４７６（１９６８））、ＲＢ１Ｂ株（Ｓｃｈａｔｅ
ｔａｌ、ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌ．、１１、５９３
−６０５（１９８２））、ＣＵ２株（Ｓｍｉｔｈｅｔ
ａｌ、ＡｖｉａｎＤｉｓ．、１７、７２７−７３６
（１９７３））、ＪＭ株（Ｓｅｖｏｉａｎｅｔａ
ｌ、Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．、５７、５００−５０１（１９６
２））、Ｍｄ５株（Ｗｉｔｔｅｒｅｔａｌ、Ａｖｉ
ａｎＤｉｓ．、２４、２１０−２３２（１９８５））
などが挙げられる。

【０００７】ところで、本発明のテグメント・プロテイ
ンは、それぞれＨＳＶ−１のＵＬ４６、ＵＬ４７、及び
ＵＬ４８と相同であり、また、ＶＺＶのジーン１２、ジ
ーン１１、ジーン１０、及びジーン９と相同である。Ｈ
ＳＶ−１ゲノムとＶＺＶゲノムとを比較すると多くの遺
伝子領域で重複するが、全てが同じ様な位置にあるので
はないことが知られている（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅｅｔ
ａｌ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１
３、７８６５−７８７９（１９８５）；ＭｃＧｅｏｃｈ
ｅｔａｌ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６９、１５
３４−１５７４（１９８８）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６７、１７５９−１８１６（１
９８６）。

【０００８】テグメント・プロテインをコードする遺伝
子（以下、テグメント遺伝子という）はＨＳＶ−１とＶ
ＺＶの糖タンパク質Ｃまたはその相同体近傍のロングユ
ニーク領域（ＵＬ領域）に位置している。ＭＤＶ由来の
遺伝子が、ＨＳＶ−１、ＶＺＶや他のヘルペスウイルス
のゲノム上の同様の位置にメジャー・テグメント遺伝子
の相同体が存在するかどうかの決定に際し、ＧＡ株のウ
イルスゲノムから得たＢａｍＨＩ−Ｂ断片の制限酵素切
断点地図を作成した（Ｆｉｇ１）。

【０００９】上記ＢａｍＨＩ−Ｂ断片から５．１ｋｂの
ＳｍａＩ断片（ＳｍａＪという）をｐＵＣ１８のＳｍａ
Ｉサイトにクローニングした。同じ５．１ｋｂのＳｍａ
Ｊ断片がそれぞれ逆方向に挿入された二つのクローン
（ｐＵＣＳｍａＩ５．１＋とｐＵＣＳｍａＩ５．１−）
をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼとＭｕｎｇＢｅａｎヌク
レアーゼ処理による一連の欠損変異体を作製するために
選択した。

【００１０】上記クローンの一連の欠損変異体をダイデ
オキシチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒｅ
ｔａｌ、ＰＮＡＳＵＳＡ、７４、５４６３−５４６
７（１９７７）、及びＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製の配列分析キット使用）で分
析して、クローニングされた５．１ｋｂのＳｍａＩ断片
の全塩基配列を決定した。５．１ｋｂのＳｍａＩ断片の
全領域にわたって少なくとも一度は両方向から分析し、
配列を決定した。その結果、４つの完全なオープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦｓ）があることが判り、これ
らは、それぞれＨＳＶ−１のＵＬ４９、ＵＬ４８、ＵＬ
４７、及びＵＬ４６に、並びにＶＺＶのジーン９、ジー
ン１０、ジーン１１、及びジーン１２に相当する。

【００１１】ＨＳＶー１のＵＬ４６とＵＬ４９に相当す
る領域（ＵＬ４６ｈとＵＬ４９ｈ）の完全なＯＲＦを得
るために、前述と同様の操作により８．４ＫｂのＢａｍ
ＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得、同様に配列分析した。その
ＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。

【００１２】（組み換えＤＮＡ分子）本発明の組み換え
ＤＮＡ分子は、前述の少なくともひとつのＭＤＶのテグ
メント遺伝子の配列と遺伝子操作によってそれに結合さ
れた少なくとも一種類の付加ＤＮＡ配列からなる。ここ
で云う付加ＤＮＡ配列とは、天然にはＭＤＶのテグメン
ト遺伝子と連結していない配列のことである。

