JPH06296489A - 網膜芽腫−関連タンパク質をコードする細胞性遺伝子 - Google Patents
網膜芽腫−関連タンパク質をコードする細胞性遺伝子Info
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- JPH06296489A JPH06296489A JP5116254A JP11625493A JPH06296489A JP H06296489 A JPH06296489 A JP H06296489A JP 5116254 A JP5116254 A JP 5116254A JP 11625493 A JP11625493 A JP 11625493A JP H06296489 A JPH06296489 A JP H06296489A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】網膜芽種遺伝子の細胞内関係部分を同定し特徴
づけること。 【構成】網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離し
た核酸分子、および転写因子E2Fの生物学的活性およびR
B-結合活性を有する単離されたタンパク質。網膜芽腫−
関連タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む
ベクター。；そのようなベクターを含む哺乳動物細
胞。；網膜芽腫−関連タンパク質に対する抗体；および
そのようなタンパク質に対するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマライン。ならびに、そのような抗
体を診断におよび予知に用いる方法。
づけること。 【構成】網膜芽腫−関連タンパク質をコードする単離し
た核酸分子、および転写因子E2Fの生物学的活性およびR
B-結合活性を有する単離されたタンパク質。網膜芽腫−
関連タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む
ベクター。；そのようなベクターを含む哺乳動物細
胞。；網膜芽腫−関連タンパク質に対する抗体；および
そのようなタンパク質に対するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマライン。ならびに、そのような抗
体を診断におよび予知に用いる方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、網膜芽腫−関連タンパ
ク質をコードする細胞性遺伝子の分子クローニングに関
する。より特定的な局面では、本発明は転写因子E2Fの
特性を有する遺伝子の同定に関する。
ク質をコードする細胞性遺伝子の分子クローニングに関
する。より特定的な局面では、本発明は転写因子E2Fの
特性を有する遺伝子の同定に関する。
【０００２】
【従来の技術】本出願を通じて、種々の出版物をかっこ
内の部分的な引用によって参照する。これらの出版物の
開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完
全に記載するために本出願中に参考として援用される。
内の部分的な引用によって参照する。これらの出版物の
開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完
全に記載するために本出願中に参考として援用される。
【０００３】網膜芽種遺伝子(RB)は、同定された最初の
腫瘍サプレッサー遺伝子であり、脊椎動物に遍在的に発
現する核リンタンパク質をコードする(Friendら、１９
８６；Ｌｅｅら、１９８７ｂ；Ｆｕｎｇら、1987)。こ
の遺伝子の正常な機能を不活性化する突然変異は100%の
網膜芽種においてのみならず、小細胞性肺癌(Harbour
ら、1988 ；Yokotaら、1988)、骨内種(Toguchidaら、19
88)、膀胱癌(Horowitzら、1989)、前立腺癌(Bookstein
ら、1990a)および胸部癌(Leeら、1988)を含む多くの他
の成人癌においても発見されていた。多様なRB-欠乏腫
瘍細胞と野生型RBとの再構成は、ヌードマウスに腫瘍を
形成させる能力を含むその新生物表現型を抑制する(Hua
ngら、1988；Sumegiら、1990；Booksteinら、1990b；Le
eら、1990；Goodrichら、1992；Takahashiら、1991；Ch
enら、1992)。これらの結果は、RBタンパク質が信頼し
得る腫瘍抑制剤であるという直接的な証拠を提供する。
腫瘍サプレッサー遺伝子であり、脊椎動物に遍在的に発
現する核リンタンパク質をコードする(Friendら、１９
８６；Ｌｅｅら、１９８７ｂ；Ｆｕｎｇら、1987)。こ
の遺伝子の正常な機能を不活性化する突然変異は100%の
網膜芽種においてのみならず、小細胞性肺癌(Harbour
ら、1988 ；Yokotaら、1988)、骨内種(Toguchidaら、19
88)、膀胱癌(Horowitzら、1989)、前立腺癌(Bookstein
ら、1990a)および胸部癌(Leeら、1988)を含む多くの他
の成人癌においても発見されていた。多様なRB-欠乏腫
瘍細胞と野生型RBとの再構成は、ヌードマウスに腫瘍を
形成させる能力を含むその新生物表現型を抑制する(Hua
ngら、1988；Sumegiら、1990；Booksteinら、1990b；Le
eら、1990；Goodrichら、1992；Takahashiら、1991；Ch
enら、1992)。これらの結果は、RBタンパク質が信頼し
得る腫瘍抑制剤であるという直接的な証拠を提供する。
【０００４】RBは、細胞周期の初期G1/G0期においてい
くつかの観察により実証された機能を成し遂げる：第一
に、おそらくはCdkキナーゼファミリーの一構成部によ
るRBのリン酸化(Linら、1991；Leeら、1991)が細胞周期
でのゆらぐこと(Chenら、1989；Buchkovichら、1989；D
eCaprioら、1989)；第二に、未リン酸化型RBがG0/G1期
において支配的に存在すること(Chenら、1989；DeCapri
oら、1989)；第三に、未リン酸化型RBの初期G1期にある
細胞内へのマイクロインジェクションが、それらのS期
への進行を妨げること(Goodrichら、1991)。これらの観
察は、RBが細胞周期内への侵入の臨界的な調節因子とし
て働き得、そして正常細胞におけるその不活性化は不規
則な増殖を導くことを示す。
くつかの観察により実証された機能を成し遂げる：第一
に、おそらくはCdkキナーゼファミリーの一構成部によ
るRBのリン酸化(Linら、1991；Leeら、1991)が細胞周期
でのゆらぐこと(Chenら、1989；Buchkovichら、1989；D
eCaprioら、1989)；第二に、未リン酸化型RBがG0/G1期
において支配的に存在すること(Chenら、1989；DeCapri
oら、1989)；第三に、未リン酸化型RBの初期G1期にある
細胞内へのマイクロインジェクションが、それらのS期
への進行を妨げること(Goodrichら、1991)。これらの観
察は、RBが細胞周期内への侵入の臨界的な調節因子とし
て働き得、そして正常細胞におけるその不活性化は不規
則な増殖を導くことを示す。
【０００５】RBがどのように機能するかが、真剣な調査
の主題である。RBタンパク質の2つの既知の生化学的特
性が、記載されていた；一つは、そのC-末端300アミノ
酸残基に位置した固有のDNA結合活性である(Leeら、198
7b；Wangら、1990b)；他はその、DNA腫瘍ウィルスのい
くつかの腫瘍タンパク質と相互作用する能力である(DeC
aprioら、1988；Whyteら、1988；Dysonら、1989)。この
相互作用は、T-結合ドメインとして示されるアミノ酸37
9-545および575-678において、2つの不連続な領域に位
置づけられた(Huら、1990；Huangら、1990)。興味深い
ことに、腫瘍中のRBタンパク質の突然変異は、しばしば
これらの同じ領域に位置していた(BooksteinおよびLe
e、1991)。これらの結果はRBタンパク質のT-結合ドメイ
ンが機能的に重要でありそしてRBとこれら腫瘍タンパク
質との相互作用が深遠な生物学的意義を有し得ることを
意味する。TのRBへの結合を模倣する細胞性タンパク質
の同定により、潜在的に複雑なネットワークがしめされ
た。c-myc(Rustgiら、1991)、Rb-p1,p2(Defeo-Jones
ら、1991)を含むいくつかのタンパク質、および8-10の
他のタンパク質(Kaelinら、1991； Leeら、1991 Huang
ら、1991)が、in vitroでRBに結合することが示され
た。
の主題である。RBタンパク質の2つの既知の生化学的特
性が、記載されていた；一つは、そのC-末端300アミノ
酸残基に位置した固有のDNA結合活性である(Leeら、198
7b；Wangら、1990b)；他はその、DNA腫瘍ウィルスのい
くつかの腫瘍タンパク質と相互作用する能力である(DeC
aprioら、1988；Whyteら、1988；Dysonら、1989)。この
相互作用は、T-結合ドメインとして示されるアミノ酸37
9-545および575-678において、2つの不連続な領域に位
置づけられた(Huら、1990；Huangら、1990)。興味深い
ことに、腫瘍中のRBタンパク質の突然変異は、しばしば
これらの同じ領域に位置していた(BooksteinおよびLe
e、1991)。これらの結果はRBタンパク質のT-結合ドメイ
ンが機能的に重要でありそしてRBとこれら腫瘍タンパク
質との相互作用が深遠な生物学的意義を有し得ることを
意味する。TのRBへの結合を模倣する細胞性タンパク質
の同定により、潜在的に複雑なネットワークがしめされ
た。c-myc(Rustgiら、1991)、Rb-p1,p2(Defeo-Jones
ら、1991)を含むいくつかのタンパク質、および8-10の
他のタンパク質(Kaelinら、1991； Leeら、1991 Huang
ら、1991)が、in vitroでRBに結合することが示され
た。
【０００６】前記が証明するように、網膜芽種遺伝子の
細胞内関係部分を緊急に同定し特徴づけることが必要な
ことは明白である。本発明はこの要求を満たし、関連す
る長所を同様に提供する。
細胞内関係部分を緊急に同定し特徴づけることが必要な
ことは明白である。本発明はこの要求を満たし、関連す
る長所を同様に提供する。
【０００７】
【発明の要旨】本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質を
コードする単離された核酸分子、および、転写因子E2F
生物学的活性およびRB-結合活性を有する単離されたタ
ンパク質を提供する。
コードする単離された核酸分子、および、転写因子E2F
生物学的活性およびRB-結合活性を有する単離されたタ
ンパク質を提供する。
【０００８】本発明はさらに、細菌細胞、酵母細胞、ま
たは哺乳動物細胞での発現に適合した網膜芽腫−関連タ
ンパク質をコードするDNA分子を含むプラスミドおよび
ウィルスのようなベクターを提供する。
たは哺乳動物細胞での発現に適合した網膜芽腫−関連タ
ンパク質をコードするDNA分子を含むプラスミドおよび
ウィルスのようなベクターを提供する。
【０００９】本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコ
ードするDNA分子を含む哺乳動物の細胞を提供する。
ードするDNA分子を含む哺乳動物の細胞を提供する。
【００１０】本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質に特
異的に結合可能な抗体を提供する。本発明はまた、モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインお
よびこれらの抗体を診断および予知に用いる方法を提供
する。
異的に結合可能な抗体を提供する。本発明はまた、モノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマセルラインお
よびこれらの抗体を診断および予知に用いる方法を提供
する。
【００１１】
【発明の構成】本発明によれば、網膜芽種−関連ポリペ
プチドをコードする、単離された核酸分子が提供され
る。
プチドをコードする、単離された核酸分子が提供され
る。
【００１２】好適な実施態様に於いては、コードされた
網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子E2Fの生物学的
活性を有する、単離された核酸分子が提供される。
網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子E2Fの生物学的
活性を有する、単離された核酸分子が提供される。
【００１３】さらに好適な実施態様に於いては、コード
された網膜芽種−関連ポリペプチドがRB結合活性を有す
る、単離された核酸分子が提供される。
された網膜芽種−関連ポリペプチドがRB結合活性を有す
る、単離された核酸分子が提供される。
【００１４】さらに好適な実施態様に於いては、前記核
酸分子が、DNA分子、cDNA分子、またはRNA分子である、
単離された核酸分子が提供される。
酸分子が、DNA分子、cDNA分子、またはRNA分子である、
単離された核酸分子が提供される。
【００１５】さらに好適な実施態様に於いては、ストリ
ンジェント条件下でハイブリッド形成して、単離された
核酸分子を形成する、核酸分子が提供される。
ンジェント条件下でハイブリッド形成して、単離された
核酸分子を形成する、核酸分子が提供される。
【００１６】さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽
種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子によってコードされた、単離および精製されたポリペ
プチドが提供される。
種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子によってコードされた、単離および精製されたポリペ
プチドが提供される。
【００１７】さらに好適な実施態様に於いては、コード
された網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子E2Fの生
物学的活性を有する、単離された核酸分子によってコー
ドされた、単離および精製されたポリペプチドが提供さ
れる。
された網膜芽種−関連ポリペプチドが転写因子E2Fの生
物学的活性を有する、単離された核酸分子によってコー
ドされた、単離および精製されたポリペプチドが提供さ
れる。
【００１８】さらに好適な実施態様に於いては、コード
された網膜芽種−関連ポリペプチドがRB結合活性を有す
る、単離された核酸分子によってコードされた、単離お
よび精製されたポリペプチドが提供される。
された網膜芽種−関連ポリペプチドがRB結合活性を有す
る、単離された核酸分子によってコードされた、単離お
よび精製されたポリペプチドが提供される。
【００１９】さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽
種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子を含む、ベクターが提供される。
種−関連ポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子を含む、ベクターが提供される。
【００２０】さらに好適な実施態様に於いては、前記ベ
クターを含む、プラスミドが提供される。
クターを含む、プラスミドが提供される。
【００２１】さらに好適な実施態様に於いては、前記ベ
クターを含む、ウィルスが提供される。
クターを含む、ウィルスが提供される。
【００２２】さらに好適な実施態様に於いては、前記ベ
クターを含む、宿主細胞が提供される。
クターを含む、宿主細胞が提供される。
【００２３】さらに好適な実施態様に於いては、前記宿
主細胞が細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、
宿主細胞が提供される。
主細胞が細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、
宿主細胞が提供される。
【００２４】さらに好適な実施態様に於いては、前記細
胞核内にある、網膜芽種−関連ポリペプチドに特異的に
結合し得る、抗体が提供される。
胞核内にある、網膜芽種−関連ポリペプチドに特異的に
結合し得る、抗体が提供される。
【００２５】さらに好適な実施態様に於いては、前記抗
体の、免疫学的に活性なポリペプチドフラグメントが提
供される。
体の、免疫学的に活性なポリペプチドフラグメントが提
供される。
【００２６】さらに好適な実施態様に於いては、前記抗
体がモノクローナル抗体である、抗体が提供される。
体がモノクローナル抗体である、抗体が提供される。
【００２７】さらに好適な実施態様に於いては、前記抗
体が検出可能なマーカーで標識された、抗体が提供され
る。
体が検出可能なマーカーで標識された、抗体が提供され
る。
【００２８】さらに好適な実施態様に於いては、検出可
能なマーカーで標識された、前記抗体を産生する、ハイ
ブリドーマセルラインが提供される。
能なマーカーで標識された、前記抗体を産生する、ハイ
ブリドーマセルラインが提供される。
【００２９】さらに好適な実施態様に於いては、以下の
a、b および c を含む試料中の網膜芽種−関連タンパ
ク質を検出する方法が提供される： a. 抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、請求項１
４の抗体を試料と接触させる方法； b. 形成されたすべ
ての複合体の存在を検出する方法； c. 該複合体の存在
が試料中の網膜芽種−関連タンパク質の存在を指示する
方法。
a、b および c を含む試料中の網膜芽種−関連タンパ
ク質を検出する方法が提供される： a. 抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、請求項１
４の抗体を試料と接触させる方法； b. 形成されたすべ
ての複合体の存在を検出する方法； c. 該複合体の存在
が試料中の網膜芽種−関連タンパク質の存在を指示する
方法。
【００３０】さらに好適な実施態様に於いては、網膜芽
種−関連タンパク質を組換えにより産生する方法であっ
て、該タンパク質を産生する好適な条件下で前記ベクタ
ーを含む、宿主細胞を増殖し、およびそのようにして得
られた該タンパク質を回収および精製する方法を包含す
る、方法が提供される。
種−関連タンパク質を組換えにより産生する方法であっ
て、該タンパク質を産生する好適な条件下で前記ベクタ
ーを含む、宿主細胞を増殖し、およびそのようにして得
られた該タンパク質を回収および精製する方法を包含す
る、方法が提供される。
【００３１】さらに好適な実施態様に於いては、組換え
により産生した、網膜芽種−関連タンパク質が提供され
る。
により産生した、網膜芽種−関連タンパク質が提供され
る。
【００３２】網膜芽種タンパク質は多くの細胞性タンパ
ク質と相互作用して、正常な生理的機能に対して決定的
であり得る複合体を形成する。これらのタンパク質を同
定するために、9つの異なる遺伝子cDNAを、精製したRB
タンパク質をプローブとして用いるcDNA発現ライブラリ
ーの直接スクリーニングによりクローンした。これらの
クローンの仮の特徴づけは、これらの遺伝子の大部分が
新規のタンパク質をコードすることを示す。それらの1
つ、Ap12は、細胞周期依存型の 2.8 Kb mRNAを発現す
る。
ク質と相互作用して、正常な生理的機能に対して決定的
であり得る複合体を形成する。これらのタンパク質を同
定するために、9つの異なる遺伝子cDNAを、精製したRB
タンパク質をプローブとして用いるcDNA発現ライブラリ
ーの直接スクリーニングによりクローンした。これらの
クローンの仮の特徴づけは、これらの遺伝子の大部分が
新規のタンパク質をコードすることを示す。それらの1
つ、Ap12は、細胞周期依存型の 2.8 Kb mRNAを発現す
る。
【００３３】Ap12の最長cDNAの単離物は、転写因子に特
徴的ないくつかの特徴をもつ476のアミノ酸からなる推
定タンパク質をコードする。Ap12のC-末端の114アミノ
酸は未リン酸化RBと、T-抗原が結合して転写活性化活性
を有するのと類似の領域で結合する。
徴的ないくつかの特徴をもつ476のアミノ酸からなる推
定タンパク質をコードする。Ap12のC-末端の114アミノ
酸は未リン酸化RBと、T-抗原が結合して転写活性化活性
を有するのと類似の領域で結合する。
【００３４】N-末端付近の領域は、塩基性残基と側面を
接する推定ロイシンジッパーを含み、E2Fと同起源の配
列に特異的に結合可能である。サル腎臓CV1細胞におけ
るAp12の発現は、E2F-依存性転写活性を著明に増強し
た。E2F遺伝子がクローンされておらず、その同一性が
特異的なDNAを認識して結合する能力のみに基づいてい
るにもかかわらず、これらの結果は新規なクローン転写
因子E2Fの既知の特性を有しRBに結合するタンパク質を
コードすることを確立する。
接する推定ロイシンジッパーを含み、E2Fと同起源の配
列に特異的に結合可能である。サル腎臓CV1細胞におけ
るAp12の発現は、E2F-依存性転写活性を著明に増強し
た。E2F遺伝子がクローンされておらず、その同一性が
特異的なDNAを認識して結合する能力のみに基づいてい
るにもかかわらず、これらの結果は新規なクローン転写
因子E2Fの既知の特性を有しRBに結合するタンパク質を
コードすることを確立する。
【００３５】それゆえに、本発明は網膜芽腫−関連タン
パク質をコードする単離された核酸分子を提供する。こ
こで用いる、用語「単離された核酸分子」は、自然界に
は発生しない形態の核酸分子に関する。ヒト網膜芽腫核
酸分子を単離する1つの手段は、当業者に公知の方法（M
aniatisら、(1989)参照、ここに参考として援用され
る）を用いて、自然のまたは人為的に設計された網膜芽
種に対する抗体でヒトcDNA発現ライブラリーをプローブ
することである。ヒト網膜芽腫−関連ポリペプチドをコ
ードするDNAおよびcDNA分子は、ヒト、哺乳類または他
の動物起源の相補ゲノムのDNA、cDNAまたはRNAを得るた
めに用い得る。単離された核酸はまた、cDNAライブラリ
ーをスクリーンしてRB-関連タンパク質をコードする他
の遺伝子を単離するのに用い得る。
パク質をコードする単離された核酸分子を提供する。こ
こで用いる、用語「単離された核酸分子」は、自然界に
は発生しない形態の核酸分子に関する。ヒト網膜芽腫核
酸分子を単離する1つの手段は、当業者に公知の方法（M
aniatisら、(1989)参照、ここに参考として援用され
る）を用いて、自然のまたは人為的に設計された網膜芽
種に対する抗体でヒトcDNA発現ライブラリーをプローブ
することである。ヒト網膜芽腫−関連ポリペプチドをコ
ードするDNAおよびcDNA分子は、ヒト、哺乳類または他
の動物起源の相補ゲノムのDNA、cDNAまたはRNAを得るた
めに用い得る。単離された核酸はまた、cDNAライブラリ
ーをスクリーンしてRB-関連タンパク質をコードする他
の遺伝子を単離するのに用い得る。
【００３６】本発明は、DNA結合およびRB結合活性を有
する可溶性の網膜芽種−関連ポリペプチドを提供する。
