JPH06304000A - ウィルスフリーネギ属野菜の選抜方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ある特定の配列からなるカーラウィルスグルー
プに属するウィルス用のプライマーとある特定の配列か
らなるポティウィルスグループに属するウィルス用のプ
ライマーを用いる逆転写−ポリメレースチェーンリアク
ション法により、両者のウィルス外被蛋白質遺伝子を増
幅し、該増幅遺伝子の視覚検出を行なうことにより、カ
ーラウィルスグループに属するウィルスとポティウィル
スグループに属するウィルスの２種類のウィルスの感染
および非感染を検定し、該２種類のウィルスに非感染な
検体を選び出すことを特徴とするウィルスフリーネギ属
野菜の選抜方法。 【効果】本発明方法によって、きわめて効率的にウィル
スフリーネギ属野菜の選択が可能となり、よりすぐれた
ネギ属野菜のウィルスフリー種苗の供給ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウィルスフリーネギ属
野菜の選抜方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物に感染するウィルスは、電子顕微鏡
によって観察される粒子の形態から大きく３つ、すなわ
ち球状、楕円体状および棒状に分けられる。さらに、棒
状ウィルスは真直な棒状および屈曲棒状の２種に分けら
れる。従来、ネギ属野菜に感染する屈曲棒状ウィルスが
複数知られているが、該屈曲棒状ウィルスについての種
類、病原性等に関しては多くの点が不明なままであっ
た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】現在栽培されているネ
ギ属野菜のほとんどすべての品種がウィルスに感受性で
ある。ウィルスがネギ属野菜に感染すると、該ウィルス
の病原性に応じて１０〜５０％の減収となり、農業生産
性が著しく低下する。このため、ウィルスフリー種苗の
供給が強く求められている。ウィルスフリー種苗は、生
長点培養法によってウィルスフリー植物体を作出した
後、該植物体を大量に増殖することにより、実際の生産
に利用される。しかしながら、ウィルスフリーである生
長点の摘出が難しい場合が多く、このため生長点培養法
によってもすべての個体についてウィルスを完全に除去
することは難しかった。また、ウィルスフリー植物体の
大量増殖は、通常、網室などの隔離圃場で数年間行なわ
れるが、その際ウィルスの再感染が生じていた。このた
め、ウィルスフリーネギ属野菜を高感度で、かつ容易に
選抜するための方法が必要であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況を鑑み、すぐれたウィルスフリーネギ属野菜の選抜方
法を見い出すべく鋭意検討を重ねた結果、ある特定のグ
ループに属するウィルスの単独感染では発病しないが、
他の特定のグループに属するウィルスが重複感染する
と、後者のウィルスの単独感染よりも著しく激しいモザ
イク病徴を生じ、生育を甚だしく阻害することをつきと
め、この知見に基づき、屈曲棒状ウィルス群内のある特
定の２種のグループに属する各々のウィルスの感染およ
び非感染を各々のウィルスに対して２種類のある特定の
塩基配列であるオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いる逆転写−ポリメレースチェーンリアクション法
（RT-PCR法) により各々のウィルス外被蛋白質遺伝子を
増幅し、該増幅遺伝子の視覚検出を行なうことにより、
きわめて効率的にウィルスフリーネギ属野菜の選択が可
能であることを見い出し、本発明を完成した。すなわ
ち、本発明は、カーラウィルスグループ（Carlavirus g
roup) に属するウィルスを選択的に検出するために、配
列群 (1) 5'−ＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＧ−
3'（以下、配列番号１と記す。）、 (2) 5'−ＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＧ−
3'（以下、配列番号２と記す。） から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドと
配列群 (3) 5'−ＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡ
−3'（以下、配列番号３と記す。）、 (4) 5'−ＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧ−
3'（以下、配列番号４と記す。） から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドの
両者をプライマーとして用いる、およびポティウィルス
グループ（Potyvirus group)に属するウィルスを選択的
に検出するために、配列群 (5) 5'−ＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧ−
3'（以下、配列番号５と記す。）、 (6) 5'−ＣＣＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡ−
3'（以下、配列番号６と記す。） から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドと
配列群 (7) 5'−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＴＧＣＡＴＴＣ−
3'（以下、配列番号７と記す。）、 (8) 5'−ＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣ−
3'（以下、配列番号８と記す。） から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドの
両者をプライマーとして用いる逆転写−ポリメレースチ
ェーンリアクション法（RT-PCR法) により両者のウィル
ス外被蛋白質遺伝子を増幅し、該増幅遺伝子の視覚検出
を行なうことにより、カーラウィルスグループに属する
ウィルスとポティウィルスグループに属するウィルスの
２種類のウィルスの感染および非感染を検定し、該２種
類のウィルスに非感染な検体を選び出すことを特徴とす
るウィルスフリーネギ属野菜の選抜方法（以下、本発明
方法と記す。）およびプライマーとして使用されるオリ
ゴヌクレオチド（以下、本発明オリゴヌクレオチドと記
す。）を提出するものである。

【０００５】本発明方法において、ネギ属野菜とは、ア
リウム属に属する植物を意味し、たとえばニンニク、シ
ャロット、ラッキョウ、ワケギ、リーキ等の栄養繁殖性
野菜、タマネギ、ネギ等の種子繁殖性野菜等をあげるこ
とができる。好ましくはニンニクがよい。本発明方法に
おいて、ウィルスフリーとはウィルスに感染していない
状態を示すことはもちろんであるが、ネギ属野菜の種類
等に応じて強い病原性のあるウィルスに非感染であり、
かつ農業生産性を著しく低下させない状態を包含する場
合もある。