【００１３】（組み換えウイルス）ウイルス本発明で用いるウイルスは、組み込んだテグメント遺伝
子が発現しうるウイルスであれば特に限定されない。こ
のようなウイルスとして、具体的にはフォウルポックス
ウイルス、ｑｕａｉｌｐｏｘｖｉｒｕｓなどのポック
スウイルスやバキュロウイルス、七面鳥ヘルペスウイル
スなどが例示される。なかでも、フォウルポックスウイ
ルスに属するものが好ましく、その具体例としては、Ａ
ＴＣＣＶＲ−２５１、ＡＴＣＣＶＲ−２５０、ＡＴＣ
ＣＶＲ−２２９、ＡＴＣＣＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ
ＶＲ−２８８、西ケ原株、泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶ
Ａワクチン株由来のウイルスのうち、ＣＥＦ（鶏胚線維
芽）細胞に感染したとき大きいプラークを形成するもの
などのごとき狭義のＦＰＶやＮＰ株（鶏胎化鳩痘毒中野
株）などのごとき狭義のＦＰＶと近縁のウイルスであっ
て、鶏痘生ワクチン株として使用されるウイルスなどが
例示される。これらは、市販されているなど容易に入手
することができる。

【００１４】非必須領域本発明で用いる非必須領域は、特に限定されないが、例
えば、ＮＰ株ＤＮＡの約７．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断
片、約５．２ＫｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片、約５．０Ｋ
ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、約４．０Ｋｂ
ｐのＢａｍＨＩ断片、ｑｕａｉｌｐｏｘｖｉｒｕｓの
ＴＫ領域、七面鳥ヘルペスウイルスのＴＫ領域、バキュ
ロウイルスの封入体領域などと相同組み換えを起こす領
域（特開平１−１６８２７９号）が例示される。

【００１５】ウイルス非必須領域を含有するベクター本発明で用いられるウイルス組み換え用ベクターの構築
に用いられるウイルス非必須領域を含有するベクター
は、特に限定されない。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ
３２５、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ１８などのプラス
ミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのファージ、ｐ
ＨＣ７９などのコスミドなどのベクターを適当な制限酵
素で処理して、上記ウイルス非必須領域を組み込めばよ
い。

【００１６】抗原遺伝子本発明でウイルスに組み込む抗原遺伝子は、配列番号
２、３、４または５に記載された塩基配列を有するマレ
ック病のテグメント・プロテインをコードする遺伝子、
その断片、またはテグメント・プロテインのアミノ酸配
列の一部が防御免疫反応を誘導能を損なわない程度に変
更されたものをコードしている遺伝子やその断片であ
る。このような断片あるいは配列の一部が変更されたも
のがコードする抗原タンパク質は、全体的にみて、実質
的に配列番号２、３、４、または５に記載のアミノ酸配
列と同じアミノ酸配列を持ち、それによって実質的に等
価の免疫反応を宿主に付与すると考えられる。その断
片、あるいは配列の一部が変更されたものは、配列番号
２、３、４、または５記載のアミノ酸配列に対して８０
％以上の、好ましくは９０％以上の、更に好ましくは９
５％以上の相同性をもつものである。これらの遺伝子
は、ひとつの組み換え体にひとつづつ組み込んでも、複
数の遺伝子を組み込んでもよく、更にこのほか、マレッ
ク病のｇＢｈ、ｇＣｈ、ｇＤｈ、ｇＨｈ、ｇＩｈなどを
コードする遺伝子やその断片も一緒に組み込むこともで
きる。

【００１７】組み換え用ベクター本発明で用いるウイルス組み換え用ベクターは、少なく
ともテグメント遺伝子とそれを支配するプロモーターが
挿入されたウイルス非必須領域を含むものである。前述
のウイルス非必須領域を含有するベクターのウイルス非
必須領域に前述の抗原遺伝子とそれを支配するプロモー
ターを挿入すればよく、また、そのようなベクター由来
の抗原遺伝子とそれを支配するプロモーターが挿入され
たウイルス非必須領域を含む断片を他のベクターに組み
込んだりしたものでもよい。さらに、組み換えウイルス
の純化などのために大腸菌のｌａｃＺ遺伝子などのマー
カー遺伝子とそれを支配するプロモーターを組み込んで
もよい。