例示の目的だけのために、このポリペプチドをコードす
る核酸配列が図4および10-15において同定される。可溶
性の網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする核酸配列
は、図4および10-15に示される配列中に含まれる。
する可溶性の網膜芽種−関連ポリペプチドを提供する。
例示の目的だけのために、このポリペプチドをコードす
る核酸配列が図4および10-15において同定される。可溶
性の網膜芽種−関連ポリペプチドをコードする核酸配列
は、図4および10-15に示される配列中に含まれる。
【００３７】ここで用いる「網膜芽種−関連ポリペプチ
ド」は、DNA結合活性とRB-結合活性とを有するポリペプ
チドを意味する。網膜芽種−関連ポリペプチドの例は、
図4に示されるクローンAp12のアミノ酸配列、またはク
ローンAp 2,4,8,10および15、またはそれらの活性フラ
グメントの核酸配列によりコードされたアミノ酸配列
と、実質的に同一である。ここで用いる「活性フラグメ
ントまたは生物学的−活性フラグメント」は、図4に示
す網膜芽種−関連ポリペプチド、または図10-15に示す
クローンAp 2,4,8,10および15によりコードされたポリ
ペプチドのすべての部分に関する。ポリペプチドがRBに
結合し得るかどうかを検定する方法は当業者に知られて
おり、例えば、本出願に示される。
ド」は、DNA結合活性とRB-結合活性とを有するポリペプ
チドを意味する。網膜芽種−関連ポリペプチドの例は、
図4に示されるクローンAp12のアミノ酸配列、またはク
ローンAp 2,4,8,10および15、またはそれらの活性フラ
グメントの核酸配列によりコードされたアミノ酸配列
と、実質的に同一である。ここで用いる「活性フラグメ
ントまたは生物学的−活性フラグメント」は、図4に示
す網膜芽種−関連ポリペプチド、または図10-15に示す
クローンAp 2,4,8,10および15によりコードされたポリ
ペプチドのすべての部分に関する。ポリペプチドがRBに
結合し得るかどうかを検定する方法は当業者に知られて
おり、例えば、本出願に示される。
【００３８】ここで用いる、用語「精製した」は、本来
のまたは自然の環境に通常伴う汚染物質を実質的に含ま
ない分子または化合物を意味する。ここで開示した精製
したポリペプチドは、可溶性ポリペプチドを含む。例え
ば、精製した可溶性ポリペプチドは、多くの方法によっ
て得られ得る。タンパク質の精製に有用な方法は、沈
澱、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニテイー
クロマトグラフィーを含む。他の公知の方法は、Deutsc
herら、 Guide to Protein Purification: Methods in
Enzymology Vol. 182, (Academic Press 1990)に記載さ
れており、ここに参考として援用する。その代わりに、
本発明の精製したポリペプチドはまた、例えば、ここに
参考として援用したManiatisら、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 第2版(Cold Spring Harbor Labora
tory 1989)に記載されているような公知の組換え法によ
っても得られ得る。この、可溶性網膜芽種−関連ポリペ
プチドを調製する手段の一つの例は、網膜芽種−関連ポ
リペプチドをコードする核酸を細菌、酵母または哺乳動
物細胞のような好適な宿主細胞中に、公知の技術を用い
て発現することであり、発現した可溶性タンパク質を、
再び公知の技術を用いて回収することである。可溶性ポ
リペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントは
化学合成によっても生成され得る。合成ポリペプチド
は、Applied Biosystems, Inc.製Model 430Aまたは431A
自動ポリペプチドシンセサイザーおよび業者によって提
供される化学を用いて生成し得る。可溶性ポリペプチド
はまた、以下にさらに詳細に記載する発現ベクターによ
って形質転換された細胞から直接単離し得る。
のまたは自然の環境に通常伴う汚染物質を実質的に含ま
ない分子または化合物を意味する。ここで開示した精製
したポリペプチドは、可溶性ポリペプチドを含む。例え
ば、精製した可溶性ポリペプチドは、多くの方法によっ
て得られ得る。タンパク質の精製に有用な方法は、沈
澱、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニテイー
クロマトグラフィーを含む。他の公知の方法は、Deutsc
herら、 Guide to Protein Purification: Methods in
Enzymology Vol. 182, (Academic Press 1990)に記載さ
れており、ここに参考として援用する。その代わりに、
本発明の精製したポリペプチドはまた、例えば、ここに
参考として援用したManiatisら、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 第2版(Cold Spring Harbor Labora
tory 1989)に記載されているような公知の組換え法によ
っても得られ得る。この、可溶性網膜芽種−関連ポリペ
プチドを調製する手段の一つの例は、網膜芽種−関連ポ
リペプチドをコードする核酸を細菌、酵母または哺乳動
物細胞のような好適な宿主細胞中に、公知の技術を用い
て発現することであり、発現した可溶性タンパク質を、
再び公知の技術を用いて回収することである。可溶性ポ
リペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントは
化学合成によっても生成され得る。合成ポリペプチド
は、Applied Biosystems, Inc.製Model 430Aまたは431A
自動ポリペプチドシンセサイザーおよび業者によって提
供される化学を用いて生成し得る。可溶性ポリペプチド
はまた、以下にさらに詳細に記載する発現ベクターによ
って形質転換された細胞から直接単離し得る。
【００３９】本発明はまた、図に示す核酸分子とは異な
るが同じ表現型の効果のある核酸分子を含む。これらの
変性した、しかし表現型としては等価の核酸分子を、
「等価の核酸分子」と呼ぶ。本発明はまた、本願上記記
載の核酸分子と比較したときそれによって産生されるポ
リペプチドの表現型を変性しない、非−コード化領域に
おける変化よって特徴づけられた核酸分子を含む。本発
明はさらに、ハイブリッド化して本発明の核酸分子を形
成する核酸分子を含む。ここで用いる用語「核酸」は、
一本鎖および二本鎖のDNAおよびcDNAと同様にRNAを含
む。加えて、ここで用いる用語「ポリペプチド」は、人
工的な組換え型と同様にすべての自然発生の対立遺伝子
変異体を含む。
るが同じ表現型の効果のある核酸分子を含む。これらの
変性した、しかし表現型としては等価の核酸分子を、
「等価の核酸分子」と呼ぶ。本発明はまた、本願上記記
載の核酸分子と比較したときそれによって産生されるポ
リペプチドの表現型を変性しない、非−コード化領域に
おける変化よって特徴づけられた核酸分子を含む。本発
明はさらに、ハイブリッド化して本発明の核酸分子を形
成する核酸分子を含む。ここで用いる用語「核酸」は、
一本鎖および二本鎖のDNAおよびcDNAと同様にRNAを含
む。加えて、ここで用いる用語「ポリペプチド」は、人
工的な組換え型と同様にすべての自然発生の対立遺伝子
変異体を含む。
【００４０】本発明はさらに、他の調節配列と同様に、
RNA転写のプロモーターに作動的に連鎖した単離核酸分
子を提供する。ここで用いる用語「作動的に連鎖した」
は、プロモーターがRNA転写を指示して核酸分子を離す
ようにする状態で位置することを意味する。そのような
プロモーターの例は、SP6、T4、およびT7である。プロ
モーターおよび挿入DNA片がそのプロモーターに作動的
に連鎖したクローニング部位の両方を含むベクターは、
当業者に知られている。好ましくは、これらのベクター
はin vitroまたはin vivoでのRNA転写をなし得る。その
ようなベクターの例は、pGEMシリーズ(Promega Biotec
h; Madison, WI)である。
RNA転写のプロモーターに作動的に連鎖した単離核酸分
子を提供する。ここで用いる用語「作動的に連鎖した」
は、プロモーターがRNA転写を指示して核酸分子を離す
ようにする状態で位置することを意味する。そのような
プロモーターの例は、SP6、T4、およびT7である。プロ
モーターおよび挿入DNA片がそのプロモーターに作動的
に連鎖したクローニング部位の両方を含むベクターは、
当業者に知られている。好ましくは、これらのベクター
はin vitroまたはin vivoでのRNA転写をなし得る。その
ようなベクターの例は、pGEMシリーズ(Promega Biotec
h; Madison, WI)である。
【００４１】本発明は、網膜芽種−関連ポリペプチドを
コードする単離核酸分子を含むベクターを提供する。ベ
クターの例は、バクテリオファージ、バキュロウィルス
およびレトロウィルスのようなウィルス、コスミド、プ
ラスミドまたは他の組換えベクターである。核酸分子を
当業者に知られる方法でベクターゲノム中に挿入する。
例えば、挿入物およびベクターDNAを双方とも制限酵素
に当て、両分子の相補的末端にそれぞれ対をなす塩基を
作り出させて、次にリガーゼと結合させる。その代わり
に、合成核酸リンカーをベクターDNAの制限部位に対応
する挿入DNAに結合させ得、次に特別なヌクレオチド配
列を認識する制限酵素で消化する。その他に、終止コド
ンを含むオリゴヌクレオチドおよび適切な制限部位を、
以下のいくつかまたはすべてを含むベクター内に挿入す
るために、結合し得る。そのようなベクターとは例え
ば：哺乳動物細胞における安定または一過性トランスフ
ェクタントを選択するネオマイシン遺伝子のような選択
マーカー遺伝子；ヒトサイトメガロウィルス(CMV)の即
時初期遺伝子から得た高レベルの転写のためのエンハン
サー／プロモーター配列；mRNA安定性のためのSV40から
得た転写終止およびRNAプロセシングシグナル；SV40ポ
リオーマの複製起点および正しいエピソーム複製のため
のCo1E1；多用途多重クローニング部位；およびセンス
およびアンチセンスRNAのin vitro転写のためのT7およ
びSP6 RNAプロモーター。用い得る他の手段は当業者に
公知である。
コードする単離核酸分子を含むベクターを提供する。ベ
クターの例は、バクテリオファージ、バキュロウィルス
およびレトロウィルスのようなウィルス、コスミド、プ
ラスミドまたは他の組換えベクターである。核酸分子を
当業者に知られる方法でベクターゲノム中に挿入する。
例えば、挿入物およびベクターDNAを双方とも制限酵素
に当て、両分子の相補的末端にそれぞれ対をなす塩基を
作り出させて、次にリガーゼと結合させる。その代わり
に、合成核酸リンカーをベクターDNAの制限部位に対応
する挿入DNAに結合させ得、次に特別なヌクレオチド配
列を認識する制限酵素で消化する。その他に、終止コド
ンを含むオリゴヌクレオチドおよび適切な制限部位を、
以下のいくつかまたはすべてを含むベクター内に挿入す
るために、結合し得る。そのようなベクターとは例え
ば：哺乳動物細胞における安定または一過性トランスフ
ェクタントを選択するネオマイシン遺伝子のような選択
マーカー遺伝子；ヒトサイトメガロウィルス(CMV)の即
時初期遺伝子から得た高レベルの転写のためのエンハン
サー／プロモーター配列；mRNA安定性のためのSV40から
得た転写終止およびRNAプロセシングシグナル；SV40ポ
リオーマの複製起点および正しいエピソーム複製のため
のCo1E1；多用途多重クローニング部位；およびセンス
およびアンチセンスRNAのin vitro転写のためのT7およ
びSP6 RNAプロモーター。用い得る他の手段は当業者に
公知である。
【００４２】また、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞
および他の動物細胞中で発現するように適合した、ヒト
網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードするDNA分子を包
含するベクターを提供する。このベクターは他に、細
菌、酵母、哺乳類または他の動物細胞中のDNAを発現す
るのに必要で、かつ網膜芽腫−関連ポリペプチドをコー
ドするDNAを発現するようそのDNAに関連して位置づけら
れた調節成分を含む。発現に必要な調節成分は、RNAポ
リメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソー
ム結合の転写開始配列を含む。例えば、細菌性発現ベク
ターは、lac プロモーターのようなプロモーターおよび
転写開始のためのShine-Dalgarno配列および開始コドン
AUG(Maniatisら、前記、1989)を含む。同様に、真核性
発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIの異種または同種
プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コド
ンAUG、およびリボソーム剥離の終止コドンを含む。そ
のようなベクターは、商業的に入手されるかまたは当業
者に知られる方法、例えば一般的にベクターを構築する
ための上記の方法に記載された配列によって集められ得
る。発現ベクターはポリペプチドを発現する細胞を産生
するのに有用である。
および他の動物細胞中で発現するように適合した、ヒト
網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードするDNA分子を包
含するベクターを提供する。このベクターは他に、細
菌、酵母、哺乳類または他の動物細胞中のDNAを発現す
るのに必要で、かつ網膜芽腫−関連ポリペプチドをコー
ドするDNAを発現するようそのDNAに関連して位置づけら
れた調節成分を含む。発現に必要な調節成分は、RNAポ
リメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソー
ム結合の転写開始配列を含む。例えば、細菌性発現ベク
ターは、lac プロモーターのようなプロモーターおよび
転写開始のためのShine-Dalgarno配列および開始コドン
AUG(Maniatisら、前記、1989)を含む。同様に、真核性
発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIの異種または同種
プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コド
ンAUG、およびリボソーム剥離の終止コドンを含む。そ
のようなベクターは、商業的に入手されるかまたは当業
者に知られる方法、例えば一般的にベクターを構築する
ための上記の方法に記載された配列によって集められ得
る。発現ベクターはポリペプチドを発現する細胞を産生
するのに有用である。
【００４３】本発明は、宿主細胞、例えばヒト網膜芽腫
−関連ポリペプチドをコードする核酸分子を含む哺乳動
物細胞を、提供する。例えば哺乳動物細胞中で発現する
ために適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞である。
プラスミドは、網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードす
る核酸分子およびポリペプチドの発現に必要な調節成分
を有する。例えば、マウス繊維芽細胞NIH3T3、CHO細
胞、HeLa細胞、Ltk-細胞などを含む、種々の哺乳動物細
胞が宿主として有用であり得る。上に記載されたような
発現プラスミドを、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキ
ストラン、電気穿孔法またはマイクロインジェクション
のような当業者に知られた方法で哺乳動物細胞をトラン
スフェクトするのに用い得る。
−関連ポリペプチドをコードする核酸分子を含む哺乳動
物細胞を、提供する。例えば哺乳動物細胞中で発現する
ために適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞である。
プラスミドは、網膜芽腫−関連ポリペプチドをコードす
る核酸分子およびポリペプチドの発現に必要な調節成分
を有する。例えば、マウス繊維芽細胞NIH3T3、CHO細
胞、HeLa細胞、Ltk-細胞などを含む、種々の哺乳動物細
胞が宿主として有用であり得る。上に記載されたような
発現プラスミドを、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキ
ストラン、電気穿孔法またはマイクロインジェクション
のような当業者に知られた方法で哺乳動物細胞をトラン
スフェクトするのに用い得る。
【００４４】また、抗−Ap12抗体またはすべての網膜芽
腫−関連ポリペプチドと特異的な反応性を有する抗体の
ような、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドと特異的
な反応性を有する抗体を提供する。抗体の免疫学的に活
性なフラグメントは、「抗体」の定義中に含まれる。免
疫学的に活性なフラグメントの同定は、例えば以下に記
載するように行い得る。本発明の抗体は、当業者に知ら
れたどの方法によっても産生し得る。例えば、ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体が、以下に記載する当
業者に知られた方法、例えば、ここに参考として援用し
たHarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manua
l (Cold Spring Harbor Laboratory 1988)にある方法に
よって産生し得る。ポリペプチド、特に本発明の網膜芽
腫−関連ポリペプチドは、そのような抗体の生成におい
て免疫抗原として用い得る。キメラ性、ヒト型、CDR-移
植または二機能性抗体のような変性抗体もまた、当業者
によって知られる方法によって産生し得る。そのような
抗体は、例えばManiatisらによってここに参考として援
用した上に記載された中の、ハイブリドーマ、化学合成
または組換え法によっても産生し得る。これらの抗体
は、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドの存在を決定
するため、または精製のために使用され得る。そのよう
なポリペプチドに関しては、これらの抗体を、in vitro
診断または機能性RBタンパク質の喪失を伴う病理の診
断または予知のためのin vivo イメージング法に用い得
る。
腫−関連ポリペプチドと特異的な反応性を有する抗体の
ような、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドと特異的
な反応性を有する抗体を提供する。抗体の免疫学的に活
性なフラグメントは、「抗体」の定義中に含まれる。免
疫学的に活性なフラグメントの同定は、例えば以下に記
載するように行い得る。本発明の抗体は、当業者に知ら
れたどの方法によっても産生し得る。例えば、ポリクロ
ーナルおよびモノクローナル抗体が、以下に記載する当
業者に知られた方法、例えば、ここに参考として援用し
たHarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manua
l (Cold Spring Harbor Laboratory 1988)にある方法に
よって産生し得る。ポリペプチド、特に本発明の網膜芽
腫−関連ポリペプチドは、そのような抗体の生成におい
て免疫抗原として用い得る。キメラ性、ヒト型、CDR-移
植または二機能性抗体のような変性抗体もまた、当業者
によって知られる方法によって産生し得る。そのような
抗体は、例えばManiatisらによってここに参考として援
用した上に記載された中の、ハイブリドーマ、化学合成
または組換え法によっても産生し得る。これらの抗体
は、本発明の網膜芽腫−関連ポリペプチドの存在を決定
するため、または精製のために使用され得る。そのよう
なポリペプチドに関しては、これらの抗体を、in vitro
診断または機能性RBタンパク質の喪失を伴う病理の診
断または予知のためのin vivo イメージング法に用い得
る。
【００４５】試料中の標的とする網膜芽腫−関連ポリペ
プチドのin vitro 検出に有用な免疫学的方法は、検出
可能な抗体を用いるイムノアッセイを含む。そのような
イムノアッセイは、例えば、当業者に知られるELISA、P
andexマイクロフルオリメトリックアッセイ、凝集反応
アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイお
よび免疫組織化学的染色法を含む。抗体は、当業者に知
られる種々の方法によって検出可能となる。例えば、検
出可能なマーカーを、直接または間接に抗体に取り付け
得る。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、
発蛍光団、色原体、および化学発光ラベルを含む。
プチドのin vitro 検出に有用な免疫学的方法は、検出
可能な抗体を用いるイムノアッセイを含む。そのような
イムノアッセイは、例えば、当業者に知られるELISA、P
andexマイクロフルオリメトリックアッセイ、凝集反応
アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイお
よび免疫組織化学的染色法を含む。抗体は、当業者に知
られる種々の方法によって検出可能となる。例えば、検
出可能なマーカーを、直接または間接に抗体に取り付け
得る。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、
発蛍光団、色原体、および化学発光ラベルを含む。
【００４６】
（実施例１： RB-関連タンパク質の同定）RB機能の最も
簡単なモデルは、細胞機能において中心的な役割を演ず
る相対的にごく僅かな標的分子が網膜芽腫タンパク質に
よって調節されることである。リン酸化(Chenら、198
9；DeCaprioら、1989)、突然変異(Shewら、1990)または
癌タンパク質摂動(DeCaprioら、1988；Goodrichら、199
1；Whyteら、1988)、の3つの方法のうちのいずれか1つ
によるRBの不活化は、潜在的にRB結合を分離し、不規則
な増殖へ導き得た。この報告までは、無論、機能未知の
2つのタンパク質、p1およびp2、mycタンパク質および8-
10の他の未同定タンパク質のような、限られた数の分子
がRBと相互作用し得ることが知られるのみであった。遺
伝学的および生化学的にRBネットワークを分析するため
に、RBの相互作用相手をコードする遺伝子をできるだけ
多く同定することが不可欠である。クローニングの可能
性を最大にするため、2つの異なるアプローチを企て
た。一つのアプローチでは、Fieldおよび彼の同僚によ
って開発された(FieldsおよびSung、1989)in vivoでの
タンパク質−タンパク質相互作用を選択する酵母GAL4系
に基づいた 2-ハイブリッド法を用いる。ここに記載し
た他のアプローチでは、λgt11 cDNA発現ライブラリー
