JPH0630573B2 - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法Info
- Publication number
- JPH0630573B2 JPH0630573B2 JP60127118A JP12711885A JPH0630573B2 JP H0630573 B2 JPH0630573 B2 JP H0630573B2 JP 60127118 A JP60127118 A JP 60127118A JP 12711885 A JP12711885 A JP 12711885A JP H0630573 B2 JPH0630573 B2 JP H0630573B2
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- mol
- scrc
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素及びせの
製造方法に関する。
製造方法に関する。
本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59-198972に記載されている。しかしながら
この公開された明細書に記載されているＬ−フェニルア
ラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム(Breviba
cterium)属細菌により生産されたものであり、この明細
書にはスポロサルシナ(Sporosarcina)属細菌及びバシル
ス(Bacillus)属細菌が同様の酵素を生産することは全く
示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量を有し、分子
量66,000±5,000のサブユニットから成る点、及びフェ
ニルピンビン酸のみならずｐ−ヒドロキシフェニルピル
ビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の基質に対して
高い特異性を有する点等において、本発明のＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
用を有するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59-198972に記載されている。しかしながら
この公開された明細書に記載されているＬ−フェニルア
ラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム(Breviba
cterium)属細菌により生産されたものであり、この明細
書にはスポロサルシナ(Sporosarcina)属細菌及びバシル
ス(Bacillus)属細菌が同様の酵素を生産することは全く
示唆されていない。またこのＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量を有し、分子
量66,000±5,000のサブユニットから成る点、及びフェ
ニルピンビン酸のみならずｐ−ヒドロキシフェニルピル
ビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の基質に対して
高い特異性を有する点等において、本発明のＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
従って本発明は、今までＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、及び該酵素
の新規な製造方法を提供しようとするものである。
素を生産することが知られていなかった微生物に由来す
る新規なＬ−フェニルアラニン脱水素酵素、及び該酵素
の新規な製造方法を提供しようとするものである。
前記の目的は、次の性質： (1)１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及び
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において約2
90,000の分子量を示し、沈降平衡法において約340,000
の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミドゲルディス
ク電気泳動法において約38,000〜39,000の分子量を有す
るサブユニットを示す； (3)Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的に
作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素；並びにこれらの細菌を培養し、この培養物から前
記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方
法；を提供することにより解決される。
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において約2
90,000の分子量を示し、沈降平衡法において約340,000
の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミドゲルディス
ク電気泳動法において約38,000〜39,000の分子量を有す
るサブユニットを示す； (3)Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに特異的に
作用し、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素；並びにこれらの細菌を培養し、この培養物から前
記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方
法；を提供することにより解決される。
(1)微生物 本発明において使用する微生物としてはスポロサルシナ
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。
属又はバシルス属に属し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素を生産することができるものであればよく、このよ
うな微生物は保存菌の中から選択することができる場合
もあり、また自然界から新たに分離することができる。
スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。この種に属する
保存菌としては例えばスポロサルシナ・ウレアエIFO126
98、及びスポロサルシナ・ウレアエIFO12699(ATCC6473)
を挙げることができ、また新菌株として本発明者等が分
離したスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04を挙げること
ができる。前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもと
にIFO又はATCCから自由に入手することができ、また新
菌株スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第8178号(FERM P-8178)
として寄託され、微工研条寄第1012号(FERM BP-1012)と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
シナ・ウレアエを挙げることができる。この種に属する
保存菌としては例えばスポロサルシナ・ウレアエIFO126
98、及びスポロサルシナ・ウレアエIFO12699(ATCC6473)
を挙げることができ、また新菌株として本発明者等が分
離したスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04を挙げること
ができる。前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のもと
にIFO又はATCCから自由に入手することができ、また新
菌株スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第8178号(FERM P-8178)
として寄託され、微工研条寄第1012号(FERM BP-1012)と
してブタペスト条約に基く国際寄託に移管された。
バシルスに属する微生物としては、例えば本発明者等に
より分離された新菌株バシルスsp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、バシルスsp.SCRC-101A、及びバシルスs
p.SCRC-114Dを挙げることができる。これらの菌株の菌
学的性質は非常に近似しており、これらの代表株として
バシルスsp.SCRC-R79aが工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第8179号(FERM P-8179)として寄託さ
れ、微工研条寄第1013号(FERM BP-1013)としてブタペス
ト条約に基く国際寄託に移管された。またバシルスsp.S
CRC-114Dが微工研条寄第1011号としてブタペスト条約に
基き国際寄託されている。
より分離された新菌株バシルスsp.SCRC-R53b、バシルス
sp.SCRC-R79a、バシルスsp.SCRC-101A、及びバシルスs
p.SCRC-114Dを挙げることができる。これらの菌株の菌
学的性質は非常に近似しており、これらの代表株として
バシルスsp.SCRC-R79aが工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第8179号(FERM P-8179)として寄託さ
れ、微工研条寄第1013号(FERM BP-1013)としてブタペス
ト条約に基く国際寄託に移管された。またバシルスsp.S
CRC-114Dが微工研条寄第1011号としてブタペスト条約に
基き国際寄託されている。
前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調製した。
示す組成の培地を調製した。
この培地を試験管（１８mm）に５mlずつ分注し、120
℃で１５分間滅菌した。この培地に各地より採取した土
壌サンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養した。
この培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさらに３
０℃で３日間振とう培養した。表の培地に２％の寒天を
加えた平板培地に、培養液の一部を白金耳を用いて画線
塗布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同
じ培地組成の斜面培地に釣菌した。
℃で１５分間滅菌した。この培地に各地より採取した土
壌サンプルを少量加え３０℃で３日間振とう培養した。
この培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種しさらに３
０℃で３日間振とう培養した。表の培地に２％の寒天を
加えた平板培地に、培養液の一部を白金耳を用いて画線
塗布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同
じ培地組成の斜面培地に釣菌した。
このようにして各地より採取した土壌サンプルから多数
の菌株を分離した。次に、表の培地200mlを500容mlの三
角フラスコに分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株
をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう培養し、得ら
れた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕した。延伸後
得られた上清を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で
透析した。この上清に含まれるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素活性を後記の方法により測定した。
の菌株を分離した。次に、表の培地200mlを500容mlの三
角フラスコに分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株
をこの培地で３０℃、２４時間回転振とう培養し、得ら
れた菌体を洗浄後、超音波処理により破砕した。延伸後
得られた上清を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で
透析した。この上清に含まれるＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素活性を後記の方法により測定した。
このようにして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を顕
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。
著に生産する下記の５株を得た。これらの菌株の分離源
は次表の通りであった。
前記の新規な５菌株はそれぞれ次のような菌学的性質を
有する。
有する。
上記の菌学的性質に基づき、バージイズ・マニュアル・
オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー(Berge
y′s Manual of Determinative Bacteriology)第８版、
1974年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に同定
した。
オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー(Berge
y′s Manual of Determinative Bacteriology)第８版、
1974年の分類基準に従って、前記５菌株を次の様に同定
した。
（ｉ）SCRC-R04株は、好気性で運動性及び胞子形成能を
有し、グラム陽性の２連〜４連の球菌であることからス
ポロサルシナ属に属する。スポロサルシナ属には唯一の
種としてスポロサルシナ・ウレアエが知られており、前
記性質が文献記載のそれとほぼ一致するので、SCRC-R04
株はスポロサルシナ・ウレアエであると同定される。
有し、グラム陽性の２連〜４連の球菌であることからス
ポロサルシナ属に属する。スポロサルシナ属には唯一の
種としてスポロサルシナ・ウレアエが知られており、前
記性質が文献記載のそれとほぼ一致するので、SCRC-R04
株はスポロサルシナ・ウレアエであると同定される。
(ii)SCRC-R53b、SCRC-R79a、SCRC-101A、及びSCRC-114D
株はいずれもグラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カ
タラーゼの生成が認められることからバシルス属に属す
ることが明らかである。
株はいずれもグラム陽性の桿菌で内生胞子を形成し、カ
タラーゼの生成が認められることからバシルス属に属す
ることが明らかである。
なお、菌株SCRC-R04、SCRC-R53b、SCRC-R79a、SCRC-101
A、及びSCRC-114Dの電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜
第５図に示す。
A、及びSCRC-114Dの電子顕微鏡写真をそれぞれ第１図〜
第５図に示す。
以上、主として自然界から分離した菌株について詳細に
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性
の高い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の
細胞中に存在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生
産に関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター
例えばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当