【０００６】本発明オリゴヌクレオチドは、配列番号１
から８で示される塩基配列に基づき、例えば、β−シア
ノエチルホスホアミダイト法がチオホスファイトを用い
る市販の自動ＤＮＡ合成装置によって得ることができ
る。

【０００７】本発明方法において、カーラウィルおよび
ポティウィルスに属するウィルスを選択的に検出するた
めには、検体であるネギ属野菜から、たとえば、下記の
方法によって、１−（１）ウィルス粒子を調製し、該ウ
ィルス粒子からウィルスゲノム遺伝子であるＤＮＡを抽
出し、または１−（２）検体である植物から直接ウィル
スゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡを抽出し、２．該ＲＮＡ
に対する相補的なＤＮＡ（以下、ｃＤＮＡと記す。）を
作製（逆転写：ＲＴ）する必要がある。３．得られるｃ
ＤＮＡは本発明オリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いるポリメレースチェーンリアクション法（ＰＣＲ
法）により増幅され、４．視覚検出される。

【０００８】（ウィルス粒子の調製）ウィルス粒子の調
製の調製は、新編 植物ウィルス学第３版 著作代表者
平井篤造 発行所（株）養賢堂(1984)、日本植物病理
学会報 第52巻、第３号第４５３頁(1986)等に記載され
る通常の方法によって行なうことができる。具体的に
は、たとえば、検体である植物の緑葉等の組織を液体窒
素中で凍結後、低温下でチオグリコール酸、亜硫酸ナト
リウム、２−メルカプトエタノール等の還元剤、ジエチ
ルジチオカーバメート、アジ化ナトリウム等の酸化酵素
の阻害剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤等を含む緩衝液を加
え、磨砕する。該磨砕物をガーゼ等でろ過し、粗抽出液
を得る。必要に応じて、さらに低速遠心分離、有機溶媒
による分別沈澱等の方法により、該粗抽出液の清澄化を
行なうことができる。また得られる粗抽出液の濃縮が必
要な場合は、高速遠心分離、硫安塩析、等電点沈澱、２
相系分配、ゲル粒子による脱水等の方法を用いることが
できる。このようにして得られる粗抽出液を低速遠心分
離と高速遠心分離とを組み合わせた分画遠心分離、速度
ゾーン遠心分離、平衡密度勾配遠心分離等の密度勾配遠
心分離、クロマトグラフィー、電気泳動等の方法により
分画・精製を行ない、ウィルス粒子を得る。

【０００９】（ウィルス粒子からのウィルスゲノム遺伝
子であるＲＮＡの抽出）ウィルスゲノム遺伝子であるＲ
ＮＡの抽出は、生物化学実験のてびき ３核酸の分離・
分析法 著作代表者 泉 美治 発行所（株）化学同人
(1986)等に記載される通常の方法によって行なうことが
できる。具体的には、たとえば、初期段階としてフェノ
ール法、グアニジウム塩、尿素、界面活性剤等のタンパ
ク質変性剤を用いる方法等によりウィルス粒子からタン
パク質を除去し、遊離したＲＮＡをエタノール沈澱等の
方法による回収を行ない、ウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡを得る。なお、この工程は、調製後のウィルス粒
子のみでなく、ウィルス粒子調製段階でもタンパク質の
除去として行なうことができる。

【００１０】（検体である植物からのウィルスゲノム遺
伝子を含む全ＲＮＡの抽出）一方、検体である植物から
のウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡの抽出は、検体
である植物が小さく、精製によりウィルス粒子を調製す
ることが困難である場合に適する。抽出されたウィルス
ゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡは、ウィルス粒子から得ら
れたウィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡと同様の方法
で、該ＲＮＡに対するｃＤＮＡの作製に供試することが
できる（後述）。検体である植物からのウィルスゲノム
遺伝子を含む全ＲＮＡの抽出は、植物遺伝子工学マニュ
アル 内宮博文ら編著 発行所（株）講談社、植物分子
生物学実験法 遠山益監訳 発行所 丸善株式会社(199
1)等に記載されるフェノール、グアニジウムイソチオシ
アネート、ＳＤＳ等のタンパク質変性剤を用いる通常の
方法によって行なうことができる。具体的には、たとえ
ば、検体である植物の緑葉等の組織を液体窒素中で凍結
後、磨砕する。液体窒素を気化除去後、室温下でフェノ
ールないしＳＤＳまたはフェノールないしグアニジウム
イソチオシアネート等を加え、急速にタンパク質を変性
させ、かつ RNase等の酵素を不活化させる。可溶化後の
磨砕物からは、たとえば、塩酸グアニジウムでの連続沈
澱、塩化セシウムクッション遠心分離、有機溶媒抽出に
よる脂溶性物質の除去等の方法により分画・精製を行な
い、エタノール沈澱等により全ＲＮＡを回収する。な
お、検体である植物にウィルスが感染していた場合、上
記の方法により得られる全ＲＮＡには、ウィルスゲノム
遺伝子であるＲＮＡ以外に、たとえば、ｍＲＮＡ等の他
のＲＮＡが混在するが、ウィルスゲノム遺伝子に対する
ｃＤＮＡの作製にはなんら影響を及ぼすものではない。

【００１１】（ウィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡまた
はウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡに対するｃＤＮ
Ａの作製）ウィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡまたはウ
ィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡに対するｃＤＮＡの
作製は、ヴィロロジー第 132巻、第 271頁(1984)等に記
載させる通常の方法によって行なうことができる。具体
的には、たとえば、ウィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡ
またはウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡを、リガン
ドとして１２から１８塩基のデオキシチミジン（ｄＴ）
をリン酸ジエステル結合を介して連結したオリゴｄＴを
有するセルロースカラムを用いるアフィニティークロマ
トグラフィー法によって、ポリＡ末端を有するウィルス
ゲノム遺伝子であるＲＮＡまたはウィルスゲノム遺伝子
を含むＲＮＡを得る。得られた該ＲＮＡからGubler−Ho
ffman 法等を用いる市販のｃＤＮＡ合成システムによっ
てｃＤＮＡを得る。

