JPH0630627B2

JPH0630627B2 - 生菌数測定方法

Info

Publication number: JPH0630627B2
Application number: JP62288686A
Authority: JP
Inventors: 文治蛭田; 福雄岩谷; 新平鈴木; 光一高地; 勲遠藤; 輝行長棟; 一浅間; 義己辨野
Original assignee: Hitachi Electronics Engineering Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Hitachi High Tech Corp; RIKEN
Priority date: 1987-11-16
Filing date: 1987-11-16
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH01128781A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は生菌数測定方法に関する。更に詳細には、本発
明は液体選択培地を用いて検体中の特定の微生物種のみ
を増殖させ、該微生物から発せられる蛍光を捕捉するこ
とからなる生菌数測定方法に関する。

［従来の技術］従来、このような微生物種の同定は生理学的、生化学的
性状に基づいて行われており、一方、生菌数はサンプル
を１０^-1，１０^-2，……，１０^-8倍に希釈し、この希釈
液の一定量を寒天平板培地上に接種塗抹し、一定時間
（２４〜４８時間）の培養後に、この寒天平板上に出現
したコロニー数に希釈倍率を乗じて求められていた。

しかし、このような全くの手作業による微生物検査法で
は、２〜５日間の検査期間と、かなりの熟練技術とを必
要とし、また、技術者あるいは検査員による測定差が生
じることも知られている。更に、大量の培地およびシャ
ーレの使用および熟練技術者の高価な人件費のため、検
査に要する費用は高価格になっている。

微生物種の同定、生菌数の測定などの微生物検査は、臨
床検査、食品検査、医薬品検査等の部門で必須であり、
迅速化、省人化、自動化に対するニーズは高い。

このため、臨床検査部門では各種の自動化機械の開発が
行われている。例えば、５０rpmで回転している寒天平
板培地に、サンプル液を中心から外側に向かって塗抹す
るプレータ、塗抹された寒天培地を培養し、平板培地上
に形成されたコロニーをHe-Neレーザ光で計数するコロ
ニーカウンタおよびデータプロセッサの３機器からなる
生菌数測定装置、あるいは、性状検査用の各種培地が入
ったカートリッジを用いて微生物種の同定と、比濁法に
よる菌量測定を完全自動で行える生菌数測定装置また
は、このカートリッジの代わりにマイクロプレートを用
いた同様な装置が試作されている。

しかし、これらの機器の大部分は尿路感染などの微生物
検査に用いられているにすぎず、食品検査のようにサン
プルが混濁物であることが多い場合には測定が不可能で
あり、また、十分な精度が得られなかったりする。更
に、いずれの方法も２４〜４８時間の培養期間を必要と
するので、迅速な測定は不可能であり、緊急に検査しな
ければならないようなニーズには対応できない。

［発明が解決しようとする問題点］本発明は広範な分野で使用でき、高精度かつ低コスト
で、検査時間が数時間程度で済む生菌数測定方法を提供
することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］本発明者らが長年にわたり広範な実験と研究を続けた結
果、液体選択培地中の微生物に励起光を照射し、該微生
物から発せられる蛍光の強度を測定し、次いで、該液体
選択培地中の微生物を培養し、増殖した微生物に励起光
を照射し、該微生物から発せられる蛍光の強度を測定
し、培養前後の蛍光強度の差を求めることにより微生物
種を同定し、かつ該微生物の生菌数を高精度で、しか
も、短時間で計測できることが発見された。本発明は斯
かる知見に基づき完成された。

［作用］微生物の生細胞は補酵素ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドの還元型）およびＮＡＤＰＨ（ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元型）を
普遍的に有する。これらの補酵素に励起光を照射すると
蛍光を発生する。