な宿主、例えばエッシェリッヒヤ・コリ(Eshcerichia c
oli)や酵母のごとき異種宿主、又はバシルス属菌株もし
くはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転換
することにより、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素生産株を人為的に創成することもできる。
記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性
の高い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の
細胞中に存在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生
産に関与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター
例えばプラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当
な宿主、例えばエッシェリッヒヤ・コリ(Eshcerichia c
oli)や酵母のごとき異種宿主、又はバシルス属菌株もし
くはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転換
することにより、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素生産株を人為的に創成することもできる。
この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。また、凍結乾燥保存も常法に従って行う
ことができる。
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてはスポロ
サルシナ属又はバシルス属細菌の保存に常用されている
培地、例えば菌の分離に関して前記した培地を使用する
ことができる。また、凍結乾燥保存も常法に従って行う
ことができる。
(2)酵素の製造方法 前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸ニカリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸ニカリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当たっては前
記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ0.01〜10w/v％であり、好ましく
は0.1〜１w/v％である。
記基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラ
ニンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニ
ンの添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等
により異なるがおよそ0.01〜10w/v％であり、好ましく
は0.1〜１w/v％である。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培養を行うのが好ましい。
よいが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用
い、振とう培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下
で培養を行うのが好ましい。
培養温度は菌が生育し、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵
素が生産される温度範囲内であればいずれの温度でも良
いが、好ましくは25〜45℃である。pHは６〜１１、好ま
しくは７〜１０の範囲である。培養時間は酵素活性が発
現される時間を選べば良いが好ましくは６〜４８時間で
ある。
素が生産される温度範囲内であればいずれの温度でも良
いが、好ましくは25〜45℃である。pHは６〜１１、好ま
しくは７〜１０の範囲である。培養時間は酵素活性が発
現される時間を選べば良いが好ましくは６〜４８時間で
ある。
次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩
析、有機溶媒沈殿、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等
を行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレン
グリコール等の添加による結晶化等の公知の方法によっ
て均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、
本発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載
する。
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって菌体を
集め、超音波処理、ダイノミル等の機械的方法によって
菌体を破砕する。細胞片などの固形物を遠心分離などに
よって除き、粗酵素を得、さらにこれに硫酸プロタミン
又は硫酸ストレプトマイシンを加えて処理を行い、塩
析、有機溶媒沈殿、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等
を行い、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレン
グリコール等の添加による結晶化等の公知の方法によっ
て均一の結晶酵素標品を単離することが出来る。なお、
本発明の酵素の製造方法の具体的な１例を実施例に記載
する。
(3)力価の測定方法 本発明においては次の方法により力価を測定した。
酸化的脱アミノ化反応：グリシン−KCl−KOH緩衝液(pH
0.5)100μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン10
μmol、及び適当量のサンプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの増加を340nmの
吸光度の増加として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを増加せしめる酵素量を１単位とした。
0.5)100μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン10
μmol、及び適当量のサンプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの増加を340nmの
吸光度の増加として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを増加せしめる酵素量を１単位とした。
還元的アミノ化反応：各種緩衝液100μmol、NADH 0.1μ
mol、NH4Cl 200μmol、フェニルピルビン酸ナトリウム１
０μmol及び適当量のサンプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの減少を340nmの
吸光度の減少として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを減少せしめる酵素量を１単位とした。
mol、NH4Cl 200μmol、フェニルピルビン酸ナトリウム１
０μmol及び適当量のサンプルを１mlになるように混合
して反応せしめ、２５℃におけるNADHの減少を340nmの
吸光度の減少として計測し、１分間当り１マイクロモル
のNADHを減少せしめる酵素量を１単位とした。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化反応の速度は、至
適pHにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて約
5.5倍速い。従って前記特開昭59-198972に記載されてい
るように還元的アミノ化反応速度を測定し、上記のよう
に力価を定義した場合、同量の酵素が約5.5倍の単位数
を示す。
適pHにおいて上記酸化的脱アミノ化反応速度に比べて約
5.5倍速い。従って前記特開昭59-198972に記載されてい
るように還元的アミノ化反応速度を測定し、上記のよう
に力価を定義した場合、同量の酵素が約5.5倍の単位数
を示す。
(4)酵素の性質 本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。
有する。
Ａ．スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04により生産され
る酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
る酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋NAD++H2O フェニルピルビン酸＋NADH+NH3+H+ (2)基質特異性：本酵素は第３表に示すようにＬ−フェ
ニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにし
か反応せず又は全く反応しない。
ニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにし
か反応せず又は全く反応しない。
上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結果
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システインおよびＤＬ−フェニルグ
リシンは基質とならない。
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システインおよびＤＬ−フェニルグ
リシンは基質とならない。
補酵素としてはNAD+が必要であり、NADP+はNAD+に対し
て約3.9％の活性を示すにすぎない。
て約3.9％の活性を示すにすぎない。
(3)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.5付近が至
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る（第６図）。
適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適であ
る（第６図）。
(4)pH安定性：各pHの緩衝液(0.05M)中３０℃にて１時間
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測定
した場合、第７図に示す（処理前の活性を100％とす
る）ごとくpH９付近において安定である。
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測定
した場合、第７図に示す（処理前の活性を100％とす
る）ごとくpH９付近において安定である。
(5)至適温度：４０℃付近における活性が最大である
（第８図）。
（第８図）。
(6)温度安定性：0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液(pH9.0)
中、各温度において１０分間処理した後の残存活性を酸
化的脱アミノ化反応について測定したところ、第９図に
示す（処理前の活性を100％とする）ごとく４２℃にお
いて活性の半分を失う。
中、各温度において１０分間処理した後の残存活性を酸
化的脱アミノ化反応について測定したところ、第９図に
示す（処理前の活性を100％とする）ごとく４２℃にお
いて活性の半分を失う。
(7)吸収スペクトル：278ｎｍに極大吸収、283ｎｍ付近
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１０図に示す。
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１０図に示す。
(8)金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イオ
ン、およびPCMB、Ｎ−エチルマレイミド、５，５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）等のＳＨ阻害剤によ
って活性が阻害される（第４表）。
ン、およびPCMB、Ｎ−エチルマレイミド、５，５′−ジ
チオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）等のＳＨ阻害剤によ
って活性が阻害される（第４表）。
金属イオンおよび阻害剤の濃度は特に記さない限り１ｍ
Ｍである。
Ｍである。
(9)等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動により
測定した場合5.3〜5.4である。
測定した場合5.3〜5.4である。
(10)分子量：高速液体クロマトグラフィー(TSK 3000 S
W)により約290,000と算出され、沈降平衡法により約30
0,000と算出される。
W)により約290,000と算出され、沈降平衡法により約30
0,000と算出される。
(11)サブユニットの分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
(12)均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動(7.5%,pH
8.4)により第１１図Ａに示す如く単一のバンドを与え
る。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(10.0%,
pH7.2)により第１１図Ｂに示す如く単一のバンドを与え
る。
8.4)により第１１図Ａに示す如く単一のバンドを与え
る。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(10.0%,
pH7.2)により第１１図Ｂに示す如く単一のバンドを与え
る。
(13)結晶形：第１２図に拡大して示すように板状であ
る。
る。
以上のごとく、本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。
素は他の微生物起源のそれとは明らかに異なっており、
新規な酵素である。
Ｂ．バシルスsp.SCRC-R79aにより生産される酵素 (1)作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋NAD++H2O フェニルピルビン酸＋NADH+MH3+H+ (2)基質特異性：本酵素は第５表に示すようにＬ−フェ
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めてわずかにしか反応せず、又は全く反応しない。
ニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には
極めてわずかにしか反応せず、又は全く反応しない。
上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結果
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
を示す。基質濃度はＬ−チロシンを1.4ｍＭとしたのを
除き、１０ｍＭとした。
Ｄ−フェニルアラニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−フルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−アミノ−ｎ−
酪酸は基質とならない。
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ
−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミ
ン、Ｌ−フルタミン酸、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−イソロイシン、およびＬ−α−アミノ−ｎ−