【００１８】プロモーターここで用いるプロモーターは、組み換えウイルス感染宿
主中でプロモーターとして機能するものであれば、特に
限定されない。例えば、７．５Ｋポリペプチドをコード
するワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、１１Ｋ
ポリペプチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子の
プロモーター、チミジンキナーゼをコードするワクチニ
アウイルスのプロモーター、バキュロウイルスのポリヘ
ドリンプロモーターや七面鳥ヘルペスウイルスのＳＶ４
０プロモーターなどが例示されるほか、プロモーターと
して機能する限りにおいては、一部を削除するなど改変
されたものであってもよく、また、合成されたものであ
ってもよい。

【００１９】組み換えウイルスの作製方法組み換えウイルスの作製方法は、特に限定されず、常法
によって行えばよい。即ち、予め、ウイルスを感染させ
た細胞に、例えば、リン酸カルシウム共沈法などにより
組み換え用ベクターが導入されることにより、ベクター
と感染細胞中のウイルスゲノムＤＮＡの間で相同組み換
えが起こり、組み換えウイルスが構築される。得られた
組み換えウイルスは、イーグルＭＥＭなどの培地で培養
された宿主細胞に感染させ、成育してくるプラークを目
的とする組み換えウイルスの候補として選択する。この
候補株を組み込んだ抗原遺伝子をプローブとするハイブ
リダイゼーション法や、抗原遺伝子と共に組み込んだマ
ーカー遺伝子の発現するものを選択するなどの方法によ
り候補株を純化し、組み込んだ抗原遺伝子のコードする
抗原に対する抗体をイムノアッセイを利用して目的の組
み換えウイルスであることを確認すればよい。例えば、
マーカー遺伝子としてｌａｃＺ遺伝子が組み込まれてい
る組み換えウイルスの場合、β−ガラクトシダーゼを発
現し、その基質のひとつであるＢｌｕ−ｏ−ｇａｌ存在
下で次々と青いプラークを形成する。宿主細胞として
は、用いるウイルスが感染し増殖することが可能なもの
であれば特に限定されず、例えばＦＰＶを用いた場合
は、鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）や発育鶏卵しょう尿
膜細胞など、バキュロウイルスを用いた場合は、スポド
プテラ・フルギペルダ細胞など、七面鳥ヘルペスウイル
スを用いた場合は、アヒル線維芽細胞（ＤＥＦ細胞）な
どが挙げられる。

【００２０】（形質転換体）抗原遺伝子組み換えウイルスと同じ

【００２１】ベクター、形質転換細胞、形質転換微生
物上記遺伝子を有する組み換えベクターを構築するための
ベクターは、格別制限されるものではなく、例えばｐＵ
Ｃ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１０、ｐＵＣ１１、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ
３２７、ｐＤＲ５４０、ｐＤＲ７２０などのプラスミド
やλｇｔ１１、λｇｔ１０、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ
４、Ｃｈａｒｏｎ４Ａなどのファージなどが例示され
る。これらのベクターに、上記遺伝子を挿入し、組み換
えベクターを生成させるための方法は当業者に周知のも
のでよく、例えばベクターを制限酵素で切断した後、宿
主内で機能するプロモーターの支配下に上記遺伝子を直
接結合すればよい。用いられるプロモーターは、例えば
ｌａｃプロモーター・オペレーター、ｔｒｐプロモータ
ー、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ＰＬプ
ロモーター、ａｍｙＥプロモーター、Ｇａ１７プロモー
ター、ＰＧＫプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが
例示される。

【００２２】これらＭＤＶ由来テグメント・プロテイン
を発現せしめるために組み換えベクターを作製する上
で、上記遺伝子を一旦適当なベクターに組み込んで、組
み換えベクターを作製し、サブクローニングする方法は
当業者においては周知の方法であり、これらのサブクロ
ーニングされた遺伝子は適切な制限酵素により切り出さ
れ、上記のプロモーターに結合させ、タンパク質を生産
せしめる組み換えベクターを作製することができる。

