JPH06306100A - Ｖｉｐアナログ調製用融合蛋白、ｖｉｐアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物 - Google Patents

Ｖｉｐアナログ調製用融合蛋白、ｖｉｐアナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド及び形質転換微生物

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JPH06306100A
JPH06306100A JP9931393A JP9931393A JPH06306100A JP H06306100 A JPH06306100 A JP H06306100A JP 9931393 A JP9931393 A JP 9931393A JP 9931393 A JP9931393 A JP 9931393A JP H06306100 A JPH06306100 A JP H06306100A
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leu
ala
asn
vip
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Haruo Takahashi
治雄 高橋
Yohei Kobayashi
洋平 小林
Masanao Nagoshi
正直 名越
Takahiko Mitani
隆彦 三谷
Kinya Hiraide
欽也 平出
Kiichi Sawai
喜一 澤井
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Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 生物学的活性と安定性に優れた VIP アナロ
グを遺伝子組換え技術により大量調製する方法を提供す
る。 【構成】 ザルコファーガレクチンの一部であって分子
量 5000 以上の部位をリーダーペプチドとし、リーダー
ペプチド下流に一般式 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-R
1-R2-Tyr-Thr-R3-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-R4-R5-Lys-
Tyr-Leu-R6-R7-R8-R9-R10-Met (例えばR1 は Asp 、R2
は Asn 、R3 は Arg 、R4 は Val、R5 は Lys 、R6 は
Asn、R7 は Ser、R8 は Ile、R9は Leu 、R10 Asn) の
ペプチドが単数又は複数分子タンデムに連結したポリペ
プチドをコードするDNA を発現用プラスミドに組込み、
大腸菌を形質転換させ、形質転換菌を培養して上記ポリ
ペプチドを融合蛋白として大量に発現させ、融合蛋白を
臭化シアンで処理して VIP アナログ (C 末端のアミノ
酸残基は Met が変化したホモセリン又はホモセリン・
ラクトン残基である) とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は VIP アナログ調製用融
合蛋白、VIP (Vasoactive IntestinalPolypeptide) ア
ナログの製法並びにそのための遺伝子組換えプラスミド
及び形質転換微生物に係る。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】平滑筋弛緩作用を有するポ
リペプチドは数多く発見されているが、VIP はSaid 及
び Mutt により 1970 年にブタ十二指腸からセクレチン
を抽出精製する過程で副分画から分離精製された 28 個
のアミノ酸からなり、C 末端に NH2 を有するペプチド
ホルモンである。VIPのアミノ酸の一次構造は 1974 年
に明らかにされ、グルカゴンやセクレチン等と類似して
いることからグルカゴン・セクレチンファミリーに属す
るペプチドホルモンであるとされるに至っている。その
後に VIP は消化管以外に神経系等にも存在が認められ
ており、その生物学的作用は多彩であって強い血管拡張
・血圧降下作用、平滑筋弛緩作用、腸液分泌促進作用、
膵液・胆汁分泌促進作用、胃酸分泌抑制作用、グリコー
ゲン分解作用、種々の下垂体ホルモン分泌促進作用や生
殖器における血流調節作用、気管支拡張作用等を有する
ことが明らかにされている。これらの種々多様な生物学
的作用の中で、VIP の気管支平滑筋弛緩作用並びに海綿
体小柱の血管拡張作用は気管支喘息やインポテンツの治
療に応用できるものと期待されている。
【０００３】しかしながら、VIP を動物の臓器から分離
抽出したり、化学合成により製造する場合には生産量、
生産効率、純度、製造コスト等に問題がある。更に、VI
P は物理化学的に不安定であるのみならず、生体内に存
在する酵素によっても分解され易いと云う問題点を有し
ており、従って VIP を医薬品として実用化することは
非常に困難であると考えられてきた。このような問題点
を解決するために、VIP と同等以上の生物学的活性を有
するVIP アナログや VIP よりも安定性に優れた VIP ア
ナログに関する研究が活発に行われてきており、例えば
以下に示すような研究成果報告が現在までになされてい
る。
【０００４】化学合成による VIP アナログとして、VIP
の 17 位に存在するメチオニン残基をロイシン又はノ
ルロイシン残基に変換したポリペプチドは VIP と同様
な生物学的活性を有する (特開昭 62 - 246595)。VIP
の N 末端或は C 末端のアミノ酸残基を 1 つ又は 2 つ
欠落させると生物学的活性は大幅に減少するが ["J.Bio
l. Chem.", Vol. 266, pages 6389 - 6392 (1991)]、C
末端に塩基性アミノ酸残基を付加した VIP アナログは
3 - 4 倍程度強い生物学的活性を示す (既述の特開昭 6
2 - 246595)。 VIP の N 末端をアセチル化し、17 位の
メチオニン残基をノルロイシン残基に変換した VIP ア
ナログをリーディング化合物とし、更に数ヶ所のアミノ
酸残基を他のアミノ酸残基に変換した VIP アナログは
優れた生物学的活性を示す (特開平 3 - 38600)。しか
しながら、これらの化学合成による VIP アナログは、
その構造中に天然には存在しない形のアミノ酸残基を包
含していたり、N 末端がアセチル化されていたりするの
で、遺伝子組換え技術により製造することは事実上不可
能である。
【０００５】一方、遺伝子組換え技術による VIP アナ
ログとしては、[Leu17]-VIP-OH (特開平 1 - 296996 及
び 同 3 - 280893)、[Leu17]-VIP-Gly、[Leu17]-VIP-Gl
y-Lys-Arg 等 (特開平 3 - 502880) 及び VIP-Gly (特