酪酸は基質とならない。
なお、還元的アミノ化反応ではフェニルピルビン酸をＬ
−フェニルアラニンにする速度を100%とすると、ｐ−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする相対
速度はpH9.0において176%である。
−フェニルアラニンにする速度を100%とすると、ｐ−ヒ
ドロキシフェニルピルビン酸をＬ−チロシンにする相対
速度はpH9.0において176%である。
Ｌ−フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化反応ではNADP
+はNAD+の2.9％の補酵素活性しか有さない。
+はNAD+の2.9％の補酵素活性しか有さない。
(3)至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.6〜11.3付
近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.8
付近が至適である（第１３図）。
近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.8
付近が至適である（第１３図）。
(4)pH安定性：各pHの緩衝液(0.05M)中３０℃にて１時間
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測定
した場合、第１４図に示す（処理する前の活性を100％
とする）ごとく、pH４〜11.3の範囲で安定であり、特に
pH９〜11の範囲で安定であった。
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測定
した場合、第１４図に示す（処理する前の活性を100％
とする）ごとく、pH４〜11.3の範囲で安定であり、特に
pH９〜11の範囲で安定であった。
(5)至適温度：５０℃付近における活性が最大である
（第１５図）。
（第１５図）。
(6)温度安定性：0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0；
第１６図Ａ），及び0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液（p
H11.0；第１６図Ｂ）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測定
する場合、pH9.0においては５７℃で活性が半減し、pH1
1.0においては４８℃で活性が半減する。
第１６図Ａ），及び0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液（p
H11.0；第１６図Ｂ）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について測定
する場合、pH9.0においては５７℃で活性が半減し、pH1
1.0においては４８℃で活性が半減する。
(7)吸収スペクトル：278ｎｍに極大吸収、283ｎｍ付近
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１７図に示す。
に肩を有する。可視部の吸収は認められない。この様子
を第１７図に示す。
(8)金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イオ
ンおよびPCMBによって活性が阻害される（第６表）。
ンおよびPCMBによって活性が阻害される（第６表）。
金属イオンおよび阻害剤の濃度は特に記さない限り１ｍ
Ｍである。
Ｍである。
(9)等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動により
測定した場合4.3〜4.4である。
測定した場合4.3〜4.4である。
(10)分子量：高速液体クロマトグラフィー(TSK 3000 S
W)により約290,000と算出され、沈降平衡法により約34
0,000と算出される。
W)により約290,000と算出され、沈降平衡法により約34
0,000と算出される。
(11)サブユニットの分子量：SDS−ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。
(12)均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動(7.5%,pH
8.4)により第１８図Ａに示す如く単一のバンドを与え
る。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(10.0%,
pH7.2)により第１８図Ｂに示す如く単一のバンドを与え
る。
8.4)により第１８図Ａに示す如く単一のバンドを与え
る。またSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(10.0%,
pH7.2)により第１８図Ｂに示す如く単一のバンドを与え
る。
(13)結晶形：第１９図に拡大して示すように針状であ
る。
る。
(5)Ｌ−フェニルアラニンの製造方法 本発明のＬ−フェニルアラニンの製造方法においては、
スポロサルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産
されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
ニルピルビン酸、NADH及びアンモニウムイオンを反応せ
しめることによりＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、
該フェニルアラニンを採取する。
スポロサルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産
されるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でフェ
ニルピルビン酸、NADH及びアンモニウムイオンを反応せ
しめることによりＬ−フェニルアラニンを生成せしめ、
該フェニルアラニンを採取する。
この方法において使用されるＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。例えば、この発
明によって精製された酵素を使用することができるのは
無論のこと、細胞を含有する培養液、培養生菌体、アセ
トン等によって脱水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、
種々の段階まで精製された部分精製酵素標品等の酵素含
有物を使用することができる。さらにこれらの酵素又は
酵素含有物を常法に従って固定化したものを使用するこ
ともできる。工業的な実施に当っては生菌体、固定化菌
体等を用いるのが有利である。反応液中のＬ−フェニル
アラニン脱水素酵素の量は基質であるフェニルピルビン
酸又はその塩の濃度等によって異なり特に限定されない
が、通常10〜10,000単位／とするのが便利である。
素酵素の使用形態は特に限定されない。例えば、この発
明によって精製された酵素を使用することができるのは
無論のこと、細胞を含有する培養液、培養生菌体、アセ
トン等によって脱水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、
種々の段階まで精製された部分精製酵素標品等の酵素含
有物を使用することができる。さらにこれらの酵素又は
酵素含有物を常法に従って固定化したものを使用するこ
ともできる。工業的な実施に当っては生菌体、固定化菌
体等を用いるのが有利である。反応液中のＬ−フェニル
アラニン脱水素酵素の量は基質であるフェニルピルビン
酸又はその塩の濃度等によって異なり特に限定されない
が、通常10〜10,000単位／とするのが便利である。
基質としてフェニルピルビン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピルビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜500g/とするのが便利であ
る。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用するこ
とができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩の形
で使用するのがpH調整の観点から好ましい。例えばフェ
ニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全には溶解し
ないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が存在してい
ても差しつかえない。また、フェニルピルビン酸アンモ
ニウム又はフェニルピルビン酸アンモニアで中和したも
のを使用することもでき、この場合このアンモニウム塩
はフェニルピルビン酸の給源であると同時に後に記載す
るアンモニウムイオンの給源としても機能する。フェニ
ルピルビン酸又はその塩はバッチ式反応においては反応
開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行と共
に複数回に分割して、もしくは連続的に添加することも
できる。
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。フェニルピルビン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜500g/とするのが便利であ
る。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用するこ
とができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩の形
で使用するのがpH調整の観点から好ましい。例えばフェ
ニルピルビン酸ナトリウムは高濃度では完全には溶解し
ないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が存在してい
ても差しつかえない。また、フェニルピルビン酸アンモ
ニウム又はフェニルピルビン酸アンモニアで中和したも
のを使用することもでき、この場合このアンモニウム塩
はフェニルピルビン酸の給源であると同時に後に記載す
るアンモニウムイオンの給源としても機能する。フェニ
ルピルビン酸又はその塩はバッチ式反応においては反応
開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行と共
に複数回に分割して、もしくは連続的に添加することも
できる。
アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のpHを所定値に維持しな
がら反応の進行と共に連続的に導入することも可能であ
る。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを使
用する場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源として
も機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピルビ
ン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量は
一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル量
とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多く
することによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラニ
ン側に傾け、フェニルピルビン酸に対するＬ−フェニル
アラニンの収率は上昇せしめることができる。
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のpHを所定値に維持しな
がら反応の進行と共に連続的に導入することも可能であ
る。前記のようにフェニルピルビン酸アンモニウムを使
用する場合にはこの物質がアンモニウム塩の給源として
も機能する。アンモニウム塩の使用量はフェニルピルビ
ン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。この量は
一般にフェニルピルビン酸の量に対して１〜２倍モル量
とするのが便利である。アンモニウム塩のモル量を多く
することによって酵素反応の平衡をＬ−フェニルアラニ
ン側に傾け、フェニルピルビン酸に対するＬ−フェニル
アラニンの収率は上昇せしめることができる。
NADHは、フェニルピルビン酸と等モルを加えてもよい
が、NADHは非常に高価であるから、工業的見地から、前
記の反応系のほかに、NADH再生系、すなわち前記反応に
より生成したNAD+をNADH還元する系を共有させるのが好
ましい。このような系としてNAD+をNADHに変換する酵素
とその基質との組合わせ、例えば蟻酸脱水素酵素(EC1.
2.1.2)と蟻酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素(EC1.4.1.
2)とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素(EC1.1.1.1)
とエタノール、アルデヒド脱水素酵素(EC1.2.1.3)とア
セトアルデヒド、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(E
C1.1.1.49)とグルコース−６−リン酸等を使用すること
ができる。また、ヒドロゲナーゼ(EC1.18.3.1)による分
子状水素を電子供与体とするNAD+のNADHへの還元反応
や、電気化学的に還元されたメチルビオローゲンやジヒ
ドロリポアミドのジアホラーゼ(EC1.6.4.3)による酸化
に伴うNAD+のNADHへの還元反応をも使用することができ
る。蟻酸脱水酵素と蟻酸を使用する場合、NAD+が還元さ
れてNADHとなると同時に蟻酸が酸化されて二酸化炭素が
生成し、これは反応系から容易に除去され、反応が常に
所望の方向に進行するため特に好ましい。蟻酸脱水素酵
素は市販されており容易に入手することができる。又、
例えばカンジダ・ボイディニ(Candida boidinii)No.220
1(AKU4705)や、ハンゼヌラ・ボリモルファ(Hansenula p
olymorpha)(ATCC26012)から公知の方法〔カトウら、ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー(Agricultural and Biological Chemistry)38,111
〜116(1974)〕により精製して使用することもできる。N
ADH再生系の酵素濃度は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素濃度等に依存して異なり、一般に基質フェニルピル
ビン酸の還元的アミノ化速度（従ってNAD+生成速度）に
匹敵する速度でNAD+をNADHに還元するために必要な量で
ある。例えば、前記のように10〜10,000単位／のＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用し、NADH再生系酵素
として蟻酸脱水素酵素を使用する場合、この酵素の使用
量は10〜10,000単位／程度とするのが好ましい。蟻酸
脱水素酵素の基質としては蟻酸の塩、例えば蟻酸ナトリ
ウム、蟻酸カリウム、蟻酸アンモニウム等を使用するの
が便利である。蟻酸塩の使用量はフェニルピルビン酸又
はその塩の量の１〜２倍モル量とするのが好ましい。NA
DH再生系を用いる場合は、NAD+又はNADHを通常の生理的
濃度である0.1〜10ｍＭ加えればよい。
が、NADHは非常に高価であるから、工業的見地から、前
記の反応系のほかに、NADH再生系、すなわち前記反応に
より生成したNAD+をNADH還元する系を共有させるのが好
ましい。このような系としてNAD+をNADHに変換する酵素
とその基質との組合わせ、例えば蟻酸脱水素酵素(EC1.