蛍光の強度は各微生物種、生菌数、生細胞１個当りに含
まれる補酵素の量に依存するので、微生物種および培養
前の生菌数が予めわかっている検体について培養前およ
び培養後の蛍光強度を測定し、その差（ΔＩ）を求め
る。培養前の生細胞１個当りに含まれる補酵素の量は、
前記培養前の蛍光強度から液体選択培地由来のバックグ
ラウンド蛍光強度を差し引き、これを前記の既知生菌数
で除した値と比例関係にあるので、この値を培養前の生
菌数１個当りの補酵素量とみなすことができる。

従って、既知試料に基づき蛍光強度差ΔＩｓのデータベ
ースを作成する場合、例えば、二次元記憶テーブルを使
用する。このテーブルにおいて、縦の欄に生菌数を取
り、横の欄に前記の方法によって求めた培養前の生菌数
１個当りの補酵素量を取る。既知生菌数を例えば、１０
¹，１０²，１０³，……，１０ⁿに区分し、補酵素量をそ
の最大値で規格化し、例えば、0,0.1,0.2,0.3,……,0.
9,1.0に区分する。そして、例えば、生菌数１０¹で補酵
素量０の既知微生物種をｎ段階（例えば、１１段階）に
等倍希釈し、各希釈段階について培養前および培養後の
蛍光強度を測定し、その蛍光強度差ΔＩｓ₁，ΔＩｓ₂，
……，ΔＩｓ₁₁を求める。このデータ収集を各生菌数と
各補酵素量について行いデータベースとする。希釈段階
は使用されるマイクロプレートに応じて変化する。例え
ば、９６穴マイクロプレートならば、可能な希釈段階は
最大１１段階である。同一の微生物種で菌数が未知の検
体について、同一希釈段階で培養前および培養後の蛍光
強度を測定し、その蛍光強度差ΔＩｕ₁，ΔＩｕ₂，…
…，ΔＩｕ₁₁を求める。

未知検体中の微生物の生菌数を求めるには、前記既知試
料の標準データと未知検体の実測データとの“へだたり
（距離）”を定義しておき、それが０もしくは０に最も
近い標準データに対応する菌数をもって未知検体中の微
生物の生菌数と推定する。

例えば、いま特徴（ΔＩｕ₁，ΔＩｕ₂，……，ΔＩ
ｕ_n）をもった一つの未知検体Ｕを、特徴が（ΔＩｓ₁，
ΔＩｓ₂，……，ΔＩｓ_n）である既知標準試料Ｓと比較
すると、その“へだたり（距離）”Ｄは次の関係式によ
り求められる。

各微生物種について前記のようなデータマトリックスを
作成し、データベース化しておけば、未知検体の測定値
からデータベースを研削、参照することにより生菌数を
正確、かつ、迅速に推定できる。従って、データベース
のデータ量が豊富になるほど本発明の測定方法の信頼性
が高まる。

微生物の生育過程は一般的に、誘導期，対数期，停止期
および死滅期に区分できるが、各段階で微生物が有する
細胞１個当りの補酵素量も変化する。前記データベース
は、微生物種、生菌数および培養前の補酵素量が既知の
検体を用いて作成されている。従って、未知検体中の微
生物種が同定され、その生菌数が推定されるとともに、
副次的にその補酵素量も推定され、検体中の微生物の生
育段階を予測することも可能となる。

本発明による未知検体中の微生物種の同定と、その生菌
数の測定は、特定の微生物種のみを生長・増殖させるこ
とができる選択培地を使用することにより可能となる。
選択培地とは特定の基質，抗生物質などを添加すること
により、特定の微生物種を他の微生物種よりも有利に生
長できるようにした培地である。