開平 4 - 148694) が報告されている。これらの公開特
許公報に開示されている方法に従い VIP を調製した場
合、培地 1 リットル当たりの発現量は通例数百 μg で
あり、最高でも数 mg であって、商業的規模での生産を
可能にするには発現量を更に高める必要性がある。又、
上記の公開特許公報に開示されている VIP アナログを
生物学的活性の面からみると、[Leu17]-VIP-OH と VIP-
Gly は天然型 VIP と同等程度であり、一方 [Leu17]-VI
P-Gly は天然型 VIP の 70% 程度であって生物学的活性
の増強は全く認められない。従って、公知の組換え技術
による VIP アナログに関しては、生産効率及び生物学
的活性の両面において問題があることになる。
【０００６】このような従来技術の課題を克服するため
に、本発明者等は鋭意検討を重ね、遺伝子組換え技術を
利用し且つ工業的大量生産に適し、然かも天然型 VIP
と比較する場合にも生物学的活性が著しく増強した VIP
アナログを見出して、これらに関する特許出願をなし
た [特開平 4 - 230400 及び特願平 5 - 9468)。本発明
者等がこれらの特許出願において開示した VIP アナロ
グに共通する構造上の特徴は、その C 末端に Hse (ホ
モセリン又はホモセリン-ラクトン残基) が付加されて
いる点にある。これらの VIP アナログは、先ずその前
駆体 (C 末端がMet) を複数個連結した融合蛋白として
遺伝子組換え技術により大量発現させ、次いでこの融合
蛋白を臭化シアンにて処理することにより得ることがで
きる (臭化シアン処理により Met の部位で切断が生じ
るので、融合蛋白が個々のペプチドフラグメントに分離
し且つ各フラグメントの C 末端における Met が上記の
Hse に変化し、この場合にホモセリン残基となるか或は
ホモセリン・ラクトン残基となるか若しくはこれらの混
合物となるかは pH 条件に依存する)。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】慣用技
術によれば、VIP および公知の VIP アナログを工業的
に大量生産することは困難であり、然かも VIP および
公知の VIP アナログは生体内で不安定であり作用持続
時間も短かく、従って生体に投与する場合には比較的大
量に投与せねばならないと云う課題があった。従って、
本発明が解決しようとする課題乃至発明の本質的な目的
は、自体周知の遺伝子組換え技術を用いて大量生産が可
能であり且つ生物学的活性が in vivoにおいて強力であ
り、斯くて所要投与量を抑制し得るようになすこと、即
ち VIPアナログを有効成分とする医薬品を殊に気管支拡
張剤、インポテンツ治療剤等として実用化する途を開く
ことにある。
【０００８】本発明の 1 特定目的は生物学的活性が強
力な VIP アナログ調製用の融合蛋白を提供することに
ある。本発明の他の特定目的は、該融合蛋白から VIP
アナログを調製する方法を提供することにある。本発明
の更に他の特定目的は VIP アナログ発現用の遺伝子組
換えプラスミド及び当該プラスミドにより形質転換され
た微生物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決し、目的を達成する手段及び作用】既述の
課題を解決し且つ上記の目的を達成するために、本発明
者等は更に検討した結果、適切なリーダーペプチドを選
択し、[Leu17]-VIP-Met を該リーダーペプチドの下流
に、好ましくは複数個タンデムに連結したペプチドに対
応する組換え DNA を発現用プラスミドに組み込み、こ
の遺伝子組換えプラスミドを宿主である微生物に移入
し、当該形質転換微生物を培養することにより封入体
(インクルージョン・ボディー) としての融合蛋白を形
成させ、次いで臭化シアン処理により該融合蛋白を個々
の VIP アナログに分離させることにより強力な生物学
的活性を有する [Leu17]-VIP-Hse (Hse-ラクトンを含
む) を大量に製造できることを見い出し、これによって
本発明を完成するに至った。
【００１０】従って、本発明によれば、ザルコファーガ
レクチンの一部であって分子量が5000 以上の部位をリ
ーダーペプチドとしており、該リーダーペプチドの下流
に一般式 (1) (配列番号 1 に相当) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1 - R2 -Tyr-Thr- R3
-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4 - R5 -Lys-Tyr-Leu- R6
- R7 - R8 - R9 - R10 -Met (式中 R1 は Asp 又は Gly を意味し、R2 は Asn 又は
Gln を意味し、R3 はArg 又は Lys を意味し、R4 は Va
l、Ala 又は Lys を意味し、R5 は Lys 又はLeu を意味
し、R6 は Asn、Gln 又は Lys を意味し、R7 は Ser、L
ys 又は Alaを意味し、R8 は Ile、Ala 又は Leu を意
味し、R9 は Leu 又は Lys を意味し、R10 は Asn、Lys
又は Arg を意味する)にて示されるペプチドが単数又
は複数分子タンデムに連結した状態をなしているVIP ア
ナログ調製用融合蛋白により上記の第 1 特定目的が達
成される。
【００１１】リーダーペプチドは、上記の一般式 (1)
にて示されるペプチドが封入体としての融合蛋白を安定
にしておくために付属させたものであり、その分子量が
5000 以上と規定されているのは、分子量がそれ以下で
あると融合蛋白の発現しないことが判明したためであ
り、上限値に格別の制限はないが、分子量が高過ぎると
形成された融合蛋白の内でリーダーペプチドの占める量
割合が相対的に多くなるので好ましくない (リーダーペ
プチド領域は不要物となるため)。上記の一般式 (1) に
て示されるペプチドの内で、R1 が Gly であり、R2 がA
sn であ り、R3 が Lys であり、R4 が Ala であり、R5
が Lys であり、R6 がAsn 又は Lys であり、R7 が Ly
s 又は Ala であり、R8 が Ala 又は Leu であり、R9
が Leu 又は Lys であり、R10 が Lys 又は Arg である
ペプチドが有利であり、殊に His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe
-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-V
al-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Met (配列番
号 3)、即ち [Leu17]-VIP-Met 分子であるのが有利であ
る。一般式 (1) にて示されるペプチド分子がタンデム
に連結される分子数にも格別の制限はないが、連結のた
