JPH06303983A - 大麦β−アミラーゼ、その遺伝子、それを含有する組換ベクター並びに該ベクターを含有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 大麦β−アミラーゼの1775塩基からなるcDNA
の全塩基配列を決定し、β−アミラーゼの一次構造を明
らかにするとともに、該cDNAを発現ベクターに組み込ん
で、さらに該ベクターを微生物に組み込んで組換えβ−
アミラーゼを得た。 【効果】 安定した且つ安価で効率の良い組換えβ−ア
ミラーゼの生産が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】本発明は、大麦β−アミラーゼ遺伝子、そ
れを含有する組換えベクター並びに組換えβ−アミラー
ゼに関する。

【０００２】

【背景技術】大麦β−アミラーゼは大豆β−アミラーゼ
とともに、輸液用マルトースや食品用マルトースの生産
に産業上有用なβ−アミラーゼ（1,4-α-D- グルカンマ
ルトヒドロラーゼ [EC 3.2.1.2] ）である。しかし、世
界的見地から将来の食糧事情を考慮した場合、飼料用お
よび食品（ビール、ウイスキーなど）製造用としての主
要農産物である大麦にその供給源を頼ることは有利な方
策とはいえず、今から何らかの他の供給源を見出してお
く必要がある。

【０００３】大麦β−アミラーゼ遺伝子の微生物による
効率的発現生産が可能となれば、安定した且つ安価な大
麦β−アミラーゼの供給が可能となり、大いにマルトー
ス生産に貢献することができる。

【０００４】大麦β−アミラーゼの遺伝子としては、品
種Hiproly の1754塩基からなるcDNAの全塩基配列が報告
されており、535 残基からなるアミノ酸配列が明らかに
されている（Eur. J. Biochem., 169, 517 (1987) ）。
しかし蛋白質の一次構造が明らかになっているのみで、
組換え大麦β−アミラーゼ生産の試みはなされていな
い。また蛋白質工学的手法による当該酵素の改良の試み
なども行われていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、大麦
β−アミラーゼの遺伝子およびそれを含有する組換えベ
クターを提供し、さらに、該ベクターを微生物に組み込
んでそれによって効率良く生産される組換えβ−アミラ
ーゼを提供することである。

【０００６】

【発明の開示】本発明者は、上記の目的を達成するため
に鋭意研究を重ねた結果、大麦β−アミラーゼの1775塩
基からなるcDNAの全塩基配列を決定し、β−アミラーゼ
の一次構造を明らかにするとともに、該cDNAを発現ベク
ターに組み込んでβ−アミラーゼを微生物により生産す
ることによって、大麦由来のβ−アミラーゼとほぼ同一
の組換えβ−アミラーゼが得られることを見出し、本発
明を完成するに至った。従って本発明は、配列表の配列
番号１に示すアミノ酸配列をコードする大麦β−アミラ
ーゼ遺伝子である。

【０００７】本発明の大麦β−アミラーゼ遺伝子の具体
例としては、配列表の配列番号2 に示す塩基配列で表さ
れるものを挙げることができる。

【０００８】本発明はまた、配列表の配列番号１に示す
アミノ酸配列をコードする大麦β−アミラーゼ遺伝子ま
たは配列表の配列番号２に示す塩基配列で表されるDNA
を含有する組換えベクターを提供するものである。

【０００９】本発明はまた、上記ベクターを含有しβ−
アミラーゼを生産するエシェリヒア・コリに関する。

【００１０】本発明はさらに、配列表の配列番号３に示
すアミノ酸配列を有する組換えβ−アミラーゼを提供す
るものである。

【００１１】本発明の組換えβ−アミラーゼ遺伝子の具
体例としては、配列表の４に示す塩基配列で表されるも
のを挙げることができる。

【００１２】本発明の組換えβ−アミラーゼ発現ベクタ
ーの具体例としては、配列表の配列番号５に示す塩基配
列で表されるものを挙げることができる。

【００１３】本明細書中、大麦β−アミラーゼとは大麦
もしくは大麦の麦芽が含有するβ−アミラーゼを意味す
る。

【００１４】以下に、本発明の遺伝子、組換えベクター
および組換えβ−アミラーゼを製造するための具体的な
手段を説明する。

【００１５】(1) 大麦β−アミラーゼcDNAのクローン化 大麦β−アミラーゼのRNA の分離は、登熟種子の胚乳を
氷冷下グアニジウムチオシアネート溶液中で破砕した後
LiClでRNA を選択的に沈澱させるか、塩酸グアニジン溶
液中で破砕した後、超遠心を行なうことにより行うこと
ができる。RNAを精製するには、常法にしたがって、フ
ェノール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、アルコ
ール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせること
により行う。

【００１６】mRNAはRNA をオリゴdTセルロースカラム
（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69,1408 (1972) ）を
通すことによって精製することができる。

【００１７】mRNAに逆転写酵素とDNA ポリメラーゼを順
次作用させることによりcDNAを合成できる（Gene, 25,
263 (1983)）。このcDNAに、種々のリンカーやアダプタ
ーをDNA リガーゼの作用により連結させた後、適当なフ
ァージ、プラスミドに挿入して組換えcDNAを作成する。

【００１８】宿主微生物としては、組換えcDNAが安定に
維持され、且つ自律的増殖ができるものであればいずれ
も使用できる。例えば、エシェリヒア・コリを使用する
ことができる。

【００１９】宿主微生物に組換えcDNAを導入する方法は
公知の方法でよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア・
コリの場合にはコンピテントセル法（J. Mol. Biol., 5
3,159 (1970)）を採用することができる。

【００２０】λファージDNA であれば、インビトロパッ
ケイジング法（Methods in Enzymology, 68, 299 (197
9)）によりλファージ粒子を作成した後、エシェリヒア
・コリの培養菌懸濁液に添加して、大麦β−アミラーゼ
cDNAを保有する特殊形質導入λファージを作成する。

【００２１】大麦β−アミラーゼcDNAが導入された形質
転換微生物の選択は、大麦β−アミラーゼの抗体、もし
くは大麦β−アミラーゼの部分アミノ酸配列からデザイ
ンした合成オリゴヌクレオチドをプローブとして選択す
ることができる（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 1
194 (1983)、“Molecular Cloning, A LaboratoryManua
l”, p.316 (1982)）。

【００２２】大麦β−アミラーゼcDNAは、mRNAからRNA-
PCR キット（宝酒造社製）により直接得ることもでき
る。

【００２３】(2) cDNA塩基配列の決定 塩基配列の決定は、マキサム- ギルバートの化学修飾法
（Methods in Enzymology, 65, 499 (1980) ）やジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法（Gene, 19, 269 (1982)）な
どにより決定することができる。

【００２４】大麦β−アミラーゼのアミノ酸配列は、塩
基配列より解読することができる。 (3) 大麦β−アミラーゼ発現ベクターの構築 cDNAに各種制限酵素、エキソヌクレアーゼなどを作用さ
せて、また必要に応じて各種リンカー、アダプターなど
をDNA リガーゼで連結して発現に必要なcDNA断片を調製
し、発現ベクターに挿入する。発現ベクターとしては、
宿主微生物で安定、且つ自律増殖が可能であればいずれ
を使用してもよい。

【００２５】(4) 組換え大麦β−アミラーゼの生産と精
製 発現用ベクターが導入された宿主微生物を、一定期間培
養した後、必要に応じて溶菌操作を行ない、硫安分画、
ゲル濾過やイオン交換などの各種クロマトグラフィーに
かけて組換えβ−アミラーゼの精製品を得ることができ
る。

【００２６】β−アミラーゼ活性の測定は、ジクロロフ
ェニルβーマルトペンタオサイド（小野薬品社製）を基
質として測定できる。37℃で基質に酵素を作用させ、１
分間に１μモルのジクロロフェノールを生成する酵素量
が１単位となる。

【００２７】澱粉からの酵素反応生成物は、薄層クロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ペーパー
クロマトグラフィーなどを用いて同定し、生成糖のアノ
マー型は旋光度計で測定できる。

【００２８】β−アミラーゼのN 末端アミノ酸配列は、
プロティンシークエンサー（アプライドバイオシステム
ズ社、モデル477A）によって決定することができる。

【００２９】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。

【００３０】

【実施例１】 大麦β−アミラーゼmRNAの調製 大麦品種はるな二条の受粉後23日目頃の種子から胚乳約
１g を集め、氷冷下塩酸グアニジン溶液中（4 M グアニ
ジウムイソチオシアネート、10 mM EDTA、2%Sarkosyl、
1% β−メルカプトエタノール、50 mM トリス塩酸
（pH 7.6））で破砕した。不溶物を遠心にて除去した
後、5.7 M CsCl/0.1 M EDTA 溶液に重層して42,000 rp
m、16時間超遠心してRNA を沈降させた。RNA をTE-SDS
（5 mM EDTA,1% SDS, 10 mM トリス塩酸 (pH 7.4) ）
に溶解し、エタノール沈澱後、滅菌水に溶解してRNA を
得た。