2.1.2)と蟻酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酵素(EC1.4.1.
2)とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素(EC1.1.1.1)
とエタノール、アルデヒド脱水素酵素(EC1.2.1.3)とア
セトアルデヒド、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(E
C1.1.1.49)とグルコース−６−リン酸等を使用すること
ができる。また、ヒドロゲナーゼ(EC1.18.3.1)による分
子状水素を電子供与体とするNAD+のNADHへの還元反応
や、電気化学的に還元されたメチルビオローゲンやジヒ
ドロリポアミドのジアホラーゼ(EC1.6.4.3)による酸化
に伴うNAD+のNADHへの還元反応をも使用することができ
る。蟻酸脱水酵素と蟻酸を使用する場合、NAD+が還元さ
れてNADHとなると同時に蟻酸が酸化されて二酸化炭素が
生成し、これは反応系から容易に除去され、反応が常に
所望の方向に進行するため特に好ましい。蟻酸脱水素酵
素は市販されており容易に入手することができる。又、
例えばカンジダ・ボイディニ(Candida boidinii)No.220
1(AKU4705)や、ハンゼヌラ・ボリモルファ(Hansenula p
olymorpha)(ATCC26012)から公知の方法〔カトウら、ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー(Agricultural and Biological Chemistry)38,111
〜116(1974)〕により精製して使用することもできる。N
ADH再生系の酵素濃度は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素濃度等に依存して異なり、一般に基質フェニルピル
ビン酸の還元的アミノ化速度（従ってNAD+生成速度）に
匹敵する速度でNAD+をNADHに還元するために必要な量で
ある。例えば、前記のように10〜10,000単位／のＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用し、NADH再生系酵素
として蟻酸脱水素酵素を使用する場合、この酵素の使用
量は10〜10,000単位／程度とするのが好ましい。蟻酸
脱水素酵素の基質としては蟻酸の塩、例えば蟻酸ナトリ
ウム、蟻酸カリウム、蟻酸アンモニウム等を使用するの
が便利である。蟻酸塩の使用量はフェニルピルビン酸又
はその塩の量の１〜２倍モル量とするのが好ましい。NA
DH再生系を用いる場合は、NAD+又はNADHを通常の生理的
濃度である0.1〜10ｍＭ加えればよい。
反応媒体としては水、又は水性液、例えば水性緩衝液を
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−HC
l緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液等を使用することがで
きる。
用いることができる。緩衝液としては例えばトリス−HC
l緩衝液、グリシン−NaOH緩衝液等を使用することがで
きる。
反応液のpHとしては、前記のNADH再生系を用いない場合
には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還元的ア
ミノ化に適するpHを用いることができ、例えばスポロサ
ルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはpH８〜１０、
好ましくはpH約９とし、バシルス属細菌由来の酵素を用
いる場合にはpH９〜１１、好ましくはpH約１０とする。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化系と共にNADH再生
系を用いる場合には、これら両者の反応が共に良好に進
行するpH範囲を選択する必要がある。このようなpHは、
例えば、スポロサルシナ属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来の蟻酸脱水
素酵素を用いる場合には通常はpH7.5〜9.5、好ましくは
pH8.0〜9.0である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来
の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常はpH８〜10好ま
しくはpH8.5〜9.5である。
には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還元的ア
ミノ化に適するpHを用いることができ、例えばスポロサ
ルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはpH８〜１０、
好ましくはpH約９とし、バシルス属細菌由来の酵素を用
いる場合にはpH９〜１１、好ましくはpH約１０とする。
フェニルピルビン酸の還元的アミノ化系と共にNADH再生
系を用いる場合には、これら両者の反応が共に良好に進
行するpH範囲を選択する必要がある。このようなpHは、
例えば、スポロサルシナ属細菌由来のＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来の蟻酸脱水
素酵素を用いる場合には通常はpH7.5〜9.5、好ましくは
pH8.0〜9.0である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来
の蟻酸脱水素酵素を用いる場合には通常はpH８〜10好ま
しくはpH8.5〜9.5である。
反応温度も、反応pHの場合と同様に考えることができる
が酵素のいずれの組合わせにおいても通常は20℃〜50
℃、好ましくは25℃〜40℃である。
が酵素のいずれの組合わせにおいても通常は20℃〜50
℃、好ましくは25℃〜40℃である。
反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基質濃度、
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。
酵素力価等に依存して、基質フェニルピルビン酸が十分
な収率でＬ−フェニルアラニンに転換されるまで反応を
維持する。
反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。
生成したＬ−フェニルアラニンは任意の常法に従って精
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。
製採取することができる。例えば、反応終了後にトリク
ロロ酢酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する
場合には）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等によ
り精製し、結晶化する。
フェニルアラニンの定量は、例えばロイコノストック・
メセンテロイデス(Leuconostoc mesentroides)ATCC 804
2を用いるバイオアッセイにより行うことができる。
メセンテロイデス(Leuconostoc mesentroides)ATCC 804
2を用いるバイオアッセイにより行うことができる。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
例１．（参考例）スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04か
らのＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO4 0.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.
02％を含有し、pH7.0に調整した培地３０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエSCRC
-R04（微工研菌寄第8178号（微工研条寄第1012号）を接
種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、遠
心分離機で菌体を採取し湿重量約380gの菌体を得た。菌
体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩
衝液(pH7.0)１に懸濁し、９ＫHzにおける超音波処理
を約１０時間行い菌体を破砕した。破砕菌体は14,000x
g、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液に
５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.1ｇとなる
ように添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱を14,0
00xg、２０分間遠心分離し、得られた粗酵素液を0.1ｍ
ＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含
む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透析した。透
析後の酵素液（1990ml）に固体硫酸アンモニウム(412g)
を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。３０分間攪
拌の後、14,000xgで２０分間遠心して得られる上清(210
0ml)にさらに固体硫酸アンモニウム(416g)を加え６０％
硫酸アンモニウム飽和とした。14,000xgで２０分間遠心
して得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに0.1ｍＭのEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝液(pH7.0)で透析した。この酵素液をあらかじ
め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したD
EAE−トヨパール650Ｍのカラムに通過させ、0.1ｍＭのE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.1
Ｍのリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出した。
らのＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO4 0.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.
02％を含有し、pH7.0に調整した培地３０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、スポロサルシナ・ウレアエSCRC
-R04（微工研菌寄第8178号（微工研条寄第1012号）を接
種し、３０℃で２４時間好気的に培養した。培養後、遠
心分離機で菌体を採取し湿重量約380gの菌体を得た。菌
体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリン酸緩
衝液(pH7.0)１に懸濁し、９ＫHzにおける超音波処理
を約１０時間行い菌体を破砕した。破砕菌体は14,000x
g、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液に
５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.1ｇとなる
ように添加し、３０分間攪拌した。生成した沈澱を14,0
00xg、２０分間遠心分離し、得られた粗酵素液を0.1ｍ
ＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含
む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透析した。透
析後の酵素液（1990ml）に固体硫酸アンモニウム(412g)
を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。３０分間攪
拌の後、14,000xgで２０分間遠心して得られる上清(210
0ml)にさらに固体硫酸アンモニウム(416g)を加え６０％
硫酸アンモニウム飽和とした。14,000xgで２０分間遠心
して得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに0.1ｍＭのEDTAお
よび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリ
ン酸緩衝液(pH7.0)で透析した。この酵素液をあらかじ
め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で平衡化したD
EAE−トヨパール650Ｍのカラムに通過させ、0.1ｍＭのE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む0.1
Ｍのリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出した。
活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.15Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。このようにして得られた酵素液を限外瀘化により
濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行った。こ
うして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２図に示
す。なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精
製工程における比活性および回収率を示す。
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.15Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め0.1ｍＭのEDTA、５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールおよび0.1ＭNaClを含む
0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファデッ
クスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを行な
った。このようにして得られた酵素液を限外瀘化により
濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行った。こ
うして収率３１％で板状結晶Ｌ−フェニルアラニン脱水
素酵素が得られた。この結晶の拡大図を第１２図に示
す。なお第７表に菌体抽出液から結晶化に至るまでの精
製工程における比活性および回収率を示す。
実施例２．バシルスsp.SCRC-R79aからのＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素の精製(1) Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO4 0.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.