をスクリーンするRB-サンドイッチを用いた。このワン
−ステップRB-サンドイッチ法を用いることの利点は、
簡単であること、直接的なことにあり、単離されたクロ
ーンは、潜在する架橋タンパク質なしに直接RBと相互作
用する融合タンパク質をコードし得た。スクリーニング
は、SV40ラージT抗原を陽性対照として用いて行った。T
抗原を発現するλgt11ファージを、この目的のために構
成し、そしてRBおよびTの会合体は本法により容易に検
出され得る。
簡単なモデルは、細胞機能において中心的な役割を演ず
る相対的にごく僅かな標的分子が網膜芽腫タンパク質に
よって調節されることである。リン酸化(Chenら、198
9；DeCaprioら、1989)、突然変異(Shewら、1990)または
癌タンパク質摂動(DeCaprioら、1988；Goodrichら、199
1；Whyteら、1988)、の3つの方法のうちのいずれか1つ
によるRBの不活化は、潜在的にRB結合を分離し、不規則
な増殖へ導き得た。この報告までは、無論、機能未知の
2つのタンパク質、p1およびp2、mycタンパク質および8-
10の他の未同定タンパク質のような、限られた数の分子
がRBと相互作用し得ることが知られるのみであった。遺
伝学的および生化学的にRBネットワークを分析するため
に、RBの相互作用相手をコードする遺伝子をできるだけ
多く同定することが不可欠である。クローニングの可能
性を最大にするため、2つの異なるアプローチを企て
た。一つのアプローチでは、Fieldおよび彼の同僚によ
って開発された(FieldsおよびSung、1989)in vivoでの
タンパク質−タンパク質相互作用を選択する酵母GAL4系
に基づいた 2-ハイブリッド法を用いる。ここに記載し
た他のアプローチでは、λgt11 cDNA発現ライブラリー
をスクリーンするRB-サンドイッチを用いた。このワン
−ステップRB-サンドイッチ法を用いることの利点は、
簡単であること、直接的なことにあり、単離されたクロ
ーンは、潜在する架橋タンパク質なしに直接RBと相互作
用する融合タンパク質をコードし得た。スクリーニング
は、SV40ラージT抗原を陽性対照として用いて行った。T
抗原を発現するλgt11ファージを、この目的のために構
成し、そしてRBおよびTの会合体は本法により容易に検
出され得る。
【００４７】このアプローチを用いて、9つのクローン
を単離した。これらのクローンによりコードされたすべ
てのタンパク質を、核内に配置した。これは、生物学的
に重要な方法でRBと相互作用し得るすべてのタンパク質
に対する重要な基準である。なぜなら相互作用は、おそ
らくは核内で起こるから(Leeら、1987b)である。
を単離した。これらのクローンによりコードされたすべ
てのタンパク質を、核内に配置した。これは、生物学的
に重要な方法でRBと相互作用し得るすべてのタンパク質
に対する重要な基準である。なぜなら相互作用は、おそ
らくは核内で起こるから(Leeら、1987b)である。
【００４８】（実施例２： RBタンパク質による調節の
標的としての転写因子）RBの細胞機能が細胞のG1への侵
入を制限すること(Goodrichら、1991)であるならば、G1
進行およびS期への進入に対して重要な遺伝子は、RBに
よって直接または間接に調節されなければならない。転
写因子E2Fは、細胞周期依存性の方法で、G0/G1期には優
勢であるがS期またはM期には優勢でないタイトな会合体
でRBに会合することが知られている(Mudryjら、1991；S
hirodkarら、1992)。myc、DHFR、およびmybを含むいく
つかの遺伝子が、E2F転写制御にかけられ得る(Hiebert
ら、1989；Mudryjら、1990)。RBがG0/G1期のE2Fを不活
性なコンフォーメーションで隔離することを企てるのは
合理的である。RB複合体からの放出は、E2F DNA-結合部
位および転写機構全般との相互作用を通して標的遺伝子
に影響し得る活性なコンフォーメーションを仮定せしめ
る。重要な挑戦は、E2F標的遺伝子の同一性を決定し、
細胞周期の制御におけるそれらの役割を確かめることで
ある。
標的としての転写因子）RBの細胞機能が細胞のG1への侵
入を制限すること(Goodrichら、1991)であるならば、G1
進行およびS期への進入に対して重要な遺伝子は、RBに
よって直接または間接に調節されなければならない。転
写因子E2Fは、細胞周期依存性の方法で、G0/G1期には優
勢であるがS期またはM期には優勢でないタイトな会合体
でRBに会合することが知られている(Mudryjら、1991；S
hirodkarら、1992)。myc、DHFR、およびmybを含むいく
つかの遺伝子が、E2F転写制御にかけられ得る(Hiebert
ら、1989；Mudryjら、1990)。RBがG0/G1期のE2Fを不活
性なコンフォーメーションで隔離することを企てるのは
合理的である。RB複合体からの放出は、E2F DNA-結合部
位および転写機構全般との相互作用を通して標的遺伝子
に影響し得る活性なコンフォーメーションを仮定せしめ
る。重要な挑戦は、E2F標的遺伝子の同一性を決定し、
細胞周期の制御におけるそれらの役割を確かめることで
ある。
【００４９】この簡単なRB機能のモデルを支持する証拠
は増加しており、9つの新しくクローンされたRB関連タ
ンパク質の収集において、一つはリボソームRNAプロモ
ーターを認識して結合し、SL1との協同的な相互作用を
通してRNAポリメラーゼに仲介される転写を活性化する
(Jantzenら、1990)、既知の真核性の上流結合因子(UBF)
であり、他は、E2F転写因子に対して企てられたRB-関連
タンパク質と矛盾しない特性を有するAp12であることの
発見で、このモデルは現在はさらに支持される。血漿に
よる刺激後6時間中のAp12 mRNAの蓄積は、遅延−早期増
殖応答遺伝子の発現パターンと一致する(LauおよびNath
ans、1991)。Ap12 mRNAの最大レベルはG1/S境界におい
て蓄積し、細胞のS期への侵入の制御における役割を有
することを確立した。また、このタンパク質は、未リン
酸化RBと、Tが結合するのと類似のドメインにおいての
み結合する。最も興味あることには、Ap12はE2Fと同源
の配列を認識し、そしてそのような特異的な配列を運ぶ
プロモーターをトランス活性する。
は増加しており、9つの新しくクローンされたRB関連タ
ンパク質の収集において、一つはリボソームRNAプロモ
ーターを認識して結合し、SL1との協同的な相互作用を
通してRNAポリメラーゼに仲介される転写を活性化する
(Jantzenら、1990)、既知の真核性の上流結合因子(UBF)
であり、他は、E2F転写因子に対して企てられたRB-関連
タンパク質と矛盾しない特性を有するAp12であることの
発見で、このモデルは現在はさらに支持される。血漿に
よる刺激後6時間中のAp12 mRNAの蓄積は、遅延−早期増
殖応答遺伝子の発現パターンと一致する(LauおよびNath
ans、1991)。Ap12 mRNAの最大レベルはG1/S境界におい
て蓄積し、細胞のS期への侵入の制御における役割を有
することを確立した。また、このタンパク質は、未リン
酸化RBと、Tが結合するのと類似のドメインにおいての
み結合する。最も興味あることには、Ap12はE2Fと同源
の配列を認識し、そしてそのような特異的な配列を運ぶ
プロモーターをトランス活性する。
【００５０】（実施例３：Ap12は、推定bZIP転写因子を
コードする）この遺伝子の予備特性付けから、最も長い
オープンリーディングフレームから推定された推定タン
パク質は、開始メチオニンはまだ判明していないが、47
6アミノ酸の長さである。この推定タンパク質の予測分
子量は約51kdであり、これは、抗Ap12抗体により免疫沈
降される60kdのタンパク質に近い。RBタンパク質に結合
し、トランス活性化活性を有するAp12のC末端領域は、
非常に酸性であり、ＧＡＬ４およびＶＰ１６（Sadowski
ら、1988; MitchellおよびTjian, 1989）のような、い
くつかの公知の転写因子のトランス活性化ドメインの特
徴である。DNA結合ドメインは、塩基性アミノ酸範囲に
よって両端に隣接されている、推定上のロイシンジッパ
ーモチーフを特徴づけるタンパク質中央の領域に位置し
ていると考えられる。Ap12は、E2Fの特徴であるほとん
どの特徴を有するので、E2FかE2F族のタンパク質のいず
れかをコードすると考えられ得る。従って、E2Fはまた
細胞増殖（例えば、fosおよびjun）および分化（例え
ば、C/EBP）に密接に関連する一クラスの転写因子であ
るので、E2Fはまた、興味のあるbZIPタンパク質である
ようだ。bZIP族のもう一つの特徴は、E2Fの制御に調節
の新しい層を加える、メンバー中のヘテロ二量体会合体
の多様な配列を形成する傾向である。
コードする）この遺伝子の予備特性付けから、最も長い
オープンリーディングフレームから推定された推定タン
パク質は、開始メチオニンはまだ判明していないが、47
6アミノ酸の長さである。この推定タンパク質の予測分
子量は約51kdであり、これは、抗Ap12抗体により免疫沈
降される60kdのタンパク質に近い。RBタンパク質に結合
し、トランス活性化活性を有するAp12のC末端領域は、
非常に酸性であり、ＧＡＬ４およびＶＰ１６（Sadowski
ら、1988; MitchellおよびTjian, 1989）のような、い
くつかの公知の転写因子のトランス活性化ドメインの特
徴である。DNA結合ドメインは、塩基性アミノ酸範囲に
よって両端に隣接されている、推定上のロイシンジッパ
ーモチーフを特徴づけるタンパク質中央の領域に位置し
ていると考えられる。Ap12は、E2Fの特徴であるほとん
どの特徴を有するので、E2FかE2F族のタンパク質のいず
れかをコードすると考えられ得る。従って、E2Fはまた
細胞増殖（例えば、fosおよびjun）および分化（例え
ば、C/EBP）に密接に関連する一クラスの転写因子であ
るので、E2Fはまた、興味のあるbZIPタンパク質である
ようだ。bZIP族のもう一つの特徴は、E2Fの制御に調節
の新しい層を加える、メンバー中のヘテロ二量体会合体
の多様な配列を形成する傾向である。
【００５１】この多様な配列の可能性は、細胞周期の完
ぺきな制御にかかわるタンパク質を複雑に調節するため
に、細胞に対してほとんど無限の機会を提供する。Ap12
/E2Fクローンの有用性は、RB、E2Fおよび細胞増殖間の
関係の解明を、さらに容易にする。
ぺきな制御にかかわるタンパク質を複雑に調節するため
に、細胞に対してほとんど無限の機会を提供する。Ap12
/E2Fクローンの有用性は、RB、E2Fおよび細胞増殖間の
関係の解明を、さらに容易にする。
【００５２】RBの細胞関連物の同定、およびRB相互に作
用する細胞ネットワークの解明を始めるために、RB関連
タンパク質をコードする遺伝子をクローン化するいくつ
かの研究がなされた。本明細書に記載されている事は、
これらの研究のうちの一つからの結果、すなわちプロー
ブとしてRBを用いたλgt11発現ライブラリーのスクリー
ニングである。9つの個別の遺伝子をクローン化し、そ
の一つであるのAp12は、転写因子E2Fをコードすること
を示唆する特徴を有する。クローンAp 2、4、8、10、1
2、および15は全てRB関連タンパク質をコードし、およ
びすべて細胞周期の制御にかかわる。
用する細胞ネットワークの解明を始めるために、RB関連
タンパク質をコードする遺伝子をクローン化するいくつ
かの研究がなされた。本明細書に記載されている事は、
これらの研究のうちの一つからの結果、すなわちプロー
ブとしてRBを用いたλgt11発現ライブラリーのスクリー
ニングである。9つの個別の遺伝子をクローン化し、そ
の一つであるのAp12は、転写因子E2Fをコードすること
を示唆する特徴を有する。クローンAp 2、4、8、10、1
2、および15は全てRB関連タンパク質をコードし、およ
びすべて細胞周期の制御にかかわる。
【００５３】（実施例４：RB関連タンパク質（RbAps）
の同定）２つのλgt11 cDNA発現ライブラリーを構築
し、Tー結合ドメインおよびプローブとして完全なC末端
領域（Leeら、1991）の両方を含む、精製p56-RBタンパ
ク質（アミノ酸376-928）を用いてスクリーニングし
た。このプローブは、RBタンパク質、ウサギ抗RB抗体、
（0.47）（Wangら、1990a）、およびアルカリホスファ
ターゼ複合体化ヤギ抗ウサギIgGを含むので、RBーサンド
イッチと呼ばれる。（材料および方法参照。）図１は、
サンドイッチスクリーニング法の図式を説明する（1Aお
よび1B）。RBとSV40 T抗原との関係は、十分に引照付け
られているので（DeCaprioら、1988）、λgt11 ファー
ジ発現T抗原を構築し、RB-サンドイッチを用いてスクリ
ーニングし、正の制御として使用した（図1-Dに示
す）。例のように（図1ーC）、この方法によって、クロ
ーンの一つ（Ap12）の融合生成物を容易に検出した。各
フィルターの半分をRBーサンドイッチ結合用に、そして
残りの半分をRBタンパク質欠損サンドイッチ結合用に使
用した。後者のプローブは、RB抗体あるいはヤギ抗ウサ
ギ抗体の、細菌タンパク質とのあらゆる交差反応のため
にバックグラウンド結合の対照として使用した。1 x 10
4の組換えファージのスクリーニングを５回行った後、1
2のクローンがRB関連タンパク質をコードする候補的遺
伝子として出現した。これらのクローンを、RbAp1、2、
4、6、8、9、10、11、12、13、14、15と呼ぶ。
の同定）２つのλgt11 cDNA発現ライブラリーを構築
し、Tー結合ドメインおよびプローブとして完全なC末端
領域（Leeら、1991）の両方を含む、精製p56-RBタンパ
ク質（アミノ酸376-928）を用いてスクリーニングし
た。このプローブは、RBタンパク質、ウサギ抗RB抗体、
（0.47）（Wangら、1990a）、およびアルカリホスファ
ターゼ複合体化ヤギ抗ウサギIgGを含むので、RBーサンド
イッチと呼ばれる。（材料および方法参照。）図１は、
サンドイッチスクリーニング法の図式を説明する（1Aお
よび1B）。RBとSV40 T抗原との関係は、十分に引照付け
られているので（DeCaprioら、1988）、λgt11 ファー
ジ発現T抗原を構築し、RB-サンドイッチを用いてスクリ
ーニングし、正の制御として使用した（図1-Dに示
す）。例のように（図1ーC）、この方法によって、クロ
ーンの一つ（Ap12）の融合生成物を容易に検出した。各
フィルターの半分をRBーサンドイッチ結合用に、そして
残りの半分をRBタンパク質欠損サンドイッチ結合用に使
用した。後者のプローブは、RB抗体あるいはヤギ抗ウサ
ギ抗体の、細菌タンパク質とのあらゆる交差反応のため
にバックグラウンド結合の対照として使用した。1 x 10
4の組換えファージのスクリーニングを５回行った後、1
2のクローンがRB関連タンパク質をコードする候補的遺
伝子として出現した。これらのクローンを、RbAp1、2、
4、6、8、9、10、11、12、13、14、15と呼ぶ。
【００５４】これらの12の推定RbAp cDNAをpGEMプラス
ミドにサブクローン化して、各クローンから500から600
bpの部分配列を得た。GENBANKデータベースにある公知
の遺伝子配列と比較して、RbAp1、2、4、8、10、12、1
3、14、15は、公知のいかなる遺伝子に対しても重要な
相同性を含まない新規遺伝子である。しかし、３つのク
ローンが以前に同定されている遺伝子と一致した。RbAp
6は、核ラミン C（McKeon, 1986; Fisher, 1986）と同
一であり；RbAp9は、Gタンパク質のβサブユニットと部
分的に相同の生成物をコードし（Gullemontら、198
9）；そして、RbAp11は、リボソームRNA遺伝子プロモー
ターに結合する上流の結合因子（UBF）をコードする（J
antzenら、1990）。クロスハイブリッド形成および配列
決定データは、RbAp1、10、13、および14が同一である
ことを示した。表１に、クローン化された全てのRbAp類
の予備特徴付けを要約する。
ミドにサブクローン化して、各クローンから500から600
bpの部分配列を得た。GENBANKデータベースにある公知
の遺伝子配列と比較して、RbAp1、2、4、8、10、12、1
3、14、15は、公知のいかなる遺伝子に対しても重要な
相同性を含まない新規遺伝子である。しかし、３つのク
ローンが以前に同定されている遺伝子と一致した。RbAp
6は、核ラミン C（McKeon, 1986; Fisher, 1986）と同
一であり；RbAp9は、Gタンパク質のβサブユニットと部
分的に相同の生成物をコードし（Gullemontら、198
9）；そして、RbAp11は、リボソームRNA遺伝子プロモー
ターに結合する上流の結合因子（UBF）をコードする（J
antzenら、1990）。クロスハイブリッド形成および配列
決定データは、RbAp1、10、13、および14が同一である
ことを示した。表１に、クローン化された全てのRbAp類
の予備特徴付けを要約する。
【００５５】RbApクローン2、4、8、10、12、および15
は、細胞周期制御での、RB、pll0RS、結合、および全機
能に対する標的である。RbApクローンによってコードさ
れる網膜芽腫関連タンパク質は、細胞増殖に対する正の
要素であることは可能である。Rbは、これらのクローン
のタンパク質生成物に結合し、それゆえに、それらの増
殖機能を阻害する。結果として、RbApタンパク質生成物
は、正には機能し得ないので、従って細胞周期の進行を
促進し得ない。RbApのRBに結合する能力の変質で、発ガ
ン性の影響を生じ得る。このような変質および／あるい
は変異を検出するアッセイは、過増殖性疾患を診断する
手段として、悪性および機能を測定し得る。過増殖性の
病状の例には、限定はされないが、甲状腺過形成、乾せ
ん、乳癌を含むLi-Fraumeni症候群、肉腫および他の新
生物、膀胱癌、結腸癌、肺癌、良性前立腺肥大、ならび
に種々の白血病およびリンパ腫が含まれる。本発明はま
た、癌および他の過増殖性病状の治療に使用する、この
ような変質および／あるいは変異RbApの拮抗薬を提供す
る。
は、細胞周期制御での、RB、pll0RS、結合、および全機
能に対する標的である。RbApクローンによってコードさ
れる網膜芽腫関連タンパク質は、細胞増殖に対する正の
要素であることは可能である。Rbは、これらのクローン
のタンパク質生成物に結合し、それゆえに、それらの増
殖機能を阻害する。結果として、RbApタンパク質生成物
は、正には機能し得ないので、従って細胞周期の進行を
促進し得ない。RbApのRBに結合する能力の変質で、発ガ
ン性の影響を生じ得る。このような変質および／あるい
は変異を検出するアッセイは、過増殖性疾患を診断する
手段として、悪性および機能を測定し得る。過増殖性の
病状の例には、限定はされないが、甲状腺過形成、乾せ
ん、乳癌を含むLi-Fraumeni症候群、肉腫および他の新
生物、膀胱癌、結腸癌、肺癌、良性前立腺肥大、ならび
に種々の白血病およびリンパ腫が含まれる。本発明はま
た、癌および他の過増殖性病状の治療に使用する、この
ような変質および／あるいは変異RbApの拮抗薬を提供す
る。
【００５６】表１．RB関連タンパク質の最初の特徴付
け： 各クローンのcDNAの大きさは、ファージDNAをEcoRIによ
り消化した後に、アガロースゲルのEtBr染色により決定
した。mRNAの大きさは、マーカーに28sおよび18srRNAを
用いたRNAブロットアッセイにより測定した。各クロー
ンからの部分配列を、クローンの同一性の決定のために
GENBANKデータベースのサーチに使用した。核の局在化
を免疫染色法および細胞分画（データは示していない）
により測定した。ndは測定していないことを示す。
け： 各クローンのcDNAの大きさは、ファージDNAをEcoRIによ
り消化した後に、アガロースゲルのEtBr染色により決定
した。mRNAの大きさは、マーカーに28sおよび18srRNAを
用いたRNAブロットアッセイにより測定した。各クロー
ンからの部分配列を、クローンの同一性の決定のために
GENBANKデータベースのサーチに使用した。核の局在化
を免疫染色法および細胞分画（データは示していない）
により測定した。ndは測定していないことを示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】（実施例５：インビトロにおけるRbAp類の
RBへの結合）RBタンパク質のRbAp類との関連を確認する
ために、クローン化したcDNA挿入断片をプラスミドpFLA
G（IBI）にサブクローン化した。このプラスミドを、細
菌での融合体のフラッグセグメントに対する抗体を使用
して検出し得る、フラッグ-融合タンパク質の発現用に
当てた。結合アッセイを促進するために、p56-RBを、グ
ルタチオンS-トランスフェラーゼ（Gst）遺伝子と融合
させ、発現させて、そしてグルタチオンアガロースクロ
マトグラフィー（Gst-RB）（SmithおよびJohnson, 198
8）により精製した。RB-結合アッセイを行うために、FL
AG-Ap溶解産物を、Gst-RBあるいはGstビーズのみ（RBを
含まない）と混合した。付加された負の制御として、FL
AG-BAP（細菌アルカリホスファターゼ）を、GstおよびG
st-RBビーズとさらに混合した。広範囲にわたる洗浄
後、結合された融合タンパク質を溶出し、抗FLAGモノク
ローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより
分析した。結果は、実験した全てのRbAp類はGst-RBビー
ズには結合し得るが、対照のGstビースには結合し得な
いことを立証した（図２）。これらのクローンでは、結
合親和性には、最も弱いAp15から最も強いAp12まで様々
であった。
RBへの結合）RBタンパク質のRbAp類との関連を確認する
ために、クローン化したcDNA挿入断片をプラスミドpFLA
G（IBI）にサブクローン化した。このプラスミドを、細
菌での融合体のフラッグセグメントに対する抗体を使用
して検出し得る、フラッグ-融合タンパク質の発現用に
当てた。結合アッセイを促進するために、p56-RBを、グ
ルタチオンS-トランスフェラーゼ（Gst）遺伝子と融合
させ、発現させて、そしてグルタチオンアガロースクロ
マトグラフィー（Gst-RB）（SmithおよびJohnson, 198
8）により精製した。RB-結合アッセイを行うために、FL
AG-Ap溶解産物を、Gst-RBあるいはGstビーズのみ（RBを
含まない）と混合した。付加された負の制御として、FL
AG-BAP（細菌アルカリホスファターゼ）を、GstおよびG
st-RBビーズとさらに混合した。広範囲にわたる洗浄
後、結合された融合タンパク質を溶出し、抗FLAGモノク
ローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングにより
分析した。結果は、実験した全てのRbAp類はGst-RBビー
ズには結合し得るが、対照のGstビースには結合し得な
いことを立証した（図２）。これらのクローンでは、結
合親和性には、最も弱いAp15から最も強いAp12まで様々
であった。
【００５９】Ap12 mRNAレベルは、細胞周期中に調節さ
れる。Ap12は、スクリーニング中に、最も強い結合シグ
ナルを一貫して示したので、さらなる研究用に選択し
た。このクローンは、約1.0 kbの非翻訳領域を伴った1.