【００３１】mRNAは常法通りオリゴdTセルロースカラム
で精製した。

【００３２】

【実施例２】 全長cDNAのクローン化 670 ngのmRNA、2,5 μM のランダムヘキサマー、2.5 U
の逆転写酵素を用いて、常法により逆転写酵素反応を行
った。

【００３３】次に上流域のプライマーとして、 5'-AAGGATCCGATATCCAACAAACCATTTG-3' （配列番号６） 下流域のプライマーとして、 5'-AAGGATCCCTTTTCAGAACACACACAAG-3' （配列番号７） を用いて常法通りPCR 反応を行って、β−アミラーゼの
全長cDNAを得た。得られた全長cDNAのフィジカルマップ
を図１に示す。略号は制限酵素の切断認識部位である。

【００３４】

【実施例３】 全長cDNAの塩基配列の決定 全長cDNAを各種制限酵素を用いて分解し、プラスミドpU
C118/119に組み込んだ後、ヘルパーファージM13K07によ
り１本鎖DNA を調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖終結
法により塩基配列を決定した（配列番号２）。決定され
た塩基配列は1775塩基対よりなり、56番目のATG から始
まり1661番目のTAA で終わる1605塩基対からなるβ−ア
ミラーゼをコードする塩基配列が確認できた。

【００３５】大麦β−アミラーゼの遺伝子としては、品
種Hiproly の1754塩基からなるcDNAの全塩基配列が報告
されている（Eur. J. Biochem., 169, 517 (1987) ）。
はるな二条由来のcDNAとHiproly 由来のβ−アミラーゼ
cDNAを比較すると９ヶ所の置換が認められ、それらを各
々[ 塩基番号, はるな二条由来塩基, Hiproly 由来塩
基] で示すと次のようになる：[721, C, T] 、[75
3, C, T] 、[796, G, A] 、[923, T, C] 、[100
0, T, C]、[1095, C, T]、[1348, C, T]、[1636,
G, A]、[1696, G, A]）。

【００３６】さらに、はるな二条由来のcDNAには3'末端
に21塩基対の付加が確認できた。

【００３７】はるな二条由来のcDNAとHiproly 由来のβ
−アミラーゼcDNAの相同性は99.49%と計算された。

【００３８】

【実施例４】 大麦β−アミラーゼのアミノ酸配列（配列番号１） 決定されたはるな二条β−アミラーゼのcDNAの塩基配列
から、β−アミラーゼは535 のアミノ酸残基からなる分
子量59,610ダルトンの酵素であると考えられた。

【００３９】品種Hiproly のcDNAの塩基配列から推定さ
れている535 残基からなるβ−アミラーゼのアミノ酸配
列（Eur. J. Biochem., 169, 517(1987)）と比較する
と、３ヶ所の置換が認められ、それらを各々[ アミノ酸
残基番号, はるな二条由来アミノ酸残基, Hiproly 由来
アミノ酸残基] で示すと次のようになる：[233, Ala,
Val] 、[347, Ser, Leu] 、[527, Met, Ile] 。

【００４０】はるな二条由来のβ−アミラーゼとHiprol
y 由来のβ−アミラーゼ相同性は99.44%と計算された。

【００４１】

【実施例５】 β−アミラーゼ発現ベクターの構築 全長cDNAの5'末端側55塩基対を除去し、新たにSmaIリン
カーを連結したcDNAを調製し、プラスミドpKK223-3（フ
ァルマシア社製）のSmaIサイトに導入して新規なプラス
ミドを構築した。このプラスミドをプラスミドpBETA92
と命名した。

【００４２】プラスミドpBETA92 は6312塩基対（配列番
号5 ）の大きさで、そのフィジカルマップを図２に示
す。ここで黒塗り以外の部分はプラスミドpKK223-3由来
で、黒塗りの部分は大麦β−アミラーゼcDNA断片部分で
ある。Amp はアンピシリン耐性を示し、他の略号は制限
酵素の切断認識部位である。

【００４３】プラスミドpBETA92 をエシェリヒア・コリ
JM109 （東洋紡社製）に導入した。

【００４４】

【実施例６】 組換えβ−アミラーゼの生産 プラスミドpBETA92 で形質転換されたエシェリヒア・コ
リJM109 を液体培地（1%トリプトン, 0.5%酵母エキス,
1% 食塩, 0.005% アンピシリンナトリウム,0.1 mM
イソプロピル β-D- ガラクトピラノサイド, 水100 m
l, pH 7.0）にて37℃で30時間培養し、遠心分離を行っ
て集菌、洗浄した。リゾチーム溶液（0.2%リゾチーム,
20 mM トリス塩酸,30 mM 食塩, pH 7.5）で５分間、室
温で処理して溶菌させた後、遠心分離して粗酵素液を得
た。粗酵素液の活性は2.0 U/mlであった。

【００４５】粗酵素液0.1 mlを1% 可溶性澱粉0.1 ml
に、37℃にて１時間作用させた時の生成糖を薄層クロマ
トグラフィーで調べた。薄層クロマトグラフィーはn-プ
ロパノール/ 水（4/1 ）の溶媒系で室温、２回上昇展開
を行った後、硫酸を噴霧して行った。生成糖はマルトー
スのみであった。また旋光度計で生成糖のアノマー型を
調べたところ、β型の糖が生成されていることから、生
産された酵素がβ−アミラーゼであることが確認でき
た。

【００４６】

【参考例１】 大麦種子からのβ−アミラーゼの精製 はるな二条の種子40 gを粉砕し、360 mlの50 mM 酢酸緩
衝液（pH 5.5）/10 mMモノチオグリセロールで抽出して
粗酵素液とした。

【００４７】粗酵素液に、30% 飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを添加し、不溶物を遠心除去した液を、ブチ
ルトヨパール650S（東ソー社製）カラム（2.5 ×18.5 c
m ）に負荷した。50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.5）で溶出さ
れる活性画分を集め、15 mMトリス塩酸緩衝液(pH 8.0)
で透析した。不溶物を遠心除去した透析液を、次にDEAE
トヨパール650S（東ソー社製）カラム（2.5 × 18.5 c
m）に負荷した。15 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）/0.1
M食塩で溶出される活性画分を集め、40% 飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを添加し、遠心にて集めた沈澱物
を50 mM 酢酸緩衝液（pH5.5 ）に溶かし、同緩衝液で透
析した。さらに、この透析液を、トヨパールHW-50S（東
ソー社製）カラム（1.5 × 48.5 cm）に負荷した。50 m
M 酢酸緩衝液（pH 5.5）で溶出し、活性画分を集め、大
麦β−アミラーゼ精製酵素標品とした。精製酵素標品を
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べたところ、
分子量56,000の均一なバンドを示した。この数字は、全
長cDNAから推定されたアミノ酸配列から計算された分子
量、59,610とほぼ一致した。

【００４８】

【実施例７】 組換えβ−アミラーゼの精製と性質 プラスミドpBETA92 で形質転換されたエシェリヒア・コ
リJM109 を液体培地（1%トリプトン, 0.5%酵母エキス,
1% 食塩, 0.005% アンピシリンナトリウム,0.1 mM
イソプロピル β-D- ガラクトピラノサイド, 水1000 m
l, pH 7.0 ）にて37℃で48時間培養し、遠心分離を行っ
て集菌、洗浄した。リゾチーム溶液（0.2% リゾチー
ム, 20 mM トリス塩酸,30 mM 食塩, pH 7.5）で5 分
間、室温で処理してから30秒間超音波処理して菌体を破
砕させた後、遠心分離して粗酵素液を得た。

【００４９】粗酵素液に、30% 飽和になるように硫酸ア
ンモニウムを添加し、不溶物を遠心除去した液を、ブチ
ルトヨパール650S（東ソー社製）カラム（2.5 ×18.5 c
m ）に負荷した。50 mM 酢酸緩衝液 (pH 5.5) で溶出さ
れる活性画分を集め、15 mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.
0）で透析した。不溶物を遠心除去した透析液を、次にD
EAEトヨパール650S（東ソー社製）カラム（2.5 × 18.5
cm）に負荷した。15mMトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）/0.
05 M 食塩で溶出される活性画分を集め、70% 飽和にな
るように硫酸アンモニウムを添加し、遠心にて集めた沈
澱物を50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.5）に溶かし、同緩衝液
で透析した。さらに、この透析液を、トヨパールHW-50S
（東ソー社製）カラム（1.5 × 48.5 cm）に負荷した。
50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.5）で溶出し、活性画分を集
め、組換えβ−アミラーゼ精製酵素標品とした。精製酵
素標品をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた
ところ、参考例1 で得た大麦由来のβ−アミラーゼ標品
と同じ分子量、56,000の均一なバンドを示した。

