JPH06303971A - ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法 - Google Patents
ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法Info
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- JPH06303971A JPH06303971A JP5089968A JP8996893A JPH06303971A JP H06303971 A JPH06303971 A JP H06303971A JP 5089968 A JP5089968 A JP 5089968A JP 8996893 A JP8996893 A JP 8996893A JP H06303971 A JPH06303971 A JP H06303971A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヘテロな２種のサブユニットから構成され、
ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な水溶性酵素タ
ンパク質をリゾビウム（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属菌か
ら分離精製した。該タンパク質をコードする遺伝子の塩
基配列を決定し、該塩基配列を有する発現ベクターによ
り形質転換された形質転換体を用いて該タンパク質を発
現させ、該形質転換体を培養して得られる培養液、分離
菌体等をニトリル類に作用させて対応するアミド類を製
造する。 【効果】 上記形質転換体を培養して得られる培養液、
分離菌体等を用いることによりニトリル類をその対応す
るアミド類に効率良く変換させることが可能である。
ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規な水溶性酵素タ
ンパク質をリゾビウム（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属菌か
ら分離精製した。該タンパク質をコードする遺伝子の塩
基配列を決定し、該塩基配列を有する発現ベクターによ
り形質転換された形質転換体を用いて該タンパク質を発
現させ、該形質転換体を培養して得られる培養液、分離
菌体等をニトリル類に作用させて対応するアミド類を製
造する。 【効果】 上記形質転換体を培養して得られる培養液、
分離菌体等を用いることによりニトリル類をその対応す
るアミド類に効率良く変換させることが可能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はニトリルヒドラターゼ活
性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺
伝子並びに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリ
ル類からアミド類の製造方法に関する。詳しくは、ニト
リル類からその対応するアミド類を生成させる活性を有
する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子
と、少なくとも該タンパク質の発現に必要なプロモータ
ー配列、当該タンパク質がコードされたＤＮＡ配列及び
ターミネーター配列を有する発現ベクターにより形質転
換された形質転換体、さらにその形質転換体を培養する
ことにより当該タンパク質を発現させる方法、ならびに
該形質転換体を培養して得られる培養液、分離菌体、菌
体処理物、タンパク質またはこれらの固定化物をニトリ
ル類に作用させて対応するアミド類を製造する方法に関
する。
性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺
伝子並びに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリ
ル類からアミド類の製造方法に関する。詳しくは、ニト
リル類からその対応するアミド類を生成させる活性を有
する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子
と、少なくとも該タンパク質の発現に必要なプロモータ
ー配列、当該タンパク質がコードされたＤＮＡ配列及び
ターミネーター配列を有する発現ベクターにより形質転
換された形質転換体、さらにその形質転換体を培養する
ことにより当該タンパク質を発現させる方法、ならびに
該形質転換体を培養して得られる培養液、分離菌体、菌
体処理物、タンパク質またはこれらの固定化物をニトリ
ル類に作用させて対応するアミド類を製造する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする問題点】ニ
トリル類のニトリル基を水和してアミド基に転化させ、
対応するアミド類を製造する技術において、反応の触媒
として酸またはアルカリを用いて加熱処理する方法、銅
触媒を用いて加熱処理する方法が知られていたが、近
年、この水和反応を促進する触媒機能を有する水溶性酵
素タンパク質、ニトリルヒドラターゼを菌体内に保持す
る微生物触媒を用いる方法が用いられるようになった
（特開昭５９−２６９３号、同６１−１６２１９３号、
同６２−９１１８９号、同６４−８６８８９号、特公昭
５６−１７９１８号、同５９−３７９５１号、同６２−
２１５１９号各公報等）。この微生物触媒を用いる方法
は、常温で水和反応を行うことができるとともに転化率
も高い点から他の方法に比べて優れた方法といえる。
トリル類のニトリル基を水和してアミド基に転化させ、
対応するアミド類を製造する技術において、反応の触媒
として酸またはアルカリを用いて加熱処理する方法、銅
触媒を用いて加熱処理する方法が知られていたが、近
年、この水和反応を促進する触媒機能を有する水溶性酵
素タンパク質、ニトリルヒドラターゼを菌体内に保持す
る微生物触媒を用いる方法が用いられるようになった
（特開昭５９−２６９３号、同６１−１６２１９３号、
同６２−９１１８９号、同６４−８６８８９号、特公昭
５６−１７９１８号、同５９−３７９５１号、同６２−
２１５１９号各公報等）。この微生物触媒を用いる方法
は、常温で水和反応を行うことができるとともに転化率
も高い点から他の方法に比べて優れた方法といえる。
【０００３】しかしながら微生物触媒を用いる場合に
は、微生物触媒を調製する段階において、その微生物の
安全性評価、最適培養法の検討など、用いる微生物触媒
の生物学的性質に応じて数多くの検討を行う必要があ
り、生物触媒としての活性をコストの上で工業的に利用
できるレベルにまであげることは必ずしも容易ではな
い。一方、かかる微生物触媒法の改良策として、微生物
触媒自身、即ち酵素ニトリルヒドラターゼを遺伝子工学
を利用して製造し、ニトリル類から対応するアミド類へ
転換する方法が検討されている。例えば、特公平３−５
４５５８号公報にはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属の菌由来で、ヘテロな２つのサブユニットから
なるニトリルヒドラターゼが酵素レベルで記載され、特
開平２−１１９７７８号公報にはロドコッカス属の菌由
来で、ヘテロな２つのサブユニットからなるニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子が、特開平３−２５１１８４号公報に
はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の菌由
来で、ヘテロな２つのサブユニットからなるニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子が開示され、また欧州特許公開４５５
６４６号公報にはロドコッカス ロドクロウス（Ｒ．ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来で、ヘテロな２つのサブユ
ニットからなるニトリルヒドラターゼ遺伝子が開示され
ている。
は、微生物触媒を調製する段階において、その微生物の
安全性評価、最適培養法の検討など、用いる微生物触媒
の生物学的性質に応じて数多くの検討を行う必要があ
り、生物触媒としての活性をコストの上で工業的に利用
できるレベルにまであげることは必ずしも容易ではな
い。一方、かかる微生物触媒法の改良策として、微生物
触媒自身、即ち酵素ニトリルヒドラターゼを遺伝子工学
を利用して製造し、ニトリル類から対応するアミド類へ
転換する方法が検討されている。例えば、特公平３−５
４５５８号公報にはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ）属の菌由来で、ヘテロな２つのサブユニットから
なるニトリルヒドラターゼが酵素レベルで記載され、特
開平２−１１９７７８号公報にはロドコッカス属の菌由
来で、ヘテロな２つのサブユニットからなるニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子が、特開平３−２５１１８４号公報に
はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の菌由
来で、ヘテロな２つのサブユニットからなるニトリルヒ
ドラターゼ遺伝子が開示され、また欧州特許公開４５５
６４６号公報にはロドコッカス ロドクロウス（Ｒ．ｒ
ｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）由来で、ヘテロな２つのサブユ
ニットからなるニトリルヒドラターゼ遺伝子が開示され
ている。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】発明者らは、より高い
触媒活性を持つ微生物触媒を調製する目的で、極めて高
いニトリル類の水和活性を有する、つまりニトリルヒド
ラターゼ活性を有するタンパク質を組換えＤＮＡ技術に
より形質転換体中に大量に生産させるべく鋭意検討を重
ね、かかる目的に有用な新規なタンパク質（以下、ニト
リルヒドラターゼタンパク質、ニトリルヒドラターゼＡ
Ｍ１タンパク質、ＡＭ１タンパク質と称することもあ
る）を初めて単離・精製し、これをコードする遺伝子も
初めて分離取得し、さらにこの遺伝子を発現ベクターに
組み込み形質転換体を得て、その形質転換体によりニト
リルヒドラターゼタンパク質を大量に生産させることに
成功し、本発明を完成するに至った。
触媒活性を持つ微生物触媒を調製する目的で、極めて高
いニトリル類の水和活性を有する、つまりニトリルヒド
ラターゼ活性を有するタンパク質を組換えＤＮＡ技術に
より形質転換体中に大量に生産させるべく鋭意検討を重
ね、かかる目的に有用な新規なタンパク質（以下、ニト
リルヒドラターゼタンパク質、ニトリルヒドラターゼＡ
Ｍ１タンパク質、ＡＭ１タンパク質と称することもあ
る）を初めて単離・精製し、これをコードする遺伝子も
初めて分離取得し、さらにこの遺伝子を発現ベクターに
組み込み形質転換体を得て、その形質転換体によりニト
リルヒドラターゼタンパク質を大量に生産させることに
成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とする新規なタンパク質および
それをコードする遺伝子並びに該遺伝子を含有する形質
転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法に存す
る。 ２種のサブユニットから構成され、ゲル濾過法によ
る分子量が約１２０，０００の水溶性酵素タンパク質で
あって、各サブユニットのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が以下の通りである。 サブユニットα 分子量 ２８，０００±５００ サブユニットβ 分子量 ２９，０００±５００ ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
性質を有することを特徴とする新規なタンパク質および
それをコードする遺伝子並びに該遺伝子を含有する形質
転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法に存す
る。 ２種のサブユニットから構成され、ゲル濾過法によ
る分子量が約１２０，０００の水溶性酵素タンパク質で
あって、各サブユニットのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動による分子量が以下の通りである。 サブユニットα 分子量 ２８，０００±５００ サブユニットβ 分子量 ２９，０００±５００ ニトリルヒドラターゼ活性を有する。
【０００６】以下本発明をさらに詳細に説明するに、本
発明の新規なタンパク質ニトリルヒドラターゼＡＭ１タ
ンパク質は、例えば後述の実施例に記述するように、土
壌から分離してきたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣ
Ｉ２６０９（特願平３−１９５４９６号、微工研（生工
研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）を破砕し、それ
を遠心分離した後の上清をＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラム（東ソー社製）等による疎水クロマトグラフ
ィーにより更に分画した後、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラムクロマトグラフィー等により更に分画する。
最後にＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ等の分子ふるいク
ロマトグラフィーに供することにより精製標品が得られ
る。精製された本発明のタンパク質はα、βの二つのサ
ブユニットからなる水溶性タンパク質で各サブユニット
のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が
それぞれ２８，０００±５００ダルトン、２９，０００
±５００ダルトンであり、ニトリル類を水和反応により
アミド類に転換する活性、即ちニトリルヒドラターゼ活
性を有する。
発明の新規なタンパク質ニトリルヒドラターゼＡＭ１タ
ンパク質は、例えば後述の実施例に記述するように、土
壌から分離してきたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣ
Ｉ２６０９（特願平３−１９５４９６号、微工研（生工