4 kbの挿入断片、および114アミノ酸のオープンリーデ
ィングフレームを有する。RNAブロット分析をおこなっ
て、mRNAの大きさおよび細胞周期の進行中の発現の様式
を決定した。正常なサルのCV1腎細胞を、10%血清を含む
新鮮培地にプレートして、ロバスタチンの存在下で36時
間培養する（細胞をG1期で停止させるために）（Jakobi
siakら，1991；Keyomarsiら，1991）か、あるいはアフ
ィジコリン（aphidicolin）（10 μg/ml）の存在下に16
時間培養（細胞をG1/S境界期で停止させるために）し、
次に、4時間放置する（細胞をS期で同調させるために）
か、あるいはナコダゾール（nacodazole）の存在下にさ
らに16時間インキュベートする（細胞をM期に進めるた
めに）（Goodrichら、1991）。各期からの全てのRNA
を、Ap12 cDNAをプローブとして用いたブロット分析の
ために調製した。2.8 kbのmRNAを、G1/S境界期およびS
期において検出したが、G1の初期あるいはM期では検出
しなかった（図３）。対照として、細胞周期中のAp9の
発現の様式は変えなかった。この観察と一致して、Ap12
mRNA発現の増加は、血清刺激後の２から６時間の間に
観察された。これらの結果は、Ap12が細胞周期の進行に
かかわり得ることを証明する。
れる。Ap12は、スクリーニング中に、最も強い結合シグ
ナルを一貫して示したので、さらなる研究用に選択し
た。このクローンは、約1.0 kbの非翻訳領域を伴った1.
4 kbの挿入断片、および114アミノ酸のオープンリーデ
ィングフレームを有する。RNAブロット分析をおこなっ
て、mRNAの大きさおよび細胞周期の進行中の発現の様式
を決定した。正常なサルのCV1腎細胞を、10%血清を含む
新鮮培地にプレートして、ロバスタチンの存在下で36時
間培養する（細胞をG1期で停止させるために）（Jakobi
siakら，1991；Keyomarsiら，1991）か、あるいはアフ
ィジコリン（aphidicolin）（10 μg/ml）の存在下に16
時間培養（細胞をG1/S境界期で停止させるために）し、
次に、4時間放置する（細胞をS期で同調させるために）
か、あるいはナコダゾール（nacodazole）の存在下にさ
らに16時間インキュベートする（細胞をM期に進めるた
めに）（Goodrichら、1991）。各期からの全てのRNA
を、Ap12 cDNAをプローブとして用いたブロット分析の
ために調製した。2.8 kbのmRNAを、G1/S境界期およびS
期において検出したが、G1の初期あるいはM期では検出
しなかった（図３）。対照として、細胞周期中のAp9の
発現の様式は変えなかった。この観察と一致して、Ap12
mRNA発現の増加は、血清刺激後の２から６時間の間に
観察された。これらの結果は、Ap12が細胞周期の進行に
かかわり得ることを証明する。
【００６０】（実施例６：Ap12の配列決定）最初のAp12
cDNAクローン（G12）は、相当するmRNAの大きさにより
短かかったことは明かである。cDNAライブラリーを再度
スクリーニングして、その中からいくつかのより長いク
ローンを単離し、A6およびB6の２つのクローンについ
て、もとのクローン（G12）とともにさらに特徴付けを
行った（図４）。2,492ヌクレオチドからの最も長いオ
ープンリーディングフレームは、476アミノ酸の推定タ
ンパク質をコードする。推定タンパク質の特有の特徴に
は、非常に酸性であるC末端の100アミノ酸、および15の
プロリン残基に占められるN末端の43アミノ酸領域が含
まれる。プロリン高含有領域の後ろに、典型的なロイシ
ン繰返し体（Landschulzら、1988; Vinsonら、1989）が
あり、塩基性アミノ酸の範囲により両端に隣接されて、
ポテンシャルDNA結合ドメインを示唆している。これら
の特徴は、真核生物の転写因子のいくつかの異なるクラ
スを示している。さらに、389ー411位のアミノ酸の範囲
（LXSXE----DED）は、RBタンパク質への結合に応答可能
なT抗原の配列に類似している（DeCaprioら、1988）。
さらに、アミノ酸159ー161（KSP）および346ー349（SPG
K）に、Cdkキナーゼに対する２つの潜在的なリン酸化部
位が存在し、これは、このタンパク質の機能を調節し得
る。
cDNAクローン（G12）は、相当するmRNAの大きさにより
短かかったことは明かである。cDNAライブラリーを再度
スクリーニングして、その中からいくつかのより長いク
ローンを単離し、A6およびB6の２つのクローンについ
て、もとのクローン（G12）とともにさらに特徴付けを
行った（図４）。2,492ヌクレオチドからの最も長いオ
ープンリーディングフレームは、476アミノ酸の推定タ
ンパク質をコードする。推定タンパク質の特有の特徴に
は、非常に酸性であるC末端の100アミノ酸、および15の
プロリン残基に占められるN末端の43アミノ酸領域が含
まれる。プロリン高含有領域の後ろに、典型的なロイシ
ン繰返し体（Landschulzら、1988; Vinsonら、1989）が
あり、塩基性アミノ酸の範囲により両端に隣接されて、
ポテンシャルDNA結合ドメインを示唆している。これら
の特徴は、真核生物の転写因子のいくつかの異なるクラ
スを示している。さらに、389ー411位のアミノ酸の範囲
（LXSXE----DED）は、RBタンパク質への結合に応答可能
なT抗原の配列に類似している（DeCaprioら、1988）。
さらに、アミノ酸159ー161（KSP）および346ー349（SPG
K）に、Cdkキナーゼに対する２つの潜在的なリン酸化部
位が存在し、これは、このタンパク質の機能を調節し得
る。
【００６１】（実施例７：Ap12は、SV40 T抗原の結合に
要求される領域に類似した領域で、RBの低リン酸化形態
にのみ結合する）Ap12のRBー結合特性を分析するため
に、もとのクローン（G12）をGst-融合タンパク質（P
3）として発現させ、グルタチオンアガロースクロマト
グラフィーにより精製した。この融合タンパク質を、Ap
12タンパク質の、Molt4細胞の細胞溶解産物から調製し
た全長のRBへの結合を試験するために使用した。このMo
lt4細胞は、RBタンパク質の高リン酸化形態および低リ
ン酸化形態の両方を発現する。この実験に、２つの付加
された制御が含められた。１つは、正の制御としてのGs
t-T抗原融合タンパク質であり、他方は、負の制御とし
てのGstのみであった。図5Aに示すように、P3タンパク
質は、低リン酸化形態にのみ結合し、結合親和性は、T
の親和性に非常に類似している。Gstのみでは、検出可
能なRBタンパク質に結合しない。RBのどのドメインがAp
12に結合するかを限定するために、細菌pET-T7発現系
（Studierら，1990）で発現させたRB変異体パネルをP3
ビーズと混合するか、あるいは平行に、GstーTビーズと
混合した。ビーズに結合された野生型あるいは変異RBタ
ンパク質の量を、モノクローナル抗RB抗体（mAb245）を
用いたウエスタンブロット分析により測定した。図5Cお
よび5Dに示すように、Tへの結合に欠ける変異RBもま
た、Ap12には結合しない。これらの結果は、Ap12および
Tの両方が、同様の領域で、RBのリン酸化されていない
形態に結合することを示し、このことは、Ap12-RB関連
が生物学的に重要であることを示している。
要求される領域に類似した領域で、RBの低リン酸化形態
にのみ結合する）Ap12のRBー結合特性を分析するため
に、もとのクローン（G12）をGst-融合タンパク質（P
3）として発現させ、グルタチオンアガロースクロマト
グラフィーにより精製した。この融合タンパク質を、Ap
12タンパク質の、Molt4細胞の細胞溶解産物から調製し
た全長のRBへの結合を試験するために使用した。このMo
lt4細胞は、RBタンパク質の高リン酸化形態および低リ
ン酸化形態の両方を発現する。この実験に、２つの付加
された制御が含められた。１つは、正の制御としてのGs
t-T抗原融合タンパク質であり、他方は、負の制御とし
てのGstのみであった。図5Aに示すように、P3タンパク
質は、低リン酸化形態にのみ結合し、結合親和性は、T
の親和性に非常に類似している。Gstのみでは、検出可
能なRBタンパク質に結合しない。RBのどのドメインがAp
12に結合するかを限定するために、細菌pET-T7発現系
（Studierら，1990）で発現させたRB変異体パネルをP3
ビーズと混合するか、あるいは平行に、GstーTビーズと
混合した。ビーズに結合された野生型あるいは変異RBタ
ンパク質の量を、モノクローナル抗RB抗体（mAb245）を
用いたウエスタンブロット分析により測定した。図5Cお
よび5Dに示すように、Tへの結合に欠ける変異RBもま
た、Ap12には結合しない。これらの結果は、Ap12および
Tの両方が、同様の領域で、RBのリン酸化されていない
形態に結合することを示し、このことは、Ap12-RB関連
が生物学的に重要であることを示している。
【００６２】（実施例８：Ap12のC末端領域は、RBへの
結合に要求される）Ap12の114アミノ酸を含有する最初
のP3融合タンパク質は、RBに結合するので、付加された
実験は、RBへの結合に要求されるAp12の領域をマップす
るために当てられた。N末端あるいはC末端の異なる欠失
のある、４つのGst-Ap12融合タンパク質を構築し、XH9
は、Ap12 cDNAの完全なコーディング配列を含み、SH5
（Sma IからHind IIIまで）は、C末端の314アミノ酸を
含む。XX4およびSX4は、それぞれ、XH9およびSH5由来で
あり、C末端で21アミノ酸を欠失している。細菌で発現
されたRBタンパク質（pETRbc）を、これらのGst-Ap12誘
導体と混合して、上記のようにウエスタンブロッティン
グにより分析した。XH9、SH5、およびP3は、同様の親和
性でRBに結合し、このことは、Ap12のN末端配列が、ほ
とんどRB結合に寄与しないことを示唆している。しか
し、XX4およびSX4は、両方ともC末端から21アミノ酸を
欠失し、そして（LXSXE---DDE）配列（DeCaprioら、198
8; Phelpsら、1992）を含むが、RBには結合しない（図
６）。これらの結果から総合して、Ap12のC末端領域がR
B結合に必要とされ、（LXSXE---DDE）配列のみでは結合
には十分でないことが示され、このことは、RB-Ap12相
互作用の様式は、RB-TあるいはRB-E1A相互作用の様式と
は異なり得ることを示唆する。
結合に要求される）Ap12の114アミノ酸を含有する最初
のP3融合タンパク質は、RBに結合するので、付加された
実験は、RBへの結合に要求されるAp12の領域をマップす
るために当てられた。N末端あるいはC末端の異なる欠失
のある、４つのGst-Ap12融合タンパク質を構築し、XH9
は、Ap12 cDNAの完全なコーディング配列を含み、SH5
（Sma IからHind IIIまで）は、C末端の314アミノ酸を
含む。XX4およびSX4は、それぞれ、XH9およびSH5由来で
あり、C末端で21アミノ酸を欠失している。細菌で発現
されたRBタンパク質（pETRbc）を、これらのGst-Ap12誘
導体と混合して、上記のようにウエスタンブロッティン
グにより分析した。XH9、SH5、およびP3は、同様の親和
性でRBに結合し、このことは、Ap12のN末端配列が、ほ
とんどRB結合に寄与しないことを示唆している。しか
し、XX4およびSX4は、両方ともC末端から21アミノ酸を
欠失し、そして（LXSXE---DDE）配列（DeCaprioら、198
8; Phelpsら、1992）を含むが、RBには結合しない（図
６）。これらの結果から総合して、Ap12のC末端領域がR
B結合に必要とされ、（LXSXE---DDE）配列のみでは結合
には十分でないことが示され、このことは、RB-Ap12相
互作用の様式は、RB-TあるいはRB-E1A相互作用の様式と
は異なり得ることを示唆する。
【００６３】（実施例９：Ap12は、E2F認識配列に特異
的に結合する）RBは転写因子E2Fと複合体を形成するこ
と（Bagchiら、1991; Bandaraら、1991;Chellappanら、
1991）、およびAp12が潜在的なDNA結合ドメインを有す
ることが示されているので、Ap12が、E2F結合部位と相
互作用し得るかどうかを決定するために実験を行った。
細菌で発現させたGst-Ap12（SH5）融合タンパク質を、
以前に記載された条件（Yeeら、1989）を用いて、２つ
のE2F認識部位を含むDNAフラグメントのDNA移動度変位
分析に使用した。図7Aに示すように、SH5は、特異的に
そのプローブと結合する。なぜなら、その複合体は、野
生型E2F同系配列を含む無標識DNAと効果的に競合する
が、たった２つのヌクレオチドによって野生型とは異な
る変異配列（Yeeら、1989）とは競合しないからであ
る。正の制御としての、HeLa細胞由来の部分精製E2Fタ
ンパク質は、予測通りにDNAプローブに特異的に結合す
る。
的に結合する）RBは転写因子E2Fと複合体を形成するこ
と（Bagchiら、1991; Bandaraら、1991;Chellappanら、
1991）、およびAp12が潜在的なDNA結合ドメインを有す
ることが示されているので、Ap12が、E2F結合部位と相
互作用し得るかどうかを決定するために実験を行った。
細菌で発現させたGst-Ap12（SH5）融合タンパク質を、
以前に記載された条件（Yeeら、1989）を用いて、２つ
のE2F認識部位を含むDNAフラグメントのDNA移動度変位
分析に使用した。図7Aに示すように、SH5は、特異的に
そのプローブと結合する。なぜなら、その複合体は、野
生型E2F同系配列を含む無標識DNAと効果的に競合する
が、たった２つのヌクレオチドによって野生型とは異な
る変異配列（Yeeら、1989）とは競合しないからであ
る。正の制御としての、HeLa細胞由来の部分精製E2Fタ
ンパク質は、予測通りにDNAプローブに特異的に結合す
る。
【００６４】RBがAp12-DNA配列特異複合体と相互作用し
得るかを決定するために、精製p 56-RBタンパク質を、D
NA移動度変位分析に含有した。実験を２つの方法で行
い、いづれかのSH5をRBと混合し、次に、E2Fプローブに
加えるか、あるいはその融合タンパク質を、まずE2Fプ
ローブに結合させ（図7B、レーン3）、その後、RBを加
えた（図7B、レーン6）。いずれの場合においても、Ap1
2-DNA複合体は、RBの添加により過変位して位置はより
遅く移動した。このことは、RBが特異Ap12-DNA複合体と
相互作用する能力を有することを示す。これらの結果
は、Ap12タンパク質が、E2Fに示される活性と同様のDNA
結合活性およびRB結合活性を有することを示している。
得るかを決定するために、精製p 56-RBタンパク質を、D
NA移動度変位分析に含有した。実験を２つの方法で行
い、いづれかのSH5をRBと混合し、次に、E2Fプローブに
加えるか、あるいはその融合タンパク質を、まずE2Fプ
ローブに結合させ（図7B、レーン3）、その後、RBを加
えた（図7B、レーン6）。いずれの場合においても、Ap1
2-DNA複合体は、RBの添加により過変位して位置はより
遅く移動した。このことは、RBが特異Ap12-DNA複合体と
相互作用する能力を有することを示す。これらの結果
は、Ap12タンパク質が、E2Fに示される活性と同様のDNA
結合活性およびRB結合活性を有することを示している。
【００６５】ロイシン繰返し体を含む領域が、DNA結合
に必要であるかどうかを決定するために、３つのGst-Ap
12融合タンパク質、P3、SH5およびXH9を、DNA移動度変
位分析用に選択した。図7Cに示すように、推定ロイシン
ジッパーおよび塩基性アミノ酸残基の範囲（bZIP）（Vi
nsonら、1989）を含むSH5およびXH9は、E2F認識配列に
結合するのに対して、Ap12（P3）のC末端領域は結合し
なかった。さらに、他のいくつかの対照、Ap9、Ap15お
よびGst単独もまた試験では陰性であった。この結果
は、推定bZIPモチーフを含む領域は、Ap12-DNA特異相互
作用に必要であることを立証する。
に必要であるかどうかを決定するために、３つのGst-Ap
12融合タンパク質、P3、SH5およびXH9を、DNA移動度変
位分析用に選択した。図7Cに示すように、推定ロイシン
ジッパーおよび塩基性アミノ酸残基の範囲（bZIP）（Vi
nsonら、1989）を含むSH5およびXH9は、E2F認識配列に
結合するのに対して、Ap12（P3）のC末端領域は結合し
なかった。さらに、他のいくつかの対照、Ap9、Ap15お
よびGst単独もまた試験では陰性であった。この結果
は、推定bZIPモチーフを含む領域は、Ap12-DNA特異相互
作用に必要であることを立証する。
【００６６】（実施例１０：Ap12のC末端は、トランス
活性化ドメインとして機能し得る）高度に酸性で、両親
媒性のαヘリックス領域は、通常は、真核生物の転写因
子の活性化ドメインとして作用する（MitchellおよびTj
ian, 1989を再参照）。Ap12のC末端領域もまた、これら
の特徴を示した。このことは、同様の様式で機能し得る
ことを示唆する。このことを試験するために、アミノ酸
22ー476あるいはC末端の114アミノ酸（362ー476）のいず
れかをコードするAp12の配列を、酵母発現ベクター上に
存在する、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインに対
応する配列（アミノ酸1ー147）（Keeganら、1986）と融
合した。このGAL4フラグメントは、特異的にその認識部
位（UASG）（Keeganら、1986）に結合し得るが、活性化
ドメインを欠いている。従って、UASGを有するプロモタ
ーから転写を命令する手段として、活性化機能を提供す
るために、キメラタンパク質は、融合セグメントをたよ
る。哺乳動物の活性化因子を含むこのような融合体のい
くつかは、p53を含めて、酵母では機能性であることが
示された（FieldsおよびJang, 1990）。図８に示すよう
に、UASG制御下での、E. coli lacZ遺伝子を有する酵母
株の形質転換の後、GAL4-Ap12両融合体は、βーガラクト
シダーゼ活性により明白になる、リポーターの転写を活
性化し得たが、それに対してGAL4-RB対照は、活性化し
得なかった。この結果は、Ap12が活性化ドメインを含む
こと、およびC末端の114アミノ酸がこの機能に対して十
分であることを示す。
活性化ドメインとして機能し得る）高度に酸性で、両親
媒性のαヘリックス領域は、通常は、真核生物の転写因
子の活性化ドメインとして作用する（MitchellおよびTj
ian, 1989を再参照）。Ap12のC末端領域もまた、これら
の特徴を示した。このことは、同様の様式で機能し得る
ことを示唆する。このことを試験するために、アミノ酸
22ー476あるいはC末端の114アミノ酸（362ー476）のいず
れかをコードするAp12の配列を、酵母発現ベクター上に
存在する、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインに対
応する配列（アミノ酸1ー147）（Keeganら、1986）と融
合した。このGAL4フラグメントは、特異的にその認識部
位（UASG）（Keeganら、1986）に結合し得るが、活性化
ドメインを欠いている。従って、UASGを有するプロモタ
ーから転写を命令する手段として、活性化機能を提供す
るために、キメラタンパク質は、融合セグメントをたよ
る。哺乳動物の活性化因子を含むこのような融合体のい
くつかは、p53を含めて、酵母では機能性であることが
示された（FieldsおよびJang, 1990）。図８に示すよう
に、UASG制御下での、E. coli lacZ遺伝子を有する酵母
株の形質転換の後、GAL4-Ap12両融合体は、βーガラクト
シダーゼ活性により明白になる、リポーターの転写を活
性化し得たが、それに対してGAL4-RB対照は、活性化し
得なかった。この結果は、Ap12が活性化ドメインを含む
こと、およびC末端の114アミノ酸がこの機能に対して十
分であることを示す。
【００６７】（実施例１１：CV1細胞でのAp12発現は、E
2F認識配列を有するプロモーターをトランス活性化す
る）Ap12がE2F結合部位依存の様式で転写を活性化し得
るかどうかを決定するために、２つのプラスミド、CMV-
Ap12-StuおよびCMV-Ap12-RHを構築して、Ap12を、サイ
トメガロウイルス（CMV）ーIEプロモーター（Neillら、1
991）（図9A）の制御下に、哺乳動物の細胞中で発現さ
せた。２つのリポータープラスミド、CATリポーター遺
伝子の上流に２つのE2F部位を有するpE2FA10CAT、およ
び、E2F部位を含まないpA10CATを（Yeeら、1989）この
アッセイに使用した。図9Bは、pA10CATではなくpE2FA10
CATをともにトランスフェクトしたときには、CMV-Ap12-
StuあるいはCMV-Ap12-RHの発現が、著しくCAT活性を高
めたことを示した。CMV-E4の発現には、リポータープラ
スミドのみによってトランスフェクトされた対照細胞に
比較しても明かな効果はない。これらのデータは、Ap12
が、E2F認識配列を有するプロモーターを活性化する、
機能性転写因子をコードすることを示唆した。
2F認識配列を有するプロモーターをトランス活性化す
る）Ap12がE2F結合部位依存の様式で転写を活性化し得
るかどうかを決定するために、２つのプラスミド、CMV-
Ap12-StuおよびCMV-Ap12-RHを構築して、Ap12を、サイ
トメガロウイルス（CMV）ーIEプロモーター（Neillら、1
991）（図9A）の制御下に、哺乳動物の細胞中で発現さ
せた。２つのリポータープラスミド、CATリポーター遺
伝子の上流に２つのE2F部位を有するpE2FA10CAT、およ
び、E2F部位を含まないpA10CATを（Yeeら、1989）この
アッセイに使用した。図9Bは、pA10CATではなくpE2FA10
CATをともにトランスフェクトしたときには、CMV-Ap12-
StuあるいはCMV-Ap12-RHの発現が、著しくCAT活性を高
めたことを示した。CMV-E4の発現には、リポータープラ
スミドのみによってトランスフェクトされた対照細胞に
比較しても明かな効果はない。これらのデータは、Ap12
が、E2F認識配列を有するプロモーターを活性化する、
機能性転写因子をコードすることを示唆した。
【００６８】（実施例１２：RB関連タンパク質をコード
する細胞遺伝子の単離）２つのcDNAライブラリーを、以
前に記載されている方法（Maniatisら、1982）により、
HeLa細胞およびSaos2細胞から単離したポリA+RNAから構
築した。二本鎖cDNAをセファロースC1-4Bクロマトグラ
フィーを使ってサイズ分画し、λgt11アームに連結し
た。インビトロでパッケージしたライブラリーの大きさ
は、HeLa細胞では2.0 x 107組換え体であり、Saos2細胞
では1.5 x 107 であり、挿入断片の平均の大きさは1.6
kbであった。そのcDNAライブラリーを100個の150mmディ
ッシュに、ディッシュあたり1ー2 x 104組換え体をプレ
ートし、42℃で、プラークがちょうど目に見える時点
（3.5時間）までインキュベートし、次に、37℃で一晩I
PTG（10 mM）で飽和したニトロセルロースフィルターに
移した。そのフィルターを変性し、6M グアニジンHCl中
で再生して、結合緩衝液（25 mMヘペス、pH 7.5、50 mM
NaCl、5 mM MgCl2、5 mM DTT、0.1% NP-40、5%ミル