【００２３】上記サブクローニングに用いることができ
るベクターも、格別制限されるものではなく、ｐＵＣ
８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１０、ｐＵＣ１１、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２
７、ｐＤＲ５４０、ｐＤＲ７２０、ｐＵＢ１１０、ｐＩ
Ｊ７０２、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ１９、ＹＣ
ｐ５０、ｐＡＣ３７３、ｐＡＣＴＭ１などのプラスミド
が例示される。ついで得られた組み換えベクターを使用
して、種々の適当な宿主を形質転換して、抗原性を有す
るＭＤＶ由来のテグメント・プロテイン、あるいはその
アミノ酸配列を含んだ融合蛋白質の生産能を有する微生
物を得ることができる。ここで用いられる宿主とは、発
現ベクターに対する適性、生成物の安定性などを加味し
て選択することができ、原核細胞でも真核細胞でもよ
い。具体的にはエシェリヒア属（例えば、エシェリヒア
・コリなど）、サルモネラ属（例えば、サルモネラ・チ
フィムリウムなど）、放線菌、酵母、昆虫細胞、トリ細
胞、ヒト細胞などが例示される。適当な発現ベクターの
導入により形質転換された宿主は、当業者により周知の
培養条件下で培養、増殖させることができる。また、タ
ンパク質の生産に当たっては、プロモーターの作用を誘
導させる条件を選択することができ、その具体例とし
て、ｌａｃプロモーター・オペレーターを例にとると、
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを適当
量培養液に添加することにより達成される。

【００２４】このようにして得られた形質転換宿主を用
いて抗マレック病ワクチンを製造するには、常法に準じ
て行えばよい。この宿主の培養は微生物の培養に通常用
いられる条件で行えばよく、例えば、大腸菌を用いた場
合、好気的条件下、３７℃でＬＢ培地を用いて培養す
る。

【００２５】（テグメント・プロテイン）本発明におけ
るテグメント・プロテインは、上述の遺伝子組み換え技
術により得られる配列番号２〜４に示されるアミノ酸配
列または該配列との相同性が８０％以上、好ましくは９
０％以上、より好ましくは９５％以上のものである。ま
た、本発明のテグメント・プロテインは、これらの配列
を有するものの類似物であってもよい。ここで云う類似
物とは、投与された場合、宿主中で防御免疫反応を誘導
するような天然のテグメント・プロテインに対して充分
な相同性を有するものであって、上記配列のアミノ酸の
アミノ末端、カルボキシル末端、中央部のどれかが欠損
した変異体、さらにはこれらの欠損が組み合わされた変
異体であってもよい。また、類似物は、ひとつ以上のア
ミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異体であってもよ
く、あるいは、ひとつ以上のアミノ酸が欠損・挿入され
たものであってもよく、さらにこれらの組み合わされた
ものであってもよい。このようなテグメント・プロテイ
ンは、前述の形質転換体の培養により生産することがで
きる。また、前述の組み換えウイルスを適当な宿主細胞
で培養し、生産することもできる。生産されたテグメン
ト・プロテインは、ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、１８２巻（「ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅ
ｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」ＭｕｒｒｙＰ．Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅｒ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社
発行）の記載に準じて単離・精製すればよい。

【００２６】このようにして得られたテグメント・プロ
テインは、常法により希釈・増量材などと混合し、コン
ポネントワクチンとして用いることができる。コンポネ
ントワクチンとして用いる場合、一個体当り０．１μｇ
以上を投与すればよく、急性毒性を示さない限り、上限
は特に限定されない。投与方法は、皮下、静脈内、筋肉
内注射等の方法のほか、噴霧によって気道に免疫するこ
とも可能である。さらに、このテグメント・プロテイン
は、マレック病ウイルス感染症用診断薬として用いるこ
ともできる。

【００２７】（生ワクチン）本発明の生ワクチンは、一
種以上の本発明の組み換えウイルスからなる非細胞依存
性ワクチンである。即ち、本発明に開示された３種類の
遺伝子を有する別々の組み換えウイルスを単独で用いる
ほか、２〜３種類の組み換えウイルスを組み合わせて用
いてもよい。また、組み換えウイルス以外にも薬理学的
に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水などを含ん
でいてもよい。本発明のワクチンの調製方法は特に限定
されない。例えば、本発明で用いられるウイルスが生育
することのできる細胞を、本発明の組み換えウイルスに
感染させ、組み換えウイルスが増殖するまで培養する。
その後、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心
分離機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換え
ウイルスを含んだ非細胞依存性の高力価遠心上清とに分
離する。本質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組
み換えウイルスを含んだこの遠心上清は、本発明のワク
チンとして使用できる。また、薬理学的に受け入れられ
る生理食塩水等の様なものでも再構成して使用してもよ
い。遠心上清を凍結乾燥した凍結乾燥ワクチンとしても
利用できる。