【００１２】（ｃＤＮＡに含まれるウィルス外被蛋白質
遺伝子の増幅）ｃＤＮＡに含まれるウィルス外被蛋白質
遺伝子の増幅は、本発明オリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いて、ポリメラーゼチェインリアクション法
により行なう。ポリメラーゼチェインリアクションは、
変性工程、プライマーのアニーリング工程およびＤＮＡ
ポリメラーゼによる伸長工程からなるＤＮＡ複製サイク
ルを繰り返して行なう反応であり、たとえば Saikiら、
Science 、第 230巻、第1350頁(1985)、Williamsら、Nu
cleic Acids Research、第18巻、第22号、第6531頁(199
1)等に通常の方法が記載されている。

【００１３】本発明方法において上記ポリメラーゼチェ
インリアクションとして、たとえば、あらかじめ本発明
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩
基（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）およびｃＤＮＡを加えた
約1.0mM から約3.0mM 、好ましくは約1.5mM から約2.0m
M の塩化マグネシウム等を含有する増幅用緩衝液中で、
約２０回から約５０回、好ましくは約２３回から約３０
回ＤＮＡ複製サイクルを繰り返して行なうことをあげる
ことができる。さらに、ポリメラーゼチェインリアクシ
ョンにおける各工程は、たとえば下記の条件等で行なう
ことができる。変性工程は、たとえば、通常約９０℃か
ら約100 ℃、好ましくは約95℃から約100 ℃で、約１分
間から約５分間、好ましくは約１分間から約２分間加熱
することにより行なう。プライマーのアニーリング工程
は、たとえば、通常約４０℃から約８０℃で、好ましく
は約５５℃から約８０℃で、約１分間から約３分間、好
ましくは約１分間から約２分間プライマーとインキュベ
ートすることにより行なう。プライマーは本発明オリゴ
ヌクレオチドを単独で用いる、または併用することがで
きる。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程は、たとえ
ば、通常約７０℃から約７５℃、好ましくは約７２℃か
ら約７３℃で、約１分間から約４分間、好ましくは約１
分間から約２分間耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ処理するこ
と等により行なう。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして
は、たとえば、宝酒造株式会社製の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の市販のものをあげることができる。

【００１４】（増幅遺伝子の視覚検出）上記方法により
得られた増幅されたウィルス外被蛋白質遺伝子は、該増
幅遺伝子を電気泳動にて分離せずにそのままの状態で、
または分離後、該増幅遺伝子の視覚検出を行なう。分離
せずにそのままの状態から増幅遺伝子の視覚検出は、植
物防疫 第44巻、第12号、第 549頁(1990)、最新農学実
験の基礎 東北大学農学部農学科編 発行所（株）ソフ
トサイエンス社(1990)、蛋白質核酸酵素 第35巻、第17
号、第2971頁等に記載される通常の方法によって行なう
ことができる。具体的には、たとえば、ウィルス外被蛋
白質遺伝子領域に特異的な塩基配列を有する³²Ｐ等で標
識した放射性もしくはビオチン−11−ｄＵＴＰあるいは
ビオチン−14−ｄＡＴＰ等のビオチン化ヌクレオチドを
ニックトランスレーション法あるいはランダムプライミ
ング法によって取り込ませて標識した非放射性プロー
ブ、またはアルカリ性フォスファターゼあるいはペルオ
キシダーゼ等の酵素をグルタールアルデヒドを用いて塩
基部位へ架橋結合させて標識した非放射性プローブを用
いるドットブロットハイブリダイゼーション法等をあげ
ることができる。分離後の増幅遺伝子の視覚検出は、染
色法によって標品であるウィルス外被蛋白質遺伝子との
バンドの位置の差を調べる方法等をあげることができ
る。たとえば、増幅されたウィルス外被蛋白質遺伝子は
約 0.2％から約２％、好ましくは約0.8％から約 1.5％
のアガロースゲルおよびTris−リン酸系（pH7.5-8.0)、
Tris−酢酸系（pH7.5-8.0)、Tris−ホウ酸系（pH7.5-8.
3)、好ましくはTris−ホウ酸系の緩衝液、また必要に応
じて、ＥＤＴＡ等を添加することもできる、を用いて１
００Ｖ、４０分間および５０Ｖ、８０分間等の条件で電
気泳動することにより分離される。染色法で用いられる
物質は、たとえば、エチジウムブロミド等のフェナント
リジン系の色素で、かつ核酸と相互作用するような物質
をあげることができる。該染色法は、あらかじめ電気泳
動に用いられる緩衝液に、たとえば、終濃度として約
0.5μg/mlのエチジウムブロミド等の物質を加えておく
と、暗所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲルに
照射することによって、電気泳動中でも、ＤＮＡとエチ
ジウムブロミドの結合体の赤色バンドを検出できるが、
通常、電気泳動終了後に、ゲルをエチジウムブロミド等
の物質の溶液に約１５分間から約６０分間浸してから暗
所で２５４nmまたは３６６nm等の紫外線をゲルに照射す
ることによって、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合体
の赤色バンドを検出する。上記の方法により、検出され
る増幅されたウィルス外被蛋白質遺伝子の存在有無によ
って、ウィルスの感染および非感染を検定し、該ウィル
スに非感染な検体を選び出すことが可能となる。また検
出の精度をさらに高める場合、ＤＮＡ複製サイクル数、
プライマーのアニーリング工程の温度、反応用緩衝液中
のマグネシウム濃度等のポリメラーゼチェインリアクシ
ョンの条件を変化させることにより可能である。