めの作業に要する手間、試薬、所要時間等を考慮に入れ
ると、1 - 10 分子程度であり、全菌体蛋白に対する融
合蛋白の量割合は 4分子連結させた場合が最も高いので
好ましい。2 - 3 分子及び 5 - 10 分子連結させた場合
の融合蛋白の量割合は何れも同程度であり、4 分子連結
させた場合と比較すると遥かに少ない。
【００１２】一般式 (2) (配列番号 2 に相当) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1 - R2 -Tyr-Thr- R3
-Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4 - R5 -Lys-Tyr-Leu- R6
- R7 - R8 - R9 - R10 -Hse (式中 R1 - R10 は前記の意味を有し、Hse はホモセリ
ン又はホモセリン・ラクトン残基を意味する)にて示さ
れる VIP アナログは上記の融合蛋白を臭化シアンで処
理することにより調製することができる。
【００１３】遺伝子組換えプラスミドは上記のリーダー
ペプチドの下流に上記の一般式 (2)にて示されるペプチ
ドが単数又は複数分子タンデムに連結されたポリペプチ
ドを用いる以外は自体周知の手法で調製することがで
き、形質転換微生物は該遺伝子組換えプラスミドを自体
周知の手法にて組み込むことにより得ることができる。
尚、微生物としては大腸菌である E. coli JM109、HB10
1 株等を用いることができる。
【００１４】
【実施例等】次に、VIP アナログの製造例及び生理活性
試験例を掲げ、これにより本発明を更に詳細に且つ具体
的に説明する。尚、下記の製造例は専ら [Leu17]-VIP-H
se (ホモセリン・ラクトンを含む) の調製に関するもの
であるが、本発明の範畴に属する VIP アナログはその
遺伝子部分が合成品であるので、同様にして調製するこ
とができる。
【００１５】製造例 a) 工程 1 : [Leu17]-VIP-Met の合成 (図 1 をも参照) 5 10 15 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys- 20 25 29 Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Met 上記のポリペプチド (配列番号 3) を調製するために、
下記の式 (3) にて示されるヌクレオチド配列を有する
二本鎖 DNA 断片 (配列番号 4) を製造した。 式 (3) 1 10 20 30 40 50 60 5'-GATCTTCATGCATTCAGATGCAGTGTTCACTGACAACTACACCCGCCTGCGCAAACAGCT 3'- AAGTACGTAAGTCTACGTCACAAGTGACTGTTGATGTGGGCGGACGCGTTTGTCGA 70 80 90 100 110 GGCTGTAAAGAAATACCTGAACTCAATATTGAACATGGGGATCCTGTGATA CCGACATTTCTTTATGGACTTGAGTTATAACTTGTACCCCTAGGACACTATTCGA 上記の式 (3) にて示される二本鎖 DNA は、次のように
して調製された。ファルマシア社製の DNA 合成装置で
ある「ジーンアセンブラ」を用いて、先ず、下記の式
(4) - (11) にて示されるヌクレオチド配列を有する一
本鎖 DNAをそれぞれ合成した。これらの一本鎖 DNA に
おいて式 (4) と (8)、(5) と(9)、(6) と (10) 及び
(7) と(11) は、末端の一部分を除き互いに相補的なも
のであり、従って二本鎖 DNA を形成することができ
る。 式 (4) (配列番号 5) 5'-GATCTTCATGCATTCAGATGCAGTGTT 式 (5) (配列番号 6) 5'-CACTGACAACTACACCCGCCTGCGCAAA 式 (6) (配列番号 7) 5'-CAGCTGGCTGTAAAGAAATACCTGAACT 式 (7) (配列番号 8) 5'-CAATATTGAACATGGGGATCCTGTGATA 式 (8) (配列番号 9) 5'-TCAGTGAACACTGCATCTGAATGCATGAA 式 (9) (配列番号 10) 5'-CCAGCTGTTTGCGCAGGCGGGTGTAGTTG 式 (10) (配列番号 11) 5'-ATATTGAGTTCAGGTATTTCTTTACAG 式 (11) (配列番号 12) 5'-AGCTTATCACAGGATCCCCATGTTCA 上記の式 (4) - (11) にて示される一本鎖 DNA をポリ
ヌクレオチドキナーゼによりそれぞれ処理して 5' 末端
を燐酸化した後に、相補的な DNA 対である式 (4) と
(8)、(5) と(9)、(6) と (10) 及び (7) と (11) にて
示される一本鎖 DNA をそれぞれアニールさせて形成さ
れた 4 本の二本鎖 DNA を DNA リガーゼにより処理し
てタンデムに接合することにより式 (3) にて示される
二本鎖DNA 断片 (配列番号 4) を得た。この合成 DNA
は、Ile-Phe-Met に続いて[Leu17]-VIP-Met-Gly-Ile-Le
u をコ−ドしている。
【００１６】b) 工程 2 : [Leu17]-VIP-Met をコードす
る DNA のベクターへの組込みと[Leu17]-VIP-Met 分子
部分の複数化 工程 1 において得られた合成 DNA 断片を発現用ベクタ
ーに組み込む操作方法について、図 1 を参照しつつ説
明する。特開平 3 - 80096 に記載のプラスミド {pTMH4
--これは [Leu13]-モチリン-Met をコードする DNA 分
子が 4 分子タンデムに連結されたものを有しているプ
ラスミドであり、この遺伝子組換えプラスミドにて 大
腸菌 (HB101 株) を形質転換した形質変換体は国際寄託
されている (微工研条寄第 2555 号)} を制限酵素 BglI
I と HindIII とを用いて切断し、大きな方のフラグメ
ントを精製した。これを式 (3) にて示される DNA 断片
(配列番号 4) と接合してプラスミドを再構築した。こ
のプラスミドを pQ6VH1 と命名した。次に、[Leu17]-VI
P-Met 分子を複数個タンデムに連結する方法について図
2を参照にしつつ説明する。プラスミド pQ6VH1 を制限
酵素 PstI と BglII を用いて切断し、[Leu17]-VIP-Met
を含む方の DNA 断片を精製した (DNA I)。これとは別
に pQ6VH1 を制限酵素 PstI と BamHI とを用いて切断
し、[Leu17]-VIP-Met を含む方の DNA 断片を精製した
(DNA II)。DNA I と DNA II とを連結してプラスミドを
再構築し、[Leu17]-VIP-Met 2 分子がタンデムに連結さ
れたプラスミド pQ6VH2 を得た。尚、この場合に制限酵
素 BglII と BamHI とによる断点がDNA リガーゼにより