【００２８】本発明のワクチンは、ワクチン中の組み換
えウイルスが家禽に感染して防御免疫を引き起こすよう
な方法であれば、どの様な方法で家禽に投与してもよ
い。例えば、皮膚に引っかき傷をつけてワクチンを接種
したり、注射針やその他の器具等によって、家禽の皮下
にワクチン接種することができる。また、ワクチンを家
禽の飲み水に懸濁したり、飼料の固形物に混入して、経
口接種させることも可能である。さらに、エアロゾルや
スプレーなどによるワクチンを吸入させる方法、静脈内
接種法、筋肉中接種法、腹腔内接種法等を用いることも
できる。接種量は、例えば、鶏の場合、１羽当り通常１
０⁴〜１０⁶ＰＦＵ（プラーク形成単位）である。注射
する場合には、この量を生理食塩水などの生理学的に受
け入れられる液体で希釈したりして０．１ｍｌ程度にす
ればよい。接種時期は限定されないが、免疫付与の目的
から、既存のワクチンと同様に、１日齢時に接種するこ
とが好ましい。本発明のワクチンは、非細胞依存性であ
り、普通の条件下で保存、使用することが可能である。
このため、コストを下げることができ、現存の細胞依存
性ワクチンの場合に必要であった液体窒素中での保存、
取扱及び接種等の面倒な手続きを軽減することができ
る。例えば、本発明の組み換えウイルスを凍結乾燥すれ
ば、室温（２０〜２２℃程度）で長期間保存、取扱、輸
送することができる本発明のワクチンとすることができ
る。凍結状態でも保存可能であり、本ワクチン中の非細
胞依存性組み換えウイルスは、水中でも保持できるの
で、例えば、組み換えウイルスの懸濁液を−２０℃〜−
７０℃にして、凍結させて保存することが可能である。

【００２９】

【実施例】

（実施例１）ＭＤＶのＧＡ株のＢａｍＨＩ−Ｂ断片由
来のＳｍａＩ５．１Ｋｂ（Ｓｍａ−Ｊ）断片のクロー
ニングプラスミドｐＡＣＹＣ１８４に含まれているＢａｍＨＩ
−Ｂ断片（ＭＤＶＧＡ株由来、Ｆｕｋｕｃｈｉら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５１、１０２−１０９（１９８
４））を制限酵素ＳｍａＩで処理し、５．１Ｋｂ断片を
アガロースゲル電気泳動で精製した。プラスミドｐＵＣ
１８を制限酵素ＳｍａＩで処理した後、子ウシの腸由来
のアルカリホスファターゼで処理し、５′側リン酸部分
を除去した。ついで、さきに得た５．１Ｋｂの断片を挿
入し、ｐＵＣＳｍａ５．１＋とｐＵＣＳｍａ５．１−の
二つのプラスミドを得た。これらのプラスミドは互いに
逆方向に５．１Ｋｂの断片が挿入されたものである。

【００３０】（実施例２）ＳｍａＩ５．１Ｋｂ断片の
配列分析一連の欠損株を調製するために、ｐＵＣＳｍａＩ＋とｐ
ＵＣＳｍａＩ−を制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで処理した後、処理時間を変えて、エンドヌクレアー
ゼIII で処理した。異なった間隔で採取した反応混合物
のサンプルを集め、ＭｕｎｇＢｅａｎヌクレアーゼで
処理した。フェノール／クロロホルム抽出後、エタノー
ル沈澱によってＤＮＡを得た。回収されたＤＮＡを自己
連結させて、コンピテントな大腸菌に導入した。二つの
プラスミドのそれぞれから約１００クローンの欠損株を
取り、挿入断片の大きさを調べ、適当だと思われる５０
クローンを配列分析用に選択した。³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（デ
ュポン社製）とシーケナーゼ（ユナイテッド・ステイツ
・バイオケミカル社製）を用いて、各クローンの配列を
分析した。その結果、いくつかの領域でクローンの選択
が適当でなく、配列分析ができなかったので、制限酵素
を用いてサブクローニングし、配列を補った。