02％を含有し、pH7.0に調整した培地１０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工研
菌寄第8179号（微工研条寄第1013号）を接種し、３０℃
で２４時間好気的に培養した。培養後、１０の培養液
から遠心分離機で菌体を採取し湿重量約108gの菌体を得
た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液(pH7.0)約０．４に懸濁し、９ＫHzにおけ
る超音波処理を約６時間行ない菌体を破砕した。破砕菌
体は14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細
胞抽出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.
1ｇとなるように添加し、３０分間攪拌した。生成した
沈澱を14,000xg、２０分間遠心分離し、得られた粗酵素
液を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透
析した。透析後の酵素液（400ml）に固体硫酸アンモニ
ウム(70.4g)を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とし
た。３０分攪拌の後、14,000xgで２０分間遠心して得ら
れる、上清(430ml)にさらに固体硫酸アンモニウム(85.6
g)を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。14,000xg
で２０分間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で透析した。この
酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH
7.0)で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラムに通
過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出
した。
ラニン脱水素酵素の精製(1) Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO4 0.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.
02％を含有し、pH7.0に調整した培地１０を120℃、１
５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工研
菌寄第8179号（微工研条寄第1013号）を接種し、３０℃
で２４時間好気的に培養した。培養後、１０の培養液
から遠心分離機で菌体を採取し湿重量約108gの菌体を得
た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.1ｍＭE
DTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液(pH7.0)約０．４に懸濁し、９ＫHzにおけ
る超音波処理を約６時間行ない菌体を破砕した。破砕菌
体は14,000xg、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細
胞抽出液に５％プロタミン硫酸水溶液を１ｇ蛋白当り0.
1ｇとなるように添加し、３０分間攪拌した。生成した
沈澱を14,000xg、２０分間遠心分離し、得られた粗酵素
液を0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に対して透
析した。透析後の酵素液（400ml）に固体硫酸アンモニ
ウム(70.4g)を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とし
た。３０分攪拌の後、14,000xgで２０分間遠心して得ら
れる、上清(430ml)にさらに固体硫酸アンモニウム(85.6
g)を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。14,000xg
で２０分間遠心して得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプトエタノー
ルを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.0)で透析した。この
酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液(pH
7.0)で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラムに通
過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メルカプト
エタノールを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液（pH7.0）で溶出
した。
活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTA、５
ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび0.1Ｍ NaClを
含む0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファ
デックスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを
行なった。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素
を約６０％の収率で約1800倍に精製した。この精製過程
における比活性および回収率を第８表に示す。この酵素
はポリアクリルアミドゲル電気泳動およびSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動において均一であることが証
明された。
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ、0.1ｍＭのEDTAおよび５ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍ
のリン酸緩衝液（pH7.0）の直線的な濃度勾配で酵素を
溶出させた。この活性画分を集め、0.1ｍＭのEDTA、５
ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび0.1Ｍ NaClを
含む0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したセファ
デックスＧ−200によるゲル濾化クロマトグラフィーを
行なった。こうして、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素
を約６０％の収率で約1800倍に精製した。この精製過程
における比活性および回収率を第８表に示す。この酵素
はポリアクリルアミドゲル電気泳動およびSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動において均一であることが証
明された。
実施例３．バシルスsp.SCRC-79aからのＬ−フェニルア
ラニン脱水 素酵素の精製(2) Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.0
2％を含有し、pH8.0に調整した培地１００を120℃、
１５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工
研菌寄第8179号(FERMP-8179)（微工研条寄第1013号）を
接種し、３０℃で２２時間好気的に培養した。培養後、
１００の培養液から遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約0.7kgの菌体を得た。菌体を0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ
の２−メルカプトエタノールを含む0.1Ｍリン酸緩衝液
(pH7.9)約４に懸濁し、９ＫHzにおける超音波処理を
約４１時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は14,000x
g、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液を
５０℃、１０分間熱処理を行ない、直ちに氷冷した。処
理後の酵素液(3,850ml)に固体硫酸アンモニウム(678g)
を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。３０分間攪
拌の後、生成した沈澱を14,000xg、２０分間の遠心によ
り除去した。この上清(3,400ml)に固体硫酸アンモニウ
ム(673g)を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。1
4,000×ｇ、２０分間遠心して得られる、酵素活性を有
する沈澱を少量の0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.9)に溶解
し、さらに0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ２−メルカプトエ
タノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.9）で透析し
た。この酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭEDTAおよび５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールを含む0.01ｍＭリン酸緩衝
液(pH7.9)で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラム
に通過させ0.1ｍＭのEDTA、５ｍＭの２−メルカプトエ
タノールおよび0.1ＭNaClを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液
（pH7.9）で溶出した。
ラニン脱水 素酵素の精製(2) Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％、NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.0
2％を含有し、pH8.0に調整した培地１００を120℃、
１５分間加熱殺菌した後、バシルスsp.SCRC-R79a（微工
研菌寄第8179号(FERMP-8179)（微工研条寄第1013号）を
接種し、３０℃で２２時間好気的に培養した。培養後、
１００の培養液から遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約0.7kgの菌体を得た。菌体を0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ
の２−メルカプトエタノールを含む0.1Ｍリン酸緩衝液
(pH7.9)約４に懸濁し、９ＫHzにおける超音波処理を
約４１時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は14,000x
g、20分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液を
５０℃、１０分間熱処理を行ない、直ちに氷冷した。処
理後の酵素液(3,850ml)に固体硫酸アンモニウム(678g)
を加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。３０分間攪
拌の後、生成した沈澱を14,000xg、２０分間の遠心によ
り除去した。この上清(3,400ml)に固体硫酸アンモニウ
ム(673g)を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。1
4,000×ｇ、２０分間遠心して得られる、酵素活性を有
する沈澱を少量の0.01Ｍリン酸緩衝液(pH7.9)に溶解
し、さらに0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ２−メルカプトエ
タノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.9）で透析し
た。この酵素液を、あらかじめ0.1ｍＭEDTAおよび５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノールを含む0.01ｍＭリン酸緩衝
液(pH7.9)で平衡化したDEAE−トヨパール650Ｍのカラム
に通過させ0.1ｍＭのEDTA、５ｍＭの２−メルカプトエ
タノールおよび0.1ＭNaClを含む0.1Ｍのリン酸緩衝液
（pH7.9）で溶出した。
活性画分を集め、0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ２−メルカ
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析後、あ
らかじめ同じ緩衝液で平衡化した２番目のDEAE−トヨパ
ール650Ｍのカラムに通過させ、全段階と同じ緩衝液で
溶出した。この活性画分を集め0.1ｍＭEDTA５ｍＭ２−
メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍのリン
酸緩衝液(pH7.9)の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させ
た。活性区分を集め濃縮後0.1ｍＭEDTA５ｍＭ２−メル
カプトエタノールおよび0.1ｍＭNaClを含む0.05Ｍのリ
ン酸緩衝液（pH7.9）で平衡化したセファデックスＧ−2
00によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こう
してＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を約５４％の収率
で約1400倍に精製した。この精製過程における比活性お
よび回収率を第９表に示す。このようにして得られた酵
素液を濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行な