【００５０】組換えβ−アミラーゼのN 末端アミノ酸配
列を38残基調べたところ、大麦β−アミラーゼと比べる
と２〜５番目のアミノ酸（Glu-Val-Asn-Val ）が欠落し
ていることがわかった。したがって、組換えβ−アミラ
ーゼは531 のアミノ酸残基（配列番号３）からなる分子
量59、169 ダルトンの酵素であると考えられた。

【００５１】組換え大麦β−アミラーゼのその他の酵素
化学的性質は、参考例1 の大麦種子から精製したβ−ア
ミラーゼとほとんど同じであった。

【００５２】寄託 プラスミドpBETA92 で形質転換されたエシェリヒア・コ
リJM109 は、平成５年１月７日通商産業省工業技術院生
命工学工業研究所に寄託されて、微工研条寄第FERM BP-
4137号の受託番号を得ている。

【００５３】

【発明の効果】本発明により、適当な宿主を使用して、
安定した且つ安価で効率の良い組換えβ−アミラーゼの
生産が可能となり、また蛋白質工学的手法によりβ−ア
ミラーゼを改良することが可能となった。

【００５４】

【配列表１】 配列番号：１ 配列の長さ：535 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Val Asn Val Lys Gly Asn Tyr Val Gln Val Tyr Val Met Leu 1 5 10 15 Pro Leu Asp Ala Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly Asp Glu 20 25 30 Leu Arg Ala Gln Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp Gly Val 35 40 45 Met Val Asp Val Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro Lys Ala 50 55 60 Tyr Asp Trp Ser Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Glu Leu Val Gln Lys Ala 65 70 75 80 Gly Leu Lys Leu Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn 85 90 95 Val Gly Asp Ala Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg Asp Val 100 105 110 Gly Thr Arg Asp Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly Thr Arg 115 120 125 Asn Ile Glu Tyr Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu Phe His 130 135 140 Gly Arg Ser Ala Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser Phe Arg 145 150 155 160 Glu Asn Met Lys Asp Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp Ile Glu 165 170 175 Val Gly Leu Gly Pro Ala Gly Glu Met Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Gln 180 185 190 Ser His Gly Trp Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys Tyr Asp 195 200 205 Lys Tyr Leu Gln Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly His 210 215 220 Pro Glu Trp Glu Phe Pro Asn Asp Ala Gly Gln Tyr Asn Asp Thr Pro 225 230 235 240 Glu Arg Thr Gln Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Lys 245 250 255 Gly Arg Phe Phe Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys His Gly 260 265 270 Asp Arg Ile Leu Asp Glu Ala Asn Lys Val Phe Leu Gly Tyr Lys Val 275 280 285 Gln Leu Ala Ile Lys Ile Ser Gly Ile His Trp Trp Tyr Lys Val Pro 290 295 300 Ser His Ala Ala Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His Asp Arg 305 310 315 320 Asp Gly Tyr Arg Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg Ala Ser 325 330 335 Ile Asn Phe Thr Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Ser Ser Gln 340 345 350 Ala Met Ser Ala Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser Ala Gly 355 360 365 Trp Arg Glu Gly Leu Asn Val Ala Cys Glu Asn Ala Leu Pro Arg Tyr 370 375 380 Asp Pro Thr Ala Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro His Gly 390 395 400 405 Ile Asn Gln Ser Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe Thr Tyr 410 415 420 Leu Arg Leu Ser Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Val Asn Phe 425 430 435 Lys Thr Phe Val Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp Pro Tyr 440 445 450 Val Asp Pro Met Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ser Ile 455 460 465 Glu Met Ile Leu Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Glu His Thr Asp 470 475 480 485 Leu Pro Val Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Gly Pro 490 495 500 Thr Cys Gly Met Gly Gly Gln Val Lys Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly 505 510 515 Gly Gln Ala Glu Asp Pro Thr Ser Gly Met Gly Gly Glu Leu Pro Ala 520 525 530 Thr Met 535

【００５５】

【配列表２】 配列番号：２ 配列の長さ：1775 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GATATCCAAC AAACCATTTG AAGTTGTAGA GCATCATCCA TAGCCAGCAT CCACAATGGA 60 GGTGAACGTG AAAGGCAACT ATGTCCAAGT CTACGTCATG CTCCCTCTGG ACGCCGTGAG 120 CGTGAACAAC AGGTTCGAGA AGGGCGACGA GCTGAGGGCG CAATTGAGGA AGCTGGTAGA 180 GGCCGGTGTG GATGGTGTCA TGGTAGACGT CTGGTGGGGC TTGGTGGAGG GCAAGGGCCC 240 CAAGGCGTAT GACTGGTCCG CCTACAAGCA GTTGTTTGAG CTGGTGCAGA AGGCTGGGCT 300 GAAGCTACAG GCCATCATGT CGTTCCACCA GTGTGGTGGC AACGTCGGCG ACGCCGTCAA 360 CATCCCAATC CCACAGTGGG TGCGGGACGT CGGCACGCGT GATCCCGACA TTTTCTACAC 420 CGACGGTCAC GGGACTAGGA ACATTGAGTA CCTCACTCTT GGAGTTGATA ACCAGCCTCT 480 CTTCCATGGA AGATCTGCCG TCCAGATGTA TGCCGATTAC ATGACAAGCT TCAGGGAGAA 540 CATGAAAGAC TTCTTGGATG CTGGTGTTAT CGTCGACATT GAAGTGGGAC TTGGCCCAGC 600 TGGAGAGATG AGGTACCCAT CATATCCTCA GAGCCACGGA TGGTCGTTCC CAGGCATCGG 660 AGAATTCATC TGCTATGATA AATACCTACA AGCAGACTTC AAAGCAGCAG CAGCGGCGGT 720 CGGCCATCCT GAGTGGGAAT TTCCTAACGA TGCCGGACAG TACAATGACA CTCCCGAGAG 780 AACTCAATTC TTCAGGGACA ACGGGACATA CCTAAGTGAG AAGGGGAGGT TTTTCCTTGC 840 ATGGTACTCC AACAATCTGA TCAAGCACGG TGACAGGATC TTGGATGAAG CAAACAAGGT 900 CTTCTTGGGA TACAAGGTGC AATTGGCAAT CAAGATCTCT GGCATTCACT GGTGGTACAA 960 GGTTCCAAGC CATGCAGCCG AGCTCACAGC TGGGTACTAT AACTTACATG ATAGAGACGG 1020 CTACAGAACC ATAGCACGCA TGCTCAAAAG GCACCGTGCT AGCATTAACT TCACTTGCGC 1080 GGAGATGAGG GATTCGGAGC AAAGCTCGCA GGCGATGAGC GCACCAGAAG AACTAGTCCA 1140 ACAGGTGTTG AGTGCTGGAT GGAGAGAGGG CCTAAATGTG GCATGCGAAA ACGCGCTTCC 1200 ACGATATGAT CCAACTGCTT ACAACACCAT ACTCAGGAAT GCGAGGCCTC ATGGAATCAA 1260 CCAGAGCGGC CCTCCTGAGC ACAAGCTGTT TGGATTCACC TACCTTCGGC TGTCGAATCA 1320 GCTGGTGGAG GGACAAAACT ATGTCAACTT CAAGACCTTT GTCGACAGAA TGCATGCCAA 1380 CCTGCCTCGT GACCCATATG TTGATCCAAT GGCGCCTTTG CCAAGATCAG GGCCAGAAAT 1440 ATCGATTGAG ATGATCCTAC AAGCAGCACA GCCAAAACTG CAGCCATTCC CCTTCCAGGA 1500 GCACACCGAC CTGCCAGTAG GCCCTACTGG TGGCATGGGT GGGCAGGCTG AAGGCCCCAC 1560 CTGTGGCATG GGTGGGCAAG TTAAAGGCCC TACTGGTGGC ATGGGTGGGC AGGCTGAAGA 1620 CCCTACTAGT GGCATGGGTG GGGAGCTCCC TGCCACCATG TAATGGAACC TTTATGATTT 1680 ACTACCCTTT ATGTTGTGTG TGAGTGTGAC AGAGAAACCT TTCTCTGCCT TATTAATAAT 1740 AAATAAAGCA CATCACTTGT GTGTGTTCTG AAAAG 1775