研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）を破砕し、それ
を遠心分離した後の上清をＢｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラム（東ソー社製）等による疎水クロマトグラフ
ィーにより更に分画した後、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラムクロマトグラフィー等により更に分画する。
最後にＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ等の分子ふるいク
ロマトグラフィーに供することにより精製標品が得られ
る。精製された本発明のタンパク質はα、βの二つのサ
ブユニットからなる水溶性タンパク質で各サブユニット
のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動による分子量が
それぞれ２８，０００±５００ダルトン、２９，０００
±５００ダルトンであり、ニトリル類を水和反応により
アミド類に転換する活性、即ちニトリルヒドラターゼ活
性を有する。
【０００７】また、本発明のＡＭ１タンパク質は、配列
表の配列番号１〜３に示すようなアミノ酸配列を有する
サブユニットα、サブユニットβの二つのサブユニット
からなるタンパク質であり、ニトリル類の水和活性を損
なわない範囲で一部のアミノ酸を除去、置換、修飾また
は追加するなどの改変を行ったものも、本発明のＡＭ１
タンパク質に含まれる。
表の配列番号１〜３に示すようなアミノ酸配列を有する
サブユニットα、サブユニットβの二つのサブユニット
からなるタンパク質であり、ニトリル類の水和活性を損
なわない範囲で一部のアミノ酸を除去、置換、修飾また
は追加するなどの改変を行ったものも、本発明のＡＭ１
タンパク質に含まれる。
【０００８】上記のＡＭ１タンパク質をコードする遺伝
子としては、例えば、配列番号３または４に示すような
塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のＡＭ１タ
ンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ断片は、例えば、次
のような方法によって得られる。本発明のタンパク質を
コードする遺伝子を含有するＤＮＡライブラリーとして
は、土壌から分離してきたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓ
ｐ．ＭＣＩ２６０９（特願平３−１９５４９６号、微工
研（生工研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）から調
製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法により作成した
プラスミドライブラリーが利用できる。このＤＮＡライ
ブラリーからプラスミドをＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方
法（「モレキュラー クローニング」，コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー，８５，１９８２年）
により宿主大腸菌に形質転換し培養する。培養後に形成
されたコロニーを部分ＤＮＡ断片あるいは決定した本発
明のタンパク質の部分アミノ酸配列に対応する塩基配列
を持つＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダ
イゼーション法（「モレキュラー クローニング」，コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー，３２０
−３２８，１９８２年）によって選択し、目的とするＤ
ＮＡを得ることができる。
子としては、例えば、配列番号３または４に示すような
塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のＡＭ１タ
ンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ断片は、例えば、次
のような方法によって得られる。本発明のタンパク質を
コードする遺伝子を含有するＤＮＡライブラリーとして
は、土壌から分離してきたＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓ
ｐ．ＭＣＩ２６０９（特願平３−１９５４９６号、微工
研（生工研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）から調
製してきた染色体ＤＮＡを用いて、常法により作成した
プラスミドライブラリーが利用できる。このＤＮＡライ
ブラリーからプラスミドをＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方
法（「モレキュラー クローニング」，コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー，８５，１９８２年）
により宿主大腸菌に形質転換し培養する。培養後に形成
されたコロニーを部分ＤＮＡ断片あるいは決定した本発
明のタンパク質の部分アミノ酸配列に対応する塩基配列
を持つＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダ
イゼーション法（「モレキュラー クローニング」，コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー，３２０
−３２８，１９８２年）によって選択し、目的とするＤ
ＮＡを得ることができる。
【０００９】このコロニーハイブリダイゼーション法に
使用するプローブには、ポリメラーゼチェイン反応（以
下、「ＰＣＲ」と略す）法（サイエンス［Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ］，２３９，４８７−４９１，１９８８年）によって
得られるＡＭ１タンパク質をコードする遺伝子の部分Ｄ
ＮＡ断片が用いられる。例えば配列表の配列番号５の＋
鎖ＤＮＡプライマーと、配列表の配列番号６の−鎖ＤＮ
Ａプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた配列表の
配列番号３に示した１９４ｂｐのＤＮＡ断片を作成して
プローブとして用いる。またＡＭ１タンパク質のアミノ
酸配列より推定されるＤＮＡ配列に基づき合成したオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いてもよい。
使用するプローブには、ポリメラーゼチェイン反応（以
下、「ＰＣＲ」と略す）法（サイエンス［Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ］，２３９，４８７−４９１，１９８８年）によって
得られるＡＭ１タンパク質をコードする遺伝子の部分Ｄ
ＮＡ断片が用いられる。例えば配列表の配列番号５の＋
鎖ＤＮＡプライマーと、配列表の配列番号６の−鎖ＤＮ
Ａプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた配列表の
配列番号３に示した１９４ｂｐのＤＮＡ断片を作成して
プローブとして用いる。またＡＭ１タンパク質のアミノ
酸配列より推定されるＤＮＡ配列に基づき合成したオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用いてもよい。
【００１０】さらに上記のスクリーニング陽性のコロニ
ーからＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー
クローニング」，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，８５，１９８２年）によりＤＮＡを調製
し、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後，ｐ
ＵＣ１８等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅ
ｒらのジデオキシ法（プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミーサイエンス ユー エス エー［Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，７
４，５４６３，１９７７年）によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。
ーからＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュラー
クローニング」，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，８５，１９８２年）によりＤＮＡを調製
し、適当な制限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後，ｐ
ＵＣ１８等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅ
ｒらのジデオキシ法（プロシーディングス オブ ナシ
ョナル アカデミーサイエンス ユー エス エー［Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］，７
４，５４６３，１９７７年）によって目的ＤＮＡ断片の
塩基配列が決定できる。
【００１１】このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩
基配列（例えば、配列表の配列番号３および４）は、α
サブユニット（２０１または２０２アミノ酸残基）、β
サブユニット（２１７アミノ酸残基）の二つのタンパク
質をコードしている、それぞれ全長６０３または６０６
ヌクレオチド、６５１ヌクレオチド長からなるものであ
る。また本発明によるＤＮＡ断片は配列表の配列番号１
〜２に示すアミノ酸配列をコードするものに限らず、ニ
トリルからアミドへの水和活性を持つ限りはそのアミノ
酸配列を改変したものも含まれる。
基配列（例えば、配列表の配列番号３および４）は、α
サブユニット（２０１または２０２アミノ酸残基）、β
サブユニット（２１７アミノ酸残基）の二つのタンパク
質をコードしている、それぞれ全長６０３または６０６
ヌクレオチド、６５１ヌクレオチド長からなるものであ
る。また本発明によるＤＮＡ断片は配列表の配列番号１
〜２に示すアミノ酸配列をコードするものに限らず、ニ
トリルからアミドへの水和活性を持つ限りはそのアミノ
酸配列を改変したものも含まれる。
【００１２】上記のようにして得られるＤＮＡ断片は、
その５’末端を修飾して公知の発現ベクターにそれ自体
公知の方法でプロモーターの下流に挿入され、次いで上
記のＤＮＡが挿入された発現ベクターは、大腸菌、酵
母、動物細胞宿主等、公知の細胞中にそれ自体公知の方
法により導入される。本発明のＡＭ１タンパク質の産生
方法につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては上
記のようにして得られたＡＭ１タンパク質をコードする
ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している
ものが使用される。たとえば大腸菌、枯草菌等の微生物
を宿主とするときには、発現ベクターはプロモーター、
リボゾーム結合（ＳＤ）配列、ＡＭ１タンパク質遺伝
子、転写終結配列、及びプロモーターを制御する遺伝子
より成ることが好ましい。
その５’末端を修飾して公知の発現ベクターにそれ自体
公知の方法でプロモーターの下流に挿入され、次いで上
記のＤＮＡが挿入された発現ベクターは、大腸菌、酵
母、動物細胞宿主等、公知の細胞中にそれ自体公知の方
法により導入される。本発明のＡＭ１タンパク質の産生
方法につき詳細に説明すると、発現ベクターとしては上
記のようにして得られたＡＭ１タンパク質をコードする
ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している
ものが使用される。たとえば大腸菌、枯草菌等の微生物
を宿主とするときには、発現ベクターはプロモーター、
リボゾーム結合（ＳＤ）配列、ＡＭ１タンパク質遺伝
子、転写終結配列、及びプロモーターを制御する遺伝子
より成ることが好ましい。
【００１３】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
ＰL 、ＰR 、Ｔ5 ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ25、Ｐ26プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（アグリカルチュラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー［Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］，５２，９８３−９８８，
１９８８年）のように独自に改変、設計された配列でも
良い。
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
ＰL 、ＰR 、Ｔ5 ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ25、Ｐ26プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（アグリカルチュラ
ル アンド バイオロジカル ケミストリー［Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．］，５２，９８３−９８８，
１９８８年）のように独自に改変、設計された配列でも
良い。
【００１４】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
【００１５】更にこれらの発現に必要な因子の発現プラ
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＡＭ１タンパク質遺伝子、転写終結因子
の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上のＳＤ配
列とＡＭ１タンパク質遺伝子とのユニットを複数個同方
向に挿入することにより、ベクター上の転写単位のコピ
ー数を増加させる方法（特開平１−９５７９８号公報）
を用いることもできる。