った。第１９図に示すような針状結晶が得られた。
プトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析後、あ
らかじめ同じ緩衝液で平衡化した２番目のDEAE−トヨパ
ール650Ｍのカラムに通過させ、全段階と同じ緩衝液で
溶出した。この活性画分を集め0.1ｍＭEDTA５ｍＭ２−
メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液で透析
後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシアパ
タイトのカラムに通過させ0.1ｍＭEDTAおよび５ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍから0.4Ｍのリン
酸緩衝液(pH7.9)の直線的な濃度勾配で酵素を溶出させ
た。活性区分を集め濃縮後0.1ｍＭEDTA５ｍＭ２−メル
カプトエタノールおよび0.1ｍＭNaClを含む0.05Ｍのリ
ン酸緩衝液（pH7.9）で平衡化したセファデックスＧ−2
00によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こう
してＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を約５４％の収率
で約1400倍に精製した。この精製過程における比活性お
よび回収率を第９表に示す。このようにして得られた酵
素液を濃縮し、硫酸アンモニウムを添加し結晶化を行な
った。第１９図に示すような針状結晶が得られた。
例４．（参考例）スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由
来の粗酵素を 用いるＬ−フェニルアラニンの製造 フェニルピルビン酸ナトリウム５ｇ(22mmol)、蟻酸アン
モニウム３ｇ(49mmol)、NAD+0.21g(0.29mmol)、トリス
−HCl緩衝液(pH8.5)１８ｍmol、粗Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素43.2単位（実施例１、第７表の工程３の硫
酸アンモニウム分画まで部分精製した粗酵素画分に相
当）および粗蟻酸脱水素酵素49.0単位（（pH8.5），カ
ンジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を含む300ml
の反応液を３０℃において２４時間反応させた。反応液
中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロイコノスト
ック・メセンテロイデスを用いる微生物定量法により定
量したところ1.91g(11.6mmol,52.7%の転換率）のＬ−フ
ェニルアラニンが生成していた。この反応液に２０％ト
リクロロ酢酸30mlを加え除蛋白後、陽イオン交換樹脂ア
ンバーライト(Amberlite)IR-120(H+)カラムに吸着さ
せ、１Ｍアンモニア水で溶出させた。Ｌ−フェニルアラ
ニンを含む画分を集め、濃縮後陰イオン交換樹脂アンバ
ーライト(Amberlite)IRA-400(OH-)カラムに吸着させ、
１Ｍ蟻酸で溶出させた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画
分を濃縮乾固した。小量の温水に溶解し、エタノールを
５０％となるように加え、冷蔵すると結晶が析出した。
この結晶を同様の操作により再結晶化し、0.458gの無色
固体を得た、この標品の元素分析値は以下のとおりであ
った。
来の粗酵素を 用いるＬ−フェニルアラニンの製造 フェニルピルビン酸ナトリウム５ｇ(22mmol)、蟻酸アン
モニウム３ｇ(49mmol)、NAD+0.21g(0.29mmol)、トリス
−HCl緩衝液(pH8.5)１８ｍmol、粗Ｌ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素43.2単位（実施例１、第７表の工程３の硫
酸アンモニウム分画まで部分精製した粗酵素画分に相
当）および粗蟻酸脱水素酵素49.0単位（（pH8.5），カ
ンジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を含む300ml
の反応液を３０℃において２４時間反応させた。反応液
中に生成したＬ−フェニルアラニンの量をロイコノスト
ック・メセンテロイデスを用いる微生物定量法により定
量したところ1.91g(11.6mmol,52.7%の転換率）のＬ−フ
ェニルアラニンが生成していた。この反応液に２０％ト
リクロロ酢酸30mlを加え除蛋白後、陽イオン交換樹脂ア
ンバーライト(Amberlite)IR-120(H+)カラムに吸着さ
せ、１Ｍアンモニア水で溶出させた。Ｌ−フェニルアラ
ニンを含む画分を集め、濃縮後陰イオン交換樹脂アンバ
ーライト(Amberlite)IRA-400(OH-)カラムに吸着させ、
１Ｍ蟻酸で溶出させた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画
分を濃縮乾固した。小量の温水に溶解し、エタノールを
５０％となるように加え、冷蔵すると結晶が析出した。
この結晶を同様の操作により再結晶化し、0.458gの無色
固体を得た、この標品の元素分析値は以下のとおりであ
った。
融点：270℃で分解した。
比旋光度▲［α］20 D▼−35.5゜(c=0.48,H2O)で光学的に
純粋なＬ体であった。マススペクトル、核磁気共鳴吸収
スペクトル、および赤外吸収スペクトルによる分析結果
はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニンであること
を示した。
純粋なＬ体であった。マススペクトル、核磁気共鳴吸収
スペクトル、および赤外吸収スペクトルによる分析結果
はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニンであること
を示した。
例５．（参考例）スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由
来の部分精 製酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの
高濃度合成 フェニルピルビン酸ナトリウム、(3.57mmol)、NAD+100
μmmol、NH4Cl 5mmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）272
μmol、蟻酸ナトリウム(7.84mmol)、Ｌ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素３５単位（実施例１、第７表の工程４の
DEAE−トヨパールカラムを通過させた画分）および蟻酸
脱水素酵素10.2単位（（pH8.5），カンジダ・ボイディ
ニNo.2201より部分精製）を５ml中に含む反応液を３０
℃で２４時間保温した。微生物定量法により定量したと
ころ、580mg(3.51mmol,98.5%の転換率）のＬ−フェニル
アラニンが生成していた。
来の部分精 製酵素を用いるＬ−フェニルアラニンの
高濃度合成 フェニルピルビン酸ナトリウム、(3.57mmol)、NAD+100
μmmol、NH4Cl 5mmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）272
μmol、蟻酸ナトリウム(7.84mmol)、Ｌ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素３５単位（実施例１、第７表の工程４の
DEAE−トヨパールカラムを通過させた画分）および蟻酸
脱水素酵素10.2単位（（pH8.5），カンジダ・ボイディ
ニNo.2201より部分精製）を５ml中に含む反応液を３０
℃で２４時間保温した。微生物定量法により定量したと
ころ、580mg(3.51mmol,98.5%の転換率）のＬ−フェニル
アラニンが生成していた。
例６．（参考例）スポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04由
来の粗酵素を 用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム200μmol、NAD+20μmo
l、蟻酸ナトリウム200μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）600μmol、蟻酸脱水素酵素11.9単位（（pH8.5），カ
ンジダ・ボイディニNo.2201の無細胞抽出液）およびＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素13.2単位（SCRC-R04株の
培養菌体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜60％飽
和として沈澱した粗酵素画分；実施例１の第７表の工程
３に相当）を含む13.0mlの反応液を３０℃で15時間反応
させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ32.8mg(198.8μmo
l,98.4%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成して
いた。
来の粗酵素を 用いるＬ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム200μmol、NAD+20μmo
l、蟻酸ナトリウム200μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）600μmol、蟻酸脱水素酵素11.9単位（（pH8.5），カ
ンジダ・ボイディニNo.2201の無細胞抽出液）およびＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素13.2単位（SCRC-R04株の
培養菌体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜60％飽
和として沈澱した粗酵素画分；実施例１の第７表の工程
３に相当）を含む13.0mlの反応液を３０℃で15時間反応
させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ32.8mg(198.8μmo
l,98.4%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成して
いた。
実施例７．バシルスsp.SCRC-R79a由来の部分精製酵素を
用いるＬ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム800μmol、NAD+5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）260μmol、粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（（pH8.5）、
およびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素0.25単位（SCRC
-R79aの無細胞抽出液よりプロタミン処理，硫安分画，D
EAE−トヨパール、およびヒドロキシアパタイトの各カ
ラムクロマグラフィーにより、約180倍に精製した酵素
標品）を含む5.0mlの反応液を３０℃で２４時間反応さ
せた。微生物定量法により定量したところ64.4mg(390.0
μmol,97.5%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成
していた。
用いるＬ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム800μmol、NAD+5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）260μmol、粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（（pH8.5）、
およびＬ−フェニルアラニン脱水素酵素0.25単位（SCRC
-R79aの無細胞抽出液よりプロタミン処理，硫安分画，D
EAE−トヨパール、およびヒドロキシアパタイトの各カ
ラムクロマグラフィーにより、約180倍に精製した酵素
標品）を含む5.0mlの反応液を３０℃で２４時間反応さ
せた。微生物定量法により定量したところ64.4mg(390.0
μmol,97.5%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成
していた。
この反応液から、実施例３の方法に準じてＬ−フェニル
アラニンを得た。
アラニンを得た。
実施例８．バシルスsp.SCRC-R79a由来の部分精製酵素を
用いるＬ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム0.91g(4mmol)、ギ酸アン
モニウム0.75g(11.9mmol)、NAD+36mg(50μmol)、トリス
−HCl緩衝液（pH8.5）2.5mmolを含む50ml反応液中にセ
ルロースチューブに入れたＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素２０単位（DEAE−トヨパールカラムを通過させた画
分）および粗ギ酸脱水素酵素１５単位(pH8.5、カンジダ
・ボイディニNo.2201より部分精製）を浸し、３０℃に
おいて２４時間反応させた。反応後、酵素の入ったチュ
ーブを取り出して新しい同反応液中に浸し、同様にして
反応させた。これをくり返して２８回の反応を行なっ
た。各反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を
ロイコノストック・メセンテロイデスを用いる微生物定
量法により測定したところ全部で10.74g(65mmol、58%の
転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。この
反応液の１部（450ml、3.58gのＬ−フェニルアラニンを
含む）を陽イオン交換樹脂アンバーライト(Amberlite)I
R-120(H+カラムに吸着させ、ＩＭアンモニア水で溶出さ
せた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後
陰イオン交換樹脂アンバーライト(Amberlite)IRA-400(O