【００１５】

【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。なお、下記の試験例で標品として用いたウィル
ス外被蛋白質遺伝子およびウィルスの外被蛋白質遺伝子
領域に特異的な塩基配列を有する非放射性プローブ
は、、平成５年３月４日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所によって受託されたEscheichia coli XL1-BL
UE/pGLA-9 （受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３４９９）お
よびEscheichia coli XL1-BLUE/pGMA-2 （受託番号：Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３５００）が保有するプラスミドから、
下記の塩基配列（配列番号９および１１）ならびに制限
酵素地図（図１）および下記の塩基配列（配列番号１０
および１２）ならびに制限酵素地図（図２）に基づき、
通常の遺伝子操作等の方法に従って得ることができる。

【００１６】実施例１ （ウィルス粒子の調製） ニンニク植物のモザイク病羅病葉２４０ｇを−８０℃の
ディープフリーザー内で凍結後、１mMのＥＤＴＡ、0.25
重量％の２−メルカプトエタノール、 0.1重量％のジエ
チルジチオカルバミン酸ナトリウムを含む 0.1Ｍのホウ
酸ナトリウム緩衝液(pH8.0) ９６０mlを加え、ワーリン
グブレンダーにより４℃下で充分に磨砕した。該磨砕物
をガーゼでろ過し、得られたろ液を遠心分離（10,000rp
m, 10min, ４℃）後、上清を回収することによって粗抽
出液を得た。該粗抽出液に終濃度として２重量％になる
ようにTriton X-100を加え、４℃で２０分間攪拌後、２
０％ショ糖クッションを用いた超遠心分離 (156,000g,
60min,４℃）によってウィルス濃縮画分を沈澱とした得
た。該画分を蒸留水４８mlに懸濁後、前記と同条件での
遠心分離および超遠心分離操作を３回繰り返し、最終的
に蒸留水に懸濁したウィルス粒子を６００μｌ（ウィル
スタンパク量として３９３μｇ）得た。

【００１７】実施例２ （ウィルス粒子からのウィルス
ゲノム遺伝子であるＲＮＡの抽出） 実施例１によって得られたウィルス粒子６００μｌ（ウ
ィルスタンパク量として３９３μｇ）に等量の終濃度と
して２００μｇ／mlのプロティナーゼＫ、１００mMの塩
化ナトリウムおよび 0.5重量％のＳＤＳを含む１０mMの
Tris−ＨＣｌ緩衝液（pH7.6)を加え、３７℃で１０分間
インキュベートした。次に等量のフェノール−クロロホ
ルム（１：１）を加え、１分間ボルテックスを用いて混
合した。これを遠心分離（10,000ｇ，１min,４℃）して
得られた水層を回収した。このフェノール−クロロホル
ム抽出操作は３回繰り返された。次に等量のクロロホル
ムを加え、１分間ボルテックスを用いて混合した。これ
を遠心分離（10,000ｇ，１min,４℃）して得られた水層
を回収し、２倍量のエタノールおよび終濃度として０．
３Ｍの酢酸ナトリウムを加え、ボルテックスを用いて１
５秒間混合後、−８０℃、５分間のエタノール沈澱を行
った。遠心分離によって得られた沈澱を回収後、風乾に
よりエタノールを除去して、ウィルスゲノム遺伝子であ
るＲＮＡを得た。該ＲＮＡをＴＥ緩衝液〔1mM EDTA,10m
M Tris-HCl (pH 8.0)]に懸濁し、該懸濁液をＯｌｉｇｏ
ｄＴ セルロースカラム（５’→３’社製）に通じて
目的物を吸着後、溶出させることにより、約８から１０
ｋｂのポリＡ末端を有するウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡを６．７６μｇ得た。

【００１８】実施例３ （検体である植物からのウィル
スゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡの抽出） ニンニク植物の各種組織として、モザイク病羅病葉（生
葉、−８０℃凍結保存葉）、リン片、生長点培養により
作出されたウィルスフリー培養苗、生長点培養により作
出されたウィルスフリー小種球を用いた。該植物体組織
各々５０mg（生重量）を乳鉢中で約５mlの液体窒素に約
１分間浸し、凍結させた。該凍結物を乳棒を用いて液体
窒素中で粉末状にした後、液体窒素を気化させた。得ら
れた粉末に室温下で、フェノール及びチオシアン酸グア
ニジン含有試薬（ISOGEN：ニッポンジーン製）１mlを加
えて室温下、１０分間放置した。更に該試料溶液にクロ
ロホルム 0.2mlを加え、１５秒間激しく振とう後、室温
下、３分間放置し、遠心分離（12,000rpm, 10min, ４
℃）後、水層を回収した。得られた水層にイソプロパノ
ール 0.5mlを加え、混合後、室温下５分間放置し、遠心
分離（12,000rpm, 10min, ４℃）して得られた沈澱に７
５％エタノール１mlを加え、１５秒間激しく振とう後、
遠心分離（7,500rpm, ６min ，４℃）した。得られた沈
澱を RNaseフリー滅菌蒸留水２００μｌに再懸濁後、エ
タノール沈澱し、最終的に植物組織中の全ＲＮＡ約４０
−約９０μｇを得た。