【００３１】（実施例３）ＭＤＶＧＡ株の８．４Ｋ
ｂＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片のクローニングと配列決
定ｐＵＣ１８の中にＭＤＶのＧＡ株のＢａｍＨＩ−Ｂ断片
のサブフラグメントである８．４ＫｂＢａｍＨＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片を挿入し、得られたプラスミドをｐＵＣＢ
ａｍ−Ｅｃｏ８．４と命名した。幾つかのサブクローン
を得るために、複数の制限酵素を用いた。これらのサブ
クローンの配列分析は、サンガーのダイデオキシチェ
ーンターミネーション法により行った。両方向から配
列分析するために、ＯｌｉｇｏｓＥｔｃ．Ｉｎｃ．Ｃ
ＴＵＳＡのいくつかの合成オリゴヌクレオチドを用い
た。コンピューター分析により解析されたメジャーＯＲ
Ｆｓの位置関係を図１に示す。先ずはじめのＯＲＦであ
るＵＬ４９ｈは、７１８番塩基の開始コドンＡＴＧから
１４７５番塩基の終止コドンＴＧＡまでであり、ペプチ
ド分子量は２７，６５４ダルトンである。このＯＲＦの
１５ｂｐ上流にＴＡＴＡ配列（７０３〜７０６番目の塩
基）があり、プロモーター領域と推定される。ＵＬ４９
ｈとＵＬ４８ｈの遺伝子領域の間に見られるポリアデニ
レーション・シグナルと見られるＡＡＴＡＡＡ配列は存
在しなかった。二番目のＯＲＦであるＵＬ４８ｈは、１
５７５番塩基の開始コドンＡＴＧから２８５６番塩基の
終止コドンＴＡＡまでであり、ペプチド分子量は４８，
６５５ダルトンである。このＯＲＦの約３０ｂｐ上流に
ＴＡＴＡＴＡ配列があり、プロモーター領域であると推
定される。また、このＯＲＦの約８０ｂｐ下流に、ＡＡ
ＴＡＡＡ配列（２９４０〜２９４６番目の塩基）があ
り、ポリアデニレーション・シグナルと見られる。

【００３２】三番目のＯＲＦであるＵＬ４７ｈは、３１
０３番塩基の開始コドンＡＴＧから５５２１番塩基の終
止コドンＴＧＡまでであり、ペプチド分子量は９１，８
８０ダルトンである。このＯＲＦの約５０ｂｐ上流にＴ
ＡＴＡＡ配列（３０４３〜３０４７番目の塩基）があ
り、プロモーター領域であると推定される。ＵＬ４７ｈ
とＵＬ４６ｈの間には、ＡＡＴＡＡＡ配列が見られなか
った。このことは、ＨＳＶ−１のＵＬ４７とＵＬ４６の
間にシグナル配列がないというマックナイトらの報告
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６１、９９２−１００１（１９８
７））と一致する。四番目のＯＲＦであるＵＬ４６は、
５６６５番塩基の開始コドンＡＴＧから７３６９番塩基
の終止コドンＴＧＡまでであり、ペプチド分子量は６
３，９２０ダルトンである。このＯＲＦの約４０ｂｐ上
流にＴＡＴＡ配列（５，６２０〜５，６２３番目の塩
基）があり、プロモーター領域であると推定される。ま
た、このＯＲＦの１００ｂｐ下流にＡＡＹＡＡＡ配列
（７，４６５〜７，４７０番目の塩基）があり、ポリア
デニレーション・シグナルと推定される。さらに、二つ
の１００アミノ酸以上からなるＯＲＦｓが７，６７９〜
８，３０２番塩基と８，１３９〜７，５０７番塩基（こ
れは逆方向の読みをもつ）に見つけられた。推定ペプチ
ド分子量はそれぞれ２２，９６９ダルトンと２３，５０
６ダルトンである。しかしながら、推定されるこれらの
ペプチドは、多のヘルペスウイルスのどの推定ペプチド
とも有意な同一性は認められなかった。