例えば、未知検体中にビヒドバクテリウム（Bifidobact
erium）属の菌（いわゆるビヒィズス菌）が存在するか
否か、存在するとすれば、その生菌数は幾らかという場
合、選択培地として次の組成を有するものを使用する。
ラブーレムコ（Lab-lemco）粉末（Ｏｘｏｉｄ社製）
２．４ｇ／１，プロテオースぺプトンNO.３（Difco社
製）１０．０ｇ／１，トリプチケース（BBL社製）５ｇ
／１，酵母エキス（Difco社製）５．０ｇ／１，肝臓浸
出液（光岡，１９６９）１５０ml／１，ラフィノース４
ｇ／１，塩類溶液Ａ（光岡ら，１９６５）１０ml／１，
塩類溶液Ｂ（光岡ら，１９６５）５ml／１，消泡剤ダウ
コーニング社製，１０％）５ml／１，ツイーン８０１
ｇ／１，Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／１，
プロピオン酸ナトリウム１５ｇ／１およびコリマイシン
（１０⁶単位，１％）１２ml／１。この選択培地を作製
する場合、コリマイシン以外の成分を混合し、１１５℃
で２０分間滅菌する。コリマイシンは使用直前に無菌的
に添加する。この選択培地中ではビヒドバクテリウム属
の菌しか生育できないので、未知検体が蛍光を発すれ
ば、未知検体中の微生物種はビヒドバクテリウム属の菌
と同定される。

前記のように特定の微生物種のみしか生育できない選択
培地に未知検体を接種し、培養し、蛍光強度を測定し、
培養の前後で蛍光強度に差が出れば、該当する微生物種
が未知検体中に存在し増殖したためであり、容易に未知
検体中の微生物種を同定することができる。

実際には、未知検体中にどのような微生物種が存在して
いるか予測することは困難なので、未知検体を全ての選
択培地に接種し、培養し、どの選択培地で生育したか、
培養前後の蛍光強度差に基づき確認し、微生物種を同定
することとなる。

本発明者らの研究によれば、下記の組成の選択培地を使
用することにより大腸菌のみを特異的に生育させること
ができる。

肉エキス３．０ｇぺプトン１０．０ｇカゼイン５．０ｇ乳糖１５．０ｇ白糖１０．０ｇデオキシコール酸ナトリウム１．０ｇチオ硫酸ナトリウム２．５ｇクエン酸ナトリウム１．０ｇクエン酸アンモニウム１．０ｇ精製水１０００ml サルモネラ菌の場合、下記の組成の選択培地中で特異的
に生育する。

肉エキス３．０ｇプロテオーズぺプトン１２．０ｇ乳糖１２．０ｇ白糖１２．０ｇサリシン２．０ｇ胆汁酸塩１５．０ｇ塩化ナトリウム５．０ｇチオ硫酸ナトリウム６．８ｇクエン酸アンモニウム０．８ｇデオキシコール酸ナトリウム２．０ｇ精製水１０００ml 黄色ブドウ状球菌について使用される選択培地は下記の
組成を有する。

酵母エキス２．５ｇぺプトン１０．０ｇケラチン３０．０ｇ乳糖２．０ｇマンニット１０．０ｇ塩化ナトリウム７５．０ｇリン酸２カリウム５．０ｇ塩化リチウム５．０ｇフェノールエチルアルコール２５ml 精製水１０００ml キャンピロバクター用の選択培地は下記の組成を有す
る。

プロテオーズぺプトン１５．０ｇ酵母エキス５．０ｇ肝臓エキス２．５ｇ塩化ナトリウム５．０ｇヴァンコマイシン１０mg ポリミキシンＢ２５００単位トリムトブリム５mg セファロシン１５mg アンフォテリシンＢ２mg 精製水１０００ml また、酵母菌については下記の組成の選択培地が使用さ
れる。

バクトポテトデキストロースブイヨン（Difco社製）３９．０ｇ１０％酒石酸１４．０ml 精製水１０００ml 選択培地は液体培地であることが好ましい。液体培地な
らば、マイクロピペット等により定量を自動分注するこ
とが可能である。