【００１９】実施例４ （ウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡおよび該遺伝子を含む全ＲＮＡに対するｃＤＮＡ
の作製） 実施例２によって得られたウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡを RNaseフリー滅菌蒸留水１０μｌに懸濁し、該
懸濁液のうち、６μｌ、すなわちＲＮＡ量として４μｇ
からｃＤＮＡ合成システム（アマシャム社製）によって
ｃＤＮＡを３００ng得た。一方、実施例３によって得ら
れたウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡを上記と同様
の方法で、ｃＤＮＡを約１３０〜２３０μｇ得た。

【００２０】実施例５ （ｃＤＮＡに含まれるウィルス
外被蛋白質遺伝子の増幅） 実施例４により得られたｃＤＮＡに含まれるウィルス外
被蛋白質遺伝子の増幅は、カーラウィルスグループに属
するウィルス用プライマーである配列番号１ならびに配
列番号３で示される本発明オリゴヌクレオチド、および
ポティウィルスグループに属するウィルス用プライマー
である配列番号６ならびに配列番号８で示される本発明
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、 1.5mM
の塩化マグネシウムを含有する増幅用緩衝液中で、２７
回ＤＮＡ増幅サイクルを繰り返すポリメラーゼチェイン
リアクション法により行ない、ウィルス外被蛋白質遺伝
子を増幅した。その際の各工程の条件は、（１）変性工
程９５℃、初回のみ５分間、他は１分間加熱、（２）プ
ライマーのアニーリング工程５７℃、１分間インキュベ
ート、（３）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程７２
℃、最終のみ７分間、他は１分間耐熱性ポリメラーゼ処
理、であった。

【００２１】実施例６ （増幅遺伝子の視覚検出） 実施例５により得られた増幅されたウィルス外被蛋白質
遺伝子は、１％アガロースゲルおよび 0.2mMのＥＤＴＡ
を含有する８９mMのTris−ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH
8.0) を用いて、１００Ｖ、３０分間の条件で電気泳動
することにより分離された。分離後の増幅遺伝子の視覚
検出は、 0.5μｇ／mlのエチジウムブロミド水溶液に約
10分間浸してから暗所で２５４nmの紫外線をゲルに照射
することによって、ＤＮＡとエチジウムブロミドの結合
体の赤色バンドを検出した。標品であるウィルス外被蛋
白質遺伝子は式化１の塩基配列（以下、配列番号９と記
す。）であるカーラウィルスグループに属するウィルス
の外被蛋白質遺伝子および式化２の塩基配列（以下、配
列番号10と記す。）であるポティウィルスグループに属
するウィルス外被蛋白質遺伝子を用いた。

【化１】配列番号９

【化２】配列番号10 結果をアガロースゲル電気泳動パターンとして図３に示
す。

【００２２】実施例７ （増幅遺伝子の視覚検出） 実施例５により得られた増幅されたウィルス外被蛋白質
遺伝子は、１００℃、５分間および氷中、５分間の条件
下で熱変性を行ない、１μｌずつナイロンフィルター
（Hybond N 登録商標、アマシャム社製）にスポット
し、濾紙上２０分間風乾後、紫外線を２分間照射するこ
とにより固定した。次に、ＥＣＬ detectionkit( アマ
シャム製）を用い、上記のＤＮＡ固定フィルター４cm²
に対し、 0.5Ｍの塩化ナトリウムを含むハイブリダイゼ
ーション用緩衝液１mlをハイブリバックに入れ、熱シー
ル後、４２℃で１時間プレハイブリダイズした。その
後、等量のハイブリダイゼーション用緩衝液と交換し、
カーラウィルスグループに属するウィルスの外被蛋白質
遺伝子領域〔式化３の塩基配列（以下、配列番号11と記
す。）〕に特異的な塩基配列を有するペルオキシダーゼ
で標識した非放射性プローブおよびポティウィルスグル
ープに属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領域〔式化４
の塩基配列（以下、配列番号12と記す。）〕に特異的な
塩基配列を有するペルオキシダーゼで標識した非放射性
プローブを１０ng／mlの割合で添加し、該ＤＮＡ固定フ
ィルターを４２℃で約12時間ゆっくり振とうしながらイ
ンキュベートし、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成さ
せた。

【化３】配列番号11

【化４】配列番号12 反応終了後、該ＤＮＡ固定フィルターを、該フィルター
１cm² に対し６Ｍの尿素、 0.4重量％のＳＤＳを含む
0.5×ＳＳＣ(7.5mMクエン酸ナトリウム，７５mM塩化ナ
トリウム， pH7.0) 洗浄後２mlを用いて、４２℃で１０
分間洗浄した。さらに毎回洗浄液を交換しながら１０分
間、次に２０分間洗浄した。次に 0.3Ｍの塩化ナトリウ
ムを含む0.03Ｍクエン酸ナトリウム(pH7.0) 洗浄液を上
記と同量用いて、室温で５分間洗浄した。この洗浄を１
回繰り返した後、ＤＮＡ固定フィルターを濾紙上で１分
間放置し、検出試薬混合液（ECL dirct labeling kit ;
アマシャム製）に浸し、室温で１分間振とうするによ
り、プローブの発光反応させた。上記の発光によりＸ線
フィルムを１時間感光させた後、このＸ線フィルムを現
像し、ウィルス存在有無の指標であるスポットの有無を
調べた。結果を表１に示す。なお、比較試験としてウィ
ルス粒子を用いたが、これはニンニク生葉５ｇから実施
例１、２、４および５に準じた同様な方法で調製され、
試験された。

【００２３】

【表１】 ここで「疑良好」とは、カーラウィルスグループに属す
るウィルスの単独感染では、モザイク病徴を生じないた
めに、現在は健全な状態であるが、将来ポティウィルス
グループに属するウィルスに感染した場合（重複感染）
には、ポティウィルスグループに属するウィルスの単独
感染の場合よりも著しく激しいモザイク病徴を生じ、生
育を甚だしく阻害することを意味する。したがって、潜
在的な危険性を有する。