ク、1 mg/ml BSA）中で、4℃で4時間、RBーサンドイッチ
プローブとインキュベートした。RBーサンドイッチは、
結合緩衝液1mlあたり、1μgの精製細菌発現p56-RB（Hua
ngら，1991）、100μlの予め吸収させたポリクローナル
抗RB抗体（抗-RB 0.47、1:100 希釈）と、1μlアルカリ
ホスファターゼ複合の二次抗体とを混合し、4℃で2時間
インキュベートして調製した。RBを含まない対照のサン
ドイッチは、RB抗体と二次抗体とを混合して調製し、ク
ローンと抗RB抗体との交差反応を抑制する対照として使
用した。結合されたフィルターを、次に、TBST（20 mM
Tris-HCl、pH 7.5、150 mMNaCl、0.05% Tween-20）中
で、各3分間で５回洗浄し、BCIP/NBP（Promega, WI）中
で発色させた。最初のスクリーニングで陽性であったク
ローンを取り出して、第二回および第三回スクリーニン
グを行った。次に、RBを含まないサンドイッチではな
く、RB-サンドイッチで一貫して陽性シグナルを示した
クローンを、それから第４回および第５回スクリーニン
グのために、低密度で対照のファージと混合してプレー
トし、続いてバックグラウンドに対して強い陽性シグナ
ルを与える均質な単離物を選抜した。
する細胞遺伝子の単離）２つのcDNAライブラリーを、以
前に記載されている方法（Maniatisら、1982）により、
HeLa細胞およびSaos2細胞から単離したポリA+RNAから構
築した。二本鎖cDNAをセファロースC1-4Bクロマトグラ
フィーを使ってサイズ分画し、λgt11アームに連結し
た。インビトロでパッケージしたライブラリーの大きさ
は、HeLa細胞では2.0 x 107組換え体であり、Saos2細胞
では1.5 x 107 であり、挿入断片の平均の大きさは1.6
kbであった。そのcDNAライブラリーを100個の150mmディ
ッシュに、ディッシュあたり1ー2 x 104組換え体をプレ
ートし、42℃で、プラークがちょうど目に見える時点
（3.5時間）までインキュベートし、次に、37℃で一晩I
PTG（10 mM）で飽和したニトロセルロースフィルターに
移した。そのフィルターを変性し、6M グアニジンHCl中
で再生して、結合緩衝液（25 mMヘペス、pH 7.5、50 mM
NaCl、5 mM MgCl2、5 mM DTT、0.1% NP-40、5%ミル
ク、1 mg/ml BSA）中で、4℃で4時間、RBーサンドイッチ
プローブとインキュベートした。RBーサンドイッチは、
結合緩衝液1mlあたり、1μgの精製細菌発現p56-RB（Hua
ngら，1991）、100μlの予め吸収させたポリクローナル
抗RB抗体（抗-RB 0.47、1:100 希釈）と、1μlアルカリ
ホスファターゼ複合の二次抗体とを混合し、4℃で2時間
インキュベートして調製した。RBを含まない対照のサン
ドイッチは、RB抗体と二次抗体とを混合して調製し、ク
ローンと抗RB抗体との交差反応を抑制する対照として使
用した。結合されたフィルターを、次に、TBST（20 mM
Tris-HCl、pH 7.5、150 mMNaCl、0.05% Tween-20）中
で、各3分間で５回洗浄し、BCIP/NBP（Promega, WI）中
で発色させた。最初のスクリーニングで陽性であったク
ローンを取り出して、第二回および第三回スクリーニン
グを行った。次に、RBを含まないサンドイッチではな
く、RB-サンドイッチで一貫して陽性シグナルを示した
クローンを、それから第４回および第５回スクリーニン
グのために、低密度で対照のファージと混合してプレー
トし、続いてバックグラウンドに対して強い陽性シグナ
ルを与える均質な単離物を選抜した。
【００６９】（実施例１３：プラスミドの構築および融
合タンパク質の発現）RbApsクローンのcDNA挿入断片
を、配列決定分析用にpGEM1にサブクローン化した。イ
ンビトロにおいて、RbAp融合タンパク質を発現させるた
めに、cDNA挿入断片をpFLAG融合タンパク質発現系（IB
I）にフレームであわせて再構築した。FLAG融合タンパ
ク質の発現を0.2 mM IPTGで誘導し、細菌溶解産物を、
凍結ー解凍、その後の溶解緩衝液B（50 mM Tris-HCl、pH
7.5、100 mM NaCl、5 mM DTT、0.2% NP-40、1 mM PMS
F、1μg/ml ロイペプチン、5 μg/mlアプロチニン（Apr
otinin）、1μg/mlアンチパイン）中での音波処理を２
回繰り返して調製し、そして遠心分離により透明にし
た。インビトロでRBタンパク質を発現させるために、RB
cDNAフラグメントのp56型を、グルタチオンS-トランス
フェラーゼ（GST）融合タンパク質pGEX-2T（Smithおよ
びJohnson, 1988）を発現するプラスミドにサブクロー
ン化し、細菌で発現されたGST-RB融合体を調製して、GS
Tアガロースビーズを用いて精製した。
合タンパク質の発現）RbApsクローンのcDNA挿入断片
を、配列決定分析用にpGEM1にサブクローン化した。イ
ンビトロにおいて、RbAp融合タンパク質を発現させるた
めに、cDNA挿入断片をpFLAG融合タンパク質発現系（IB
I）にフレームであわせて再構築した。FLAG融合タンパ
ク質の発現を0.2 mM IPTGで誘導し、細菌溶解産物を、
凍結ー解凍、その後の溶解緩衝液B（50 mM Tris-HCl、pH
7.5、100 mM NaCl、5 mM DTT、0.2% NP-40、1 mM PMS
F、1μg/ml ロイペプチン、5 μg/mlアプロチニン（Apr
otinin）、1μg/mlアンチパイン）中での音波処理を２
回繰り返して調製し、そして遠心分離により透明にし
た。インビトロでRBタンパク質を発現させるために、RB
cDNAフラグメントのp56型を、グルタチオンS-トランス
フェラーゼ（GST）融合タンパク質pGEX-2T（Smithおよ
びJohnson, 1988）を発現するプラスミドにサブクロー
ン化し、細菌で発現されたGST-RB融合体を調製して、GS
Tアガロースビーズを用いて精製した。
【００７０】（実施例１４：インビトロ結合アッセイ）
FLAG-RbApsを約0.5μg含む細菌溶解産物（100 μl）
を、1ー2μgの融合タンパク質を有する20μlのGST-RBビ
ーズあるいはGSTビーズと、400μlの溶解緩衝液B中で、
4℃で60分間混合した。結合されたビーズを、1 ml PBS/
0.2% NP-40中で連続して５回洗浄し、タンパク質複合体
をSDS負荷緩衝液中で煮沸した。結合されたFLAG融合タ
ンパク質を、次にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析し、イムノブロットを行い、抗FLAGモノクロ
ーナル抗体（IBI）で精査した。
FLAG-RbApsを約0.5μg含む細菌溶解産物（100 μl）
を、1ー2μgの融合タンパク質を有する20μlのGST-RBビ
ーズあるいはGSTビーズと、400μlの溶解緩衝液B中で、
4℃で60分間混合した。結合されたビーズを、1 ml PBS/
0.2% NP-40中で連続して５回洗浄し、タンパク質複合体
をSDS負荷緩衝液中で煮沸した。結合されたFLAG融合タ
ンパク質を、次にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析し、イムノブロットを行い、抗FLAGモノクロ
ーナル抗体（IBI）で精査した。
【００７１】（実施例１５：細菌pET-T7系で発現される
変異RBタンパク質の構築）pETRbc、pETM6およびpETM9
（Huangら、1991）に加えて、pETB2、pETSsp、およびpE
TM8を、pB2、pSsp、およびpM8（Huangら、1990）からの
AhaII-BamHIフラグメントを対応のpET発現ベクターにク
ローン化して構築した。細菌溶解産物を前章に記載のよ
うに調製した。
変異RBタンパク質の構築）pETRbc、pETM6およびpETM9
（Huangら、1991）に加えて、pETB2、pETSsp、およびpE
TM8を、pB2、pSsp、およびpM8（Huangら、1990）からの
AhaII-BamHIフラグメントを対応のpET発現ベクターにク
ローン化して構築した。細菌溶解産物を前章に記載のよ
うに調製した。
【００７２】（実施例１６：GST-RbAp12融合タンパク質
の構築）RbAp12クローン由来のDNAフラグメントを、GST
融合プラスミドにサブクローン化した。GST-P3を、もと
のC末端の1.3kbのcDNA（G12）からのEco RI-Sph Iフラ
グメントを、pGEX-2T（Smith, 1988）からの誘導体であ
るpGEPK（Chen, 未発表）にクローン化して構築した。G
ST-SH5は、クローンB6からのSmaI-HindIIIフラグメント
を含有し、GST-XH9は、クローンA6のEcoRI-HindIIIフラ
グメントを含有し、このフラグメントは、完全なコーデ
ィング配列を含んでいる。GST-SX4およびGSTーXX4は、そ
れぞれ、GST-SH5およびGST-XH9由来であるが、C末端Xho
I-HindIIIフラグメントは欠失している。
の構築）RbAp12クローン由来のDNAフラグメントを、GST
融合プラスミドにサブクローン化した。GST-P3を、もと
のC末端の1.3kbのcDNA（G12）からのEco RI-Sph Iフラ
グメントを、pGEX-2T（Smith, 1988）からの誘導体であ
るpGEPK（Chen, 未発表）にクローン化して構築した。G
ST-SH5は、クローンB6からのSmaI-HindIIIフラグメント
を含有し、GST-XH9は、クローンA6のEcoRI-HindIIIフラ
グメントを含有し、このフラグメントは、完全なコーデ
ィング配列を含んでいる。GST-SX4およびGSTーXX4は、そ
れぞれ、GST-SH5およびGST-XH9由来であるが、C末端Xho
I-HindIIIフラグメントは欠失している。
【００７３】（実施例１７：RNAブロット分析）グアニ
ジンイソチオシアネートーCsCl法（Maniatisら、1982）
により抽出した全てのRNAを、50%ホルムアミド、2.2Mホ
ルムアルデヒド、20mM ホウ酸ナトリウム（pH 8.3）中
で変性し、1.0% アガロースゲル電気泳動により分析し
た。次に、RNAをハイボンドペーパー（Amersham）に移
し、ブロットをUV交差結合により保持させた。プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、
50%ホルムアミド、5x SSPE、5x デンハルト（Denhardt'
s）、1% SDS、および100μg/mlサケ精子DNA中で実施
し、ハイブリダイゼーションは、32P標識の1.3kb RbAp1
2挿入断片DNAの存在下に45℃で18時間行った。最初の洗
浄は、2x SSC、0.1% SDS中で室温で行い、最終の洗浄
は、0.1x SSC、0.1% SDS中で、65℃において45分間行っ
た。
ジンイソチオシアネートーCsCl法（Maniatisら、1982）
により抽出した全てのRNAを、50%ホルムアミド、2.2Mホ
ルムアルデヒド、20mM ホウ酸ナトリウム（pH 8.3）中
で変性し、1.0% アガロースゲル電気泳動により分析し
た。次に、RNAをハイボンドペーパー（Amersham）に移
し、ブロットをUV交差結合により保持させた。プレハイ
ブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、
50%ホルムアミド、5x SSPE、5x デンハルト（Denhardt'
s）、1% SDS、および100μg/mlサケ精子DNA中で実施
し、ハイブリダイゼーションは、32P標識の1.3kb RbAp1
2挿入断片DNAの存在下に45℃で18時間行った。最初の洗
浄は、2x SSC、0.1% SDS中で室温で行い、最終の洗浄
は、0.1x SSC、0.1% SDS中で、65℃において45分間行っ
た。
【００７４】（実施例１８：DNAゲル移動度変位分析）
２つのE2F認識配列（TTTCGCGC---GCGCGAAA）を含有する
プラスミドからの挿入断片を、ゲル移動度変位分析用の
プローブとして使用し、また競合因子として作用させ
た。変異E2F部位（TTTAGCGC---GCGCTAAA）を有するプラ
スミド（Huangら、1992）もまた、これはE2Fには結合し
ないが、競合因子として使用した。分析は、以前に記載
（Yeeら、1989）されたように実施した。希釈したGST-A
p12細菌溶解産物（SH5およびXH9融合タンパク質に対し
て20ng、P3、Gst、GstAp9、およびGstAp15に対して200n
g）を、1x結合緩衝液（20mMヘペス、pH 7.6、1mM MgC
l2、0.1mM EGTA、40mM KCl、10%グリセロール）、0.1%
NP40、1mg/mlサケ精子DNAと、室温で、15分間インキュ
ベートし、そして32P末端標識（Klenowによって充填）
プローブを加えてさらに30分間インキュベートした。タ
ンパク質ーDNA複合体を、4℃、0.25x TBE緩衝液中の4％
アクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
２つのE2F認識配列（TTTCGCGC---GCGCGAAA）を含有する
プラスミドからの挿入断片を、ゲル移動度変位分析用の
プローブとして使用し、また競合因子として作用させ
た。変異E2F部位（TTTAGCGC---GCGCTAAA）を有するプラ
スミド（Huangら、1992）もまた、これはE2Fには結合し
ないが、競合因子として使用した。分析は、以前に記載
（Yeeら、1989）されたように実施した。希釈したGST-A
p12細菌溶解産物（SH5およびXH9融合タンパク質に対し
て20ng、P3、Gst、GstAp9、およびGstAp15に対して200n
g）を、1x結合緩衝液（20mMヘペス、pH 7.6、1mM MgC
l2、0.1mM EGTA、40mM KCl、10%グリセロール）、0.1%
NP40、1mg/mlサケ精子DNAと、室温で、15分間インキュ
ベートし、そして32P末端標識（Klenowによって充填）
プローブを加えてさらに30分間インキュベートした。タ
ンパク質ーDNA複合体を、4℃、0.25x TBE緩衝液中の4％
アクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００７５】（実施例１９：酵母の発現ベクターおよび
菌株）酵母に使用する発現ベクターは、pAS1ベクターに
基づいた。簡単には、そのプラスミドは、GAL4 DNA結合
ドメインの発現を差動するADH1プロモーターと、その後
下流にポリリンカーを含む。ベクターは、さらに、2μ
複製起点および酵母での維持および選択用のTRP1遺伝子
を有する。pAS/G12は、G12から単離したEcoRIフラグメ
ントをpAS1の単一のEcoRI部位にサブクローン化して構
築した。同様に、pAS/12B6は、p12B6からのEcoRIフラグ
メント用いて、pAS1 EcoRI部位にサブクローン化して構
築した。pASRb2は、ほかにも記載される（Durfeeら、未
発表）。
菌株）酵母に使用する発現ベクターは、pAS1ベクターに
基づいた。簡単には、そのプラスミドは、GAL4 DNA結合
ドメインの発現を差動するADH1プロモーターと、その後
下流にポリリンカーを含む。ベクターは、さらに、2μ
複製起点および酵母での維持および選択用のTRP1遺伝子
を有する。pAS/G12は、G12から単離したEcoRIフラグメ
ントをpAS1の単一のEcoRI部位にサブクローン化して構
築した。同様に、pAS/12B6は、p12B6からのEcoRIフラグ
メント用いて、pAS1 EcoRI部位にサブクローン化して構
築した。pASRb2は、ほかにも記載される（Durfeeら、未
発表）。
【００７６】使用したSaccharomyces cervisiae株は、Y
153（MATa, trp1-901,leu2-3, -112,ade2-101, ura3-5
2::URA3(GAL1-lacZ), MEL(GAL1-lacZ);(Durfeeら、未発
表）であった。
153（MATa, trp1-901,leu2-3, -112,ade2-101, ura3-5
2::URA3(GAL1-lacZ), MEL(GAL1-lacZ);(Durfeeら、未発
表）であった。
【００７７】（実施例２０：酵母の形質転換およびβー
ガラクトシダーゼアッセイ）酵母の形質転換を、以前に
記載（SchiestlおよびGietz, 1989）のLiOAc法により実
施した。形質転換後、細胞を、トリプトファンを含まな
い合成ドロップアウト培地にプレートし、プラスミドの
存在を選択した。その後、30℃で2ー3日増殖させ、各形
質転換からの単一コロニーを他の選択プレート上に線状
に移し、さらに24時間増殖させた。次に、コロニーの色
によるβーガラクトシダーゼ活性アッセイは、細胞を透
過可能にするために、ニトロセルロースフィルターを液
体窒素中に約30ー60秒浸漬したこと以外は、記載（Breed
enおよびNasmyth, 1985）通りに実施し、次に、LacZ-X-
Gal溶液（BreedenおよびNasmyth, 1985）で飽和したWha
tmanフィルター上に重層する前に、室温で解凍した。AP
12クローンの場合には、約20分以内に発色した。pAS/Rb
2クローンでは、一晩感光しても色の変化は認められな
かった。
ガラクトシダーゼアッセイ）酵母の形質転換を、以前に
記載（SchiestlおよびGietz, 1989）のLiOAc法により実
施した。形質転換後、細胞を、トリプトファンを含まな
い合成ドロップアウト培地にプレートし、プラスミドの
存在を選択した。その後、30℃で2ー3日増殖させ、各形
質転換からの単一コロニーを他の選択プレート上に線状
に移し、さらに24時間増殖させた。次に、コロニーの色
によるβーガラクトシダーゼ活性アッセイは、細胞を透
過可能にするために、ニトロセルロースフィルターを液
体窒素中に約30ー60秒浸漬したこと以外は、記載（Breed
enおよびNasmyth, 1985）通りに実施し、次に、LacZ-X-
Gal溶液（BreedenおよびNasmyth, 1985）で飽和したWha
tmanフィルター上に重層する前に、室温で解凍した。AP
12クローンの場合には、約20分以内に発色した。pAS/Rb
2クローンでは、一晩感光しても色の変化は認められな
かった。
【００７８】（実施例２１：一過性のトランスフェクシ
ョンアッセイ）トランスフェクションは、従来のリン酸
カルシウム沈降法により、CV1細胞を用いて行った。プ
ラスミドpCMVAp12Stuを、クローンA6からのStuIフラグ
メントをpCMVのSmaI部位にクローン化して構築し、そし
てプラスミドpCMVAp12RHは、クローンB6からのEcoRI-Hi
ndIIIフラグメントを含有する。プラスミドpCMVE4を対
照として使用した。CMV構築物を、プラスミドpE2FA10CA
T（２つのE2F結合部位を有する）と、pA10CAT（E2F結合
部位を含まない）とを用いて、同数（5 x 106）の細胞
を使用して共にトランスフェクトし、CAT活性を、以前
に記載（Gormanら、1982）のように48時間後に測定し
た。
ョンアッセイ）トランスフェクションは、従来のリン酸
カルシウム沈降法により、CV1細胞を用いて行った。プ
ラスミドpCMVAp12Stuを、クローンA6からのStuIフラグ
メントをpCMVのSmaI部位にクローン化して構築し、そし
てプラスミドpCMVAp12RHは、クローンB6からのEcoRI-Hi
ndIIIフラグメントを含有する。プラスミドpCMVE4を対
照として使用した。CMV構築物を、プラスミドpE2FA10CA
T（２つのE2F結合部位を有する）と、pA10CAT（E2F結合
部位を含まない）とを用いて、同数（5 x 106）の細胞
を使用して共にトランスフェクトし、CAT活性を、以前
に記載（Gormanら、1982）のように48時間後に測定し
た。
【００７９】本発明は、網膜芽腫−関連タンパク質をコ
ードする単離した核酸分子、および転写因子E2Fの生物
学的活性およびRB-結合活性を有する単離されたタンパ
ク質を、提供する。本発明はまた、網膜芽腫−関連タン
パク質をコードする単離された核酸分子を含むベクタ
ー、そのようなベクターを含む哺乳動物細胞、網膜芽腫
−関連タンパク質に対する抗体およびそのようなタンパ
ク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマラインを、提供する。本発明はさらに、そのような
抗体を診断におよび予知に用いる方法を提供する。
ードする単離した核酸分子、および転写因子E2Fの生物
学的活性およびRB-結合活性を有する単離されたタンパ
ク質を、提供する。本発明はまた、網膜芽腫−関連タン
パク質をコードする単離された核酸分子を含むベクタ
ー、そのようなベクターを含む哺乳動物細胞、網膜芽腫
−関連タンパク質に対する抗体およびそのようなタンパ
ク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマラインを、提供する。本発明はさらに、そのような
抗体を診断におよび予知に用いる方法を提供する。
【００８０】本発明はまさに好ましい実施態様を参考と
して記載しているが、種々の改変が、本発明の範囲を逸
脱することなくなされ得ることを理解されるべきであ
る。従って、本発明は、下記の特許請求の範囲によって
のみ限定される。
して記載しているが、種々の改変が、本発明の範囲を逸
脱することなくなされ得ることを理解されるべきであ
る。従って、本発明は、下記の特許請求の範囲によって
のみ限定される。
【００８１】本発明は国立衛生研究所発行の許可No. EY
05758および対WHLタバコ研究委員会許可の下に、部分
的に政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明にお
いて何らかの権利を有し得る。
05758および対WHLタバコ研究委員会許可の下に、部分
的に政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明にお
いて何らかの権利を有し得る。
【００８２】＜引用文献＞Bagchi,S.,Weinmann,R.and R
aychaudhuri,P.(1991).The retinoblastoma protein co
purifies with E2F-I,an E1A-regulated inhibitor of
the transcription factor E2F.Cell.65,1063-1072。
aychaudhuri,P.(1991).The retinoblastoma protein co
purifies with E2F-I,an E1A-regulated inhibitor of
the transcription factor E2F.Cell.65,1063-1072。
【００８３】Bandara,L.R.,Adamczewski,J.P.,Hunt,T.a
nd LaThangue,N.B.(1991).Cyciin Aand the retinoblas
toma gene product complex with a common trascripti
onfactor.Nature.352,249-251。
nd LaThangue,N.B.(1991).Cyciin Aand the retinoblas
toma gene product complex with a common trascripti
onfactor.Nature.352,249-251。