【００３３】（実施例４）大腸菌内でのＵＬ４８ｈ遺
伝子の発現ＳａｉｋｉらのＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０，１
３５０〜１３５４（１９８５））により、ＵＬ４８ｈ遺
伝子を増幅させた。配列番号６に示すＣＣＣＧＧＡＴ
ＣＣＡＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＡＧ
ＴＴＴと配列番号７に示すＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡ
ＴＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴと
を、プライマーとして制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した実
施例１で得られたｐＵＣＳｍａ５．１＋をテンプレート
として用いた。１．３ＫｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩがＰ
ＣＲにより得られ、これをｐＵＣ１８にクローニングし
た。挿入した断片を確認したが、ＰＣＲ中に如何なる変
異も見られなかった。１．３ＫｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｌ
Ｉ断片を、ｔａｃプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら，Ｐ
ＮＡＳＵＳＡ，７８，２１（１９８３））とｒｒｎＢ
リボソームＲＮＡ転写終結因子（ＢｒｏｓｉｕｓらＪ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４８、１０７（１９８１））の
間に挿入し、発現ベクターｐＴａｃＵＬ４８ｈを作製し
た。大腸菌ＴＧ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製、ＵＫ）に、
ｐＫＫ２２３−３（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＭＤＵ
ＳＡ）由来のプラスミドｐＴ１または、ｐＴａｃＵＬ４
８ｈを導入した。プラスミドｐＴ１やｐＴａｃＵＬ４８
ｈを有する大腸菌ＴＧ１やプラスミドを有さない大腸菌
ＴＧ１をＬＢ培地で３７℃、一晩培養した。但し、プラ
スミドを有するＴＧ１を培養するときは、５０μｇ／ml
のアンピシリン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＭＤＵＳ
Ａ）を添加した培地を用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍ
ｏｌｅｃｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（１９８２））。次に
培養した各大腸菌ＴＧ１０．１mlを新たに調製した１
０mlのＬＢ培地に加え、２時間培養した。但し、プラス
ミドを有するＴＧ１を培養するときは、５０μｇ／mlの
アンピシリン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＭＤＵＳ
Ａ）を添加した培地を用いた。更に最終濃度が１ｍＭと
なるようにＩＰＴＧ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、ＭＤＵ
ＳＡ）を各培地に加え、４時間培養した。次に、培養液
を遠心分離（１０分×１０，０００Ｇ）し、細胞のペレ
ットを得た。このペレットをサンプル緩衝液（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０−６８５（１９
７０））に懸濁させ、煮沸した。これを遠心分離した
後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ、Ｎａｔｕｒｅ、２２７、６８０−６８５（１９７
０））。その結果、図３のレーン１に示すように約５
０，０００ダルトンのタンパク質がｐＴａｃＵＬ４８ｈ
を有する大腸菌のサンプルから検出された。この分子量
から、得られたタンパク質はＭＤＶのＧＡ株由来のＵＬ
４８ｈであることが判った。

【００３４】〔配列表〕配列番号：１配列の長さ：８４３３塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：円形状配列の種類：ＤＮＡ配列

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【００３５】配列番号：２配列の長さ：２４９アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列：

【化１３】

【化１４】

【００３６】配列番号：３配列の長さ：４０７アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク配列

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【００３７】配列番号：４配列の長さ：８０６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク配列

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【００３８】配列番号：５配列の長さ：５６８アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列：

【化２１】

【化２２】

【化２３】

【００３９】配列番号：６配列の長さ：３３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：ＤＮＡ配列

【化２４】

【００４０】配列番号：７配列の長さ：３２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列：

【化２５】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＤＶゲノムのＢａｍＨＩ−Ｂ断片の制限酵素
地図及びｇｃ相同体のＯＲＦの位置を示す。

【図２】Ｅ．ｃｏｌｉ中におけるＵＬ４８ｈの発現ベ
クターを調製する手順を示すフローチャートである。

【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ中でのＵＬ４８ｈの発現を示す
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の発現タンパクのパターン図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 7/01 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ルーシィエフ．リーアメリカ合衆国48823 ミシガン州イーストランシング，ウィッティアードライブ 954 (72)発明者柳田昇アメリカ合衆国48823 ミシガン州イーストランシング，エイ − １，サウスショアードライブ 1640

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２、３または４から選ばれたア
ミノ酸配列との相同性が８０％以上のアミノ酸配列を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項２】請求項１記載のＤＮＡ分子と、少なくと
もひとつの付加ＤＮＡ配列とからなる組み換えＤＮＡ分
子。
【請求項３】請求項１のＤＮＡ分子のＤＮＡ配列を含
有する組み換えベクター。
【請求項４】請求項１または２のＤＮＡ分子を有する
細胞、微生物、またはウイルス。
【請求項５】請求項１のＤＮＡ分子を有する組み換え
ウイルス。
【請求項６】配列番号２、３または４から選ばれたア
ミノ酸配列との相同性が８０％以上のアミノ酸配列を有
する単離または精製されたポリペプチド。
【請求項７】請求項５の組み換えウイルスを有効成分
とする抗マレック病用生ワクチン。
【請求項８】請求項６のポリペプチド、またはその薬
理学的に許容しうる塩を有効成分とする抗マレック病用
ワクチン。