接合されるが、この接合部位はこれら両酵素の認識部位
ではなくなってしまう。従って、上記の切断および接合
操作を繰り返すことにより[Leu17]-VIP-Met が任意の個
数タンデムに連結されたプラスミドを得ることができ
る。このようにして [Leu17]-VIP-Met が 3 - 10 分子
タンデムに連結されたプラスミドである pQ6VH3、pQ6VH
4、pQ6VH5、pQ6VH6、pQ6VH7、pQ6VH8、pQ6VH9 及びpQ6V
H10 をそれぞれ得た。
【００１７】c) 工程 3 : リーダーペプチドであるザル
コファーガレクチンのベクターへの組込み 工程 2 により得られた遺伝子組換えプラスミドに、リ
ーダーペプチドとしてのザルコファーガレクチンを更に
導入する方法について図 3 を参照しつつ説明する。ザ
ルコファーガレクチン ["J.Biological Chemistry", Vo
l. 260, pages12228 - 12233 (1985)] の発現に用いる
プラスミド (pTA160-12) を制限酵素EcoT22I と ScaI
とを用いて切断し、DNA 断片を得た。この DNA 断片に
宝酒造株式会社製のブランティングキットを用いて平滑
末端処理を施した (この DNA断片を DNA III とする)。
一方、プラスミド pQ6VH1 を制限酵素 ScaI と BglIIで
切断した後、上記と同様に平滑末端処理して DNA IV を
得た。DNA III と DNAIV とを DNA リガーゼで連結する
ことによりザルコファーガレクチンの 24 番目から 265
番目のアミノ酸残基を有するポリペプチドに [Leu17]-
VIP-Met が 1分子結合したポリペプチドをコードする D
NA を含むプラスミド pTLVH1 を作製した。更に、pQ6VH
2、pQ6VH3、pQ6VH4、pQ6VH5、pQ6VH6、pQ6VH7、pQ6VH
8、pQ6VH9及び pQ6VH10 についても同様の処理、即ち制
限酵素 ScaI と BglII を用いて切断した後、平滑末端
処理した DNA 断片を各々 DNA III と連結することによ
り、ザルコファーガレクチンの 24 番目から 265 番目
のアミノ酸残基を有するポリペプチドに [Leu17]-VIP-M
et が 2 - 10 分子タンデムに連結したポリペプチドを
コードする DNA を含むプラスミド pTLVH2、pTLVH3、pT
LVH4、pTLVH5、pTLVH6、pTLVH7、pTLVH8、pTLVH9 及び
pTLVH10 を得た。
【００１８】d) 工程 4 : 融合蛋白発現用プラスミドの
作製 次に、融合蛋白発現用プラスミドの構築について図 4
を参照しつつ説明する。ファルマシア社製のプラスミド
pKK223-3 を制限酵素 EcoRI と HindIII とを用いて切
断して DNA V を得た。尚、このプラスミド pKK223-3
は、tac プロモータを有しており、外来性遺伝子にコ−
ドされた蛋白をイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシ
ド (IPTG) によって発現することができるプラスミドベ
クターである。一方、pTLVH1 を制限酵素 EcoRI と Hin
dIII とを用いて切断した後にVIP アナログをコドする
方の DNA V と接合することにより、tac プロモータに
続いて、ザルコファーガレクチンの 24 番目から 265
番目のアミノ酸残基を有するポリペプチドに [Leu17]-V
IP-Met が 1 分子結合したポリペプチドをコードする発
現用プラスミド pILVH1 を得た。プラスミド pTLVH2、p
TLVH3、pTLVH4、pTLVH5、pTLVH6、pTLVH7、pTLVH8、pTL
VH9 及び pTLVH10 についても同様の処理、即ち制限酵
素である EcoRI とHindIII とを用いて切断した後に VI
P アナログをコードする方の DNA を単離し、DNA V と
接合することにより、tac プロモータに引き続いて、ザ
ルコファーガレクチンの 24 番目から 265 番目のアミ
ノ酸残基を有するポリペプチドに[Leu17]-VIP-Met が 2
- 10 分子タンデムに連結したポリペプチドをコードす
る発現用プラスミドである pILVH2、pILVH3、pILVH4、p
ILVH5、pILVH6、 pILVH7、pILVH8、pILVH9 及び pILVH1
0 を得た。
【００１９】e) 工程 5 : リーダーペプチドとしてのザ
ルコファーガレクチンの削り込み [Leu17]-VIP-Hse を多量に得るためには、融合蛋白とし
て発現される蛋白の内で [Leu17]-VIP-Met の占める割
合を高くさせると共に、融合蛋白の発現量が多いプラス
ミドを選択するのが望ましい。そこで、リーダーペプチ
ドとしてのザルコファーガレクチン部分の削り込みを複
製連鎖反応法により行なった。この方法について図 5
を参照しつつ説明する。複製連鎖反応法を行なうための
プライマーとして pKK223-3 の 39 - 55 番目のヌクレ
オチド配列に相当するDNA (DNA VI, 配列番号 13)、ザ
ルコファーガレクチンをコードする DNAの内で162 - 17
8 番目のヌクレオチドに相当する DNA に制限酵素 BglI
I を認識するヌクレオチド配列を付加した DNA のアン
チセンス DNA (DNA VII, 配列番号 14)、ザルコファー
ガレクチンをコードする DNA の内で 288 - 304 番目の
ヌク レオチド配列に相当する DNA に制限酵素 BglII
を認識するヌクレオチド配列を付加した DNA のアンチ
センス DNA (DNA VIII, 配列番号 15) 及びザルコファ
ーガレクチンをコードする DNA の内で 496 - 513 番目
のヌクレオチド配列に相当するDNA に制限酵素 BglII
を認識するヌクレオチド配列を付加した DNA の アンチ
センス DNA (DNA IX, 配列番号 16) 及びザルコファー
ガレクチンをコードするDNA の内で 135 - 151 番目の
ヌクレオチド配列に相当する DNA に制限酵素BglII を
認識するヌクレオチド配列を付加した DNA のアンチセ
ンス DNA (DNAXIII, 配列番号 17) を合成した。 DNA VI (配列番号 13) : 5'-GCTCGTATAATGTGTGG-3' DNA VII (配列番号 14) : 5'-CCAGATCTGTTGTTGATCATGGCGG-3' DNA VIII (配列番号 15) : 5'-CCAGATCTTGCCATAGTCACGACTT-3' DNA IX (配列番号 16) : 5'-CCAGATCTTGAGTGCTTGATCATA-3' DNA XIII (配列番号 17) : 5'-CCAGATCTGCCAGGCTTGATGCCAA 鋳型 DNA として pILVH1 を、プライマー DNA として D