【００２４】

【発明の効果】本発明方法によって、きわめて効率的に
ウィルスフリーネギ属野菜の選択が可能となり、よりす
ぐれたネギ属野菜のウィルスフリー種苗の供給ができ
る。

【配列表】

【００２５】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCAAAACCTGCCTACCCG ２０

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTGGCGTGATGGATCGTGAG ２０

【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGAAAACATCCGAAGAAGCCA ２１

【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGGGAATTCTTCGCCAGAG ２０

【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGTTCTTGAACAAGCACCG ２０

【００３０】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGATTGTGAGGCAACGGAA ２０

【００３１】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATGGTGCATCCGTGCATTC ２０

【００３２】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACATGTGCTGTGTGCCTCTC ２０

【００３３】配列番号：９ 配列の長さ：１４１３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Carlavius group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１３７．．１０３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGACATTGAA CGAAGTGCAC GTTATCATCA CTGGTGAGTC CGTCAAGCTC ATTGGCTGCG 60 ATCACGAAGA TTCATCGATT TCGCAAACAA GCGAACCCTT TGGTTCACTT TAGTTAACAG 120 CGCTCTAATT GATATTATGG CTAACGAAGA AGAAGAACTC AGTAGAATGC AAAACCTGCC 180 TACCCGCGAT CCCGGAACTA TCCCCGAGCA AGAACGTAGC AAGGCAGTTA ATGATGTTGG 240 CGTGATGGAT CGTGAGAATT TTGAAGCTGT GTTGCGGAGA AGTGAAGATA GATTCAATAA 300 GCTTAAGGAG AAATGCCTGT CGGAACTATC TAGCGTGAGA GTGACCAATT GCGGGTGGGA 360 GTCAGGAAGA CCCAAAGCAC AATTAGCCGA TAGTCTTAAG GGGGATGCAT CCAACATTTT 420 CACACGCCCC TCAATGGATG CCTTGCTAGT GAGGAACTAC GCGCCTGAGA GCAACAATAT 480 GGCTACCGCC GAAGAGTTAG CGAAAATTTC TGCTAAAATA CAGGCTCTCG GCGCTCCTGA 540 AGAATGCTTG GCCGAAGTTT TCTGGGATAT CTGTATGTAC TGTACCACTG CAGGCAGTTC 600 GCCAAATGTG AATCCCAAAG GTACTATCTC AGTCGGGGGT AAAGTCGTGA CTCGAGATAT 660 GGTTGTCGCT GTGATCAAGG AGTATTCCAC ATTACGTCAA GTCTGTCGTT GCTACGCACC 720 AGTGGTCTGG AATTACATGC TATTAAATGA ACAACCACCA GCTAATTGGG ATTCCAAAGG 780 ATTTACTGAG AACACTAAAT ACGCGGCTTT CGATACTTTT GATGCTGTCA CGAACAAGGC 840 TGCAATTCAA CCACTCGAGG GCCTTATTCG AGCCCCGACT GACGCGGAAC GCATCGCTTT 900 TCGTACGCAC AAGAAATTAG CTCTGGCGAA GAATTCCCAG AATTCACGTT ATTCCAACAC 960 TTCTGCTGAA GTTACCGGTG GCTTCTTCGG ATGTTTTCCA AAACACAATT TCAGAGAGAA 1020 TCGATGTTGA TCAAGCAAAG GACTTACCGT AGACTATTGC GTGCTATATT TAAGTTGCAT 1080 ACTTA AAGA ACTGTGTGGA TGTGATAGAC ATCATCGTTA ATAAAATAGT GTGTGGATGC 1140 ACTGGAGCAT CTAAATATGC TCGAGCTCGT AGAGCTAAGA GTATTGGTAG GTGCCCCCGC 1200 TGCTTCAGGT GTGCTCCTGG TTTTTATTTT ACTAAAAACT GTGATACTAA AAATTGTACC 1260 CCAGGCATTA GCTATAATGA AAAAGTCAAG AACTTTATAG TTGATGGTGT TAACAATGTG 1320 AAACCCTACT ACAGTTCTTG GCTTGTTGCC CATAAAACCT AAATAATGCA TAAGTGGGAC 1380 ATATAAAATA ATTTGTTTTT AAAATATTTT CGC 1413