【００５６】

【配列表３】 配列番号：３ 配列の長さ：531 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Lys Gly Asn Tyr Val Gln Val Tyr Val Met Leu Pro Leu Asp Ala 1 5 10 15 Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly Asp Glu Leu Arg Ala Gln 20 25 30 Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp Gly Val Met Val Asp Val 35 40 45 Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro Lys Ala Tyr Asp Trp Ser 50 55 60 Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Glu Leu Val Gln Lys Ala Gly Leu Lys Leu 65 70 75 80 Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ala 85 90 95 Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg Asp Val Gly Thr Arg Asp 100 105 110 Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly Thr Arg Asn Ile Glu Tyr 115 120 125 Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu Phe His Gly Arg Ser Ala 130 135 140 Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser Phe Arg Glu Asn Met Lys 145 150 155 160 Asp Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp Ile Glu Val Gly Leu Gly 165 170 175 Pro Ala Gly Glu Met Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Gln Ser His Gly Trp 180 185 190 Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys Tyr Asp Lys Tyr Leu Gln 195 200 205 Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly His Pro Glu Trp Glu 210 215 220 Phe Pro Asn Asp Ala Gly Gln Tyr Asn Asp Thr Pro Glu Arg Thr Gln 225 230 235 240 Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Lys Gly Arg Phe Phe 245 250 255 Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys His Gly Asp Arg Ile Leu 260 265 270 Asp Glu Ala Asn Lys Val Phe Leu Gly Tyr Lys Val Gln Leu Ala Ile 275 280 285 Lys Ile Ser Gly Ile His Trp Trp Tyr Lys Val Pro Ser His Ala Ala 290 295 300 Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His Asp Arg Asp Gly Tyr Arg 305 310 315 320 Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg Ala Ser Ile Asn Phe Thr 325 330 335 Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Ser Ser Gln Ala Met Ser Ala 340 345 350 Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser Ala Gly Trp Arg Glu Gly 355 360 365 Leu Asn Val Ala Cys Glu Asn Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Pro Thr Ala 370 375 380 Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro His Gly Ile Asn Gln Ser 390 395 400 405 Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Leu Arg Leu Ser 410 415 420 Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Val Asn Phe Lys Thr Phe Val 425 430 435 Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp Pro Tyr Val Asp Pro Met 440 445 450 Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ser Ile Glu Met Ile Leu 455 460 465 Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Glu His Thr Asp Leu Pro Val Gly 470 475 480 485 Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Gly Pro Thr Cys Gly Met 490 495 500 Gly Gly Gln Val Lys Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu 505 510 515 Asp Pro Thr Ser Gly Met Gly Gly Glu Leu Pro Ala Thr Met 520 525 530 531

【００５７】

【配列表４】 配列番号：４ 配列の長さ：1596 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列 GTGAAAGGCA ACTATGTCCA AGTCTACGTC ATGCTCCCTC TGGACG
CCGT GAGCGTGAAC 60

【００５８】

【配列表５】 配列番号：５ 配列の長さ：6312 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA 配列 TTCCGGGATG GAGGTGAACG TGAAAGGCAA CTATGTCCAA GTCTACGTCA TGCTCCCTCT 60 GGACGCCGTG AGCGTGAACA ACAGGTTCGA GAAGGGCGAC GAGCTGAGGG CGCAATTGAG 120 GAAGCTGGTA GAGGCCGGTG TGGATGGTGT CATGGTAGAC GTCTGGTGGG GCTTGGTGGA 180 GGGCAAGGGC CCCAAGGCGT ATGACTGGTC CGCCTACAAG CAGTTGTTTG AGCTGGTGCA 240 GAAGGCTGGG CTGAAGCTAC AGGCCATCAT GTCGTTCCAC CAGTGTGGTG GCAACGTCGG 300 CGACGCCGTC AACATCCCAA TCCCACAGTG GGTGCGGGAC GTCGGCACGC GTGATCCCGA 360 CATTTTCTAC ACCGACGGTC ACGGGACTAG GAACATTGAG TACCTCACTC TTGGAGTTGA 420 TAACCAGCCT CTCTTCCATG GAAGATCTGC CGTCCAGATG TATGCCGATT ACATGACAAG 480 CTTCAGGGAG AACATGAAAG ACTTCTTGGA TGCTGGTGTT ATCGTCGACA TTGAAGTGGG 540 ACTTGGCCCA GCTGGAGAGA TGAGGTACCC ATCATATCCT CAGAGCCACG GATGGTCGTT 600 CCCAGGCATC GGAGAATTCA TCTGCTATGA TAAATACCTA CAAGCAGACT TCAAAGCAGC 660 AGCAGCGGCG GTCGGCCATC CTGAGTGGGA ATTTCCTAAC GATGCCGGAC AGTACAATGA 720 CACTCCCGAG AGAACTCAAT TCTTCAGGGA CAACGGGACA TACCTAAGTG AGAAGGGGAG 780 GTTTTTCCTT GCATGGTACT CCAACAATCT GATCAAGCAC GGTGACAGGA TCTTGGATGA 840 AGCAAACAAG GTCTTCTTGG GATACAAGGT GCAATTGGCA ATCAAGATCT CTGGCATTCA 900 CTGGTGGTAC AAGGTTCCAA GCCATGCAGC CGAGCTCACA GCTGGGTACT ATAACTTACA 960 TGATAGAGAC GGCTACAGAA CCATAGCACG CATGCTCAAA AGGCACCGTG CTAGCATTAA 1020 CTTCACTTGC GCGGAGATGA GGGATTCGGA GCAAAGCTCG CAGGCGATGA GCGCACCAGA 1080 AGAACTAGTC CAACAGGTGT TGAGTGCTGG ATGGAGAGAG GGCCTAAATG TGGCATGCGA 1140 AAACGCGCTT CCACGATATG ATCCAACTGC TTACAACACC ATACTCAGGA ATGCGAGGCC 1200 TCATGGAATC AACCAGAGCG GCCCTCCTGA GCACAAGCTG TTTGGATTCA CCTACCTTCG 1260 GCTGTCGAAT CAGCTGGTGG AGGGACAAAA CTATGTCAAC TTCAAGACCT TTGTCGACAG 1320 AATGCATGCC AACCTGCCTC GTGACCCATA TGTTGATCCA ATGGCGCCTT TGCCAAGATC 1380 AGGGCCAGAA ATATCGATTG AGATGATCCT ACAAGCAGCA CAGCCAAAAC TGCAGCCATT 1440 CCCCTTCCAG GAGCACACCG ACCTGCCAGT AGGCCCTACT GGTGGCATGG GTGGGCAGGC 1500 TGAAGGCCCC ACCTGTGGCA TGGGTGGGCA AGTTAAAGGC CCTACTGGTG GCATGGGTGG 1560 GCAGGCTGAA GACCCTACTA GTGGCATGGG TGGGGAGCTC CCTGCCACCA TGTAATGGAA 1620 CCTTTATGAT TTACTACCCT TTATGTTGTG TGTGAGTGTG ACAGAGAAAC CTTTCTCTGC 1680 CTTATTAATA ATAAATAAAG CACATCACTT GTGTGTGTTC TGAAAAGCCC GGGGATCCGT 1740 CGACCTGCAG CCAAGCTTGG CTGTTTTGGC GGATGAGAGA AGATTTTCAG CCTGATACAG 1800 ATTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTGGCGG CAGTAGCGCG 1860 GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGT 1920 GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGGGAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCA 1980 GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAG 2040 GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGC 2100 AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGG 2160 CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC 2220 CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA 2280 GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT 2340 TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG 2400 TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG 2460 AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTG 2520 TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG 2580 AGTACTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA 2640 GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG 2700 GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC 2760 GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG 2820 TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC 2880 GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG 2940 CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG 3000 GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA 3060 CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 3120 TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA 3180 AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 3240 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG 3300 GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC 3360 CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 3420 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC 3480 ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 3540 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 3600 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC 3660 GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC 3720 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA 3780 CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 3840 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 3900 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT 3960 TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 4020 CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 4080 GCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT TTCACACCGC ATATGGTGCA 4140 CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA GTATACACTC CGCTATCGCT 4200 ACGTGACTGG GTCATGGCTG CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG 4260 GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 4320 GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGCTGCGGT AAAGCTCATC 4380 AGCGTGGTCG TGAAGCGATT CACAGATGTC TGCCTGTTCA TCCGCGTCCA GCTCGTTGAG 4440 TTTCTCCAGA AGCGTTAATG TCTGGCTTCT GATAAAGCGG GCCATGTTAA GGGCGGTTTT 4500 TTCCTGTTTG GTCACTTGAT GCCTCCGTGT AAGGGGGAAT TTCTGTTCAT GGGGGTAATG 4560 ATACCGATGA AACGAGAGAG GATGCTCACG ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG 4620 TTACTGGAAC GTTGTGAGGG TAAACAACTG GCGGTATGGA TGCGGCGGGA CCAGAGAAAA 4680 ATCACTCAGG GTCAATGCCA GCGCTTCGTT AATACAGATG TAGGTGTTCC ACAGGGTAGC 4740 CAGCAGCATC CTGCGATGCA GATCCGGAAC ATAATGGTGC AGGGCGCTGA CTTCCGCGTT 4800 TCCAGACTTT ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC 4860 GTTTTGCAGC AGCAGTCGCT TCACGTTCGC TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA 4920 GTAAGGCAAC CCCGCCAGCC TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC 4980 CGTGGCCAGG ACCCAACGCT GCCCGAGATG CGCCGCGTGC GGCTGCTGGA GATGGCGGAC 5040 GCGATGGATA TGTTCTGCCA AGGGTTGGTT TGCGCATTCA CAGTTCTCCG CAAGAATTGA 5100 TTGGCTCCAA TTCTTGGAGT GGTGAATCCG TTAGCGAGGT GCCGCCGGCT TCCATTCAGG 5160 TCGAGGTGGC CCGGCTCCAT GCACCGCGAC GCAACGCGGG GAGGCAGACA AGGTATAGGG 5220 CGGCGCCTAC AATCCATGCC AACCCGTTCC ATGTGCTCGC CGAGGCGGCA TAAATCGCCG 5280 TGACGATCAG CGGTCCAGTG ATCGAAGTTA GGCTGGTAAG AGCCGCGAGC GATCCTTGAA 5340 GCTGTCCCTG ATGGTCGTCA TCTACCTGCC TGGACAGCAT GGCCTGCAAC GCGGGCATCC 5400 CGATGCCGCC GGAAGCGAGA AGAATCATAA TGGGGAAGGC CATCCAGCCT CGCGTCGCGA 5460 ACGCCAGCAA GACGTAGCCC AGCGCGTCGG CCGCCATGCC GGCGATAATG GCCTGCTTCT 5520 CGCCGAAACG TTTGGTGGCG GGACCAGTGA CGAAGGCTTG AGCGAGGGCG TGCAAGATTC 5580 CGAATACCGC AAGCGACAGG CCGATCATCG TCGCGCTCCA GCGAAAGCGG TCCTCGCCGA 5640 AAATGACCCA GAGCGCTGCC GGCACCTGTC CTACGAGTTG CATGATAAAG AAGACAGTCA 5700 TAAGTGCGGC GACGATAGTC ATGCCCCGCG CCCACCGGAA GGAGCTGACT GGGTTGAAGG 5760 CTCTCAAGGG CATCGGTCGA CGCTCTCCCT TATGCGACTC CTGCATTAGG AAGCAGCCCA 5820 GTAGTAGGTT GAGGCCGTTG AGCACCGCCG CCGCAAGGAA TGGTGCATGC AAGGAGATGG 5880 CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA 5940 TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG 6000 CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCCGGG 6060 CTTATCGACT GCACGGTGCA CCAATGCTTC TGGCGTCAGG CAGCCATCGG AAGCTGTGGT 6120 ATGGCTGTGC AGGTCGTAAA TCACTGCATA ATTCGTGTCG CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC 6180 TGGATAATGT TTTTTGCGCC GACATCATAA CGGTTCTGGC AAATATTCTG AAATGAGCTG 6240 TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 6300 CAGGAAACAG AA 6312