［実施例］以下、図面を参照しながら本発明の一実施例について更
に詳細に説明する。

第１図は本発明の生菌数測定方法を実施するのに使用さ
れる装置の一例のブロック図である。

この装置は基本的にマイクロプレート希釈・測定部１０
とデータ処理部２０とからなる。

第１図のマイクロプレート希釈・測定部１０において、
マイクロプレートは図中の実線矢印で示されるようにロ
ーダカセット３０から自動希釈・攪拌装置４０に送ら
れ、ここで検体（サンプル）の接種，希釈，攪拌が同時
に行われ、アンローダカセット３２へ移送される。この
アンローダカセット３２は隣接する自動蛍光測定装置５
０へマイクロプレートを供給するローダカセットも兼ね
ている。蛍光測定の済んだマイクロプレートは別のアン
ローダカセット３４に移送される。自動蛍光測定装置５
０による蛍光強度測定は、培養前のマイクロプレートに
ついて行い、次いでいインキュベータ３６に移送して所
定時間培養し、培養後再び蛍光強度測定を行う。インキ
ュベータは特に装置自体に組込む必要はなく、通常の実
験室等に備え付けられている常用の恒温器等を利用する
こともできる。第１図において、太線矢印は培養後のマ
イクロプレートの移動を示す。マイクロプレートの移送
にはコンベヤ等の慣用手段が使用される。アンローダ／
ローダ兼用カセット３２およびアンローダカセット３４
とインキュベータ３６との間のカセットの移送には所望
により、ロボット等を使用できる。

自動蛍光測定装置５０からの培養前蛍光強度測定信号
（図中、一点鎖線矢印）および培養後蛍光強度測定信号
（図中、太一点鎖線矢印）はデータ処理部２０のプロセ
ッサ６０へ送信される。この測定信号と使用した選択培
地の種類に関する情報とから外部記憶装置７０に記憶さ
れているデータベースを検索、参照することにより検体
内に存在する微生物種の同定と、その微生物種の生菌数
を推定する。プロセッサ６０は外部記憶装置７０と、Ｃ
ＲＴおよびキーボードを有するコンソール８０に接続さ
れている。全てのオペレーションはコンソール８０から
の命令入力によって行える。図中の破線矢印は制御信号
およびデータの流れを示す。

培養前蛍光強度測定を行い、培養後蛍光強度測定値から
その値を引くことにより、バックグランドが除かれると
共に、選択培地中で増殖した特定の微生物種の生菌数の
増加量に対応する信号が得られる。一方、培養前後の蛍
光強度に差がなければ、その選択培地に該当する微生物
種が未知検体内に存在していないことを意味する。

第２図は本発明で使用されるマイクロプレート９０の斜
視図である。

マイクロプレート９０は例えば、ポリカーボネイトのよ
うな高分子材料またはガラス等の透明な素材から構成さ
れている。マイクロプレート９０は不透明なプラスチッ
ク類、セラミック類または陶器などから構成されていて
もよい。

マイクロプラスチック９０のおもて面には９６個（８行
ｘ１２列）の穴が設けられている。穴の形状は特に限定
されない。スリバチ状，Ｖ字状または円柱状もしくは角
柱状など任意の形状を使用できる。言うまでもなく、９
６穴以外のマイクロプレートも使用できる。マイクロプ
レート手前側１列は検査液を注入しておくスペースであ
り、希釈用の残列には予め液体選択培地が一定量注入さ
れている。

第３図は本発明の生菌数測定方法を実施するのに使用さ
れる装置の一例の平面図であり、第４図は第３図におけ
るＡ矢視図である。

自動希釈・攪拌装置４０の搬送系４１の両端にローダカ
セット３０（図中、左側）およびアンローダ／ローダ兼
用カセット３２が配設されている。搬送系４１の駆動伝
達系は例えば、コンベヤ，チェーン，ベルト等の慣用手
段により構成できる。それぞれのカセットはマイクロプ
レート９０を例えば、１０枚収納でき、ミニチュア倉庫
型構造になっている。第１図のアンローダカセット３４
も同一構造である。マイクロプレートはカセットごとイ
ンキュベータ３６に入れることができる。カセットはボ
ールスクリュー機構またはエレベータ等の慣用手段を使
用することにより上下動させることができる。第３図に
おいて、４８はベースであり、４９は架台である。