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＡＭ１タンパク質遺伝子、転写終結因子
の順に並ぶ事が望ましい。また発現ベクター上のＳＤ配
列とＡＭ１タンパク質遺伝子とのユニットを複数個同方
向に挿入することにより、ベクター上の転写単位のコピ
ー数を増加させる方法（特開平１−９５７９８号公報）
を用いることもできる。
【００１６】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等がある。ま
た、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシ
リーズ（ファルマシア社製）等も同様にして使用でき
る。宿主の形質転換法としては、常法に従い行うことが
できる。
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等がある。ま
た、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシ
リーズ（ファルマシア社製）等も同様にして使用でき
る。宿主の形質転換法としては、常法に従い行うことが
できる。
【００１７】形質転換体の培養は、モレキュラー クロ
ーニング（コールド スプリングハーバー ラボラトリ
ー，１９８２年）に記載の方法を参考にして行うことが
できる。培養温度としては、２８〜４２℃が適当であ
る。また、形質転換に用いる宿主としては、例えば後述
の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とくに大腸菌
に限定されるものではなく、他の微生物、動物細胞、昆
虫細胞などの宿主生物を用いることができる。
ーニング（コールド スプリングハーバー ラボラトリ
ー，１９８２年）に記載の方法を参考にして行うことが
できる。培養温度としては、２８〜４２℃が適当であ
る。また、形質転換に用いる宿主としては、例えば後述
の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とくに大腸菌
に限定されるものではなく、他の微生物、動物細胞、昆
虫細胞などの宿主生物を用いることができる。
【００１８】上記形質転換体を培養して得られるＡＭ１
タンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製され
る。本発明においては、ニトリル類のアミド類への変換
には、上記で得られたＡＭ１タンパク質の他に形質転換
体の培養液、分離菌体、菌体処理物、固定化菌体、粗酵
素液、酵素処理物、固定化酵素等が用いられる。
タンパク質は、公知の方法で宿主から単離・精製され
る。本発明においては、ニトリル類のアミド類への変換
には、上記で得られたＡＭ１タンパク質の他に形質転換
体の培養液、分離菌体、菌体処理物、固定化菌体、粗酵
素液、酵素処理物、固定化酵素等が用いられる。
【００１９】また、本発明で対象とするニトリルとして
は、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの炭素数２〜４のニトリル
が挙げられ、アクリロニトリルが代表的である。
は、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、アク
リロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの炭素数２〜４のニトリル
が挙げられ、アクリロニトリルが代表的である。
【００２０】
【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。 実施例１ ＡＭ１タンパク質の精製 土壌分離菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０
９（特願平３−１９５４９６号、微工研（生工研）条寄
ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）を培地（グリセリン ４
ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ３ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ
2 ・６Ｈ2 Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ
１０ｍｇ／ｌ、酵母エキス ２ｇ／ｌ、ポリペプトン
０．５ｇ／ｌ）で２８℃、４０時間培養した後、遠心分
離（８，０００×ｇ、４０分間）により集菌した。菌体
を生理食塩水で洗浄し、集菌した菌体を再び緩衝液（５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液を氷水で冷やしな
がら超音波破砕（１００Ｗ、１０分間）し、２５，００
０×ｇで２０分間遠心分離した後の上清を回収した。こ
の上清に飽和硫安を終濃度が２５％（ｗ／ｖ）になるよ
うにゆっくりと加え、生じた沈澱を２５，０００×ｇ、
２０分の遠心分離で除去した。この上清に終濃度が６５
％（ｗ／ｖ）になるように飽和硫安を加え、生じた沈澱
を２５，０００×ｇ、２０分間の遠心分離により回収し
た。この沈澱を４℃で上記の緩衝液に溶解させた後、終
濃度が２５％（ｗ／ｖ）になるように飽和硫安をくわ
え、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１．２×
２０ｃｍ）にて分画した。すなわち、２５％硫安を含む
緩衝液でカラムを十分洗浄した後、硫安の濃度２５％か
ら０％（ｗ／ｖ）の濃度勾配溶出を行い、ニトリルヒド
ラターゼ活性を含む画分を得た。
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。 実施例１ ＡＭ１タンパク質の精製 土壌分離菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０
９（特願平３−１９５４９６号、微工研（生工研）条寄
ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４９）を培地（グリセリン ４
ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ３ｇ／ｌ、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．５ｇ
／ｌ、ＭｇＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．５ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ
2 ・６Ｈ2 Ｏ １０ｍｇ／ｌ、ＦｅＳＯ 4 ・７Ｈ2 Ｏ
１０ｍｇ／ｌ、酵母エキス ２ｇ／ｌ、ポリペプトン
０．５ｇ／ｌ）で２８℃、４０時間培養した後、遠心分
離（８，０００×ｇ、４０分間）により集菌した。菌体
を生理食塩水で洗浄し、集菌した菌体を再び緩衝液（５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、
ｐＨ８．０）に懸濁した。この懸濁液を氷水で冷やしな
がら超音波破砕（１００Ｗ、１０分間）し、２５，００
０×ｇで２０分間遠心分離した後の上清を回収した。こ
の上清に飽和硫安を終濃度が２５％（ｗ／ｖ）になるよ
うにゆっくりと加え、生じた沈澱を２５，０００×ｇ、
２０分の遠心分離で除去した。この上清に終濃度が６５
％（ｗ／ｖ）になるように飽和硫安を加え、生じた沈澱
を２５，０００×ｇ、２０分間の遠心分離により回収し
た。この沈澱を４℃で上記の緩衝液に溶解させた後、終
濃度が２５％（ｗ／ｖ）になるように飽和硫安をくわ
え、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム（１．２×
２０ｃｍ）にて分画した。すなわち、２５％硫安を含む
緩衝液でカラムを十分洗浄した後、硫安の濃度２５％か
ら０％（ｗ／ｖ）の濃度勾配溶出を行い、ニトリルヒド
ラターゼ活性を含む画分を得た。
【００２１】この活性画分を１０ｍＭ Ｂｉｓ−ｔｒｉ
ｓ ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ６．５）に対して透析したの
ち、同液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカ
ラム（０．７×２０ｃｍ）に共した。カラムを同液で洗
浄した後、０から０．７ＭのＮａＣｌの濃度勾配溶出を
行い、活性画分を得た。この画分を３０ｍＭ Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）に透
析した後、同液で平衡化したＣＱＡ−３１Ａカラムに共
した。カラムを同液で洗浄した後、０から０．４ＭのＮ
ａＣｌ濃度勾配溶出を行い、活性画分を得た。この画分
をミリポア社製、ウルトラフリー（１０，０００カット
オフ）を用いて濃縮した後、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ／ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で
平衡化したＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに共
した。このうち１３．５ｍｌに溶出したメインピークが
ニトリルヒドラターゼ活性を示し、非還元状態での電気
泳動で単一のバンドとなった。
ｓ ｐｒｏｐａｎｅ（ｐＨ６．５）に対して透析したの
ち、同液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカ
ラム（０．７×２０ｃｍ）に共した。カラムを同液で洗
浄した後、０から０．７ＭのＮａＣｌの濃度勾配溶出を
行い、活性画分を得た。この画分を３０ｍＭ Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）に透
析した後、同液で平衡化したＣＱＡ−３１Ａカラムに共
した。カラムを同液で洗浄した後、０から０．４ＭのＮ
ａＣｌ濃度勾配溶出を行い、活性画分を得た。この画分
をミリポア社製、ウルトラフリー（１０，０００カット
オフ）を用いて濃縮した後、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ／ＮａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で
平衡化したＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに共
した。このうち１３．５ｍｌに溶出したメインピークが
ニトリルヒドラターゼ活性を示し、非還元状態での電気
泳動で単一のバンドとなった。
【００２２】またこれらの精製したＡＭ１タンパク質を
１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解
析したところ、それぞれのサブユニットの分子量はαサ
ブユニットが２８，０００±５００ダルトン、βサブユ
ニットが２９，０００±５００ダルトンであることが明
かとなった。
１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により解
析したところ、それぞれのサブユニットの分子量はαサ
ブユニットが２８，０００±５００ダルトン、βサブユ
ニットが２９，０００±５００ダルトンであることが明
かとなった。
【００２３】実施例２ ＡＭ１タンパク質のニトリルヒ
ドラターゼ活性の評価 分離菌体及び酵素溶液（ＡＭ１タンパク質溶液）中の活
性評価は、以下のように行った。すなわち菌体懸濁液あ
るいは酵素溶液１容量に対して７％（ｖ／ｖ）アクリロ
ニトリル１容量と０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）３容量を加え、２５℃で１０分間反応させた。反応
後１容量の１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた後、
純水で１００倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣのＯＤＳ
カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｃ１８）に添
加して１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ リン酸２
水素ナトリウム溶液で展開した。生成アクリルアミドは
逐次分光光度測定（λ＝１９５ｎｍ）により検出した。
ドラターゼ活性の評価 分離菌体及び酵素溶液（ＡＭ１タンパク質溶液）中の活
性評価は、以下のように行った。すなわち菌体懸濁液あ
るいは酵素溶液１容量に対して７％（ｖ／ｖ）アクリロ
ニトリル１容量と０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）３容量を加え、２５℃で１０分間反応させた。反応
後１容量の１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた後、
純水で１００倍に希釈して１０μｌをＨＰＬＣのＯＤＳ
カラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ １００−５Ｃ１８）に添
加して１０％アセトニトリルを含む０．１Ｍ リン酸２
水素ナトリウム溶液で展開した。生成アクリルアミドは
逐次分光光度測定（λ＝１９５ｎｍ）により検出した。
【００２４】実施例３ ＰＣＲ法によるＡＭ１タンパク
質の部分ＤＮＡ断片の調製 基質となる土壌分離菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．Ｍ
ＣＩ２６０９（微工研（生工研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ
−３９４９）の染色体ＤＮＡは常法に従って作製され
る。すなわち培養菌体よりフェノール−クロロホルム法
（「モレキュラークローニング」，コールドスプリング
ハーバーラボラトリー，１９８２年）に従い、若干の改
良を加えて以下のごとく調製した。
質の部分ＤＮＡ断片の調製 基質となる土壌分離菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．Ｍ
ＣＩ２６０９（微工研（生工研）条寄 ＦＥＲＭ ＢＰ
−３９４９）の染色体ＤＮＡは常法に従って作製され
る。すなわち培養菌体よりフェノール−クロロホルム法
（「モレキュラークローニング」，コールドスプリング