【００３４】配列番号：１０ 配列の長さ：１９７４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Potyvirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：３４６．．１３７７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTCTTCGTGA ACGGTGATGA TTTAATCATA GCAGTTGAAC CAGGCTCTGA AACATTCCTT 60 GATAGTTTGC AAAATCTCTT TCATCAACTT GGCTTAAATT ACAACTTTGA CAATCGAACG 120 CGCAATAAGG AAGAGTTGTG TTTCATGTCA CACATGGGTA TTTTACAAGA AGACATATAT 180 ATACCAAAAC TGGATAAGGA GCGCATAGTG TCAATATTGG AGTGGGATCG CGCTCAGCAG 240 CCTGAGCATA GATTGGAAGC TCTATGCGCA GCCATGATCG AAGCTTGGGG ATATCCGGAA 300 TTGCTAGATC GAATCCGAAA GTTCTATTAT TGGGTTCTTG AACAAGCACC GTATAATGAG 360 TTGAGTGCAT TAGGTAAAGC GCCATTTATC TCTGAGGCAG CCCTGCGGAA TTTATACACC 420 GATTGTGAGG CAACGGAAGC GGAGTTAGCA CGATACCTCG AACTTTACGA CAGCGATACA 480 CCCGTAGAAG ACACGTTTGT GTTCCAAGCT AATGATGAAT TAGATGCAGG CATGCAAACA 540 AGTAAGAAAC AGAAGGATGG TAATGATAAA TCTATTGAAC AACGCGATCC AGCATCATCA 600 CAAGTTAGTT CATTAGGCAA GAAAGACGGT GAAGGCGGTT CAGGAATGAG TAGAAACAAA 660 GACAGGGATG TGAACGTTGG CACAACAGGG ACTTTTAGTG TTCCACGAAT CAAACAGATA 720 CCACAGAAAG GTATTTCGAT ACCAATGGAC GGAGGAAAAT CAATACTCAA CTTAGATCAC 780 TTACTACAGT ATAAACCAAA GCAATTGAAT ATATCGAACA CAAGAGCCAC GGTGGCACAA 840 TTTAAAACCT GGATGGAGAG AGTGCAAGAG GATTACGGTG TCACTAAAGG TGAAATGGGC 900 ATAATTCTGA ATGGTTTGAT GGTGTGGTGC ATCGAAAATG GAACCTCACC AAATATAAAT 960 GGGACTTGGA CTATGATGGA TGGCGATGAG CAAGTCGCGT ACCCTTTACG GCCGATCGTT 1020 GAACATGCGA AACCAACCTT ACGGCAAATA ATGGCGCATT TTTCAGCACT CGCGGAGGCG 1080 TACATTGAAA TGAGAAATTC AGAGCAGGCT TATATGCCAA GATATGGACT ACAAAGAAAT 1140 CTTACAGACA TGGGCCTCGC ACGGTATGCA TTTGATTTTT ATGAAGTCAC ATCAAGAACA 1200 CCAGTTAGAG CGCGCGAGGC TCACGCACAA ATGAAAGCAG CGGCCCTACG TAATTCAAGG 1260 CCAAGGCTGT TTGGACTAGA CGGTAACGTC ACAACCACGG ATGAGGACAC GGAGAGGCAC 1320 ACAGCACATG TCGTGAATGC ACGGATGCAC CATCTTGATG GTCGGCATAT GCAGTGATGT 1380 TTCGGTTAGT AACCGGTTAT GGGCTTCCAT TTAAAAAGTC CCGAGTGCCA AACTTGTATT 1440 TTGGCTAGTG TAGTGAAACT ATGATTCACT CGTTCAAGGC AGTTTCTACT TTAAGGATGA 1500 CTTGGGAATT AGTAGCTCCC AATGCCAGTC ACGATGGTGA CTACCAAGAG TCAACACTTG 1560 GTTTGAGGTT GATCGTCCGA AGATCTATCC GGAGTACGGT TTTGTAAAGA AGGTGAATTC 1620 AATTTTTAAG GATAGTAAGT CTGAAGCCTT ATTGGTGTAT AAGCAGCCTG AATTCTGATA 1680 CCCCACCTTT ACCCTACAAT GGAGTGCTAC TTTAGAGACT AGCTAGGATT GAGACCGAAA 1740 TCTCACATAC TGGCATGGCC AGTAGTTGAT CACTTAATGA TCAGGTGACC ACTCTACAGT 1800 CAAGTTGGAA CCCGTAGTAT CCTATCCTTA CCTAATATCG TAAGTTTTAT TTACTGGTGT 1860 AGCGTAGGTT CAACCACCTT ATAAACACTT TGCTATATTA GGATCTGAGC TGTTCGTCTG 1920 AAGGCACTAA GAGTGGTTTG ACCATGTGTG CGTTCTTACG TTGCAGTAAG AGAC 1974

【００３５】配列番号：１１ 配列の長さ：８９４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Carlavius group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．８９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGGCTAACG AAGAAGAAGA ACTCAGTAGA ATGCAAAACC TGCCTACCCG CGATCCCGGA 60 ACTATCCCCG AGCAAGAACG TAGCAAGGCA GTTAATGATG TTGGCGTGAT GGATCGTGAG 120 AATTTTGAAG CTGTGTTGCG GAGAAGTGAA GATAGATTCA ATAAGCTTAA GGAGAAATGC 180 CTGTCGGAAC TATCTAGCGT GAGAGTGACC AATTGCGGGT GGGAGTCAGG AAGACCCAAA 240 GCACAATTAG CCGATAGTCT TAAGGGGGAT GCATCCAACA TTTTCACACG CCCCTCAATG 300 GATGCCTTGC TAGTGAGGAA CTACGCGCCT GAGAGCAACA ATATGGCTAC CGCCGAAGAG 360 TTAGCGAAAA TTTCTGCTAA AATACAGGCT CTCGGCGCTC CTGAAGAATG CTTGGCCGAA 420 GTTTTCTGGG ATATCTGTAT GTACTGTACC ACTGCAGGCA GTTCGCCAAA TGTGAATCCC 480 AAAGGTACTA TCTCAGTCGG GGGTAAAGTC GTGACTCGAG ATATGGTTGT CGCTGTGATC 540 AAGGAGTATT CCACATTACG TCAAGTCTGT CGTTGCTACG CACCAGTGGT CTGGAATTAC 600 ATGCTATTAA ATGAACAACC ACCAGCTAAT TGGGATTCCA AAGGATTTAC TGAGAACACT 660 AAATACGCGG CTTTCGATAC TTTTGATGCT GTCACGAACA AGGCTGCAAT TCAACCACTC 720 GAGGGCCTTA TTCGAGCCCC GACTGACGCG GAACGCATCG CTTTTCGTAC GCACAAGAAA 780 TTAGCTCTGG CGAAGAATTC CCAGAATTCA CGTTATTCCA ACACTTCTGC TGAAGTTACC 840 GGTGGCTTCT TCGGATGTTT TCCAAAACAC AATTTCAGAG AGAATCGATG TTGA 894