H-)カラムに吸着させ、ＩＭギ酸で溶出させた。Ｌ−フ
ェニルアラニンを含む画分を濃縮乾固した。小量の温水
に溶解し、冷蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様
の操作により再結晶化し、1.235gの無色固体を得た。こ
の標品の元素分析値は以下のとおりであった。
用いるＬ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム0.91g(4mmol)、ギ酸アン
モニウム0.75g(11.9mmol)、NAD+36mg(50μmol)、トリス
−HCl緩衝液（pH8.5）2.5mmolを含む50ml反応液中にセ
ルロースチューブに入れたＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素２０単位（DEAE−トヨパールカラムを通過させた画
分）および粗ギ酸脱水素酵素１５単位(pH8.5、カンジダ
・ボイディニNo.2201より部分精製）を浸し、３０℃に
おいて２４時間反応させた。反応後、酵素の入ったチュ
ーブを取り出して新しい同反応液中に浸し、同様にして
反応させた。これをくり返して２８回の反応を行なっ
た。各反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を
ロイコノストック・メセンテロイデスを用いる微生物定
量法により測定したところ全部で10.74g(65mmol、58%の
転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。この
反応液の１部（450ml、3.58gのＬ−フェニルアラニンを
含む）を陽イオン交換樹脂アンバーライト(Amberlite)I
R-120(H+カラムに吸着させ、ＩＭアンモニア水で溶出さ
せた。Ｌ−フェニルアラニンを含む画分を集め、濃縮後
陰イオン交換樹脂アンバーライト(Amberlite)IRA-400(O
H-)カラムに吸着させ、ＩＭギ酸で溶出させた。Ｌ−フ
ェニルアラニンを含む画分を濃縮乾固した。小量の温水
に溶解し、冷蔵すると結晶が析出した。この結晶を同様
の操作により再結晶化し、1.235gの無色固体を得た。こ
の標品の元素分析値は以下のとおりであった。
融点：252〜254℃で分解した。
比旋光度〔α〕20 D＝-34.1゜(c=1.72、H2O)でＬ体であ
り、光学純度は９８％e.e.である。マススペクトル、核
磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルに
よる分析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニ
ンであることを示した。
り、光学純度は９８％e.e.である。マススペクトル、核
磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルに
よる分析結果はいずれも、生成物がＬ−フェニルアラニ
ンであることを示した。
実施例９．バシルスsp.SCRC-R79a由来の部分精製酵素を
用いるＬ −フェニルアラニンの高濃度合成 フェニルピルビン酸ナトリウム1.8g(8mmol)、ギ酸アン
モニウム0.98g(15.54mmol)、NAD+72mg(100μmol)、トリ
ス−HCl緩衝液（pH8.5）5mmol、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素４０単位（DEAE−トヨパールカラムを通過さ
せた画分）およびギ酸脱水素酵素２０単位pH8.5、カン
ジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を１０ml中に
含む反応液を３０℃で２４時間保温した。微生物定量法
により定量したところ1.12g(6.78mmol、86%の転換率）の
Ｌ−フェニルアラニンが生成していた。
用いるＬ −フェニルアラニンの高濃度合成 フェニルピルビン酸ナトリウム1.8g(8mmol)、ギ酸アン
モニウム0.98g(15.54mmol)、NAD+72mg(100μmol)、トリ
ス−HCl緩衝液（pH8.5）5mmol、Ｌ−フェニルアラニン
脱水素酵素４０単位（DEAE−トヨパールカラムを通過さ
せた画分）およびギ酸脱水素酵素２０単位pH8.5、カン
ジダ・ボイディニNo.2201より部分精製）を１０ml中に
含む反応液を３０℃で２４時間保温した。微生物定量法
により定量したところ1.12g(6.78mmol、86%の転換率）の
Ｌ−フェニルアラニンが生成していた。
実施例10.バシルスsp.SCRC-R79a由来の粗酵素を用いる
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、塩化アンモニ
ウム1.2mmol、NADH480μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmolおよび粗Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素2.
0単位（SCRC-R79a株の培養菌体の無細胞抽出液に５０
℃、１０分間の熱処理を行なった後、硫酸アンモニウム
30〜60％飽和として沈澱した粗酵素画分；実施例３の工
程２に相当）を含む５mlの反応液を３０℃で２４時間反
応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの
量を微生物定量法により測定したところ63.5mg(384μmo
l、96.0%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成して
いた。
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、塩化アンモニ
ウム1.2mmol、NADH480μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmolおよび粗Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素2.
0単位（SCRC-R79a株の培養菌体の無細胞抽出液に５０
℃、１０分間の熱処理を行なった後、硫酸アンモニウム
30〜60％飽和として沈澱した粗酵素画分；実施例３の工
程２に相当）を含む５mlの反応液を３０℃で２４時間反
応させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの
量を微生物定量法により測定したところ63.5mg(384μmo
l、96.0%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成して
いた。
実施例11．バシルスsp.SCRC-R79a由来の粗酵素を用いる
Ｌ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジ
ダ・ボイディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-R79a株の培養
菌体の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行な
った後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した
粗酵素画分；実施例３の工程２に相当）を含む５mlの反
応液を３０℃で２４時間反応させた。反応液中に生成し
たＬ−フェニルアラニンの量を微生物定量法により測定
したところ62.8mg(380μmol、95.0%の転換率）のＬ−フ
ェニルアラニンが生成していた。
Ｌ −フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5）250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジ
ダ・ボイディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-R79a株の培養
菌体の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行な
った後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した
粗酵素画分；実施例３の工程２に相当）を含む５mlの反
応液を３０℃で２４時間反応させた。反応液中に生成し
たＬ−フェニルアラニンの量を微生物定量法により測定
したところ62.8mg(380μmol、95.0%の転換率）のＬ−フ
ェニルアラニンが生成していた。
実施例12.バシルスsp.SCRC-R53b由来の粗酵素を用いる
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、ギ酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μl、トリス−HCl緩衝液（pH8.5)
250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ・
ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-R53b株の培養菌体
の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった
後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した粗酵
素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で２０時間反応さ
せた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を
微生物定量法により測定したところ57.3mg(347μmol、8
6.8%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成してい
た。
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、ギ酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μl、トリス−HCl緩衝液（pH8.5)
250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ・
ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-R53b株の培養菌体
の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なった
後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した粗酵
素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で２０時間反応さ
せた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量を
微生物定量法により測定したところ57.3mg(347μmol、8
6.8%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成してい
た。
実施例13.バシルスsp.SCRC-101A由来の粗酵素を用いる
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、ギ酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ
・ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-101A株の培養菌
体の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なっ
た後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した粗
酵素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で２０時間反応
させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ58.3mg(353μmol、
88.3%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成してい
た。
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、ギ酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ
・ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-101A株の培養菌
体の無細胞抽出液に５０℃、１０分間の熱処理を行なっ
た後、硫酸アンモニウム30〜60％飽和として沈澱した粗
酵素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で２０時間反応
させた。反応液中に生成したＬ−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ58.3mg(353μmol、
88.3%の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成してい
た。
実施例14.バシルスsp.SCRC-114D由来の粗酵素を用いる
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ
・ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-114D株の培養菌
体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜60％飽和とし
て沈澱した粗酵素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で
２０時間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニル
アラニンの量を微生物定量法により測定したところ52.5
mg(318μmol、79.5%の転換率）のＬ−フェニルアラニン
が生成していた。
Ｌ−フェニルアラニンの合成 フェニルピルビン酸ナトリウム400μmol、蟻酸アンモニ
ウム1.2mmol、NAD+2.5μmol、トリス−HCl緩衝液（pH8.