ハーバーラボラトリー，１９８２年）に従い、若干の改
良を加えて以下のごとく調製した。
【００２５】Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６
０９株を前記実施例１における培地１００ｍｌに植菌し
て培養した後集菌し、この菌体をＴＥＳ［１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄後、ＴＥ［１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］５ｍｌ
に懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて３７℃で３０分
間インキュベートした後、凍結−再融解を繰り返して細
胞を破壊する。次に１／２量の１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ
を穏やかに振とうしながら加え、更にプロテイナーゼＫ
（シグマ社製）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるよう加
えて６０℃で５時間インキュベートする。次に等量のＴ
Ｅ飽和フェノール・クロロホルムを加え、一晩室温で緩
やかに振とうする（以下、この操作をフェノール処理と
呼ぶ）。遠心後、上層をとり等量のクロロホルムを加え
て再抽出する。遠心後の上層に等量のエタノールを加え
たのちガラス棒でＤＮＡを巻きとり、７０％、８５％、
９９．５％のエタノールで順次脱水する。次にＤＮＡを
３ｍｌのＴＥバッファーに溶解させたのち１００℃、１
０分間の加熱処理したＲＮａｓｅＡ水溶液を終濃度１０
μｇ／ｍｌになるよう加えて３７℃で１時間保温する。
その後フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。この結果、２．５ｍｇの染色体ＤＮＡが得ら
れた。
０９株を前記実施例１における培地１００ｍｌに植菌し
て培養した後集菌し、この菌体をＴＥＳ［１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄後、ＴＥ［１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］５ｍｌ
に懸濁し、リゾチーム１０ｍｇを加えて３７℃で３０分
間インキュベートした後、凍結−再融解を繰り返して細
胞を破壊する。次に１／２量の１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ
を穏やかに振とうしながら加え、更にプロテイナーゼＫ
（シグマ社製）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌになるよう加
えて６０℃で５時間インキュベートする。次に等量のＴ
Ｅ飽和フェノール・クロロホルムを加え、一晩室温で緩
やかに振とうする（以下、この操作をフェノール処理と
呼ぶ）。遠心後、上層をとり等量のクロロホルムを加え
て再抽出する。遠心後の上層に等量のエタノールを加え
たのちガラス棒でＤＮＡを巻きとり、７０％、８５％、
９９．５％のエタノールで順次脱水する。次にＤＮＡを
３ｍｌのＴＥバッファーに溶解させたのち１００℃、１
０分間の加熱処理したＲＮａｓｅＡ水溶液を終濃度１０
μｇ／ｍｌになるよう加えて３７℃で１時間保温する。
その後フェノール処理、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。この結果、２．５ｍｇの染色体ＤＮＡが得ら
れた。
【００２６】ＰＣＲはパーキン・エルマー・シータス・
ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍ
ｅｒ・Ｃｅｔｕｓ・ＤＮＡ・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ）を使用して、使用説明書に基づき、ジーンアンプ
キット（Ｇｅｎｅ ＡｍｐＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、宝酒造製）を使っ
て行った。すなわち基質ＤＮＡ０．５μｌ（１μｇ相当
量）、１０倍濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ ＫＣｌ、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］１０μ
ｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μｌ、５０μＭプ
ライマー＃１として配列表の配列番号５の＋鎖ＤＮＡプ
ライマー５’−ＴＧＧＣＣＩＡ／ＧＴＩＣＴＩＧＧＩＣ
／ＴＴＩＣＣ−３’（２０ヌクレオチド、Ｉはイノシ
ン）及びプライマー＃２として配列表の配列番号６の−
鎖ＤＮＡプライマー５’−ＣＡＩＣＣＡ／ＧＴＣＩＧＴ
ＩＣＣＩＧ／ＴＣＩＧＧ−３’（２０ヌクレオチド）各
５μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えて
１００μｌの系とする。反応は９４℃、１０分間の前処
理後、９４℃で１分間（変性ステップ）、４６℃で１．
５分間（アニーリングステップ）、７２℃で２分間（伸
長ステップ）のインキュベーションを３５サイクル行っ
た。最後に７２℃で７分間のインキュベーションを行い
反応を終了した。得られた反応液をフェノール：クロロ
ホルム＝１：１で抽出し、エタノール沈澱を行った。こ
の沈澱を１６μｌ滅菌脱イオン水に溶解した後、５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、１９４ｂｐのバ
ンドを常法に従って切り出しＤＮＡフラグメントを回収
し、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ沈澱を１６μｌ滅
菌脱イオン水に溶解し、１０培濃度のＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ緩衝液［０．３３Ｍトリス−酢酸（ｐＨ７．
９）、０．６６Ｍ酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシ
ウム、５ｍＭ ＤＴＴ］２μｌ，１．２５ｍＭ ４ｄＮ
ＴＰ １μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（６ユニ
ット）を加え２０μｌの系とし、３７℃で３０分間反応
させ、２本鎖の平滑末端ＤＮＡを得た。
ＤＮＡ・サーマル・サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍ
ｅｒ・Ｃｅｔｕｓ・ＤＮＡ・Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ）を使用して、使用説明書に基づき、ジーンアンプ
キット（Ｇｅｎｅ ＡｍｐＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、宝酒造製）を使っ
て行った。すなわち基質ＤＮＡ０．５μｌ（１μｇ相当
量）、１０倍濃度の反応緩衝液［５００ｍＭ ＫＣｌ、
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］１０μ
ｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μｌ、５０μＭプ
ライマー＃１として配列表の配列番号５の＋鎖ＤＮＡプ
ライマー５’−ＴＧＧＣＣＩＡ／ＧＴＩＣＴＩＧＧＩＣ
／ＴＴＩＣＣ−３’（２０ヌクレオチド、Ｉはイノシ
ン）及びプライマー＃２として配列表の配列番号６の−
鎖ＤＮＡプライマー５’−ＣＡＩＣＣＡ／ＧＴＣＩＧＴ
ＩＣＣＩＧ／ＴＣＩＧＧ−３’（２０ヌクレオチド）各
５μｌ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌを加えて
１００μｌの系とする。反応は９４℃、１０分間の前処
理後、９４℃で１分間（変性ステップ）、４６℃で１．
５分間（アニーリングステップ）、７２℃で２分間（伸
長ステップ）のインキュベーションを３５サイクル行っ
た。最後に７２℃で７分間のインキュベーションを行い
反応を終了した。得られた反応液をフェノール：クロロ
ホルム＝１：１で抽出し、エタノール沈澱を行った。こ
の沈澱を１６μｌ滅菌脱イオン水に溶解した後、５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行い、１９４ｂｐのバ
ンドを常法に従って切り出しＤＮＡフラグメントを回収
し、エタノール沈澱を行った。ＤＮＡ沈澱を１６μｌ滅
菌脱イオン水に溶解し、１０培濃度のＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ緩衝液［０．３３Ｍトリス−酢酸（ｐＨ７．
９）、０．６６Ｍ酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシ
ウム、５ｍＭ ＤＴＴ］２μｌ，１．２５ｍＭ ４ｄＮ
ＴＰ １μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ（６ユニ
ット）を加え２０μｌの系とし、３７℃で３０分間反応
させ、２本鎖の平滑末端ＤＮＡを得た。
【００２７】このＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＳ
ｍａＩ部位に挿入してデュポン社の蛍光法ＤＮＡシーケ
ンサーを用いてその塩基配列を決定した。決定したＰＣ
Ｒフラグメントの塩基配列は配列表の配列番号３に示す
とおりである。
ｍａＩ部位に挿入してデュポン社の蛍光法ＤＮＡシーケ
ンサーを用いてその塩基配列を決定した。決定したＰＣ
Ｒフラグメントの塩基配列は配列表の配列番号３に示す
とおりである。
【００２８】実施例４ ＡＭ１タンパク質をコードする
完全長ＤＮＡ断片を含むクローンのスクリーニング 上記実施例３で作製した１９４ｂｐのＰＣＲ断片をモレ
キュラークローニング（コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー，１９８２年）に記載の方法に従い 32Ｐ標識
することによりスクリーニング用プローブとした。
完全長ＤＮＡ断片を含むクローンのスクリーニング 上記実施例３で作製した１９４ｂｐのＰＣＲ断片をモレ
キュラークローニング（コールドスプリングハーバーラ
ボラトリー，１９８２年）に記載の方法に従い 32Ｐ標識
することによりスクリーニング用プローブとした。
【００２９】上記実施例３で調製した染色体ＤＮＡ標品
２．５μｌ（５μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝
液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＤＴＴ］２μｌ、滅菌脱イオン水１４．５μｌ、制限酵
素ＰｓｔＩ １μｌ（１５ユニット）を加え３７℃で３
時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、
４時間）を行い、前記のプローブを用いてモレキュラー
クローニング（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２年）に記載の方法に従いサザンハイブリダ
イゼーションを行った結果、約４Ｋｂの位置にプローブ
と強くハイブリダイズするＤＮＡ断片が存在することが
明らかになった。
２．５μｌ（５μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝
液［５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩
化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ
ＤＴＴ］２μｌ、滅菌脱イオン水１４．５μｌ、制限酵
素ＰｓｔＩ １μｌ（１５ユニット）を加え３７℃で３
時間反応させた後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、
４時間）を行い、前記のプローブを用いてモレキュラー
クローニング（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、１９８２年）に記載の方法に従いサザンハイブリダ
イゼーションを行った結果、約４Ｋｂの位置にプローブ
と強くハイブリダイズするＤＮＡ断片が存在することが
明らかになった。
【００３０】そこで前出の染色体ＤＮＡ標品１０μｌ
（２０μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝液［５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ］
４μｌ、滅菌脱イオン水１３μｌ、制限酵素ＰｓｔＩ
３μｌ（４５ユニット）を加え３７℃で２時間反応させ
た後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、５時間）を行
い、モレキュラークローニング（コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー，１９８２年）に記載の方法に従い
４Ｋｂ付近のＤＮＡ断片を分離・回収した。
（２０μｇ相当量）に１０倍濃度制限酵素緩衝液［５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マグネ
シウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＤＴＴ］
４μｌ、滅菌脱イオン水１３μｌ、制限酵素ＰｓｔＩ
３μｌ（４５ユニット）を加え３７℃で２時間反応させ
た後、アガロースゲル電気泳動（６５Ｖ、５時間）を行
い、モレキュラークローニング（コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー，１９８２年）に記載の方法に従い
４Ｋｂ付近のＤＮＡ断片を分離・回収した。
【００３１】こうして回収した約４ＫｂのＤＮＡ断片を
少なくとも１０ｐｍｏｌ用意し、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドベクタ
ー（東洋紡績社製）のマルチクローニングサイト内にあ
るＰｓｔＩサイトに組み込んだ（この時ライゲーション
に用いたベクターＤＮＡは、次の様に用意されたものを
２０ｎｇ使用した。即ち、ｐＵＣ１９のＤＮＡを制限酵
素ＰｓｔＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノール／ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱させた後、さらにアル
カリフォスタファーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
で５′末端を脱リン酸化して［モレキュラークローニン
グ，コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８
２年］、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈
澱させた。）。
少なくとも１０ｐｍｏｌ用意し、ライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドベクタ
ー（東洋紡績社製）のマルチクローニングサイト内にあ
るＰｓｔＩサイトに組み込んだ（この時ライゲーション
に用いたベクターＤＮＡは、次の様に用意されたものを
２０ｎｇ使用した。即ち、ｐＵＣ１９のＤＮＡを制限酵
素ＰｓｔＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノール／ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱させた後、さらにアル
カリフォスタファーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）
で５′末端を脱リン酸化して［モレキュラークローニン
グ，コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８
２年］、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈
澱させた。）。
【００３２】このようにして作成したＤＮＡを東洋紡績
社製の大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＣＯＭＰＥ
ＴＥＮＴ ＨＩＧＨ）を用いてトランスフォーメーショ
ンを行い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシリン含
有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地（１％酵母抽出物、
０．５％バクトトリプトン、０．５％塩化ナトリウム）
に菌液を塗布した。一枚あたり１０2 〜１０3 個のコロ
ニーが出現したシャーレをバンクのスクリーニングに用
いた。トランスフォーメーションには東洋紡績社製の大
腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ
ＨＩＧＨ）を用いた。
社製の大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＣＯＭＰＥ
ＴＥＮＴ ＨＩＧＨ）を用いてトランスフォーメーショ
ンを行い、直径１５ｃｍのシャーレ中のアンピシリン含
有（５０μｇ／ｍｌ）ＬＢ寒天培地（１％酵母抽出物、
０．５％バクトトリプトン、０．５％塩化ナトリウム）
に菌液を塗布した。一枚あたり１０2 〜１０3 個のコロ
ニーが出現したシャーレをバンクのスクリーニングに用
いた。トランスフォーメーションには東洋紡績社製の大
腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＣＯＭＰＥＴＥＮＴ
ＨＩＧＨ）を用いた。
【００３３】バンクのスクリーニングはＮＥＮ社製のナ
イロンメンブレン、Ｃｏｌｏｎｙ／ＰｌａｑｕｅＳｃｒ
ｅｅｎを用いて添付の説明書に従って行った。すなわち
プレート上に生育したコロニーをプレート１枚あたり２
枚のメンブレンに移し取った後、そのメンブレンを０．
５Ｍ水酸化ナトリウムが染み込んだ濾紙上に２分間静置
し、続いて１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）が染み込ん
だ濾紙上で５分間静置した。このフィルターの処理を更
に２回繰り返した後、ウオッシングバッファー（２×Ｓ
ＳＣ（２倍ＳＳＣ溶液）、０．１％ＳＤＳ）でフィルタ
ーを洗浄し、乾いた濾紙上で風乾した。次にこのメンブ
レンに１２０ｍＪ／ｃｍ2 のＵＶ照射を行うことにより
メンブレンに移したＤＮＡの固定を行った。
イロンメンブレン、Ｃｏｌｏｎｙ／ＰｌａｑｕｅＳｃｒ
ｅｅｎを用いて添付の説明書に従って行った。すなわち
プレート上に生育したコロニーをプレート１枚あたり２
枚のメンブレンに移し取った後、そのメンブレンを０．
５Ｍ水酸化ナトリウムが染み込んだ濾紙上に２分間静置
し、続いて１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．５）が染み込ん
だ濾紙上で５分間静置した。このフィルターの処理を更
に２回繰り返した後、ウオッシングバッファー（２×Ｓ
ＳＣ（２倍ＳＳＣ溶液）、０．１％ＳＤＳ）でフィルタ
ーを洗浄し、乾いた濾紙上で風乾した。次にこのメンブ
レンに１２０ｍＪ／ｃｍ2 のＵＶ照射を行うことにより
メンブレンに移したＤＮＡの固定を行った。
【００３４】こうして処理したメンブレン４枚（１，０
００コロニー相当）に３０ｍｌのプレハイブリダイゼー
ション液［１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸
（ｐＨ７．５）、２００μｇ／ｍｌ鱒精子ＤＮＡ］に６
５℃で３０分浸した。この間に実施例４で作製した１９
４ｂｐのＤＮＡ断片をＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＲＴＧＤ
ＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、添付の説
明書に従い32Ｐ標識した。次にこの32Ｐ標識ＤＮＡ断片
を１μＣｉ／ｍｌの濃度で含むハイブリダイゼーション
液［１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ
７．５）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、２０
０μｇ／ｍｌ鱒精子ＤＮＡ］２５ｍｌ中に上述のフィル
ターを６５℃で１６時間浸した。その後メンブレンを取
り出し２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中での洗浄を室
温で２回行い、更に０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶
液中で６５℃で１５分の洗浄を２回行った後にオートラ
ジオグラフィーを取った。この結果、２枚１組のメンブ
レンのオートラジオグラフィー上のポジティブなシグナ
ルが一致したコロニーが５個得られた。このコロニーを
ＬＢ培地（１％酵母抽出物、０．５％バクトトリプト
ン、０．５％塩化ナトリウム）で培養した後に希釈して
ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）
にシャーレ一枚当たりコロニーが１００個程度出現する
ように塗布し、再度32Ｐ標識ＤＮＡ断片を用いたハイブ
リダイゼーション法を行うことによりポジティブクロー
ンを純化した。
００コロニー相当）に３０ｍｌのプレハイブリダイゼー
ション液［１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸
（ｐＨ７．５）、２００μｇ／ｍｌ鱒精子ＤＮＡ］に６
５℃で３０分浸した。この間に実施例４で作製した１９
４ｂｐのＤＮＡ断片をＰｈａｒｍａｃｉａ社製ＲＴＧＤ
ＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、添付の説
明書に従い32Ｐ標識した。次にこの32Ｐ標識ＤＮＡ断片
を１μＣｉ／ｍｌの濃度で含むハイブリダイゼーション
液［１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ
７．５）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、２０
０μｇ／ｍｌ鱒精子ＤＮＡ］２５ｍｌ中に上述のフィル
ターを６５℃で１６時間浸した。その後メンブレンを取
り出し２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中での洗浄を室
温で２回行い、更に０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶
液中で６５℃で１５分の洗浄を２回行った後にオートラ
ジオグラフィーを取った。この結果、２枚１組のメンブ
レンのオートラジオグラフィー上のポジティブなシグナ
ルが一致したコロニーが５個得られた。このコロニーを
ＬＢ培地（１％酵母抽出物、０．５％バクトトリプト
ン、０．５％塩化ナトリウム）で培養した後に希釈して
ＬＢ寒天培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）
にシャーレ一枚当たりコロニーが１００個程度出現する
ように塗布し、再度32Ｐ標識ＤＮＡ断片を用いたハイブ
リダイゼーション法を行うことによりポジティブクロー
ンを純化した。
【００３５】実施例５ ＤＮＡ断片のサブクローニング
及び塩基配列の決定 純化したポジティブクローンのうちの一つからプラスミ
ドＤＮＡ（ｐＵＡＭ１Ｐ５）を常法（「モレキュラーク
ローニング」，コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー，８６−９６頁（１９８２））に従い調製し、必要な
ＤＮＡ領域を適宜制限酵素で小断片化した後にプラスミ
ドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングを行った。得
られたサブクローンからプラスミドＤＮＡを常法により
調製し、デュポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩ
Ｓ２０００システムを用いて、配列を決定した。シーク
エンスプライマーとして次の２種の合成プライマー５′
ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列
表の配列番号７）、５′ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴ
ＡＴＧＡＣ）３′（配列表の配列番号８）を使用し、該
ＤＮＡ断片の＋鎖、一鎖の塩基配列を決定した。この結
果、配列表の配列番号４に示すような塩基配列が得られ
た。
及び塩基配列の決定 純化したポジティブクローンのうちの一つからプラスミ
ドＤＮＡ（ｐＵＡＭ１Ｐ５）を常法（「モレキュラーク
ローニング」，コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー，８６−９６頁（１９８２））に従い調製し、必要な
ＤＮＡ領域を適宜制限酵素で小断片化した後にプラスミ
ドベクターｐＵＣ１９にサブクローニングを行った。得
られたサブクローンからプラスミドＤＮＡを常法により
調製し、デュポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩ
Ｓ２０００システムを用いて、配列を決定した。シーク
エンスプライマーとして次の２種の合成プライマー５′
ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列
表の配列番号７）、５′ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴ
ＡＴＧＡＣ）３′（配列表の配列番号８）を使用し、該
ＤＮＡ断片の＋鎖、一鎖の塩基配列を決定した。この結
果、配列表の配列番号４に示すような塩基配列が得られ
た。
【００３６】実施例６ ＡＭ１タンパク質発現プラスミ
ドの構築と形質転換体の取得 実施例５で得たＡＭ１タンパク質遺伝子ＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＵＡＭ１Ｐ５（図１）ＤＮＡ２μｇを制限酵
素ＳａｌＩとＥｃｏＲＶで消化した後にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により目的のＡＭ１タンパク質コード
領域を含むＤＮＡ断片を分離した後フェノール／クロロ
ホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片
を精製し１０μｌの滅菌水に溶解した。この断片を挿入
する発現ベクターには、ｐＵＳＩ２（特開平１−９５７
９８号公報）の誘導体であるｐＥＶ２３を用いた。ｐＥ
Ｖ２３は、ｐＵＳＩ２のｔａｃプロモーターをより強力
なプロモーターであるｔｒｃプロモーターに置き換え、
さらにクローニング部位を改変して調整した。ｐＥＶ２
３のＤＮＡ１μｇを制限酵素ＸｈｏＩで切断後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、さらに制限酵素Ｓａ
ｌＩで切断した後フェノール／クロロホルム抽出を行
い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を精製し１００
μｌの滅菌水に溶解した。このベクターＤＮＡ１μｌ
（１０ｎｇ相当）と先に分離したＤＮＡ断片を含む溶液
１μｌとを混ぜ、両者をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造６０２１）を用いて連結した。この反応液を用
いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らの方法（「モレキュラークローニング」，３６５−３
８１頁（１９８２））に従い解析することにより、ニト
リルヒドラターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入された
ＡＭ１タンパク質発現プラスミド、ｐＥＡＭ１（図２）
を含有する形質転換体を得た。
ドの構築と形質転換体の取得 実施例５で得たＡＭ１タンパク質遺伝子ＤＮＡを含むプ
ラスミドｐＵＡＭ１Ｐ５（図１）ＤＮＡ２μｇを制限酵
素ＳａｌＩとＥｃｏＲＶで消化した後にポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により目的のＡＭ１タンパク質コード
領域を含むＤＮＡ断片を分離した後フェノール／クロロ
ホルム抽出を行い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片
を精製し１０μｌの滅菌水に溶解した。この断片を挿入