ガイドレール４２に沿って前後進可能な駆動系４３の先
端部にはマイクロプレート９０の検体穴数に対応する本
数の例えば、マイクロシリンジ等の極微量分注器４４が
取り付けられている。この極微量分注器４４の先端には
滅菌済みの使い捨てチップ４５が装着される。チップ４
５はチップ供給部４６から供給される。マイクロプレー
ト９０は第３図に示されるような横送りだけでなく、縦
送りも可能である。横送りの場合、最大８検体を１０
^-11倍まで希釈することが可能であり、縦送りの場合に
は最大１２検体を１０^-7倍まで希釈することが可能であ
る。偏心モータ４７により極微量分注手段４４の先端の
チップ４５を振動させることにより穴内の液体を攪拌し
濃度を均一化させる。偏心モータ以外の攪拌手段も当然
使用できる。例えば、シリンジで穴内の液体を吸引・吐
出する操作を数回繰り返すことによっても攪拌の目的は
達せられる。

各穴に注入されている選択培地の量に合わせて、所定の
希釈倍率になるように検体液の分注器のシリンジストロ
ークが設定され、分注器が前後移動を繰り返しながら滅
菌済チップの装填，設定段階の希釈と攪拌、最後のチッ
プ廃棄までを自動的に行う。希釈方法は例えば、選択培
地列の各穴内に４５μの選択培地を注入しておき、検
体列の穴から５μの検体を分注器で採取し、これを最
初の選択培地穴に注ぎ込み、攪拌する。得られた１０^-1
倍希釈液から５μ採取し、次の選択培地穴に注ぎ込
み、攪拌する。すると１０^-2倍希釈液が得られる。この
１０^-2倍希釈液から５μ採取し、次の選択培地穴に注
ぎ込み、攪拌する。かくして、１０^-3倍希釈液が得られ
る。この操作を繰返すことにより、１０^-7または１０
^-11倍までの希釈液を調製することができる。このよう
に、１検体について多数の希釈倍率を設けて試験するの
は、未知検体中に存在する測定対象とする菌の生菌数レ
ベルが１０¹〜１０¹¹／mlの広範囲の場合について検出
可能とするとともに、生菌数の大体の値を予測するため
である。例えば、１０^-9倍以上の希釈検体について蛍光
強度差が検出されない場合、未知検体の生菌数は大体１
０⁸〜１０⁹程度と予測される。

第５図は自動蛍光測定装置５０内の光学系による蛍光検
出原理を示す概要図である。

蛍光検出の原理自体は公知であり、基本的には照明系に
励起フィルタ，観察系に吸収フィルタを有し、ハーフミ
ラーの代わりにダイクロイックミラーが使用されてい
る。

第５図に示されているように、光源５１から発せられた
様々な波長の光を含む照明光は、励起フィルタ５２によ
り、蛍光を発生させるのに必要な波長域の光だけが抽出
され透過する。この透過光はダイクロイックミラー５３
により９０°下方に反射後、対物レンズ５４ａを通常と
は逆の方向で通過し、励起光としてマイクロプレート９
０の穴内の検体に達する。励起光照射により任意方向に
発光した蛍光の一部は対物レンズ５４ａに入る。ダイク
ロイックミラー５３は励起光より長波長の蛍光は反射せ
ずにこれを透過する。従って、対物レンズ５４ａに入っ
た蛍光はダイクロイックミラー５３を透過し、吸収フィ
ルタ５５ａを通る。吸収フィルタ５５ａは励起光の僅か
な迷光もカットし、蛍光のみを光電子増倍管５６ａに到
達させる。