【００８４】Bookstein,R.and Lee,W.-H.(1991).Molecu
lar genetics of the retinoblastomasuppressor gene
CRC Crit.Rev.Oncogenesis.2,211-227。
lar genetics of the retinoblastomasuppressor gene
CRC Crit.Rev.Oncogenesis.2,211-227。
【００８５】Bookstein,R,Rio,P.,Madreperia,S.,Hong,
F.,Allred,C,Grizzie,W.E.and Lee,W.-H.(1990a).Promo
ter deletion and loss of retinoblastoma gene expre
ssionin human prostate carcinoma.Proc.Natl.Acad.Sc
i.U S A. 87:7762-7766。
F.,Allred,C,Grizzie,W.E.and Lee,W.-H.(1990a).Promo
ter deletion and loss of retinoblastoma gene expre
ssionin human prostate carcinoma.Proc.Natl.Acad.Sc
i.U S A. 87:7762-7766。
【００８６】Bookstein,R.,Shew,J.-Y.,Chen,P.-L.,Scu
lly,P.and Lee, W.-H(1990b).Suppression of tumorige
nicity of human prostate carcinoma cells by replac
inga mutated RB gene.Science.247,712-715。
lly,P.and Lee, W.-H(1990b).Suppression of tumorige
nicity of human prostate carcinoma cells by replac
inga mutated RB gene.Science.247,712-715。
【００８７】Breeden,L.and Nasmyth,K.(1985).Regulat
ion of the yeast HO gene.Cold Spring Harbor Symp.Q
uant.Biol.50,643-650。
ion of the yeast HO gene.Cold Spring Harbor Symp.Q
uant.Biol.50,643-650。
【００８８】Buchkovich,K.,Duffy,L.A.and Harlow,E(1
989).The retinoblastoma proteinis phosphorylated d
uring specific phases of the cell cycle.Cell.58,10
97-1105。
989).The retinoblastoma proteinis phosphorylated d
uring specific phases of the cell cycle.Cell.58,10
97-1105。
【００８９】Chellappan,S.P.,Hiebert,S.,Mudryj,M.,H
orowitz,J.M.and Nevins,J.R.(1991).The E2F transcri
ption factor is a cellular target for the RB prote
in.Cell.65,1053-1061。
orowitz,J.M.and Nevins,J.R.(1991).The E2F transcri
ption factor is a cellular target for the RB prote
in.Cell.65,1053-1061。
【００９０】Chen,P.-L.,Chen,Y.,Shan,B., Bookstein,
R,Lee, W-H.(1992).Stability of RB expression deter
mines the tumorigenicity of reconstituted retinobl
astomacells. Cell Growth Diff.3,119-125。
R,Lee, W-H.(1992).Stability of RB expression deter
mines the tumorigenicity of reconstituted retinobl
astomacells. Cell Growth Diff.3,119-125。
【００９１】Chen,P.-L.,Scully,P.,Shew,J.-Y.,Wang,
J.Y.-J.and Lee,W.-H.(1989).Phosphorylation of the
retinoblastoma gene product is modulated during th
e cell cycle and cellular differentiation.Cell.58,
1193-1198。
J.Y.-J.and Lee,W.-H.(1989).Phosphorylation of the
retinoblastoma gene product is modulated during th
e cell cycle and cellular differentiation.Cell.58,
1193-1198。
【００９２】DeCaprio,J.A.,Ludlow,J.W.,Figge,J.,She
w,J.-Y.,Huang,C.-M.,Lee,W.-H.,Marsillo,E.,Paucha,
E.and Livingston,D.M.(1988).SV40 large tumor antig
en forms a specific complex with the product of th
e retinoblastoma susceptibility gene.Cell.54,275-2
83。
w,J.-Y.,Huang,C.-M.,Lee,W.-H.,Marsillo,E.,Paucha,
E.and Livingston,D.M.(1988).SV40 large tumor antig
en forms a specific complex with the product of th
e retinoblastoma susceptibility gene.Cell.54,275-2
83。
【００９３】DeCaprio,J.A.,Ludlow,J.W.,Lynch,D.,Fur
ukawa,Y.,Griffin,J.,Pawnica-Worms,H.,Huang,C.-M.an
d Livingston,D.M.(1989). The product of the retino
blastoma susceptibility gene has properties of a c
ell cycle regulatory element. Cell.58,1085-1095。
ukawa,Y.,Griffin,J.,Pawnica-Worms,H.,Huang,C.-M.an
d Livingston,D.M.(1989). The product of the retino
blastoma susceptibility gene has properties of a c
ell cycle regulatory element. Cell.58,1085-1095。
【００９４】Defeo-Jones,D.,Huang,P.S.,Jones,R.E.,H
askell,K.M.,Vuocolo,G.A.,Hanobik,M.G.,Huber,H.E.an
d Oliff,A.(1991).Cloning of cDNAs for cellular pro
teins that bind to the retinoblastoma gene produc
t.Nature.352,251-254。
askell,K.M.,Vuocolo,G.A.,Hanobik,M.G.,Huber,H.E.an
d Oliff,A.(1991).Cloning of cDNAs for cellular pro
teins that bind to the retinoblastoma gene produc
t.Nature.352,251-254。
【００９５】Dyson,N.,Howley,P.M.,Munger,K. and Har
low,E.(1989). The human papilloma virus-16 E7 onco
protein is able to bind to the retinoblastoma gene
product.Science.243,934-937。
low,E.(1989). The human papilloma virus-16 E7 onco
protein is able to bind to the retinoblastoma gene
product.Science.243,934-937。
【００９６】Fields,S.,Jang,S.K.(1990).Presence of
a potent trascription activatingsequence in the p5
3 protein.Science.249,1046-1051。
a potent trascription activatingsequence in the p5
3 protein.Science.249,1046-1051。
【００９７】Fields,S.and Sung, O-K.(1989).A novel
genetic system to detect protein-protein interacti
ons.Nature.340,245-246。
genetic system to detect protein-protein interacti
ons.Nature.340,245-246。
【００９８】Fisher,D.Z.,Chaudhary,N.,Blobel,G.(198
6).cDNA sequencing of nuclear lamins A and C revea
ls primary and secondary structural homology to in
termediate filament proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.83,6450-6454。
6).cDNA sequencing of nuclear lamins A and C revea
ls primary and secondary structural homology to in
termediate filament proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.83,6450-6454。
【００９９】Friend,S.H.,Bernards,R,Rogeij,S.,Weinb
erg,R.A.,Rapaport,J.M.,Albert,D.M.and Dryja,T.P.(1
986).A human DNA segment with properties of the ge
ne that predisposes to retinoblastoma and osteosar
coma.Nature(London).323,643-646。
erg,R.A.,Rapaport,J.M.,Albert,D.M.and Dryja,T.P.(1
986).A human DNA segment with properties of the ge
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coma.Nature(London).323,643-646。
【０１００】Fung,Y.K.T.,Murphree,A.L.,TAng,A.,Qia
n,J.,Hinrichs,S.H.and Benedict,W.F.(1987).Structur
al evidence for the authenticity of the human reti
noblastoma gene.Scieince.236,1657-1661。
n,J.,Hinrichs,S.H.and Benedict,W.F.(1987).Structur
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【０１０１】Goodrich,D.W.,Chen,Y.,Scully,P.and Le
e,W.-H.(1992).Expression of the retinoblastoma gen
e product in bladder carcinoma cells associates wi
th alow frequency of tumor formation.Can.Res.52,19
68-1973。
e,W.-H.(1992).Expression of the retinoblastoma gen
e product in bladder carcinoma cells associates wi
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68-1973。
【０１０２】Goodrich,D.W.,Wang,N.P.,Qian,Y.-W.,Le
e,E.Y.-H.P.and Lee,W.-H.(1991).The retinoblastoma
gene product regulates progression through the G1
phaseof the cell cycle.Cell.67,293-302。
e,E.Y.-H.P.and Lee,W.-H.(1991).The retinoblastoma
gene product regulates progression through the G1
phaseof the cell cycle.Cell.67,293-302。
【０１０３】Gorman,C.M.,Moffat,L.F.,Howard,B.H.(19
82).Recombinant genomes which express chlorampheni
col acetyltransferase in mammalian cells.Mol.Cell
Biol.2,1044-1051。
82).Recombinant genomes which express chlorampheni
col acetyltransferase in mammalian cells.Mol.Cell
Biol.2,1044-1051。
【０１０４】Gullemont,F.,Billault,A.,Auffray,C.(19
89).Physical linkage of guaninenucleotide-binding
protein-related gene to the chicken major histocom
patibility complex.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86,4594-
4598。
89).Physical linkage of guaninenucleotide-binding
protein-related gene to the chicken major histocom
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4598。
【０１０５】Harbour,J.W.,Lai,S.-H.,Whang-Peng,J.,G
azdar,A.F.,Minna,J.D.and Kaye,F.J.(1988).Abnormali
ties in structure and expression of the human reti
noblastoma gene in SCLC.Science.241,353-357。
azdar,A.F.,Minna,J.D.and Kaye,F.J.(1988).Abnormali
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noblastoma gene in SCLC.Science.241,353-357。
【０１０６】Hiebert,S.W.,Lipp,M.,Nevins,J.R.(198
9).E1A-dependent trans-activationofthe human MYC p
romoter is mediated by the E2F factor.Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.86,3594-3598。
9).E1A-dependent trans-activationofthe human MYC p
romoter is mediated by the E2F factor.Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA.86,3594-3598。
【０１０７】Horowitz,J.M.,Yandell,D.W.,Park,S.H.,C
anning,S.,Whyte,P.,Buchkovich,K.,Harlow,E,Weinber
g,R.and Dryja,T.(1989).Point mutational inactivati
on ofthe retinoblastoma antioncogene.Science.243,9
37-940。
anning,S.,Whyte,P.,Buchkovich,K.,Harlow,E,Weinber
g,R.and Dryja,T.(1989).Point mutational inactivati
on ofthe retinoblastoma antioncogene.Science.243,9
37-940。
【０１０８】Hu,Q.,Dyson,N.and Harlow,E.(1990).The
regions of the retinoblastoma protein needed for b
inding to adenovirus E1A or SV40 T antigen are com
monsites for mutations.EMBO J.9,1147-1155。
regions of the retinoblastoma protein needed for b
inding to adenovirus E1A or SV40 T antigen are com
monsites for mutations.EMBO J.9,1147-1155。
【０１０９】Huang,H.-J.S.,Yee,J.-K.,Shew,J.-Y.,Che
n,P.-L.,Bookstein,R,Friedmann,T.,Lee,E.Y.-H.P.and
Lee,W.-H(1988).Suppression of the neoplastic pheno
typeby replacement of the retinoblastoma gene prod
uct in human cancer cells.Science.242,1563-1566。
n,P.-L.,Bookstein,R,Friedmann,T.,Lee,E.Y.-H.P.and
Lee,W.-H(1988).Suppression of the neoplastic pheno
typeby replacement of the retinoblastoma gene prod
uct in human cancer cells.Science.242,1563-1566。
【０１１０】Huang,S.,Shin,E.,Sheppard,K-A.,Chokrov
erty,L.,Shan,B.,Qian,Y-W.,Lee,E.Y-HP.,Yee,AS.(199
2).The retinoblastoma protein region required for
interaction with the E2F trascription factor inclu
des the T/E1A binding and C-terminal sequences.DNA
and Cell Biology.in press。
erty,L.,Shan,B.,Qian,Y-W.,Lee,E.Y-HP.,Yee,AS.(199
2).The retinoblastoma protein region required for
interaction with the E2F trascription factor inclu
des the T/E1A binding and C-terminal sequences.DNA
and Cell Biology.in press。
【０１１１】Huang,S.,Lee,W.-H.and Lee,E.Y.-H.P.(19
91).Identification of a cellularprotein that compe
tes with SV40 T antigen for binding to the retinob
lastoma gene product.Nature.160-162。
91).Identification of a cellularprotein that compe
tes with SV40 T antigen for binding to the retinob
lastoma gene product.Nature.160-162。
【０１１２】Huang,S.,Wang,N.-P.,Tseng,B.Y.,Lee,W.-
H.and Lee,E.Y.-H.P.(1990).Two distinct and frequen
tly mutated regions of retinoblastoma protein are
required for binding to SV40 T antigen.EMBO J.9,18
15-1822。
H.and Lee,E.Y.-H.P.(1990).Two distinct and frequen
tly mutated regions of retinoblastoma protein are
required for binding to SV40 T antigen.EMBO J.9,18
15-1822。
【０１１３】Jakobisiak,M.,Bruno,S.,Skierski,J.S.an
d Darzynkiewicz,Z.(1991).Cell cycle-specific effec
ts of lovastatin.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.88,3628-363
2。
d Darzynkiewicz,Z.(1991).Cell cycle-specific effec
ts of lovastatin.Proc.Nat.Acad.Sci.USA.88,3628-363
2。
【０１１４】Jantzen,H.-M.,Admon,A.,Bell,S.P.,Tjia
n,R.(1990).Nucleolar transcription factor hUBF con
tains a DNA-binding motif with homology to HMG pro
teins.Nature.344,830-836。
n,R.(1990).Nucleolar transcription factor hUBF con
tains a DNA-binding motif with homology to HMG pro
teins.Nature.344,830-836。
【０１１５】Kaelin,W.G.J.,Pallas,D.C.,DeCaprio,J.