する発現ベクターには、ｐＵＳＩ２（特開平１−９５７
９８号公報）の誘導体であるｐＥＶ２３を用いた。ｐＥ
Ｖ２３は、ｐＵＳＩ２のｔａｃプロモーターをより強力
なプロモーターであるｔｒｃプロモーターに置き換え、
さらにクローニング部位を改変して調整した。ｐＥＶ２
３のＤＮＡ１μｇを制限酵素ＸｈｏＩで切断後、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、さらに制限酵素Ｓａ
ｌＩで切断した後フェノール／クロロホルム抽出を行
い、エタノール沈澱により該ＤＮＡ断片を精製し１００
μｌの滅菌水に溶解した。このベクターＤＮＡ１μｌ
（１０ｎｇ相当）と先に分離したＤＮＡ断片を含む溶液
１μｌとを混ぜ、両者をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造６０２１）を用いて連結した。この反応液を用
いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らの方法（「モレキュラークローニング」，３６５−３
８１頁（１９８２））に従い解析することにより、ニト
リルヒドラターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入された
ＡＭ１タンパク質発現プラスミド、ｐＥＡＭ１（図２）
を含有する形質転換体を得た。
【００３７】実施例７ 形質転換体を用いたＡＭ１タン
パク質の産生とニトリル類のアミド類への変換 実施例６で得られたｐＥＡＭ１を含有する形質転換体を
１０ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）
培地に接種し２７℃で一晩（１２〜１６時間）培養し、
この培養液を１０ｍｌのＬＢ（アンピシリン５０μｇ／
ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ2 ・５Ｈ2 Ｏ含有）に
１／１００量（０．１ｍｌ）加えて２７℃で２時間培養
した後、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃
度１ｍＭになるよう添加し、さらに２７℃で１２時間培
養した。菌体を遠心分離により集め、これを生理食塩水
で一回洗浄したのち１．６ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、０．１Ｍ）に懸濁した。このうち０．３２ｍｌ
をサンプリングし、７％アクリロニトリル水溶液８０μ
ｌを混和し、３０℃で１時間反応させた。反応終了後、
反応液中のアクリルアミドと未反応のアクリロニトリル
を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出したとこ
ろ、反応液中にはアクリルアミドが検出され、アクリロ
ニトリルは検出されなかった。
パク質の産生とニトリル類のアミド類への変換 実施例６で得られたｐＥＡＭ１を含有する形質転換体を
１０ｍｌのＬＢ（５０μｇ／ｍｌのアンピシリン含有）
培地に接種し２７℃で一晩（１２〜１６時間）培養し、
この培養液を１０ｍｌのＬＢ（アンピシリン５０μｇ／
ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ2 ・５Ｈ2 Ｏ含有）に
１／１００量（０．１ｍｌ）加えて２７℃で２時間培養
した後、プロモーターの転写誘導剤であるＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を終濃
度１ｍＭになるよう添加し、さらに２７℃で１２時間培
養した。菌体を遠心分離により集め、これを生理食塩水
で一回洗浄したのち１．６ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０、０．１Ｍ）に懸濁した。このうち０．３２ｍｌ
をサンプリングし、７％アクリロニトリル水溶液８０μ
ｌを混和し、３０℃で１時間反応させた。反応終了後、
反応液中のアクリルアミドと未反応のアクリロニトリル
を高速液体クロマトグラフィーを用いて検出したとこ
ろ、反応液中にはアクリルアミドが検出され、アクリロ
ニトリルは検出されなかった。
【００３８】これに対し上記発現プラスミド、ｐＥＡＭ
１を含まない大腸菌ＤＨ５α株を用いて同様な試験を行
ったところ、反応終了後の反応液中にアクリルアミドが
検出できなかった。なお培地中のコバルトは必須で、コ
バルトを含まない培地を用いてｐＥＡＭ１を含有する形
質転換体を培養した場合には、同様な試験において反応
終了後の反応液中にアクリルアミドが検出できなかっ
た。
１を含まない大腸菌ＤＨ５α株を用いて同様な試験を行
ったところ、反応終了後の反応液中にアクリルアミドが
検出できなかった。なお培地中のコバルトは必須で、コ
バルトを含まない培地を用いてｐＥＡＭ１を含有する形
質転換体を培養した場合には、同様な試験において反応
終了後の反応液中にアクリルアミドが検出できなかっ
た。
【００３９】実施例８ 形質転換体からのＡＭ１タンパ
ク質の精製と部分配列決定 実施例７の方法で培養した形質転換体１ｇを生理食塩水
で１回洗浄した後、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／Ｎ
ａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し
た。この懸濁液を氷水で冷やしながら超音波破砕（１０
０Ｗ、５分間）し、２５，０００×ｇで２０分間遠心分
離した後の上清を回収した。この上清を実施例１と同様
に硫安分画、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムク
ロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラ
ムクロマトグラフィー、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００Ｓ
Ｗカラムクロマトグラフィーの順に精製を行い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与える精製
標品を得た。この精製標品はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓ
ｐ．ＭＣＩ２６０９株から精製したＡＭ１タンパク質と
同等の分子量と比活性を有していた。
ク質の精製と部分配列決定 実施例７の方法で培養した形質転換体１ｇを生理食塩水
で１回洗浄した後、緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／Ｎ
ａＯＨ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し
た。この懸濁液を氷水で冷やしながら超音波破砕（１０
０Ｗ、５分間）し、２５，０００×ｇで２０分間遠心分
離した後の上清を回収した。この上清を実施例１と同様
に硫安分画、Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムク
ロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラ
ムクロマトグラフィー、ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００Ｓ
Ｗカラムクロマトグラフィーの順に精製を行い、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与える精製
標品を得た。この精製標品はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓ
ｐ．ＭＣＩ２６０９株から精製したＡＭ１タンパク質と
同等の分子量と比活性を有していた。
【００４０】
【発明の効果】本発明により、αサブユニット、βサブ
ユニットの二つのサブユニットのアミノ酸配列を有し、
ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする新規なＤＮＡ断片が得られ、その塩基配列が明ら
かにされた。そして本発明で構築した発現プラスミドを
有する形質転換体を培養することにより得られる菌体、
菌体抽出物等を用いることでニトリル化合物をその対応
するアミド化合物に変換させることが可能となった。本
発明の方法を用いることによりニトリル類よりアミド類
を効率よく製造することができる。
ユニットの二つのサブユニットのアミノ酸配列を有し、
ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコー
ドする新規なＤＮＡ断片が得られ、その塩基配列が明ら
かにされた。そして本発明で構築した発現プラスミドを
有する形質転換体を培養することにより得られる菌体、
菌体抽出物等を用いることでニトリル化合物をその対応
するアミド化合物に変換させることが可能となった。本
発明の方法を用いることによりニトリル類よりアミド類
を効率よく製造することができる。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：２０１−２０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 配列 Xaa Ser His Gln His Asp His Asp His Thr Glu Pro Pro Ala Asp Ile 1 5 10 15 Glu Leu Arg Val Arg Ala Leu Glu Ser Leu Leu Gln Glu Lys Gly Leu 20 25 30 Ile Asp Pro Ala Ala Leu Asp Glu Leu Ile Asp Thr Tyr Glu His Lys 35 40 45 Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Gln Val Val Ala Lys Ala Trp Ser Asp 50 55 60 Pro Glu Tyr Lys Arg Arg Leu Leu Ala Asp Ala Thr Ala Ala Ile Ala 65 70 75 80 Glu Leu Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp Met Gln Val Val Glu 85 90 95 Asn Thr Pro Asp Val His Asn Val Thr Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys 100 105 110 Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Ala 115 120 125 Pro Tyr Arg Ser Arg Ile Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu 130 135 140 Phe Gly Val Asn Ile Pro Glu Ser Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser 145 150 155 160 Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 165 170 175 Asp Gly Trp Ser Glu Ala Gln Leu Ile Glu Leu Val Thr Arg Asp Ser 180 185 190 Met Ile Gly Thr Gly Leu Val Ala Ala Pro 195 200 （上記式中Ｘａａは欠失またはＭｅｔを表す）
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：２１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 配列 Met Asn Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Met His Gly Leu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Leu Asn Glu Glu Asn Glu Pro Tyr Phe His His Glu Trp Glu Arg Arg 20 25 30 Val Phe Pro Leu Phe Ala Ser Leu Phe Val Gly Gly His Phe Asn Val 35 40 45 Asp Glu Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asp Pro Ala His Tyr Leu 50 55 60 Glu Ala Ser Tyr Tyr Glu His Trp Leu His Ala Phe Glu Thr Leu Leu 65 70 75 80 Leu Glu Lys Gly Val Ile Thr Ala Asp Glu Leu Trp Gly Gly Ser Thr 85 90 95 Pro Ala Pro Cys Ala Pro Gly Thr Pro Val Leu Thr Gln Asp Ile Val 100 105 110 Ala Met Val Val Ser Thr Gly Ala Ser Ala Arg Val Ser His Asp Ile 115 120 125 Ala Pro Arg Phe Lys Ala Gly Asp Arg Val Arg Ala Lys Asn Ile Asn 130 135 140 Pro Thr Thr His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Val Arg Gly Lys Ile Gly 145 150 155 160 Arg Ile Glu Thr Asp His Gly Val Phe Ile Thr Pro Asp Thr Ala Ala 165 170 175 His Gly Leu Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Ser Val Ser Phe Thr 180 185 190 Ala Leu Glu Leu Trp Gly Thr Pro Arg Pro Asp Asn Val Tyr Ile Asp 195 200 205 Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Glu Ala 210 215