NA VI (配列番号 13)と DNA VII (配列番号 14) とを添
加して複製連鎖反応法を行った。反応後の溶液から、産
物 DNA を単離した後に、制限酵素 EcoR1 と BglII と
を用いて切断し、DNA X を単離した。この DNA X は、
ザルコファーガレクチンの 24 - 59 番目のアミノ酸残
基に相当するポリペプチドをコードしている。一方、pI
LVH1 を制限酵素 EcoR1 と BglII とで切断した後に、V
IP アナログをコードする方のDNA を単離し、DNA X と
連結すること により、ザルコファーガレクチンの 24 -
59 番目のアミノ酸残基に相当するポ リペプチドに [Le
u17]-VIP-Met が 1 分子連結したポリペプチドをコード
する発現用プラスミド pIL162VH1 を得た。尚、プラス
ミド pILVH2、pILVH3、pILVH4、pILVH5、pILVH6、pILVH
7、pILVH8、pILVH9 及び pILVH10 についても同様の処
理、即ち制限酵素 EcoRI とBglII とを用いて切断した
後に、VIP アナログをコードする方の DNA を単離し、D
NA X と連結することにより、tac プロモータに引き続
いて、ザルコファーガレクチンの 24 - 59 番目のアミ
ノ酸残基に相当 するポリペプチドに [Leu17]-VIP-Met
が 2 - 10 分子タンデムに連結したプラスミドである p
IL162VH2、pIL162VH3、pIL162VH4、pIL162VH5、pIL162V
H6、pIL162VH7、pIL162VH8、pIL162VH9 及び pIL162VH1
0 を得た。次に、鋳型 DNA として pILVH1、プライマー
DNA として DNA VI (配列番号13) と DNA VIII (配列
番号 15) を添加して複製連鎖反応法を行った。反応後
の溶液から、産物 DNA を単離した後、制限酵素 EcoR1
と BglII とを用いて切断し、DNA XI を単離した。この
DNA XI は、ザルコファーガレクチンの 24 - 101番目
のアミノ酸残基に相当するポリペプチドをコードしてい
る。一方、pILVH1 を制限酵素 EcoR1 と BglII とで切
断した後に、VIP アナログをコードする方の DNA を単
離し、DNA XI と連結することにより、ザルコファーガ
レクチンの 24 - 101 番目のアミノ酸残基に相当するポ
リペプチドに [Leu17]-VIP-Met が 1 分子連結したポリ
ペプチドをコードする発現用プラスミドpIL288VH1 を得
た。尚、プラスミド pILVH2、pILVH3、pILVH4、pILVH
5、pILVH6、pILVH7、pILVH8、pILVH9 及び pILVH10 に
ついても同様の処理、即ち制限酵素 EcoRI とBglII と
を用いて切断した後に、VIP アナログをコードする方の
DNA を単離し、DNA XI と接合することにより、tac プ
ロモータに引き続いて、ザルコファーガレクチンの 24
- 101 番目のアミノ酸残基に相当するポリペプチドに[L
eu17]-VIP-Met が 2 - 10 分子タンデムに連結したポリ
ペプチドをコードするプラスミドである pIL288VH2、pI
L288VH3、pIL288VH4、pIL288VH5、pIL288VH6、pIL288VH
7、pIL288VH8、pIL288VH9 及び pIL288VH10 を得た。更
に、鋳型 DNA としてpILVH1、プライマー DNA として D
NA VI (配列番号13) と DNA IX (配列番号 16) とを添
加して複製連鎖反応法を行った。反応後の溶液から、産
物 DNA を単離した後に、制限酵素 EcoR1 と BglII と
で切断し、DNA XII を単離した。この DNA XII はザル
コファーガレクチンの 24 - 171 番目のアミノ酸残基に
相当するポリペプチドをコードしている。一方、pILVH1
を制限酵素 EcoR1 と BglII とで切断した後に、VIP
アナログをコードする方の DNA を単離し、DNA XII と
連結することにより、ザルコファーガレクチンの 24 -
から 171 番目のアミノ酸残基に相当するポリペプチド
に[Leu17]-VIP-Met が 1 分子連結したポリペプチドを
コードする発現用プラスミド pIL496VH1 を得た。尚、
プラスミド pILVH2、pILVH3、pILVH4、pILVH5、pILVH
6、pILVH7、pILVH8、pILVH9 及び pILVH10 についても
同様の処理、即ち制限酵素 EcoRI とBglII とを用いて
切断した後に、VIP アナログをコードする方の DNA を
単離し、DNA XII と連結することにより、tac プロモー
タに引き続いて、ザルコファーガレクチンの 24 - 171
番目のアミノ酸残基に相当するポリペプチドに[Leu17]-
VIP-Met が 2 - 10 分子タンデムに連結したポリペプチ
ドをコードするプラスミド pIL496VH2、pIL496VH3、pIL
496VH4、pIL496VH5、pIL496VH6、pIL496VH7、pIL496VH
8、pIL496VH9 及び pIL496VH10 を得た。更に、鋳型 DN
A として PILVH1、プライマー DNA として DNA VI (配
列番号13) 及び DNA XIII (配列番号 17) を添加し、複
製連鎖反応を行った。反応後の溶液から産物 DNA を単
離した後、制限酵素 EcoRI と BglII により切断し、DN
AXIV を単離した。この DNA XIV は、ザルコファーガレ
クチンの 24 - 50 番目のアミノ酸残基に相当するポリ
ペプチドをコードしている。一方、pILVH1 を制限酵素
EcoR1 と BglII とで切断した後に、VIP アナログをコ
ードする方の DNA を単離し、DNA XIV と連結すること
により、ザルコファーガレクチンの 24 - から 50 番目
のアミノ酸残基に相当するポリペプチドに[Leu17]-VIP-
Met が 1 分子連結したポリペプチドをコードする発現
用プラスミド pIL135VH1 を得た。尚、プラスミド pILV
H2、pILVH3、pILVH4、pILVH5、pILVH6、pILVH7、pILVH
8、pILVH9 及び pILVH10 についても同様の処理、即ち
制限酵素 EcoRI とBglII とを用いて切断した後に、VIP
アナログをコードする方の DNA を単離し、DNA XIV と
連結することにより、tac プロモータに引き続いて、ザ
ルコファーガレクチンの 24 - 50 番目のアミノ酸残基
に相当するポリペプチドに[Leu17]-VIP-Met が 2 - 10
分子タンデムに連結したポリペプチドをコードするプラ
スミドである pIL135VH2、pIL135VH3、pIL135VH4、pIL1
35VH5、pIL135VH6、pIL135VH7、pIL135VH8、pIL135VH9