【００３６】配列番号：１２ 配列の長さ：１０３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Potyvirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．１０３２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCACCGTATA ATGAGTTGAG TGCATTAGGT AAAGCGCCAT TTATCTCTGA GGCAGCCCTG 60 CGGAATTTAT ACACCGATTG TGAGGCAACG GAAGCGGAGT TAGCACGATA CCTCGAACTT 120 TACGACAGCG ATACACCCGT AGAAGACACG TTTGTGTTCC AAGCTAATGA TGAATTAGAT 180 GCAGGCATGC AAACAAGTAA GAAACAGAAG GATGGTAATG ATAAATCTAT TGAACAACGC 240 GATCCAGCAT CATCACAAGT TAGTTCATTA GGCAAGAAAG ACGGTGAAGG CGGTTCAGGA 300 ATGAGTAGAA ACAAAGACAG GGATGTGAAC GTTGGCACAA CAGGGACTTT TAGTGTTCCA 360 CGAATCAAAC AGATACCACA GAAAGGTATT TCGATACCAA TGGACGGAGG AAAATCAATA 420 CTCAACTTAG ATCACTTACT ACAGTATAAA CCAAAGCAAT TGAATATATC GAACACAAGA 480 GCCACGGTGG CACAATTTAA AACCTGGATG GAGAGAGTGC AAGAGGATTA CGGTGTCACT 540 AAAGGTGAAA TGGGCATAAT TCTGAATGGT TTGATGGTGT GGTGCATCGA AAATGGAACC 600 TCACCAAATA TAAATGGGAC TTGGACTATG ATGGATGGCG ATGAGCAAGT CGCGTACCCT 660 TTACGGCCGA TCGTTGAACA TGCGAAACCA ACCTTACGGC AAATAATGGC GCATTTTTCA 720 GCACTCGCGG AGGCGTACAT TGAAATGAGA AATTCAGAGC AGGCTTATAT GCCAAGATAT 780 GGACTACAAA GAAATCTTAC AGACATGGGC CTCGCACGGT ATGCATTTGA TTTTTATGAA 840 GTCACATCAA GAACACCAGT TAGAGCGCGC GAGGCTCACG CACAAATGAA AGCAGCGGCC 900 CTACGTAATT CAAGGCCAAG GCTGTTTGGA CTAGACGGTA ACGTCACAAC CACGGATGAG 960 GACACGGAGA GGCACACAGC ACATGTCGTG AATGCACGGA TGCACCATCT TGATGGTCGG 1020 CATATGCAGT GA 1032

【図面の簡単な説明】

【図１】カーラウィルスグループに属するウィルスの外
被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有するプラスミドで
あるｐＧＬＡ−９の制限酵素地図

【図２】ポティウィルスグループに属するウィルスの外
被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有するプラスミドで
あるｐＧＭＡ−２の制限酵素地図

【図３】本発明方法において、増幅遺伝子の視覚検出の
ために、電気泳動−染色法を用いた場合（実施例６）の
検出結果をアガロースゲル電気泳動パターンとして示す
図である。レーンの識別記号であるＡは、カーラウィル
スグループに属するウィルス用プライマーにより増幅さ
れたウィルス外被蛋白質遺伝子、Ｂはポティウィルスグ
ループに属するウィルス用プライマーにより増幅された
ウィルス外被蛋白質遺伝子を示し、またレーンの識別番
号である数字は検体の植物組織の種類を意味し、１は罹
病葉、２および３はリン片、４および５は生長点培養に
より作出されたウィルスフリー培養苗、６および７は生
長点培養により作出されたウィルスフリー小種球、８お
よび９は比較のためのウィルス粒子を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カーラウィルスグループ（Carlavirus gro
   up) に属するウィルスを選択的に検出するために、配列
   群 (1) 5'−ＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＧ−
   3' (2) 5'−ＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＧ−
   3' から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドと
   配列群 (3) 5'−ＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡ
   −3' (4) 5'−ＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧ−
   3' から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドの
   両者をプライマーとして用いる、およびポティウィルス
   グループ（Potyvirus group)に属するウィルスを選択的
   に検出するために、配列群 (5) 5'−ＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧ−
   3' (6) 5'−ＣＣＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡ−
   3' から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドと
   配列群 (7) 5'−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＴＧＣＡＴＴＣ−
   3' (8) 5'−ＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣ−
   3' から選ばれる配列からなる１つのオリゴヌクレオチドの
   両者をプライマーとして用いる逆転写−ポリメレースチ
   ェーンリアクション法（RT-PCR法) により両者のウィル
   ス外被蛋白質遺伝子を増幅し、該増幅遺伝子の視覚検出
   を行なうことにより、カーラウィルスグループに属する
   ウィルスとポティウィルスグループに属するウィルスの
   ２種類のウィルスの感染および非感染を検定し、該２種
   類のウィルスに非感染な検体を選び出すことを特徴とす
   るウィルスフリーネギ属野菜の選抜方法。
2. 【請求項２】下記の配列群から選ばれる配列からなるオ
   リゴヌクレオチド。 配列群 (1) 5'−ＡＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＡＣＣＣＧ−
   3' (2) 5'−ＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＡＴＣＧＴＧＡＧ−
   3' (3) 5'−ＧＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡ
   −3' (4) 5'−ＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧ−
   3' (5) 5'−ＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＣＣＧ−
   3' (6) 5'−ＣＣＧＡＴＴＧＴＧＡＧＧＣＡＡＣＧＧＡＡ−
   3' (7) 5'−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＧＴＧＣＡＴＴＣ−
   3' (8) 5'−ＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣ−
   3'