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：１９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 直接の起源 クローン名：ＡＭ１ｃ１ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（partial amino acid seq
uence of α subunit） 存在位置：１．．１９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGG CCN RTN CTN GGN YTN CCA CCG GTG TGG TAC AAA TCG GCC CCC TAT 48 Trp Pro Xa1 Leu Gly Xa2 Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr 1 5 10 15 CGT TCG CGT ATT GTT ATC GAC CCG CGC GGC GTT CTG GCC GAA TTC GGG 96 Arg Ser Arg Ile Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly 20 25 30 GTA AAC ATT CCA GAA AGT AAA GAG GTG CGC GTC TGG GAC AGC AGC GCG 144 Val Asn Ile Pro Glu Ser Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala 35 40 45 GAA CTG CGC TAT CTG GTC CTG CCA GAA CGT CCN GCN GGN ACN GAY GGN 192 Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 TG 194 （上記式中ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＹはＣまた
はＴ、Ｘａ１はＶａｌまたはＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ
２はＬｅｕまたはＰｈｅを表す）
uence of α subunit） 存在位置：１．．１９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGG CCN RTN CTN GGN YTN CCA CCG GTG TGG TAC AAA TCG GCC CCC TAT 48 Trp Pro Xa1 Leu Gly Xa2 Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr 1 5 10 15 CGT TCG CGT ATT GTT ATC GAC CCG CGC GGC GTT CTG GCC GAA TTC GGG 96 Arg Ser Arg Ile Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly 20 25 30 GTA AAC ATT CCA GAA AGT AAA GAG GTG CGC GTC TGG GAC AGC AGC GCG 144 Val Asn Ile Pro Glu Ser Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala 35 40 45 GAA CTG CGC TAT CTG GTC CTG CCA GAA CGT CCN GCN GGN ACN GAY GGN 192 Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 TG 194 （上記式中ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＹはＣまた
はＴ、Ｘａ１はＶａｌまたはＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ
２はＬｅｕまたはＰｈｅを表す）
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１２４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 直接の起源 クローン名：ｐＵＡＭ１Ｐ５ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（α subunit） 存在位置：１．．６０６ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（β subunit） 存在位置：６２５．．１２４５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGAGCCATC AACACGACCA CGACCATACT GAACCGCCGG CGGACATCGA GCTACGCGTC 60 CGGGCGCTGG AATCCCTGCT ACAGGAGAAA GGACTGATTG ACCCGGCGGC ACTGGATGAA 120 CTGATTGACA CTTATGAGCA CAAGGTCGGC CCCCGTAACG GCGCGCAGGT GGTCGCTAAA 180 GCGTGGAGTG ATCCGGAGTA TAAACGTCGG CTGCTGGCGG ACGCCACAGC CGCCATCGCC 240 GAGCTGGGTT TCTCCGGCGT GCAGGGTGAA GACATGCAGG TAGTGGAGAA CACGCCGGAC 300 GTGCACAACG TGACCGTCTG TACATTATGT TCCTGCTACC CCTGGCCGGT GCTGGGTCTG 360 CCACCGGTGT GGTACAAATC GGCCCCCTAT CGTTCGCGTA TTGTTATCGA CCCGCGCGGC 420 GTTCTGGCCG AATTCGGGGT AAACATTCCA GAAAGTAAAG AGGTGCGCGT CTGGGACAGC 480 AGCGCGGAAC TGCGCTATCT GGTCCTGCCA GAACGTCCGG CGGGTACCGA CGGCTGGAGC 540 GAAGCGCAGC TGATCGAACT GGTCACCCGC GATTCCATGA TCGGCACCGG CCTGGTCGCC 600 GCGCCATAAT AAGAGGAGAA AACCATGAAC GGGATACATG ATCTGGGCGG TATGCACGGC 660 CTCGGGCCGA TCCTCAACGA GGAAAATGAG CCGTATTTCC ATCATGAATG GGAGCGCCGG 720 GTATTTCCGC TGTTCGCCTC GCTGTTCGTC GGCGGACATT TCAATGTTGA TGAATTCCGC 780 CACGCCATTG AACGCATGGA TCCAGCCCAC TACCTGGAGG CGAGCTACTA CGAGCACTGG 840 TTGCACGCAT TTGAAACGCT GCTGCTGGAA AAAGGGGTGA TCACCGCCGA TGAACTCTGG 900 GGTGGCTCGA CCCCTGCCCC CTGCGCTCCG GGCACGCCGG TGCTGACGCA GGACATCGTG 960 GCGATGGTTG TCAGTACCGG CGCCTCCGCG CGCGTCAGTC ACGATATTGC TCCCCGCTTT 1020 AAGGCCGGAG ACCGGGTTCG GGCAAAAAAC ATCAACCCAA CCACCCACAC CCGCCTGCCG 1080 CGTTACGTGC GCGGGAAAAT CGGCCGTATT GAGACCGATC ATGGCGTGTT CATCACGCCG 1140 GACACCGCAG CGCACGGTCT GGGCGAACAT CCTCAGCACG TCTACAGCGT CAGCTTCACC 1200 GCGCTGGAAC TGTGGGGCAC GCCGCGCCCG GACAACGTGT ACATCGATCT GTGGGACGAC 1260 TATCTGGAGG AAGCATGA 1278
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGGCCIRTIC TIGGIYTICC 20 （上記式中ＲはＧまたはＡ、Ｉはイノシン、ＹはＣまた
はＴを表す）
はＴを表す）
【００４６】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAICCRTCIG TICCIKCIGG 20 （上記式中ＲはＧまたはＡ、Ｉはイノシン、ＹはＣまた
はＴ、ＫはＧまたはＴを表す）
はＴ、ＫはＧまたはＴを表す）
【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17
【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【図１】本発明のＡＭ１タンパク質をコードする遺伝子
領域を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドクローン、ｐ
ＵＡＭ１Ｐ５の構築を表す図面である。図中Ａｐr はア
ンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは複製開始領域を、α
とβの矢印はそれぞれニトリルヒドラターゼのα、βサ
ブユニットを表す。
領域を含むＤＮＡ断片を有するプラスミドクローン、ｐ
ＵＡＭ１Ｐ５の構築を表す図面である。図中Ａｐr はア
ンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉは複製開始領域を、α
とβの矢印はそれぞれニトリルヒドラターゼのα、βサ
ブユニットを表す。
【図２】本発明のＡＭ１タンパク質を発現するベクター
ｐＥＡＭ１の構築を表す図面である。図中、Ａｍｐr 、
ｏｒｉ、αとβの矢印は図１と同様であり、ｌａｃＩq
はリプレッサー遺伝子を、Ｐtrc はｔｒｃプロモーター
を、ｌｐｐ３’はｌｐｐ遺伝子ターミネーター領域を表
す。
ｐＥＡＭ１の構築を表す図面である。図中、Ａｍｐr 、
ｏｒｉ、αとβの矢印は図１と同様であり、ｌａｃＩq
はリプレッサー遺伝子を、Ｐtrc はｔｒｃプロモーター
を、ｌｐｐ３’はｌｐｐ遺伝子ターミネーター領域を表
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：１９４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 直接の起源 クローン名：ＡＭ１ｃ１ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（partial amino acid seq
uence of α subunit） 存在位置：１．．１９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGG CCN RTN CTN GGN YTN CCA CCG GTG TGG TAC AAA TCG GCC CCC TAT 48 Trp Pro Xa1 Leu Gly Xa2 Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr 1 5 10 15 CGT TCG CGT ATC GTT ATC GAC CCG CGC GGC GTT CTG GCC GAA TTC GGG 96 Arg Ser Arg Ile Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly 20 25 30 GTA AAC ATT CCA GAA AGT AAA GAG GTG CGC GTC TGG GAC AGC AGC GCG 144 Val Asn Ile Pro Glu Ser Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala 35 40 45 GAA CTG CGC TAT CTG GTC CTG CCA GAA CGT CCN GCN GGN ACN GAY GGN 192 Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 TG 194 （上記式中ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＹはＣまた
はＴ、Ｘａ１はＶａｌまたはＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ
２はＬｅｕまたはＰｈｅを表す）
uence of α subunit） 存在位置：１．．１９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGG CCN RTN CTN GGN YTN CCA CCG GTG TGG TAC AAA TCG GCC CCC TAT 48 Trp Pro Xa1 Leu Gly Xa2 Pro Pro Val Trp Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr 1 5 10 15 CGT TCG CGT ATC GTT ATC GAC CCG CGC GGC GTT CTG GCC GAA TTC GGG 96 Arg Ser Arg Ile Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly 20 25 30 GTA AAC ATT CCA GAA AGT AAA GAG GTG CGC GTC TGG GAC AGC AGC GCG 144 Val Asn Ile Pro Glu Ser Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala 35 40 45 GAA CTG CGC TAT CTG GTC CTG CCA GAA CGT CCN GCN GGN ACN GAY GGN 192 Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly 50 55 60 TG 194 （上記式中ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれか、ＹはＣまた
はＴ、Ｘａ１はＶａｌまたはＩｌｅまたはＭｅｔ、Ｘａ
２はＬｅｕまたはＰｈｅを表す）