及び pIL135VH10 を得た。
【００２０】f) 工程 6 : 融合蛋白の産生 工程 2 において得られたプラスミド pQ6VH1、pQ6VH2、
pQ6VH3、pQ6VH4、pQ6VH5、pQ6VH6、pQ6VH7、pQ6VH8、pQ
6VH9 及び pQ6VH10 の各々を大腸菌(JM109 株) に取り
込ませて形質転換菌を得た。これらの形質転換菌をアン
ピシリン 50μg/ml 含有培養液により 25 - 40℃ で通
気培養し、A550 が 0.4 - 5.0になった時点で IPTG を
最終濃度が 1mM となるように添加した。その後に 5 -2
4 時間培養を継続し、遠心分離 (5000rpm, 4℃, 20 分
間) により菌体を回収した。これらの菌体の一部を分取
して 12.5% ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分
析した処、該当する部分には目的とする蛋白のバンドは
微量しか確認されなかった。これらのバンドをデンシト
メータにより測定した処、何れの蛋白も全蛋白の 1% 以
下の発現量であった。工程 5 において得られた融合蛋
白発現用プラスミドである pILVH1、pILVH2、pILVH3、p
ILVH4、pILVH5、pILVH6、pILVH7、pILVH8、pILVH9、pIL
VH10、pIL135VH1、pIL135VH2、pIL135VH3、pIL135VH4、
pIL135VH5、pIL135VH6、pIL135VH7、pIL135VH8、pIL135
VH9 及び pIL135VH10、pIL162VH1、pIL162VH2、pIL162V
H3、pIL162VH4、pIL162VH5、pIL162VH6、pIL162VH7、pI
L162VH8、pIL162VH9、pIL162VH10、pIL288VH1、pIL288V
H2、pIL288VH3、pIL288VH4、pIL288VH5、pIL288VH6、pI
L288VH7、pIL288VH8、pIL288VH9、pIL288VH10、pIL496V
H1、pIL496VH2、pIL496VH3、pIL496VH4、pIL496VH5、pI
L496VH6、pIL496VH7、pIL496VH8、pIL496VH9 及び pIL4
96VH10 の各々を大腸菌 (JM109株) に取り込ませて形質
転換菌を得た。これらの形質転換された大腸菌のうちpI
L496VH4 を取り込ませた菌については、工業技術院微生
物工業技術研究所に国内寄託された [微工研菌寄第 134
47 号 (FERM P-13447)]。これらの形質転換菌をアンピ
シリン 50μg/ml 含有培養液 (例えば L-培地、アミノ
酸含有 M9 培地等) により且つエイブル社製の D 型フ
ァーメンターを用いて 25 - 40℃ (好ましくは 30 - 38
℃の間) で通気培養した。A550 が、0.4 -5.0 (好まし
くは 0.6 - 0.8) となった時点で IPTG を最終濃度が 1
mM となるように添加した。その後、5 - 24 時間培養を
継続し、次いで遠心分離法 (5000rpm, 4℃, 20 分間)
により菌体を回収した。これらの菌体の一部を分取して
12.5% SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析
した処、目的とする融合蛋白の分子量に相当する位置に
バンドが確認された。これらのバンドをデンシトメータ
により測定した処、目的とする融合蛋白の発現量は、下
記の表 1 に示される通りであった。尚、リーダーペプ
チドとしてザルコファーガレクチンの 24 - 50 番目の
アミノ酸残基を有する遺伝子組換えプラスミド (pIL135
VH1 - pIL135VH10) を用いて形質転換させた大腸菌には
融合蛋白の発現が認められず、従ってこれらは表 1から
除外されている。一方、ザルコファーガレクチンの 24
- 59 番目のアミノ酸残基をリーダーペプチドとして有
している遺伝子組換えプラスミド(pIL162VH1 - pIL162V
H10) を用いて形質転換させた大腸菌には融合蛋白の発
現が認められたので、ザルコファーガレクチンの一部を
リーダーペプチドとして用いる場合に、その分子量は 5
000 以上のものとすることが必要であると推定された。
この表 1 に示される結果から、[Leu17]-VIP-Met が 4
分子タンデムに連結したものを用いるのが殊に有利であ
ることが判る。
【００２１】
【表１】
【００２２】g) 工程 7 : [Leu17]-VIP-Hse の分離精製 既述の工程 5 において得た遺伝子組換えプラスミド pI
L496VH4 により形質転換させた大腸菌を培養し、IPTG
により融合蛋白を産生させた大腸菌 (工程 6 参照) の
菌体沈澱物 (培地 300ml に相当) に精製水 8ml を添加
して懸濁させ、超音波装置を用いて菌体に破砕処理を施
した。遠心分離法 (5000 rpm, 4℃, 15 分間) により
[Leu17]-VIP-Met を包含する封入体を含む沈澱部分を回
収し、70%蟻酸 40ml を加えて沈澱を溶解させた後に臭
化シアン 0.1g を添加し、30℃ にて 16 時間反応させ
た。反応終了後、160 ml の精製水を加えて遠心分離 (5
000rpm, 4℃, 15 分間) し、上清を凍結乾燥することに
より [Leu17]-VIP-Hse を含有する凍結乾燥粉末を得
た。これに 10% 酢酸溶液10 ml を添加して溶解させ、
ウォーターズ社製の μ-ボンダスフェアの C-18 カラム
(19mm x 15cm) を用い液体クロマトグラフィーにより
[Leu17]-VIP-Hse を精製した。 精製条件 : 溶出液 ; 0.012 規定塩酸 (15% から 50% までのアセト
ニトリルの直線勾配, 30 分間)、 流速 ; 7.0 ml/min. [Leu17]-VIP-Hse に相当するピ−クを分取して凍結乾燥
させ、そのサンプルの一部をアプライドバイオシステム
ズ社製のペプチドシークエンサーにより調べた処、正し
く [Leu17]-VIP-Hse が調製されていることが確認され
た。上記の方法により、大腸菌培地 1 リットル当り 30
- 40mg の [Leu17]-VIP-Hse を得ることができた (こ
れは、従来技術による収量が通例 数百μg/リットル 程
度、最高でも 数mg/リットル 程度であったのと比較す
ると、約 10 - 100倍に相当する)。
【００２３】生理活性試験例 上記の方法により得られた [Leu17]-VIP-Hse を被験物
質とし、天然型 VIP を対照物質として、コンツェット-
レスラー (Konzett-Roessler) 法によりモルモットを用
いた試験 ["J. Biol. Chem.", Vol. 256, pages 6389 -
6392, (1991)]を行った。この実験は、被験物質がヒス
タミンによる気道収縮を阻害する活性を確認するための
ものであり、結果は図 6 に示されている通りであっ