【００５９】

【配列表６】 配列番号：６ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGGATCCGA TATCCAACAA ACCATTTG

【００６０】

【配列表７】 配列番号：７ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAGGATCCCT TTTCAGAACA CACACAAG

【図面の簡単な説明】

【図１】大麦β−アミラーゼの全長cDNAのフィジカルマ
ップを示す図である。略号は制限酵素の切断部位であ
る。

【図２】プラスミドpBETA92 のフィジカルマップを示す
図である。ここで黒塗り以外の部分はプラスミドpKK223
-3由来で、黒塗りの部分は大麦β−アミラーゼcDNA断片
部分である。Amp はアンピシリン耐性を示し、他の略号
は制限酵素の切断認識部位である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年５月１６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５７】配列番号：４ 配列の長さ：1596 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列 GTGAAAGGCA ACTATGTCCA AGTCTACGTC ATGCTCCCTC TGGACGCCGT GAGCGTGAAC 60 AACAGGTTCG AGAAGGGCGA CGAGCTGAGG GCGCAATTGA GGAAGCTGGT AGAGGCCGGT 120 GTGGATGGTG TCATGGTAGA CGTCTGGTGG GGCTTGGTGG AGGGCAAGGG CCCCAAGGCG 180 TATGACTGGT CCGCCTACAA GCAGTTGTTT GAGCTGGTGC AGAAGGCTGG GCTGAAGCTA 240 CAGGCCATCA TGTCGTTCCA CCAGTGTGGT GGCAACGTCG GCGACGCCGT CAACATCCCA 300 ATCCCACAGT GGGTGCGGGA CGTCGGCACG CGTGATCCCG ACATTTTCTA CACCGACGGT 360 CACGGGACTA GGAACATTGA GTACCTCACT CTTGGAGTTG ATAACCAGCC TCTCTTCCAT 420 GGAAGATCTG CCGTCCAGAT GTATGCCGAT TACATGACAA GCTTCAGGGA GAACATGAAA 480 GACTTCTTGG ATGCTGGTGT TATCGTCGAC ATTGAAGTGG GACTTGGCCC AGCTGGAGAG 540 ATGAGGTACC CATCATATCC TCAGAGCCAC GGATGGTCGT TCCCAGGCAT CGGAGAATTC 600 ATCTGCTATG ATAAATACCT ACAAGCAGAC TTCAAAGCAG CAGCAGCGGC GGTCGGCCAT 660 CCTGAGTGGG AATTTCCTAA CGATGCCGGA CAGTACAATG ACACTCCCGA GAGAACTCAA 720 TTCTTCAGGG ACAACGGGAC ATACCTAAGT GAGAAGGGGA GGTTTTTCCT TGCATGGTAC 780 TCCAACAATC TGATCAAGCA CGGTGACAGG ATCTTGGATG AAGCAAACAA GGTCTTCTTG 840 GGATACAAGG TGCAATTGGC AATCAAGATC TCTGGCATTC ACTGGTGGTA CAAGGTTCCA 900 AGCCATGCAG CCGAGCTCAC AGCTGGGTAC TATAACTTAC ATGATAGAGA CGGCTACAGA 960 ACCATAGCAC GCATGCTCAA AAGGCACCGT GCTAGCATTA ACTTCACTTG CGCGGAGATG 1020 AGGGATTCGG AGCAAAGCTC GCAGGCGATG AGCGCACCAG AAGAACTAGT CCAACAGGTG 1080 TTGAGTGCTG GATGGAGAGA GGGCCTAAAT GTGGCATGCG AAAACGCGCT TCCACGATAT 1140 GATCCAACTG CTTACAACAC CATACTCAGG AATGCGAGGC CTCATGGAAT CAACCAGAGC 1200 GGCCCTCCTG AGCACAAGCT GTTTGGATTC ACCTACCTTC GGCTGTCGAA TCAGCTGGTG 1260 GAGGGACAAA ACTATGTCAA CTTCAAGACC TTTGTCGACA GAATGCATGC CAACCTGCCT 1320 CGTGACCCAT ATGTTGATCC AATGGCGCCT TTGCCAAGAT CAGGGCCAGA AATATCGATT 1380 GAGATGATCC TACAAGCAGC ACAGCCAAAA CTGCAGCCAT TCCCCTTCCA GGAGCACACC 1440 GACCTGCCAG TAGGCCCTAC TGGTGGCATG GGTGGGCAGG CTGAAGGCCC CACCTGTGGC 1500 ATGGGTGGGC AAGTTAAAGG CCCTACTGGT GGCATGGGTG GGCAGGCTGA AGACCCTACT 1560 AGTGGCATGG GTGGGGAGCT CCCTGCCACC ATGTAA 1596