マイクロプレート９０が透明な光透過材料で構成されて
いるため、励起光照射により任意方向に発光した蛍光は
マイクロプレート９０の上方および下方の両方向へ向か
う。従って、マイクロプレート９０の下側にも対物レン
ズ５４ｂと吸収フィルタ５５ｂおよび光電子増倍管５６
ｂを配設する。微生物から発生する蛍光は極めて微弱な
ため、マイクロプレートの表側および裏側の両側で蛍光
を捕捉し、測定することにより検出精度が向上する。し
かし、光透過性マイクロプレートの使用は本発明の必須
要件ではない。従って、光透過性のマイクロプレートを
使用し、上方だけで蛍光を捕捉し測定することもでき
る。

光源５１としては例えば、超高圧水銀灯が用いられる。
主として、波長が３６５nm〜５４６nmの範囲内の輝線ス
ペクトルが励起光として利用されるが、本発明では約３
４０nm〜約３９０nmの範囲内でピーク波長が３６６nmの
励起光を使用する。光源としてはその他に、キセノンラ
ンプ，ハロゲンランプ等も使用できる。光源から発せら
れた照明光の４００nm以上の波長は励起フィルタ５２で
カットされ、約３４０nm〜約３９０nmの範囲内でピーク
波長が３６６nmの励起光を得る。

ダイクロイックミラー５３は光軸に対して４５度の角度
に配置したときに、ある波長より短波長の光は反射し、
長波長の光は透過するような特性を持った干渉フィルタ
である。本発明では短波長側に励起波長域，長波長側に
蛍光波長域がくるように設定した。

吸収フィルタ５５ａおよび５５ｂは微生物により吸収さ
れずに反射・透過した励起光が光電子増倍管５６に入射
することを防ぐため、および、蛍光の中でも特定の波長
のみを透過させるために配設されている。本発明では約
４３０nm〜４９０nm、好ましくは約４４０nm〜約４８０
nm、一層好ましくは４５０nm〜４７０nm、最も好ましく
は４５５nm〜４６７nmの範囲内の波長を有する蛍光を捕
捉する。

光電子増倍管５６ａおよび５６ｂからの測定信号はプロ
セッサ６０へ送信される。プロセッサのＡ／Ｄ変換器
（図示されていない）により測定信号をデジタル値に変
換し、演算回路（図示されていない）で蛍光強度を算出
する。この算出結果に基づき、外部記憶装置に記憶され
ているデータベースを前記の“へだたり（距離）”Ｄを
算出しつつ、検索、参照し、前記Ｄが最も０に近くなる
標準データを見出すことにより生菌数が求められる。こ
の結果はコンソールのＣＲＴ画面に表示するか、あるい
は、所望により、プリンタ（図示されていない）に出力
することができる。

本発明の方法は好気性菌および嫌気性菌の何れにも使用
できる。嫌気性菌について本発明の方法を実施する場
合、測定装置は例えば、炭酸ガスまたは窒素ガス等の不
活性ガス雰囲気下で運転することが必要となる場合もあ
る。

［発明の効果］以上説明したように、本発明の方法によれば、液体選択
培地中の微生物に励起光を照射し、該微生物が有する補
酵素から発せられる蛍光の強度を測定し、増殖した微生
物に励起光を照射し、該微生物が有する補酵素から発せ
られる蛍光の強度を測定し、培養前後の蛍光強度の差を
求め、この値を予め既知の生菌数と蛍光強度とについて
作成されたデータベースに当てはめることにより、未知
検体中の微生物種を固定し、かつ、該微生物の生菌数を
迅速に測定することができる。