た。本発明者等は以前に化学合成によって得た [Leu17]
-VIP-Hse が、モルモット気管支平滑筋を用いた試験に
より、天然型 VIP に比べて 3 倍以上の活性を有するこ
とを報告しているが (特開平 4 - 230400)、本試験にお
いてもこの事実が裏付けられた。
【００２４】
【発明の効果】本発明によれば、天然型 VIP と比較す
る場合に数倍の活性を有し且つ安定性の高い [Leu17]-V
IP-Hse が形質転換大腸菌を用いて容易に且つ大量に製
造することができる。このことは、気管支喘息やインポ
テンツの治療に使用することが期待されながら、大量に
得ることができないために、或は活性が比較的低いため
に利用されてこなかった VIP や VIP アナログが、上記
の構造の VIP アナログとして大量に且つ廉価に市場へ
供給し得ることを意味している。
【配列表】
配列番号 : 1 配列の長さ : 29 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直線状 配列の種類 : ペプチド 配列 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Xaa-Xaa-Tyr-Thr-Xaa-Leu-Arg-Lys- 1 5 10 15 Gln-Leu-Ala-Xaa-Xaa-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Met 20 25 配列番号 : 2 配列の長さ : 29 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直線状 配列の種類 : ペプチド 配列 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Gly-Asn-Tyr-Thr-Lys-Leu-Arg-Lys- 1 5 10 15 Gln-Leu-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa 20 25 配列番号 : 3 配列の長さ : 29 配列の型 : アミノ酸 トポロジー : 直線状 配列の種類 : ペプチド 配列 His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys- 1 5 10 15 Gln-Leu-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Met 20 25 配列番号 : 4 配列の長さ : 111 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 1 10 20 30 40 50 60 GATCTTCATGCATTCAGATGCAGTGTTCACTGACAACTACACCCGCCTGCGCAAACAGCT AAGTACGTAAGTCTACGTCACAAGTGACTGTTGATGTGGGCGGACGCGTTTGTCGA 70 80 90 100 110 GGCTGTAAAGAAATACCTGAACTCAATATTGAACATGGGGATCCTGTGATA CCGACATTTCTTTATGGACTTGAGTTATAACTTGTACCCCTAGGACACTATTCGA 配列番号 : 5 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 GATCTTCATGCATTCAGATGCAGTGTT 1 10 20 配列番号 : 6 配列の長さ : 28 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 CACTGACAACTACACCCGCCTGCGCAAA 1 10 20 配列番号 : 7 配列の長さ : 28 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 CAGCTGGCTGTAAAGAAATACCTGAACT 1 10 20 配列番号 : 8 配列の長さ : 28 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 CAATATTGAACATGGGGATCCTGTGATA 1 10 20 配列番号 : 9 配列の長さ : 29 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 TCAGTGAACACTGCATCTGAATGCATGAA 1 10 20 配列番号 : 10 配列の長さ : 29 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 CCAGCTGTTTGCGCAGGCGGGTGTAGTTG 1 10 20 配列番号 : 11 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 ATATTGAGTTCAGGTATTTCTTTACAG 1 10 20 配列番号 : 12 配列の長さ : 26 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 AGCTTATCACAGGATCCCCATGTTCA 1 10 20 配列番号 : 13 配列の長さ : 17 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA 配列 GCTCGTATAATGTGTGG 1 10 配列番号 : 14 配列の長さ : 25 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA アンチセンス : Yes 配列 CCAGATCTGTTGTTGATCATGGCGG 1 10 20 配列番号 : 15 配列の長さ : 25 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA アンチセンス : Yes 配列 CCAGATCTTGCCATAGTCACGACTT 1 10 20 配列番号 : 16 配列の長さ : 24 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA アンチセンス : Yes 配列 CCAGATCTTGAGTGCTTGATCATA 1 10 20 配列番号 : 17 配列の長さ : 25 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直線状 配列の種類 : 他の核酸 合成 DNA アンチセンス : Yes 配列 CCAGATCTGCCAGGCTTGATGCCAA 1 10 20
【図面の簡単な説明】
【図１】[Leu17]-VIP-Met をコードする合成遺伝子をプ
ラスミドに組み込む方法を示す説明図である。
【図２】[Leu17]-VIP-Met をコードする合成遺伝子をプ
ラスミド中で複数化する方法を示す説明図である。
【図３】ザルコファーガレクチンの下流に [Leu17]-VIP