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：１２４８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源 生物名：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．ＭＣＩ２６０９ 直接の起源 クローン名：ｐＵＡＭ１Ｐ５ 配列の特徴 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（α subunit） 存在位置：１．．６０６ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：Ｐ ＣＤＳ（β subunit） 存在位置：６２５．．１２４５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGAGCCATC AACACGACCA CGACCATACT GAACCGCCGG CGGACATCGA GCTACGCGTC 60 CGGGCGCTGG AATCCCTGCT ACAGGAGAAA GGACTGATTG ACCCGGCGGC ACTGGATGAA 120 CTGATTGACA CTTATGAGCA CAAGGTCGGC CCCCGTAACG GCGCGCAGGT GGTCGCTAAA 180 GCGTGGAGTG ATCCGGAGTA TAAACGTCGG CTGCTGGCGG ACGCCACAGC CGCCATCGCC 240 GAGCTGGGTT TCTCCGGCGT GCAGGGTGAA GACATGCAGG TAGTGGAGAA CACGCCGGAC 300 GTGCACAACG TGACCGTCTG TACATTATGT TCCTGCTACC CCTGGCCGGT GCTGGGTCTG 360 CCACCGGTGT GGTACAAATC GGCCCCCTAT CGTTCGCGTA TCGTTATCGA CCCGCGCGGC 420 GTTCTGGCCG AATTCGGGGT AAACATTCCA GAAAGTAAAG AGGTGCGCGT CTGGGACAGC 480 AGCGCGGAAC TGCGCTATCT GGTCCTGCCA GAACGTCCGG CGGGTACCGA CGGCTGGAGC 540 GAAGCGCAGC TGATCGAACT GGTCACCCGC GATTCCATGA TCGGCACCGG CCTGGTCGCC 600 GCGCCATAAT AAGAGGAGAA AACCATGAAC GGGATACATG ATCTGGGCGG TATGCACGGC 660 CTCGGGCCGA TCCTCAACGA GGAAAATGAG CCGTATTTCC ATCATGAATG GGAGCGCCGG 720 GTATTTCCGC TGTTCGCCTC GCTGTTCGTC GGCGGACATT TCAATGTTGA TGAATTCCGC 780 CACGCCATTG AACGCATGGA TCCAGCCCAC TACCTGGAGG CGAGCTACTA CGAGCACTGG 840 TTGCACGCAT TTGAAACGCT GCTGCTGGAA AAAGGGGTGA TCACCGCCGA TGAACTCTGG 900 GGTGGCTCGA CCCCTGCCCC CTGCGCTCCG GGCACGCCGG TGCTGACGCA GGACATCGTG 960 GCGATGGTTG TCAGTACCGG CGCCTCCGCG CGCGTCAGTC ACGATATTGC TCCCCGCTTT 1020 AAGGCCGGAG ACCGGGTTCG GGCAAAAAAC ATCAACCCAA CCACCCACAC CCGCCTGCCG 1080 CGTTACGTGC GCGGGAAAAT CGGCCGTATT GAGACCGATC ATGGCGTGTT CATCACGCCG 1140 GACACCGCAG CGCACGGTCT GGGCGAACAT CCTCAGCACG TCTACAGCGT CAGCTTCACC 1200 GCGCTGGAAC TGTGGGGCAC GCCGCGCCCG GACAACGTGT ACATCGATCT GTGGGACGAC 1260 TATCTGGAGG AAGCATGA 1278
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/02 2121−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (10)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする新規なタンパク質。 ２種のサブユニットから構成され、ゲル濾過法によ
る分子量が約１２０，０００の水溶性酵素タンパク質で
あって、サブユニットのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動による分子量が以下の通りである。 サブユニットα 分子量 ２８，０００±５００ サブユニットβ 分子量 ２９，０００±５００ ニトリルヒドラターゼ活性を有する。 - 【請求項２】 サブユニットαが配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項
１記載のタンパク質。 - 【請求項３】 サブユニットβが配列表の配列番号２に
記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする請求項
１記載のタンパク質。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
ク質をコードする遺伝子。 - 【請求項５】 配列表の配列番号３または４に記載の塩
基配列で表されることを特徴とする請求項４記載の遺伝
子。 - 【請求項６】 配列表の配列番号５及び６に記載の合成
ＤＮＡで増幅されることを特徴とするＤＮＡ断片。 - 【請求項７】 請求項４または５に記載の遺伝子により
コードされるポリペプチドを発現する組換え発現ベクタ
ー。 - 【請求項８】 請求項７記載の組換え発現ベクターで、
宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換体。 - 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体を培養して請
求項１に記載のタンパク質を産生させる方法。 - 【請求項１０】 請求項８記載の形質転換体を培養して
得られる形質転換体の培養液、該培養液から分離された
菌体、該菌体処理物、請求項１〜３記載のタンパク質ま
たはこれらの固定化物をニトリル類に作用させて、該ニ
トリル類に対応するアミド類を製造することを特徴とす
るアミド類の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5089968A JPH06303971A (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5089968A JPH06303971A (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303971A true JPH06303971A (ja) | 1994-11-01 |
Family
ID=13985491
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5089968A Pending JPH06303971A (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | ニトリルヒドラターゼ活性を有する新規なタンパク質およびそれをコードする遺伝子ならびに該遺伝子を含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06303971A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997012964A3 (en) * | 1995-10-06 | 1997-06-19 | Du Pont | Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides |
| US5807730A (en) * | 1996-02-14 | 1998-09-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | Nitrile hydratase |
| WO2005116206A1 (ja) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| EP1842907A1 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-10 | B.R.A.I.N. Ag | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| JP2019176836A (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 三井化学株式会社 | ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法及びアミド化合物の製造方法 |
-
1993
- 1993-04-16 JP JP5089968A patent/JPH06303971A/ja active Pending
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888785A (en) * | 1995-10-06 | 1999-03-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for using hydratase or a hydratase-amidase fusion for stereospecifically bioconverting certain racemic nitriles to the corresponding enatiomeric R--or S-amide or s-carboxylic acid |
| US6133421A (en) * | 1995-10-06 | 2000-10-17 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Polypeptides and polypeptide subunits of a stereospecific nitrile hydratase enzyme |
| US6251650B1 (en) | 1995-10-06 | 2001-06-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudomonas putida amidase polypeptide useful for the production of chiral amides and acids |
| WO1997012964A3 (en) * | 1995-10-06 | 1997-06-19 | Du Pont | Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides |
| US5807730A (en) * | 1996-02-14 | 1998-09-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | Nitrile hydratase |
| US5910432A (en) * | 1996-02-14 | 1999-06-08 | Mitsui Chemicals, Inc. | Nitrile hydratase |
| US7803578B2 (en) | 2004-05-26 | 2010-09-28 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Heat-resistant nitrile hydratase |
| WO2005116206A1 (ja) * | 2004-05-26 | 2005-12-08 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| KR101265508B1 (ko) * | 2004-05-26 | 2013-05-21 | 다이야니트릭스 가부시키가이샤 | 개량형 니트릴 하이드라타제 |
| US7645605B2 (en) | 2004-05-26 | 2010-01-12 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd | Heat-resistant nitrile hydratase |
| WO2007115797A3 (en) * | 2006-04-07 | 2008-03-06 | B R A I N Ag | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| US20100047863A1 (en) * | 2006-04-07 | 2010-02-25 | B.R.A.I.N. Ag | Group of novel enantiosleective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| EP2261327A2 (en) | 2006-04-07 | 2010-12-15 | B.R.A.I.N. Ag | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| EP1842907A1 (en) | 2006-04-07 | 2007-10-10 | B.R.A.I.N. Ag | A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| US8470576B2 (en) | 2006-04-07 | 2013-06-25 | B.R.A.I.N. Ag | Group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity |
| JP2019176836A (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 三井化学株式会社 | ニトリルヒドラターゼを含む菌体処理物の製造方法及びアミド化合物の製造方法 |
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