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式I で表されるアミノ酸配列をコ
   ードする大麦β−アミラーゼ遺伝子。式I ： Met Glu Val Asn Val Lys Gly Asn Tyr Val Gln Val Tyr Val Met Leu 1 5 10 15 Pro Leu Asp Ala Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly Asp Glu 20 25 30 Leu Arg Ala Gln Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp Gly Val 35 40 45 Met Val Asp Val Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro Lys Ala 50 55 60 Tyr Asp Trp Ser Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Glu Leu Val Gln Lys Ala 65 70 75 80 Gly Leu Lys Leu Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn 85 90 95 Val Gly Asp Ala Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg Asp Val 100 105 110 Gly Thr Arg Asp Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly Thr Arg 115 120 125 Asn Ile Glu Tyr Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu Phe His 130 135 140 Gly Arg Ser Ala Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser Phe Arg 145 150 155 160 Glu Asn Met Lys Asp Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp Ile Glu 165 170 175 Val Gly Leu Gly Pro Ala Gly Glu Met Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Gln 180 185 190 Ser His Gly Trp Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys Tyr Asp 195 200 205 Lys Tyr Leu Gln Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly His 210 215 220 Pro Glu Trp Glu Phe Pro Asn Asp Ala Gly Gln Tyr Asn Asp Thr Pro 225 230 235 240 Glu Arg Thr Gln Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Lys 245 250 255 Gly Arg Phe Phe Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys His Gly 260 265 270 Asp Arg Ile Leu Asp Glu Ala Asn Lys Val Phe Leu Gly Tyr Lys Val 275 280 285 Gln Leu Ala Ile Lys Ile Ser Gly Ile His Trp Trp Tyr Lys Val Pro 290 295 300 Ser His Ala Ala Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His Asp Arg 305 310 315 320 Asp Gly Tyr Arg Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg Ala Ser 325 330 335 Ile Asn Phe Thr Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Ser Ser Gln 340 345 350 Ala Met Ser Ala Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser Ala Gly 355 360 365 Trp Arg Glu Gly Leu Asn Val Ala Cys Glu Asn Ala Leu Pro Arg Tyr 370 375 380 Asp Pro Thr Ala Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro His Gly 390 395 400 405 Ile Asn Gln Ser Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe Thr Tyr 410 415 420 Leu Arg Leu Ser Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Val Asn Phe 425 430 435 Lys Thr Phe Val Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp Pro Tyr 440 445 450 Val Asp Pro Met Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ser Ile 455 460 465 Glu Met Ile Leu Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Glu His Thr Asp 470 475 480 485 Leu Pro Val Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Gly Pro 490 495 500 Thr Cys Gly Met Gly Gly Gln Val Lys Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly 505 510 515 Gly Gln Ala Glu Asp Pro Thr Ser Gly Met Gly Gly Glu Leu Pro Ala 520 525 530 Thr Met 535
2. 【請求項２】 下記の式IIで示される塩基配列で表され
   る請求項1 記載の大麦β−アミラーゼ遺伝子。式II： GATATCCAAC AAACCATTTG AAGTTGTAGA GCATCATCCA TAGCCAGCAT CCACAATGGA 60 GGTGAACGTG AAAGGCAACT ATGTCCAAGT CTACGTCATG CTCCCTCTGG ACGCCGTGAG 120 CGTGAACAAC AGGTTCGAGA AGGGCGACGA GCTGAGGGCG CAATTGAGGA AGCTGGTAGA 180 GGCCGGTGTG GATGGTGTCA TGGTAGACGT CTGGTGGGGC TTGGTGGAGG GCAAGGGCCC 240 CAAGGCGTAT GACTGGTCCG CCTACAAGCA GTTGTTTGAG CTGGTGCAGA AGGCTGGGCT 300 GAAGCTACAG GCCATCATGT CGTTCCACCA GTGTGGTGGC AACGTCGGCG ACGCCGTCAA 360 CATCCCAATC CCACAGTGGG TGCGGGACGT CGGCACGCGT GATCCCGACA TTTTCTACAC 420 CGACGGTCAC GGGACTAGGA ACATTGAGTA CCTCACTCTT GGAGTTGATA ACCAGCCTCT 480 CTTCCATGGA AGATCTGCCG TCCAGATGTA TGCCGATTAC ATGACAAGCT TCAGGGAGAA 540 CATGAAAGAC TTCTTGGATG CTGGTGTTAT CGTCGACATT GAAGTGGGAC TTGGCCCAGC 600 TGGAGAGATG AGGTACCCAT CATATCCTCA GAGCCACGGA TGGTCGTTCC CAGGCATCGG 660 AGAATTCATC TGCTATGATA AATACCTACA AGCAGACTTC AAAGCAGCAG CAGCGGCGGT 720 CGGCCATCCT GAGTGGGAAT TTCCTAACGA TGCCGGACAG TACAATGACA CTCCCGAGAG 780 AACTCAATTC TTCAGGGACA ACGGGACATA CCTAAGTGAG AAGGGGAGGT TTTTCCTTGC 840 ATGGTACTCC AACAATCTGA TCAAGCACGG TGACAGGATC TTGGATGAAG CAAACAAGGT 900 CTTCTTGGGA TACAAGGTGC AATTGGCAAT CAAGATCTCT GGCATTCACT GGTGGTACAA 960 GGTTCCAAGC CATGCAGCCG AGCTCACAGC TGGGTACTAT AACTTACATG ATAGAGACGG 1020 CTACAGAACC ATAGCACGCA TGCTCAAAAG GCACCGTGCT AGCATTAACT TCACTTGCGC 1080 GGAGATGAGG GATTCGGAGC AAAGCTCGCA GGCGATGAGC GCACCAGAAG AACTAGTCCA 1140 ACAGGTGTTG AGTGCTGGAT GGAGAGAGGG CCTAAATGTG GCATGCGAAA ACGCGCTTCC 1200 ACGATATGAT CCAACTGCTT ACAACACCAT ACTCAGGAAT GCGAGGCCTC ATGGAATCAA 1260 CCAGAGCGGC CCTCCTGAGC ACAAGCTGTT TGGATTCACC TACCTTCGGC TGTCGAATCA 1320 GCTGGTGGAG GGACAAAACT ATGTCAACTT CAAGACCTTT GTCGACAGAA TGCATGCCAA 1380 CCTGCCTCGT GACCCATATG TTGATCCAAT GGCGCCTTTG CCAAGATCAG GGCCAGAAAT 1440 ATCGATTGAG ATGATCCTAC AAGCAGCACA GCCAAAACTG CAGCCATTCC CCTTCCAGGA 1500 GCACACCGAC CTGCCAGTAG GCCCTACTGG TGGCATGGGT GGGCAGGCTG AAGGCCCCAC 1560 CTGTGGCATG GGTGGGCAAG TTAAAGGCCC TACTGGTGGC ATGGGTGGGC AGGCTGAAGA 1620 CCCTACTAGT GGCATGGGTG GGGAGCTCCC TGCCACCATG TAATGGAACC TTTATGATTT 1680 ACTACCCTTT ATGTTGTGTG TGAGTGTGAC AGAGAAACCT TTCTCTGCCT TATTAATAAT 1740 AAATAAAGCA CATCACTTGT GTGTGTTCTG AAAAG 1775
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の大麦β−アミ
   ラーゼ遺伝子を含有する組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換えベクターを含有
   しβ−アミラーゼを生産するエシェリヒア・コリ（Esch
   erichia coli）。
5. 【請求項５】 下記の式III で表されるアミノ酸配列を