A.,Kaye,F.J.and Livingston,D.M.(1991).Identificati
on of cellular proteins that can interact specific
allywith the T/E1A-binding region of the retinobla
stoma gene product.Cell.64,521-532。
A.,Kaye,F.J.and Livingston,D.M.(1991).Identificati
on of cellular proteins that can interact specific
allywith the T/E1A-binding region of the retinobla
stoma gene product.Cell.64,521-532。
【０１１６】Keegan,L.,Gill,G.and Ptashne,M.(1986).
Separation of DNA binding from thetrascription-act
ivating function of a eukaryotic regulatory protei
n.Science.231,699-704。
Separation of DNA binding from thetrascription-act
ivating function of a eukaryotic regulatory protei
n.Science.231,699-704。
【０１１７】Keyomarsi,K,Sandoval,L.,Band,V.and Par
dee,A.B.(1991).Synchronization of tumor and normal
cells from G1 to multiple cell cycles by lovastat
in.Can.Res.51,3602-3609。
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【０１１８】Landschulz,W.H.,Johnson,P.F.,McKnight,
S.L.(1988).The leucine zipper:ahypothetical struct
ure common to a new class of DNA binding proteins.
Science 240,1759-1764。
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【０１１９】Lau,L.F.,Nathans,D.(1991).Genes induce
d by serum growth factors.The Hormonal control reg
ulation of gene transcription ed.P.Cohen & J.G.Fou
lkes.Elsevier Science Publishers.pp257-293。
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【０１２０】Lee,E.Y.-H.P.,To,H,Shew,J.-Y.,Bookstei
n,R,Scully,P.and Lee,W.-H.(1988).Inactivation of t
he retinoblastoma susceptibility gene in human bre
astcancers.Science.241,218-221。
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【０１２１】Lee,W.-H.,Hollingsworth,R.E.,Qian,Y-
W.,Chen,P-L.,Hong,F.,Lee,EY-HP.(1991).The RB Prote
in as a Cellular 'Corral' for Growth-Promoting Pro
teins.Cold Spring Harbor Symp.Quanti.Biol.:Cell Cy
cle.61,211-217。
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in as a Cellular 'Corral' for Growth-Promoting Pro
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cle.61,211-217。
【０１２２】Lee,W.-H.,Bookstein,R,Hong,F.,Young,L.
-J.,Shew,J.-Y.and Lee,E.Y.-H.P.(1987a).Human retin
oblastoma susceptibility gene: cloning,identificat
ion,and sequence Science.235,1394-1399。
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【０１２３】Lee,W.-H.,Shew,J.-Y.,Hong,F.,Sery,T.,D
onoso,L.A.,Young,L.J.,Bookstein,R.and Lee,E.Y.-H.
P.(1987b).The retinoblastoma susceptibility gene p
roduct is a nuclear phosphoprotein associated with
DNA binding activity.Nature.329,642-645。
onoso,L.A.,Young,L.J.,Bookstein,R.and Lee,E.Y.-H.
P.(1987b).The retinoblastoma susceptibility gene p
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【０１２４】Lees,J.A.,Buchkovich,K.J.,Marshak,D.
R.,Anderson,C.W.and Harlow,E.(1991).The retinoblas
toma protein is phosphorylated on multiple sites b
y human cdc2.EMBO J.10,4279-4290。
R.,Anderson,C.W.and Harlow,E.(1991).The retinoblas
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【０１２５】Lin,B.T.,Gruenwald,S.,Moria,A.O.,Lee,
W.-H.and wang,J.Y.(1991).Retinoblastoma cancer sup
pressor gene product is a substrate of the cell cy
cle regulator cdc2 kinase.EMBO J.10,857-864。
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【０１２６】McKeon,F.,Kirschner,M.,Caput,D.(1986).
Homologies in both primary and secondary structure
between nuclear envelope and intermediate filamen
t proteins.Nature.319,463-468。
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【０１２７】Mitchell,P.J.and Tjian,R.(1989).Transc
riptional regulation in mammalian cells by sequenc
e-specific DNA binding proteins.Science.245,371-37
8。
riptional regulation in mammalian cells by sequenc
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【０１２８】Mudryj,M.,Hiebert,,S.W.,Nevins,J.R.(19
90).A role for the adenovirus inducible E2F transc
ription factor in a proliferation dependent signal
transduction pathway.EMBO J.9,2179-2184。
90).A role for the adenovirus inducible E2F transc
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【０１２９】Mudryj,M.,Devoto,S.H.,Hiebert,S.W.,Hun
ter,T.,Pines,J.,Nevins,J.R.(1991).Cell cycle regul
ation of the E2F transcription factor involves an
interaction with cyclin A.Cell.28,1243-1253。
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interaction with cyclin A.Cell.28,1243-1253。
【０１３０】Neill,S.D.,Nevins,J.R.(1991).Genetic a
nalysis of the adenovirus E4 6/7trans activator in
teraction with E2F and induction of a stable DNA-p
rotein complex are critical for activity.J.Virol.6
5,5364-5373。
nalysis of the adenovirus E4 6/7trans activator in
teraction with E2F and induction of a stable DNA-p
rotein complex are critical for activity.J.Virol.6
5,5364-5373。
【０１３１】Phelps,W.C.,Munger,K.,Yee,C.L.,Barnes,
J.A.,Howley,P.M.(1992).Structure-function analysis
of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotei
n.J.Virol.66,2418-2427。
J.A.,Howley,P.M.(1992).Structure-function analysis
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【０１３２】Rustgi,A.K.,Dyson,N.and Bernards,R.(19
91).Amino-terminal domains of c-myc and N-myc prot
eins mediate binding to the retinoblastoma gene pr
oduct.Nature.352,541-544。
91).Amino-terminal domains of c-myc and N-myc prot
eins mediate binding to the retinoblastoma gene pr
oduct.Nature.352,541-544。
【０１３３】Sadowski,L,Ma,J.,Triezenberg,S.,Ptashn
e,M.(1988).GAL4-VP16 is an unusually potent transc
riptional activator.Nature.335,563-564。
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【０１３４】Schiestl,R.H.and Gietz,R.D.(1989).High
efficiency transformation of intact yeast cells u
sing single stranded nucleic acids as a carrier.Cu
rr.Genet 16,339-346。
efficiency transformation of intact yeast cells u
sing single stranded nucleic acids as a carrier.Cu
rr.Genet 16,339-346。
【０１３５】Shenoy,S.,Choi,J.-K,Bagrodia,S.,Copela
nd,T.D.,Maller,J.L.and Shalloway,D.(1989).Purified
maturation promoting factor phosphorylates pp60c-
srcatthe sites phosphorylated during fibroblast mi
tosis.Cell.57,763-774。
nd,T.D.,Maller,J.L.and Shalloway,D.(1989).Purified
maturation promoting factor phosphorylates pp60c-
srcatthe sites phosphorylated during fibroblast mi
tosis.Cell.57,763-774。
【０１３６】Shew,J.-Y.,Lin,B.,Chen,P.-L.,Tseng,B.
Y.,Yang-Feng,T.L.and Lee,W.-H.(1990).C-terminal tr
uncation of the RB protein leads to functional ina
ctivation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,6-10。
Y.,Yang-Feng,T.L.and Lee,W.-H.(1990).C-terminal tr
uncation of the RB protein leads to functional ina
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【０１３７】Shirodkar,S.,Ewen,M,Decaprio,J.A.,Morg
an,J.,Livingston,D.M.,Chittenden,T.(1992).The tran
scription factor E2F interacts with the retinoblas
tomaproduct and a p107-cyclin A complex in a cell
cycle-regulated manner.Cell.68,157-166。
an,J.,Livingston,D.M.,Chittenden,T.(1992).The tran
scription factor E2F interacts with the retinoblas
tomaproduct and a p107-cyclin A complex in a cell
cycle-regulated manner.Cell.68,157-166。
【０１３８】Smith,D.B.,Johnson,K.S.(1988).Single-s
tep purification of polypeptidesexpressed in E. co
li as fusions with glutathione S-transferase.Gene.
67,31-40。
tep purification of polypeptidesexpressed in E. co
li as fusions with glutathione S-transferase.Gene.
67,31-40。
【０１３９】Studier,F.W.,Rosenberg,A.H.,Dunn,J.J.,
Dubendorff,J.W.(1990).Use of T7RNA polymerase to d
irect expression of cloned genes.Methods in Enzymo
logy.185,60-89。
Dubendorff,J.W.(1990).Use of T7RNA polymerase to d
irect expression of cloned genes.Methods in Enzymo
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【０１４０】Sumegi,J.,Uzvolgyi,E.and Klein,G.(199
0).Expression of the RB gene under the control of
MuLV-LTR suppresses tumorigenicity of WERI-Rb-27 r
etinoblastoma cells in immunodefective mice.Cell G
rowth Differ.1,247-250。
0).Expression of the RB gene under the control of
MuLV-LTR suppresses tumorigenicity of WERI-Rb-27 r
etinoblastoma cells in immunodefective mice.Cell G
rowth Differ.1,247-250。
【０１４１】Takahashi,R.,Hashimoto,T.,Hong-Ji,X.,H
u,S.-X.,Matsui,T.,Miki,T.,Bigo-Marshall,H.,Aaronso
n,S.A.and Benedict,W.F.(1991).The retinoblastoma g
enefunctions as a growth and tumor suppressor in h
uman bladder carcinoma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.88,5257-5261。
u,S.-X.,Matsui,T.,Miki,T.,Bigo-Marshall,H.,Aaronso
n,S.A.and Benedict,W.F.(1991).The retinoblastoma g
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uman bladder carcinoma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.US
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【０１４２】Toguchida,J.,Ishizaki,K.,Sasaki,M.S.,I
kenaga,M.,Sugimoto,M.,Kotoura,Y.and Yamamuro,T.(19
88).Chromosomal-reorganization for the expression
of recessive mutation of retinoblastoma susceptibi
lity gene in the developmentof osteosarcoma.Cancer
Res.48,3939-3943。
kenaga,M.,Sugimoto,M.,Kotoura,Y.and Yamamuro,T.(19
88).Chromosomal-reorganization for the expression
of recessive mutation of retinoblastoma susceptibi
lity gene in the developmentof osteosarcoma.Cancer
Res.48,3939-3943。
【０１４３】Vinson,C.R.,Sigler,P.B.,McKnight,S.L.
(1989).Scissors-Grip Model for DNA recognition by
a family of leucine zipper proteins.Science.246,91
1-916。
(1989).Scissors-Grip Model for DNA recognition by
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【０１４４】Wang,N.-P.,Chen,P.-L,Huang,S.,Donoso,
L.A.,Lee,W.-H.and Lee,E.Y.-H.P.(1990a).DNA-binding
activity of retinoblastoma protein is intrinsic t
o itscarboxyl-terminal region.Cell Growth Diff.1,2
33-239。
L.A.,Lee,W.-H.and Lee,E.Y.-H.P.(1990a).DNA-binding
activity of retinoblastoma protein is intrinsic t
o itscarboxyl-terminal region.Cell Growth Diff.1,2
33-239。
【０１４５】Wang,N.P.,Qian,Y.,Chung,A.E.,Lee,W.-H.
and Lee,E.Y.-H.P.(1990b).Expression of the human r
etinoblastoma gene product pp110RB in insect cells
usingthe baculovirus system.Cell Growth Diff.1,42
9-437。
and Lee,E.Y.-H.P.(1990b).Expression of the human r
etinoblastoma gene product pp110RB in insect cells
usingthe baculovirus system.Cell Growth Diff.1,42
9-437。
【０１４６】Whyte,P.,Buchkovich,K.J.,Horowitz,J.