5)250μmol、蟻酸脱水素酵素1.5単位（pH8.5、カンジダ
・ボィディニNo.2201より部分精製）および粗Ｌ−フェ
ニルアラニン脱水素酵素2.0単位（SCRC-114D株の培養菌
体の無細胞抽出液を硫酸アンモニウム30〜60％飽和とし
て沈澱した粗酵素画分）を含む５mlの反応液を３０℃で
２０時間反応させた。反応液中に生成したＬ−フェニル
アラニンの量を微生物定量法により測定したところ52.5
mg(318μmol、79.5%の転換率）のＬ−フェニルアラニン
が生成していた。
参考例 本発明のバシルス由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素は、Ｌ−フェニルアラニンに対するのと同様Ｌ−チロ
シンに対しても強く作用し、１モルのＬ−チロシン、１
モルのNAD+及び１モルの水から１モルのｐ−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、１モルのNADH及び１モルのアンモ
ニウムイオンを生成する反応、並びにこの逆反応を触媒
する。
素は、Ｌ−フェニルアラニンに対するのと同様Ｌ−チロ
シンに対しても強く作用し、１モルのＬ−チロシン、１
モルのNAD+及び１モルの水から１モルのｐ−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、１モルのNADH及び１モルのアンモ
ニウムイオンを生成する反応、並びにこの逆反応を触媒
する。
従って、Ｌ−フェニルアラニンの製造方法について記載
したのと同様の方法を用い、但し基質としてフェニルピ
ルビン酸の代りにｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を
使用することにより、Ｌ−チロシンを製造することがで
きる。次に参考のためＬ−チロシンの製造例を記載す
る。
したのと同様の方法を用い、但し基質としてフェニルピ
ルビン酸の代りにｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を
使用することにより、Ｌ−チロシンを製造することがで
きる。次に参考のためＬ−チロシンの製造例を記載す
る。
バシルスsp.SCRC-R79a由来の部分精製酵素を用いるＬ−
チロシンの合成 ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸1.1g(6mmol)、ギ酸
アンモニウム4.5g(71.3mmol)、NAD+216mg(300μmol)、
トリス−HCl緩衝液（pH8.5）１５mmol、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素２４単位（DEAE−トヨパールカラムを
通過させた画分）および粗ギ酸脱水素酵素３０単位（pH
8.5、カンジダ・ボインディニNo.2201より部分精製）を
含む300mlの反応液を３０℃において４５時間反応させ
たところ、結晶が析出した。この結晶をろ取し、再結晶
化して0.648gの無色固体を得た。この標品の元素分析値
は以下のとおりであった。
チロシンの合成 ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸1.1g(6mmol)、ギ酸
アンモニウム4.5g(71.3mmol)、NAD+216mg(300μmol)、
トリス−HCl緩衝液（pH8.5）１５mmol、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素２４単位（DEAE−トヨパールカラムを
通過させた画分）および粗ギ酸脱水素酵素３０単位（pH
8.5、カンジダ・ボインディニNo.2201より部分精製）を
含む300mlの反応液を３０℃において４５時間反応させ
たところ、結晶が析出した。この結晶をろ取し、再結晶
化して0.648gの無色固体を得た。この標品の元素分析値
は以下のとおりであった。
比旋光度▲〔α〕25 D▼＝-7.33゜(c＝4、6NHCl)でＬ体で
あり、光学純度は100%e.e.である。マススペクトル、核
磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルに
よる分析結果はいずれも、生成物がＬ−チロシンである
ことを示した。
あり、光学純度は100%e.e.である。マススペクトル、核
磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペクトルに
よる分析結果はいずれも、生成物がＬ−チロシンである
ことを示した。
第１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04の電子顕微
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第２図はバシルスsp.SCRC-R53bの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第３図はバシルスsp.SCRC-R79aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第４図はバシルスsp.SCRC-101Aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第５図はバシルスsp.SCRC-114Dの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第６図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係
を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応に
ついて、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を示
し； 第７図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラ
フであり； 第８図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との
関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ化反応に
ついての結果を示し； 第９図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグ
ラフであり； 第１０図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペク
トラムであり； 第１１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気
泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.
5％ゲル，pH8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10.0％ゲル，pH7.2）を示し； 第１２図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッ
チであり； 第１３図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係を表わすグ
ラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応について、Ｂ
は還元的アミノ化反応についての結果を示し； 第１４図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラフであり； 第１５図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との関係を表わ
すグラフであって、酸化的脱アミノ化反応についての結
果を示し； 第１６図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであ
り、Ａは0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）中での結
果を示し、そしてＢは0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液
（pH11.0）中での結果を示し； 第１７図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペクトラムであ
り； 第１８図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気泳動図であっ
て、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.5％ゲル，pH
8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動（10.0％ゲル，pH7.2）の結果を示し；そして 第１９図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッチである。
鏡写真であって、生物の形態を表わす図面に代る写真で
あり； 第２図はバシルスsp.SCRC-R53bの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第３図はバシルスsp.SCRC-R79aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第４図はバシルスsp.SCRC-101Aの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第５図はバシルスsp.SCRC-114Dの電子顕微鏡写真であっ
て、生物の形態を表わす図面に代る写真であり； 第６図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係
を表わすグラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応に
ついて、Ｂは還元的アミノ化反応についての結果を示
し； 第７図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラ
フであり； 第８図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との
関係を表わすグラフであって、酸化的脱アミノ化反応に
ついての結果を示し； 第９図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産する
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグ
ラフであり； 第１０図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペク
トラムであり； 第１１図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気
泳動図であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.
5％ゲル，pH8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリ
ルアミド電気泳動（10.0％ゲル，pH7.2）を示し； 第１２図はスポロサルシナ・ウレアエSCRC-R04が生産す
るＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッ
チであり； 第１３図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpHと反応速度の関係を表わすグ
ラフであって、Ａは酸化的脱アミノ化反応について、Ｂ
は還元的アミノ化反応についての結果を示し； 第１４図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素のpH安定性を示すグラフであり； 第１５図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度と反応速度との関係を表わ
すグラフであって、酸化的脱アミノ化反応についての結
果を示し； 第１６図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の温度安定性を示すグラフであ
り、Ａは0.1Ｍグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）中での結
果を示し、そしてＢは0.1Ｍグリシン−KCl−KOH緩衝液
（pH11.0）中での結果を示し； 第１７図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の紫外部吸収スペクトラムであ
り； 第１８図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の均一性を示す電気泳動図であっ
て、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（7.5％ゲル，pH
8.4）を示し、そしてＢはSDS−ポリアクリルアミド電気
泳動（10.0％ゲル，pH7.2）の結果を示し；そして 第１９図はバシルスsp.SCRC-R79aが生産するＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素の顕微鏡拡大スケッチである。
Claims (4)
- 【請求項１】次の性質： （１）作用：１モルのＬ−アミノ酸、１モルのNAD+及び
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； （２）分子量：高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法
において290,000の分子量を示し、沈降平衡法において3
40,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法において38,000〜39,000の分子量を
有するサブユニットを示す； （３）基質特異性：下記の表に示すようにＬ−フェニル
アラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には極め
てわずかにしか反応せず、又は全く反応しない： （上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結
果を示す）； （４）至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.6〜11.3
付近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.
8付近が至適である； （５）pH安定性：各pHの緩衝液(0.05M)中30℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合、pH４〜11.3の範囲で安定である；並びに （６）至適温度：50℃付近における活性が最大である； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素。 - 【請求項２】バシルス(Bacillus)属細菌により生産され
る特許請求の範囲第１項記載の酵素。 - 【請求項３】次の性質： （１）作用：１モルのＬ−アミノ酸、１モルのNAD+及び
１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モルの
NADH及び１モルのアンモニウムイオンを生成する反応、
並びにこの逆反応を触媒する； （２）分子量：高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法
において290,000の分子量を示し、沈降平衡法において3
40,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法において38,000〜39,000の分子量を
有するサブユニットを示す； （３）基質特異性：下記の表に示すようにＬ−フェニル
アラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸には極め
てわずかにしか反応せず、又は全く反応しない： （上記の表は酸化的脱アミノ化反応について測定した結
果を示す）； （４）至適pH：酸化的脱アミノ化反応ではpH10.6〜11.3
付近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.
8付近が至適である； （５）pH安定性：各pHの緩衝液(0.05M)中30℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について測
定した場合、pH４〜11.3の範囲で安定である；並びに （６）至適温度：50℃付近における活性が最大である； を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるバシルス(Bacil
lus)属細菌を培養し、この培養物から該酵素を採取する
ことを特徴とする方法。 - 【請求項４】前記細菌がバシルスsp.(Bacillus sp.)SCR
C-R53b,SCRC-R79a（微工研菌寄第8179号；微工研条寄第
1013号）、SCRC-101A、又はSCRC-114D株（微工研条寄第
1011号）である特許請求の範囲第３項記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60127118A JPH0630573B2 (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 |
| US06/851,207 US4849345A (en) | 1985-04-17 | 1986-04-14 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| EP19920113785 EP0513872A1 (en) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| EP86302830A EP0206460B1 (en) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-phenylalanine dehydrogenase and use thereof |
| DE86302830T DE3688864T2 (de) | 1985-04-17 | 1986-04-16 | L-Phenylalanindehydrogenase und deren Verwendung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60127118A JPH0630573B2 (ja) | 1985-06-13 | 1985-06-13 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60080293A Division JPH0630572B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-04-17 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61239888A JPS61239888A (ja) | 1986-10-25 |
| JPH0630573B2 true JPH0630573B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=14952048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60127118A Expired - Lifetime JPH0630573B2 (ja) | 1985-04-17 | 1985-06-13 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630573B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0630572B2 (ja) * | 1985-04-17 | 1994-04-27 | 財団法人相模中央化学研究所 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 |
-
1985
- 1985-06-13 JP JP60127118A patent/JPH0630573B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61239888A (ja) | 1986-10-25 |
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