   有する組換えβ−アミラーゼ。式III ： Met Lys Gly Asn Tyr Val Gln Val Tyr Val Met Leu Pro Leu Asp Ala 1 5 10 15 Val Ser Val Asn Asn Arg Phe Glu Lys Gly Asp Glu Leu Arg Ala Gln 20 25 30 Leu Arg Lys Leu Val Glu Ala Gly Val Asp Gly Val Met Val Asp Val 35 40 45 Trp Trp Gly Leu Val Glu Gly Lys Gly Pro Lys Ala Tyr Asp Trp Ser 50 55 60 Ala Tyr Lys Gln Leu Phe Glu Leu Val Gln Lys Ala Gly Leu Lys Leu 65 70 75 80 Gln Ala Ile Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly Asp Ala 85 90 95 Val Asn Ile Pro Ile Pro Gln Trp Val Arg Asp Val Gly Thr Arg Asp 100 105 110 Pro Asp Ile Phe Tyr Thr Asp Gly His Gly Thr Arg Asn Ile Glu Tyr 115 120 125 Leu Thr Leu Gly Val Asp Asn Gln Pro Leu Phe His Gly Arg Ser Ala 130 135 140 Val Gln Met Tyr Ala Asp Tyr Met Thr Ser Phe Arg Glu Asn Met Lys 145 150 155 160 Asp Phe Leu Asp Ala Gly Val Ile Val Asp Ile Glu Val Gly Leu Gly 165 170 175 Pro Ala Gly Glu Met Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Gln Ser His Gly Trp 180 185 190 Ser Phe Pro Gly Ile Gly Glu Phe Ile Cys Tyr Asp Lys Tyr Leu Gln 195 200 205 Ala Asp Phe Lys Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly His Pro Glu Trp Glu 210 215 220 Phe Pro Asn Asp Ala Gly Gln Tyr Asn Asp Thr Pro Glu Arg Thr Gln 225 230 235 240 Phe Phe Arg Asp Asn Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Lys Gly Arg Phe Phe 245 250 255 Leu Ala Trp Tyr Ser Asn Asn Leu Ile Lys His Gly Asp Arg Ile Leu 260 265 270 Asp Glu Ala Asn Lys Val Phe Leu Gly Tyr Lys Val Gln Leu Ala Ile 275 280 285 Lys Ile Ser Gly Ile His Trp Trp Tyr Lys Val Pro Ser His Ala Ala 290 295 300 Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn Leu His Asp Arg Asp Gly Tyr Arg 305 310 315 320 Thr Ile Ala Arg Met Leu Lys Arg His Arg Ala Ser Ile Asn Phe Thr 325 330 335 Cys Ala Glu Met Arg Asp Ser Glu Gln Ser Ser Gln Ala Met Ser Ala 340 345 350 Pro Glu Glu Leu Val Gln Gln Val Leu Ser Ala Gly Trp Arg Glu Gly 355 360 365 Leu Asn Val Ala Cys Glu Asn Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Pro Thr Ala 370 375 380 Tyr Asn Thr Ile Leu Arg Asn Ala Arg Pro His Gly Ile Asn Gln Ser 390 395 400 405 Gly Pro Pro Glu His Lys Leu Phe Gly Phe Thr Tyr Leu Arg Leu Ser 410 415 420 Asn Gln Leu Val Glu Gly Gln Asn Tyr Val Asn Phe Lys Thr Phe Val 425 430 435 Asp Arg Met His Ala Asn Leu Pro Arg Asp Pro Tyr Val Asp Pro Met 440 445 450 Ala Pro Leu Pro Arg Ser Gly Pro Glu Ile Ser Ile Glu Met Ile Leu 455 460 465 Gln Ala Ala Gln Pro Lys Leu Gln Glu His Thr Asp Leu Pro Val Gly 470 475 480 485 Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu Gly Pro Thr Cys Gly Met 490 495 500 Gly Gly Gln Val Lys Gly Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Gln Ala Glu 505 510 515 Asp Pro Thr Ser Gly Met Gly Gly Glu Leu Pro Ala Thr Met 520 525 530 531
6. 【請求項６】 請求項２に記載の大麦β−アミラーゼ遺
   伝子中、式IVで表される請求項５に記載の組換えβ−ア
   ミラーゼを直接コードする遺伝子。式IV： GTGAAAGGCA ACTATGTCCA AGTCTACGTC ATGCTCCCTC TGGACGCCGT GAGCGTGAAC 60 AACAGGTTCG AGAAGGGCGA CGAGCTGAGG GCGCAATTGA GGAAGCTGGT AGAGGCCGGT 120 GTGGATGGTG TCATGGTAGA CGTCTGGTGG GGCTTGGTGG AGGGCAAGGG CCCCAAGGCG 180 TATGACTGGT CCGCCTACAA GCAGTTGTTT GAGCTGGTGC AGAAGGCTGG GCTGAAGCTA 240 CAGGCCATCA TGTCGTTCCA CCAGTGTGGT GGCAACGTCG GCGACGCCGT CAACATCCCA 300 ATCCCACAGT GGGTGCGGGA CGTCGGCACG CGTGATCCCG ACATTTTCTA CACCGACGGT 360 CACGGGACTA GGAACATTGA GTACCTCACT CTTGGAGTTG ATAACCAGCC TCTCTTCCAT 420 GGAAGATCTG CCGTCCAGAT GTATGCCGAT TACATGACAA GCTTCAGGGA GAACATGAAA 480 GACTTCTTGG ATGCTGGTGT TATCGTCGAC ATTGAAGTGG GACTTGGCCC AGCTGGAGAG 540 ATGAGGTACC CATCATATCC TCAGAGCCAC GGATGGTCGT TCCCAGGCAT CGGAGAATTC 600 ATCTGCTATG ATAAATACCT ACAAGCAGAC TTCAAAGCAG CAGCAGCGGC GGTCGGCCAT 660 CCTGAGTGGG AATTTCCTAA CGATGCCGGA CAGTACAATG ACACTCCCGA GAGAACTCAA 720 TTCTTCAGGG ACAACGGGAC ATACCTAAGT GAGAAGGGGA GGTTTTTCCT TGCATGGTAC 780 TCCAACAATC TGATCAAGCA CGGTGACAGG ATCTTGGATG AAGCAAACAA GGTCTTCTTG 840 GGATACAAGG TGCAATTGGC AATCAAGATC TCTGGCATTC ACTGGTGGTA CAAGGTTCCA 900 AGCCATGCAG CCGAGCTCAC AGCTGGGTAC TATAACTTAC ATGATAGAGA CGGCTACAGA 960 ACCATAGCAC GCATGCTCAA AAGGCACCGT GCTAGCATTA ACTTCACTTG CGCGGAGATG 1020 AGGGATTCGG AGCAAAGCTC GCAGGCGATG AGCGCACCAG AAGAACTAGT CCAACAGGTG 1080 TTGAGTGCTG GATGGAGAGA GGGCCTAAAT GTGGCATGCG AAAACGCGCT TCCACGATAT 1140 GATCCAACTG CTTACAACAC CATACTCAGG AATGCGAGGC CTCATGGAAT CAACCAGAGC 1200 GGCCCTCCTG AGCACAAGCT GTTTGGATTC ACCTACCTTC GGCTGTCGAA TCAGCTGGTG 1260 GAGGGACAAA ACTATGTCAA CTTCAAGACC TTTGTCGACA GAATGCATGC CAACCTGCCT 1320 CGTGACCCAT ATGTTGATCC AATGGCGCCT TTGCCAAGAT CAGGGCCAGA AATATCGATT 1380 GAGATGATCC TACAAGCAGC ACAGCCAAAA CTGCAGCCAT TCCCCTTCCA GGAGCACACC 1440 GACCTGCCAG TAGGCCCTAC TGGTGGCATG GGTGGGCAGG CTGAAGGCCC CACCTGTGGC 1500 ATGGGTGGGC AAGTTAAAGG CCCTACTGGT GGCATGGGTG GGCAGGCTGA AGACCCTACT 1560 AGTGGCATGG GTGGGGAGCT CCCTGCCACC ATGTAA 1596
7. 【請求項７】 式V で表される請求項６に記載の組換え
   β−アミラーゼを直接コードする遺伝子を含有する組換
   えβ−アミラーゼ発現ベクター。式V ： TTCCGGGATG GAGGTGAACG TGAAAGGCAA CTATGTCCAA GTCTACGTCA TGCTCCCTCT 60 GGACGCCGTG AGCGTGAACA ACAGGTTCGA GAAGGGCGAC GAGCTGAGGG CGCAATTGAG 120 GAAGCTGGTA GAGGCCGGTG TGGATGGTGT CATGGTAGAC GTCTGGTGGG GCTTGGTGGA 180 GGGCAAGGGC CCCAAGGCGT ATGACTGGTC CGCCTACAAG CAGTTGTTTG AGCTGGTGCA 240 GAAGGCTGGG CTGAAGCTAC AGGCCATCAT GTCGTTCCAC CAGTGTGGTG GCAACGTCGG 300 CGACGCCGTC AACATCCCAA TCCCACAGTG GGTGCGGGAC GTCGGCACGC GTGATCCCGA 360 CATTTTCTAC ACCGACGGTC ACGGGACTAG GAACATTGAG TACCTCACTC TTGGAGTTGA 420 TAACCAGCCT CTCTTCCATG GAAGATCTGC CGTCCAGATG TATGCCGATT ACATGACAAG 480 CTTCAGGGAG AACATGAAAG ACTTCTTGGA TGCTGGTGTT ATCGTCGACA TTGAAGTGGG 540 ACTTGGCCCA GCTGGAGAGA TGAGGTACCC ATCATATCCT CAGAGCCACG GATGGTCGTT 600 CCCAGGCATC GGAGAATTCA TCTGCTATGA TAAATACCTA CAAGCAGACT TCAAAGCAGC 660 AGCAGCGGCG GTCGGCCATC CTGAGTGGGA ATTTCCTAAC GATGCCGGAC AGTACAATGA 720 CACTCCCGAG AGAACTCAAT TCTTCAGGGA CAACGGGACA TACCTAAGTG AGAAGGGGAG 780 GTTTTTCCTT GCATGGTACT CCAACAATCT GATCAAGCAC GGTGACAGGA TCTTGGATGA 840 AGCAAACAAG GTCTTCTTGG GATACAAGGT GCAATTGGCA ATCAAGATCT CTGGCATTCA 900 CTGGTGGTAC AAGGTTCCAA GCCATGCAGC CGAGCTCACA GCTGGGTACT ATAACTTACA 960 TGATAGAGAC GGCTACAGAA CCATAGCACG CATGCTCAAA AGGCACCGTG CTAGCATTAA 1020 CTTCACTTGC GCGGAGATGA GGGATTCGGA GCAAAGCTCG CAGGCGATGA GCGCACCAGA 1080 AGAACTAGTC CAACAGGTGT TGAGTGCTGG ATGGAGAGAG GGCCTAAATG TGGCATGCGA 1140 AAACGCGCTT CCACGATATG ATCCAACTGC TTACAACACC ATACTCAGGA ATGCGAGGCC 1200 