M.,Friend,S.H.,Raybuck,M.,Weinberg,R.A.and Harlow,
E.(1988).Association between an oncogene and an an
ti-oncogene:the adenovirus E1A proteins bind to th
e retinoblastoma gene product.Nature.334,124-129。
M.,Friend,S.H.,Raybuck,M.,Weinberg,R.A.and Harlow,
E.(1988).Association between an oncogene and an an
ti-oncogene:the adenovirus E1A proteins bind to th
e retinoblastoma gene product.Nature.334,124-129。
【０１４７】Yee,A.S.,Raychaudhuri,P.,Jakoi,L,Nevin
s,J.R.(1989).The adenovirus-inducible factor E2F s
timulates transcription after specific DNA bindin
g.Mol.Cell Biol.9,578-585。
s,J.R.(1989).The adenovirus-inducible factor E2F s
timulates transcription after specific DNA bindin
g.Mol.Cell Biol.9,578-585。
【０１４８】Yokota,J.,Akiyama,T.,Fung,Y.-K.T.,Bene
dict,W.F.,Namba,Y.,Hanaoka,M.,Wada,M.,Terasaki,T.,
Shimosato,Y.,Sugimura,T.and Terada,M.(1988).Altere
d expression of the retinoblastoma (RB) gene in sm
all-cell carcinoma of thelung.Oncogene.3,471-475。
dict,W.F.,Namba,Y.,Hanaoka,M.,Wada,M.,Terasaki,T.,
Shimosato,Y.,Sugimura,T.and Terada,M.(1988).Altere
d expression of the retinoblastoma (RB) gene in sm
all-cell carcinoma of thelung.Oncogene.3,471-475。
【図１】図１は、RB-サンドイッチスクリーニングの結
果を示す。λgt11 cDNA発現ライブラリーをプレートし
て、精製したp56-RB、抗RB抗体、およびアルカリホスフ
ァターゼを抱合した第二の抗体を含むRB-サンドイッチ
を用いてスクリーニングした。AおよびBは、RB-サンド
イッチスクリーニングの図解である。CおよびDは、RB-
サンドイッチ(フィルターの左半分)を伴うハイブリッド
化したフィルターであり、そこにおいて正の記号はRbAp
-RB複合体(C)またはT-抗原-RB複合体(D)を示す。フィル
ターの右半分はRB-マイナスサンドイッチをプローブと
した。
果を示す。λgt11 cDNA発現ライブラリーをプレートし
て、精製したp56-RB、抗RB抗体、およびアルカリホスフ
ァターゼを抱合した第二の抗体を含むRB-サンドイッチ
を用いてスクリーニングした。AおよびBは、RB-サンド
イッチスクリーニングの図解である。CおよびDは、RB-
サンドイッチ(フィルターの左半分)を伴うハイブリッド
化したフィルターであり、そこにおいて正の記号はRbAp
-RB複合体(C)またはT-抗原-RB複合体(D)を示す。フィル
ターの右半分はRB-マイナスサンドイッチをプローブと
した。
【図２】図２は、in vitro でのRbApのRBとの結合を示
す。それぞれのクローン(Ap4,6,9,10,11,12,15)によるc
DNA挿入物をpFLAGプラスミド中にサブクローンし、FLAG
-Ap融合タンパク質の溶解物をGST-RBビーズ(R)またはGS
Tビーズ単独(C)と混合した。次に結合タンパク質を抗−
FLAGモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットにより分
析した。矢印は、抗−FLAG抗体により検出された、GST-
RBビーズに結合したFLAG-Apsを示す。BAP=FLAG細菌性ア
ルカリホスファターゼ融合タンパク質。
す。それぞれのクローン(Ap4,6,9,10,11,12,15)によるc
DNA挿入物をpFLAGプラスミド中にサブクローンし、FLAG
-Ap融合タンパク質の溶解物をGST-RBビーズ(R)またはGS
Tビーズ単独(C)と混合した。次に結合タンパク質を抗−
FLAGモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットにより分
析した。矢印は、抗−FLAG抗体により検出された、GST-
RBビーズに結合したFLAG-Apsを示す。BAP=FLAG細菌性ア
ルカリホスファターゼ融合タンパク質。
【図３】図３は、Ap12の細胞周期依存性発現を示す。CV
1細胞から得た、細胞周期の種々の段階に同調させた全R
NAを変性し、ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分析
した。RNAブロットを32p-標識 Ap12 cDNA挿入物(G12)と
ハイブリッド化した。レーン1はG1初期；レーン2はG1/S
境界；レーン3はS期(アフィジコリン放出4時間後)；レ
ーン4はS期(飢餓細胞再プレート18時間後)；レーン5はM
期である。mRNA(矢印で示す)の大きさは、RNA試料に隣
合う平行レーンを走るrRNA 28Sおよび18Sの移動により
測定した。
1細胞から得た、細胞周期の種々の段階に同調させた全R
NAを変性し、ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分析
した。RNAブロットを32p-標識 Ap12 cDNA挿入物(G12)と
ハイブリッド化した。レーン1はG1初期；レーン2はG1/S
境界；レーン3はS期(アフィジコリン放出4時間後)；レ
ーン4はS期(飢餓細胞再プレート18時間後)；レーン5はM
期である。mRNA(矢印で示す)の大きさは、RNA試料に隣
合う平行レーンを走るrRNA 28Sおよび18Sの移動により
測定した。
【図４】図４は、Ap12の制限マップおよび核酸およびア
ミノ酸配列を示す。クローンA6, 2,492ヌクレオチドの
完全な配列が得られた。A: 最長オープンリーデイングフ
レームを有するAp12(A6)の制限マップ。G12はRB-サンド
イッチスクリーニングで得られた最初のAp12クローンで
ある。A6およびB6をcDNAライブラリーの再スクリーニン
グにより単離した。Ap12誘導体の構築において使用した
制限部位のみを示す。B: Ap12の配列および予測された
アミノ酸配列。四角はロイシンの反復を示す。2つの推
定されたCdkリン酸化部位をアンダーラインで示す。
ミノ酸配列を示す。クローンA6, 2,492ヌクレオチドの
完全な配列が得られた。A: 最長オープンリーデイングフ
レームを有するAp12(A6)の制限マップ。G12はRB-サンド
イッチスクリーニングで得られた最初のAp12クローンで
ある。A6およびB6をcDNAライブラリーの再スクリーニン
グにより単離した。Ap12誘導体の構築において使用した
制限部位のみを示す。B: Ap12の配列および予測された
アミノ酸配列。四角はロイシンの反復を示す。2つの推
定されたCdkリン酸化部位をアンダーラインで示す。
【図５】図５は、Ap12がRBの低リン酸化型とT類似部位
で特異的に結合することを示す。A、レーン1：モノクロ
ーナル抗-RB抗体、mAb11D7を用いたMolt4溶解物免疫沈
降物。レーン2：分子マーカー。レーン3-5：Molt4細胞
溶解物(5×106cells)を、GSTビーズ(レーン3)、GST-Ap1
2(レーン4)およびGST-T(レーン5)ビーズと混合した。洗
浄後、GST融合物に結合したRBをモノクローナル抗-RB抗
体、mAb11D7を用いる免疫ブロツテイングにより分析し
た。B： 細菌性pET-T7発現系で発現したRB変異タンパク
質のパネル。T-結合ドメインを強調する。C-D：細菌性
に発現した野生型(pETRbc)または変異RBタンパク質(pET
B2,Ssp,Xs,M8,M6,M9,Nm)を、GST-Ap12(C)またはGST-T
(D)ビーズと混合し、そして結合タンパク質をモノクロ
ーナル抗-RB抗体、mAb245を用いるウェスタンブロット
分析により測定した。
で特異的に結合することを示す。A、レーン1：モノクロ
ーナル抗-RB抗体、mAb11D7を用いたMolt4溶解物免疫沈
降物。レーン2：分子マーカー。レーン3-5：Molt4細胞
溶解物(5×106cells)を、GSTビーズ(レーン3)、GST-Ap1
2(レーン4)およびGST-T(レーン5)ビーズと混合した。洗
浄後、GST融合物に結合したRBをモノクローナル抗-RB抗
体、mAb11D7を用いる免疫ブロツテイングにより分析し
た。B： 細菌性pET-T7発現系で発現したRB変異タンパク
質のパネル。T-結合ドメインを強調する。C-D：細菌性
に発現した野生型(pETRbc)または変異RBタンパク質(pET
B2,Ssp,Xs,M8,M6,M9,Nm)を、GST-Ap12(C)またはGST-T
(D)ビーズと混合し、そして結合タンパク質をモノクロ
ーナル抗-RB抗体、mAb245を用いるウェスタンブロット
分析により測定した。
【図６】図６は、RB-結合にAp12のC-末端領域が必要で
あることを示す。一連のGST-Ap12誘導体、P3、SH5、XH
9、SX4、およびXX4、を構築し(パネルBに示す)、そして
RB結合に使用した。細菌性に発現したpETRbc(野生型RB)
をGST-Ap12ビーズと混合して、モノクローナル抗-RB抗
体、mAb245を用いるウェスタンブロットにより分析し
た。P3に対する領域をコードするポリペプチドはアミノ
酸362-476；SH5に対してはアミノ酸162-476；XH9に対し
てはアミノ酸1-476；SX4に対してはアミノ酸162-455；X
X4に対してはアミノ酸1-455である。矢印はp110-RBの位
置を示す。
あることを示す。一連のGST-Ap12誘導体、P3、SH5、XH
9、SX4、およびXX4、を構築し(パネルBに示す)、そして
RB結合に使用した。細菌性に発現したpETRbc(野生型RB)
をGST-Ap12ビーズと混合して、モノクローナル抗-RB抗
体、mAb245を用いるウェスタンブロットにより分析し
た。P3に対する領域をコードするポリペプチドはアミノ
酸362-476；SH5に対してはアミノ酸162-476；XH9に対し
てはアミノ酸1-476；SX4に対してはアミノ酸162-455；X
X4に対してはアミノ酸1-455である。矢印はp110-RBの位
置を示す。
【図７】図７は、Ap12がE2F認識配列に特異的に結合す
ることを示す。細菌性に発現したGST-Ap12の誘導体(p3,
SH5,XH9)から調製した溶解物、およびGST-Ap9、GST-Ap1
5、および単独のGSTをDNA移動度シフトアッセイに用い
た。プローブはKlenowの補欠反応により32P-末端-標識
した、2つのE2F認識部位を含むDNAフラグメントで（材
料と方法を参照）あった。A：GST-Ap12SH5はE2F-特異性
配列に結合する。陽性対照として、HeLa細胞から得られ
る部分的に精製したE2Fタンパク質も同様に用いた。野
生型E2F部位または変異型E2F部位のいずれかを含むDNA
フラグメントを競合物として用いた（材料と方法を参
照）。レーン1：プローブ単独；レーン2：E2F + プロー
ブ；レーン3：E2F + プローブ + wt競合物；レーン4：E
2F + プローブ +変異株競合物；レーン5：SH5 +プロー
ブ；レーン6：SH5 +プローブ+ wt競合物；レーン7：SH5
+プローブ+変異株競合物。B：RBはAp12-E2F DNA複合体
と相互作用する。レーン1：プローブ単独；レーン2：SH
5 +プローブ；レーン3：SH5 + p56-RB(0.25μg)、15分
間インキュベートした後、プローブを添加した；レーン
4：p56-RB +プローブ；レーン5：SH5 +プローブ；レー
ン6：SH5 +プローブで15分間、次にp56-RBを添加した。
C：Ap12のDNA結合ドメインは潜在するbZIPモチーフを含
む領域に位置する。レーン1：P3,200ng；レーン2：P3,4
00ng；レーン3：SH5,20ng；レーン4：SH5,40ng；レーン
5：XH9,20ng；レーン6：XH9,40ng；レーン7：GST単独,2
00ng；レーン8：GST-Ap9,200ng；レーン9：GST-Ap15,20
0ng。
ることを示す。細菌性に発現したGST-Ap12の誘導体(p3,
SH5,XH9)から調製した溶解物、およびGST-Ap9、GST-Ap1
5、および単独のGSTをDNA移動度シフトアッセイに用い
た。プローブはKlenowの補欠反応により32P-末端-標識
した、2つのE2F認識部位を含むDNAフラグメントで（材
料と方法を参照）あった。A：GST-Ap12SH5はE2F-特異性
配列に結合する。陽性対照として、HeLa細胞から得られ
る部分的に精製したE2Fタンパク質も同様に用いた。野
生型E2F部位または変異型E2F部位のいずれかを含むDNA
フラグメントを競合物として用いた（材料と方法を参
照）。レーン1：プローブ単独；レーン2：E2F + プロー
ブ；レーン3：E2F + プローブ + wt競合物；レーン4：E
2F + プローブ +変異株競合物；レーン5：SH5 +プロー
ブ；レーン6：SH5 +プローブ+ wt競合物；レーン7：SH5
+プローブ+変異株競合物。B：RBはAp12-E2F DNA複合体
と相互作用する。レーン1：プローブ単独；レーン2：SH
5 +プローブ；レーン3：SH5 + p56-RB(0.25μg)、15分
間インキュベートした後、プローブを添加した；レーン
4：p56-RB +プローブ；レーン5：SH5 +プローブ；レー
ン6：SH5 +プローブで15分間、次にp56-RBを添加した。
C：Ap12のDNA結合ドメインは潜在するbZIPモチーフを含
む領域に位置する。レーン1：P3,200ng；レーン2：P3,4
00ng；レーン3：SH5,20ng；レーン4：SH5,40ng；レーン
5：XH9,20ng；レーン6：XH9,40ng；レーン7：GST単独,2
00ng；レーン8：GST-Ap9,200ng；レーン9：GST-Ap15,20
0ng。
【図８】図８は、Ap12のC-末端が、酵母中のGAL4 DNA結
合ドメインと融合させたときに活性化ドメインとして役
立つことを示す。GAL4(アミノ酸 1-147)およびG12(AP1
2、アミノ酸 362-476)、12B6(AP12、アミノ酸 22-47
6)、またはRb2(RB、アミノ酸301-928)のいずれかの融合
タンパク質を、材料および方法の中に詳細に記載したよ
うにして酵母中で発現した。プラスミドを用いて、Y153
をトリプトファン要求株に形質転換し、それぞれの形質
転換体の単一コロニーをトリプトファン欠乏ドロップア
ウト培地上に筋状に植え付けた。30℃で1日間培養した
後、コロニーリフトアッセイを用いて細胞のβ-ガラク
トシダーゼ活性を分析した。
合ドメインと融合させたときに活性化ドメインとして役
立つことを示す。GAL4(アミノ酸 1-147)およびG12(AP1
2、アミノ酸 362-476)、12B6(AP12、アミノ酸 22-47
6)、またはRb2(RB、アミノ酸301-928)のいずれかの融合
タンパク質を、材料および方法の中に詳細に記載したよ
うにして酵母中で発現した。プラスミドを用いて、Y153
をトリプトファン要求株に形質転換し、それぞれの形質
転換体の単一コロニーをトリプトファン欠乏ドロップア
ウト培地上に筋状に植え付けた。30℃で1日間培養した
後、コロニーリフトアッセイを用いて細胞のβ-ガラク
トシダーゼ活性を分析した。
【図９】図９は、Ap12がE2F認識部位を伴うプロモータ
ーをトランス作用活性化することを示す。A：Ap12 cDNA
発現ベクターの図解。PA、ポリ(A)。B：E2F認識配列を
伴うプロモーターの転写活性化。pA10CATまたはpE2FA10
CATのいずれかの10μgを、CMV-Ap12-StuまたはCMV-Ap12
-RHの10μgとともにサル腎臓CV1細胞中に共トランスフ
ェクションした。48時間後、細胞を取り出してCAT活性
を測定した。CMV-E4をリポータープラスミドと共トラン
スフェクションして、リポータープラスミド単独の場合
と同様に対照として用いた。
ーをトランス作用活性化することを示す。A：Ap12 cDNA
発現ベクターの図解。PA、ポリ(A)。B：E2F認識配列を
伴うプロモーターの転写活性化。pA10CATまたはpE2FA10
CATのいずれかの10μgを、CMV-Ap12-StuまたはCMV-Ap12
-RHの10μgとともにサル腎臓CV1細胞中に共トランスフ
ェクションした。48時間後、細胞を取り出してCAT活性
を測定した。CMV-E4をリポータープラスミドと共トラン
スフェクションして、リポータープラスミド単独の場合
と同様に対照として用いた。
【図１０】図１０は、クローンAp2の核酸配列の一部を
示す。p=5’配列；r=3’配列。
示す。p=5’配列；r=3’配列。
【図１１】図１１は、クローンAp8の核酸配列の一部を
示す。p=5’配列；r=3’配列。
示す。p=5’配列；r=3’配列。
【図１２】図１２は、クローンAp15の核酸配列の一部を
示す。p=5’配列；r=3’配列。
示す。p=5’配列；r=3’配列。
【図１３】図１３は、クローンAp4の核酸の全配列を示
す。
す。
【図１４】図１４は、クローンAp10の核酸の全配列を示
す。
す。
【図１５】図１５は、クローンAp10の核酸の全配列を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8318−4Ｈ 15/06 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/19 7236−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ウェン−ホワ リー アメリカ合衆国 テキサス 92122，サン アントニオ，ジャービス ドライブ 11718 (72)発明者 ベイ シャン アメリカ合衆国 テキサス 78245，サン アントニオ，ナンバー501，オミクロン ドライブ 14825
Claims (21)
- 【請求項１】網膜芽種−関連ポリペプチドをコードす
る、単離された核酸分子。 - 【請求項２】コードされた網膜芽種−関連ポリペプチド
が転写因子E2Fの生物学的活性を有する、請求項１の単
離された核酸分子。 - 【請求項３】コードされた網膜芽種−関連ポリペプチド
がRB結合活性を有する、請求項１の単離された核酸分
子。 - 【請求項４】前記核酸分子が、DNA分子、cDNA分子、ま
たはRNA分子である、請求項１の単離された核酸分子。 - 【請求項５】ストリンジェント条件下でハイブリッド形
成して請求項１の単離された核酸分子を形成する、核酸
分子。 - 【請求項６】請求項１の単離された核酸分子によってコ
ードされた、単離および精製されたポリペプチド。 - 【請求項７】請求項２の単離された核酸分子によってコ
ードされた、単離および精製されたポリペプチド。 - 【請求項８】請求項３の単離された核酸分子によってコ
ードされた、単離および精製されたポリペプチド。 - 【請求項９】請求項１の単離された核酸分子を含む、ベ
クター。 - 【請求項１０】請求項９のベクターを含む、プラスミ
ド。 - 【請求項１１】請求項９のベクターを含む、ウィルス。
- 【請求項１２】請求項９のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項１３】請求項１２の宿主細胞であって、該宿主
細胞が細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、宿
主細胞。 - 【請求項１４】前記細胞核内にある、網膜芽種−関連ポ
リペプチドに特異的に結合し得る、抗体。 - 【請求項１５】請求項１４の抗体の、免疫学的に活性な
ポリペプチドフラグメント。 - 【請求項１６】請求項１４の抗体であって、該抗体がモ
ノクローナル抗体である、抗体。 - 【請求項１７】請求項１４の抗体であって、該抗体が検
出可能なマーカーで標識された、抗体。 - 【請求項１８】請求項１７の抗体を産生する、ハイブリ
ドーマセルライン。 - 【請求項１９】以下の a、b および c を含む試料中の
網膜芽種−関連タンパク質を検出する方法： a. 抗体−抗原複合体を形成させる条件下で、請求項１
４の抗体を試料と接触させる方法； b. 形成されたすべ
ての複合体の存在を検出する方法； c. 該複合体の存在
が試料中の網膜芽種−関連タンパク質の存在を指示する
方法。 - 【請求項２０】網膜芽種−関連タンパク質を組換えによ
り産生する方法であって、該タンパク質を産生する好適
な条件下で請求項１２の宿主細胞を増殖し、およびその
ようにして得られた該タンパク質を回収および精製する
方法を包含する、方法。 - 【請求項２１】組換えにより産生した、請求項２０のタ
ンパク質。
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| US7384735B1 (en) | 1986-08-11 | 2008-06-10 | Massachusetts Eye And Ear Infirmary | Retinoblastoma nucleic acids |
| PL314179A1 (en) * | 1993-10-22 | 1996-08-19 | Univ Texas | Novel nuclear miotic phoshorylated protein |
| US5831008A (en) * | 1994-08-18 | 1998-11-03 | La Jolla Cancer Research Foundation | Retinoblastoma protein-interacting zinc finger proteins |
| US5599919A (en) * | 1994-12-09 | 1997-02-04 | Fox Chase Cancer Center | Nucleic acid encoding a transiently-expressed kinetochore protein, and methods of use |
| AU703145B2 (en) * | 1995-11-07 | 1999-03-18 | Toshio Tanaka | Method for expression cloning of gene encoding ligand-bound protein |
| GB9610195D0 (en) * | 1996-05-15 | 1996-07-24 | Medical Res Council | Assay |
| US6159691A (en) * | 1996-05-15 | 2000-12-12 | Prolifix Limited | Assay for a putative regulator of cell cycle progression |
| US6387649B1 (en) | 1996-09-30 | 2002-05-14 | Prolifix Limited | Assay for a regulator of cell cycle progression |
| AU771619B2 (en) | 1998-06-30 | 2004-04-01 | Genset S.A. | A nucleic acid encoding a retinoblastoma binding protein (RBP-7) and polymorphic markers associated with said nucleic acid |
| EP2306404B1 (en) * | 2003-12-23 | 2012-11-21 | Telecom Italia S.p.A. | Method and system for identification and registration of a moving object entering a pre-determined area and computer program product therefor |
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|---|---|---|---|---|
| CA1341576C (en) * | 1986-08-11 | 2008-07-08 | Thaddeus P. Dryja | Diagnosis of retinoblastoma |
| GB8712646D0 (en) * | 1987-05-29 | 1987-07-01 | Clayton Found Res | Structural evidence |
| US4942123A (en) * | 1987-09-17 | 1990-07-17 | The Regents Of The University Of California | ppRB110 -phosphoprotein the retinoblastoma susceptibility gene product |
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- 1993-10-20 US US08/139,937 patent/US5821070A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-11-19 EP EP94902337A patent/EP0669930A4/en not_active Withdrawn
- 1993-11-19 WO PCT/US1993/011310 patent/WO1994012521A1/en not_active Ceased
- 1993-11-19 CA CA002149883A patent/CA2149883A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-08-04 JP JP2003286331A patent/JP2004081216A/ja active Pending
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