このように、蛍光標識を全く使用せず、微生物が有する
補酵素から発せられる蛍光から微生物の生菌数を測定す
る方法は本発明が初めてである。実際、蛍光標識を使用
することにより微生物量を測定する方法は多数知られて
いる。例えば、特開昭６１−１８６８５４号、同６１−
２１０８４号、同６１−１６５８６号および同５７−１
３２８９９号公報に開示されている。蛍光標識を使用す
ると検出感度が上昇するという利点があるが、反面、検
出標識使用に伴う測定誤差も発生する。例えば、微生物
によっては添加された検出標識と結合しないものもあ
り、使用に不確実性が伴う。また、微生物ばかりか、培
地成分と結合してしまう蛍光標識もあり、測定誤差の大
きな原因となっていた。このため、測定前に培地の除去
作業を行うなどの余計な負担が強いられる。更に、存在
する微生物数に対する蛍光標識の化学的量論的量を測定
前に決定することができないので、必然的に蛍光標識は
過剰量添加しなければならない。すると、微生物と結合
しないで残った蛍光標識からも蛍光が発生し、これも測
定誤差を構成する大きな原因となる。また、蛍光標識は
不安定なものもあり、測定前または測定中に空気中の酸
素などの物質または温度などの影響を受けて分解してし
まい、測定を誤らせることがある。従って、本発明の方
法では、このような従来の蛍光標識の使用に伴う測定誤
差の問題は全く生じない。

また、本発明の生菌数測定方法によれば、生菌を含む検
体液の正確な希釈ならびに微生物種の同定と生菌数の測
定を人手を介することなく、完全に自動的に行うことが
できる。

本発明ではマイクロプレートを使用するため、少量の培
地で多量の検体を同時に処理できるので従来の寒天平板
法に比べて、１検体あたりの検査コストが約1/20まで軽
減される。

液体選択培地を使用し、かつ、カセットで運搬している
ため、空気中の浮遊雑菌による細菌汚染の恐れは少な
い。このため、本発明ではクリーンルームあるいはクリ
ーンベンチは特に必要とせず、簡便，迅速，正確，安価
に微生物種を同定し、該微生物種の生菌数を測定でき
る。

本発明の方法は臨床検査分野に限らず、食品関係，化粧
品関係，流通関係，保健所関係．医薬品関係等の広範囲
な分野で微生物種の同定および該微生物種の生菌数の測
定に利用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の生菌数測定方法を実施するのに使用さ
れる装置の一例のブロック図、第２図は本発明で使用さ
れるマイクロプレートの斜視図、第３図は本発明の生菌
数測定方法を実施するのに使用される装置の一例の平面
図、第４図は第３図におけるＡ矢視図、第５図は自動蛍
光測定装置内の光学系による蛍光検出原理を示す概要図
である。１０…マイクロプレート希釈・測定部，２０…データ処
理部，３０…ローダカセット，３２…アンローダ／ロー
ダ兼用カセット，３４…アンローダカセット，３６…イ
ンキュベータ，４０…自動希釈装置，４１…搬送系，４
２…ガイドレール，４３…駆動系，４４…分注器，４５
…使い捨てチップ，４６…チップ供給部，４７…偏心モ
ータ，４８…ベース，４９…架台，５０…自動蛍光測定
装置，５１…光源，５２…励起フィルタ，５３…ダイク
ロイックミラー，５４ａおよび５４ｂ…対物レンズ，５
５ａおよび５５ｂ…吸収フィルタ，５６ａおよび５６ｂ
…光電子増倍管，６０…プロセッサ，７０…外部記憶装
置，８０…コンソール，９０…マイクロプレート