-Met をコードする合成遺伝子を組み込む方法を示す説
明図である。
【図４】ザルコファ−ガレクチンと [Leu17]-VIP-Met
とをコードする遺伝子を tac プロモータの下流に連結
する方法を示す説明図である。
【図５】複製連鎖反応法を用いてリーダーペプチドであ
るザルコファ−ガレ クチンを削り込む方法を示す説明
図である。
【図６】[Leu17]-VIP-Hse がヒスタミンによる気管支収
縮活性を阻害する作用を測定した結果を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 三谷 隆彦 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内 (72)発明者 平出 欽也 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内 (72)発明者 澤井 喜一 名古屋市東区東外堀町35番地 株式会社三 和化学研究所内

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ザルコファーガレクチンの一部であって
    分子量が 5000 以上の部位をリーダーペプチドとしてお
    り、該リーダーペプチドの下流に一般式 (1) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1 - R2 -Tyr-Thr- R3
    -Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4 - R5 -Lys-Tyr-Leu- R6
    - R7 - R8 - R9 - R10 -Met (式中 R1 は Asp 又は Gly を意味し、R2 は Asn 又は
    Gln を意味し、R3 はArg 又は Lys を意味し、R4 は Va
    l、Ala 又は Lys を意味し、R5 は Lys 又はLeu を意味
    し、R6 は Asn、Gln 又は Lys を意味し、R7 は Ser、L
    ys 又は Alaを意味し、R8 は Ile、Ala 又は Leu を意
    味し、R9 は Leu 又は Lys を意味し、R10 は Asn、Lys
    又は Arg を意味する)にて示されるペプチドが単数又
    は複数分子タンデムに連結した状態をなしていることを
    特徴とする、VIP アナログ調製用融合蛋白。
  2. 【請求項２】 一般式 (1) において、R1 が Gly であ
    り、R2 が Asn であり、R3 が Lys であり、R4 が Ala
    であり、R5 が Lys であり、R6 が Asn 又はLys であ
    り、R7 が Lys 又は Ala であり、R8 が Ala 又は Leu
    であり、R9 がLeu 又は Lys であり、R10 が Lys 又は
    Arg であることを特徴とする、請求項1 に記載の VIP
    アナログ調製用融合蛋白。
  3. 【請求項３】 リーダーペプチドに後続するペプチドが
    タンデムに 4 分子連結した状態であることを特徴とす
    る、請求項 1 又は 2 に記載の VIP アナログ調製用融
    合蛋白。
  4. 【請求項４】 請求項 1 に記載の融合蛋白を臭化シア
    ンで処理することを特徴とする、一般式 (2) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1 - R2 -Tyr-Thr- R3
    -Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4 - R5 -Lys-Tyr-Leu- R6
    - R7 - R8 - R9 - R10 -Hse (式中 R1 は Asp 又は Gly を意味し、R2 は Asn 又は
    Gln を意味し、R3 はArg 又は Lys を意味し、R4 が Va
    l、Ala 又は Lys を意味し、R5 は Lys 又はLeu を意味
    し、R6 は Asn、Gln 又は Lys を意味し、R7 は Ser、L
    ys 又は Alaを意味し、R8 は Ile、Ala 又は Leu を意
    味し、R9 は Leu 又は Lys を意味し、R10 は Asn、Lys
    又は Arg を意味し、Hse はホモセリン又はホモセリン
    ラクトン残基を意味する)にて示される VIP アナログの
    製法。
  5. 【請求項５】 ザルコファーガレクチンの一部であって
    分子量が 5000 以上の部位をリーダーペプチドとしてお
    り、該リーダーペプチドの下流に一般式 (1) His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr- R1 - R2 -Tyr-Thr- R3
    -Leu-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala- R4 - R5 -Lys-Tyr-Leu- R6
    - R7 - R8 - R9 - R10 -Met (式中 R1 は Asp 又は Gly を意味し、R2 は Asn 又は
    Gln を意味し、R3 はArg 又は Lys を意味し、R4 は Va
    l、Ala 又は Lys を意味し、R5 は Lys 又はLeu を意味
    し、R6 は Asn、Gln 又は Lys を意味し、R7 は Ser、L
    ys 又は Alaを意味し、R8 は Ile、Ala 又は Leu を意
    味し、R9 は Leu 又は Lys を意味し、R10 は Asn、Lys
    又は Arg を意味する)にて示されるペプチド が単数又
    は複数分子タンデムに連結した状態をなしているポリペ
    プチドをコードする DNA を有していることを特徴とす
    る、遺伝子組換えプラスミド。
  6. 【請求項６】 一般式 (1) において、R1 が Gly であ
    り、R2 が Asn であり、R3 が Lys であり、R4 が Ala
    であり、R5 が Lys であり、R6 が Asn 又はLys であ
    り、R7 が Lys 又は Ala であり、R8 が Ala 又は Leu
    であり、R9 がLeu 又は Lys であり、R10 が Lys 又は
    Arg であることを特徴とする、請求項5 に記載の遺伝子
    組換えプラスミド。
  7. 【請求項７】 請求項５に記載のプラスミドを含有して
    いることを特徴とする、形質転換微生物。
  8. 【請求項８】 形質転換されているのが E. coli JM109
    又は HB101 株であることを特徴とする、請求項 7 に
    記載の形質転換微生物。
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