TCATGGAATC AACCAGAGCG GCCCTCCTGA GCACAAGCTG TTTGGATTCA CCTACCTTCG 1260 GCTGTCGAAT CAGCTGGTGG AGGGACAAAA CTATGTCAAC TTCAAGACCT TTGTCGACAG 1320 AATGCATGCC AACCTGCCTC GTGACCCATA TGTTGATCCA ATGGCGCCTT TGCCAAGATC 1380 AGGGCCAGAA ATATCGATTG AGATGATCCT ACAAGCAGCA CAGCCAAAAC TGCAGCCATT 1440 CCCCTTCCAG GAGCACACCG ACCTGCCAGT AGGCCCTACT GGTGGCATGG GTGGGCAGGC 1500 TGAAGGCCCC ACCTGTGGCA TGGGTGGGCA AGTTAAAGGC CCTACTGGTG GCATGGGTGG 1560 GCAGGCTGAA GACCCTACTA GTGGCATGGG TGGGGAGCTC CCTGCCACCA TGTAATGGAA 1620 CCTTTATGAT TTACTACCCT TTATGTTGTG TGTGAGTGTG ACAGAGAAAC CTTTCTCTGC 1680 CTTATTAATA ATAAATAAAG CACATCACTT GTGTGTGTTC TGAAAAGCCC GGGGATCCGT 1740 CGACCTGCAG CCAAGCTTGG CTGTTTTGGC GGATGAGAGA AGATTTTCAG CCTGATACAG 1800 ATTAAATCAG AACGCAGAAG CGGTCTGATA AAACAGAATT TGCCTGGCGG CAGTAGCGCG 1860 GTGGTCCCAC CTGACCCCAT GCCGAACTCA GAAGTGAAAC GCCGTAGCGC CGATGGTAGT 1920 GTGGGGTCTC CCCATGCGAG AGTAGGGAAC TGCCAGGCAT CAAATAAAAC GAAAGGCTCA 1980 GTCGAAAGAC TGGGCCTTTC GTTTTATCTG TTGTTTGTCG GTGAACGCTC TCCTGAGTAG 2040 GACAAATCCG CCGGGAGCGG ATTTGAACGT TGCGAAGCAA CGGCCCGGAG GGTGGCGGGC 2100 AGGACGCCCG CCATAAACTG CCAGGCATCA AATTAAGCAG AAGGCCATCC TGACGGATGG 2160 CCTTTTTGCG TTTCTACAAA CTCTTTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC 2220 CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA 2280 GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT 2340 TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG 2400 TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG 2460 AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTG 2520 TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG 2580 AGTACTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA 2640 GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG 2700 GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC 2760 GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG 2820 TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC 2880 GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG 2940 CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG 3000 GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA 3060 CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 3120 TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA 3180 AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA 3240 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG 3300 GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC 3360 CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 3420 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC 3480 ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 3540 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 3600 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC 3660 GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC 3720 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA 3780 CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 3840 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 3900 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT 3960 TTCCTGCGTT ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 4020 CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA GCGGAAGAGC 4080 GCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT TTCACACCGC ATATGGTGCA 4140 CTCTCAGTAC AATCTGCTCT GATGCCGCAT AGTTAAGCCA GTATACACTC CGCTATCGCT 4200 ACGTGACTGG GTCATGGCTG CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG 4260 GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 4320 GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGCTGCGGT AAAGCTCATC 4380 AGCGTGGTCG TGAAGCGATT CACAGATGTC TGCCTGTTCA TCCGCGTCCA GCTCGTTGAG 4440 TTTCTCCAGA AGCGTTAATG TCTGGCTTCT GATAAAGCGG GCCATGTTAA GGGCGGTTTT 4500 TTCCTGTTTG GTCACTTGAT GCCTCCGTGT AAGGGGGAAT TTCTGTTCAT GGGGGTAATG 4560 ATACCGATGA AACGAGAGAG GATGCTCACG ATACGGGTTA CTGATGATGA ACATGCCCGG 4620 TTACTGGAAC GTTGTGAGGG TAAACAACTG GCGGTATGGA TGCGGCGGGA CCAGAGAAAA 4680 ATCACTCAGG GTCAATGCCA GCGCTTCGTT AATACAGATG TAGGTGTTCC ACAGGGTAGC 4740 CAGCAGCATC CTGCGATGCA GATCCGGAAC ATAATGGTGC AGGGCGCTGA CTTCCGCGTT 4800 TCCAGACTTT ACGAAACACG GAAACCGAAG ACCATTCATG TTGTTGCTCA GGTCGCAGAC 4860 GTTTTGCAGC AGCAGTCGCT TCACGTTCGC TCGCGTATCG GTGATTCATT CTGCTAACCA 4920 GTAAGGCAAC CCCGCCAGCC TAGCCGGGTC CTCAACGACA GGAGCACGAT CATGCGCACC 4980 CGTGGCCAGG ACCCAACGCT GCCCGAGATG CGCCGCGTGC GGCTGCTGGA GATGGCGGAC 5040 GCGATGGATA TGTTCTGCCA AGGGTTGGTT TGCGCATTCA CAGTTCTCCG CAAGAATTGA 5100 TTGGCTCCAA TTCTTGGAGT GGTGAATCCG TTAGCGAGGT GCCGCCGGCT TCCATTCAGG 5160 TCGAGGTGGC CCGGCTCCAT GCACCGCGAC GCAACGCGGG GAGGCAGACA AGGTATAGGG 5220 CGGCGCCTAC AATCCATGCC AACCCGTTCC ATGTGCTCGC CGAGGCGGCA TAAATCGCCG 5280 TGACGATCAG CGGTCCAGTG ATCGAAGTTA GGCTGGTAAG AGCCGCGAGC GATCCTTGAA 5340 GCTGTCCCTG ATGGTCGTCA TCTACCTGCC TGGACAGCAT GGCCTGCAAC GCGGGCATCC 5400 CGATGCCGCC GGAAGCGAGA AGAATCATAA TGGGGAAGGC CATCCAGCCT CGCGTCGCGA 5460 ACGCCAGCAA GACGTAGCCC AGCGCGTCGG CCGCCATGCC GGCGATAATG GCCTGCTTCT 5520 CGCCGAAACG TTTGGTGGCG GGACCAGTGA CGAAGGCTTG AGCGAGGGCG TGCAAGATTC 5580 CGAATACCGC AAGCGACAGG CCGATCATCG TCGCGCTCCA GCGAAAGCGG TCCTCGCCGA 5640 AAATGACCCA GAGCGCTGCC GGCACCTGTC CTACGAGTTG CATGATAAAG AAGACAGTCA 5700 TAAGTGCGGC GACGATAGTC ATGCCCCGCG CCCACCGGAA GGAGCTGACT GGGTTGAAGG 5760 CTCTCAAGGG CATCGGTCGA CGCTCTCCCT TATGCGACTC CTGCATTAGG AAGCAGCCCA 5820 GTAGTAGGTT GAGGCCGTTG AGCACCGCCG CCGCAAGGAA TGGTGCATGC AAGGAGATGG 5880 CGCCCAACAG TCCCCCGGCC ACGGGGCCTG CCACCATACC CACGCCGAAA CAAGCGCTCA 5940 TGAGCCCGAA GTGGCGAGCC CGATCTTCCC CATCGGTGAT GTCGGCGATA TAGGCGCCAG 6000 CAACCGCACC TGTGGCGCCG GTGATGCCGG CCACGATGCG TCCGGCGTAG AGGATCCGGG 6060 CTTATCGACT GCACGGTGCA CCAATGCTTC TGGCGTCAGG CAGCCATCGG AAGCTGTGGT 6120 ATGGCTGTGC AGGTCGTAAA TCACTGCATA ATTCGTGTCG CTCAAGGCGC ACTCCCGTTC 6180 TGGATAATGT TTTTTGCGCC GACATCATAA CGGTTCTGGC AAATATTCTG AAATGAGCTG 6240 TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA 6300 CAGGAAACAG AA 6312