フロントページの続き (72)発明者鈴木新平東京都千代田区大手町２丁目６番２号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者高地光一東京都千代田区大手町２丁目６番２号日立電子エンジニアリング株式会社内 (72)発明者遠藤勲埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者長棟輝行埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者浅間一埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者辨野義己埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (56)参考文献特開昭61−186854（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−21084（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−16586（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラブ−レムコ，プロテオースペプトンNo.
3，トリプチケース，酵母エキス，肝臓浸出液，ラフィ
ノース，塩類溶液Ａ，塩類溶液Ｂ，消泡剤，ツイーン８
０，Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ，プロピオン酸ナト
リウムおよびコリマイシンからなるビヒドバクテリウム
属菌用液体選択培地，肉エキス，ペプトン，カゼイン，乳糖，白糖，デオキシ
コール酸ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，クエン酸ナ
トリウム，クエン酸アンモニウムおよび精製水からなる
大腸菌用液体選択培地，肉エキス，プロテオーズペプトン，乳糖，白糖，サリシ
ン，胆汁酸塩，塩化ナトリウム，チオ硫酸ナトリウム，
クエン酸アンモニウム，デオキシコール酸ナトリウムお
よび精製水からなるサルモネラ菌用菌液体選択培地，酵母エキス，ペプトン，ケラチン，乳糖，マンニット，
塩化ナトリウム，リン酸２カリウム，塩化リチウム，フ
ェノールエチルアルコールおよび精製水からなる黄色ブ
ドウ状球菌用液体選択培地，プロテオーズペプトン，酵母エキス，肝臓エキス，塩化
ナトリウム，ヴァンコマイシン，ポリミキシンＢ，トリ
ムトブリム，セファロシン，アンフォテリシンＢおよび
精製水からなるキャンピロバクター用液体選択培地，お
よび、バクトポテトデキストロースブイヨン，１０％酒石酸お
よび精製水からなる酵母菌用液体選択培地，に微生物を接種して均一に混合し、該液体培地中の微生
物にピーク波長が３６６ｎｍの励起光を照射し、該微生
物自体がその生細胞内に有する補酵素から発せられる波
長４３０〜４９０ｎｍの蛍光の強度を測定し、次いで、
該液体選択培地中の微生物を培養し、増殖した微生物に
ピーク波長が３６６ｎｍの励起光を照射し、該微生物自
体がその生細胞内に有する補酵素から発せられる波長４
３０〜４９０ｎｍの蛍光の強度を測定し、培養前後の蛍
光強度の差を求め、得られた値から、前記液体選択培地
のうちの特定の選択培地で微生物が増殖したことを確認
することにより該特定選択培地に対応する微生物種を同
定し、それと共に、予め同じ微生物種について作成され
た生菌数と蛍光強度とに関するデータベースを検索・参
照することにより対応する生菌数を求めることからなる
生菌数測定方法。
【請求項２】ビヒドバクテリウム属菌用液体選択培地
は、ラブ−レムコ２．４ｇ／，プロテオースペプトン
No.3１０．０ｇ／，トリプチケース５ｇ／，酵母エ
キス５．０ｇ／，肝臓浸出液１５０ml／，ラフィノ
ース４ｇ／，塩類溶液Ａ１０ml／，塩類溶液Ｂ５ml
／，消泡剤５ml／，ツイーン８０１ｇ／，Ｌ−
システインＨＣｌ・Ｈ₂Ｏ０．５ｇ／，プロピオン酸
ナトリウム１５ｇ／およびコリマイシン（１０⁶単
位，１％）１２ml／からなり、大腸菌用液体選択培地は、肉エキス３．０ｇ／，ペプ
トン１０．０ｇ／，カゼイン５．０ｇ／，乳糖１
５．０ｇ／，白糖１０．０ｇ／，デオキシコール酸
ナトリウム１．０ｇ／，チオ硫酸ナトリウム２．５ｇ
／，クエン酸ナトリウム１．０ｇ／，クエン酸アン
モニウム１．０ｇ／および精製水１０００mlからな
り、サルモネラ菌用菌液体選択培地は、肉エキス３．０ｇ／
，プロテオーズペプトン１２．０ｇ／，乳糖１２．
０ｇ／，白糖１２．０ｇ／，サリシン２．０ｇ／
，胆汁酸塩１５．０ｇ／，塩化ナトリウム５．０ｇ
／，チオ硫酸ナトリウム６．８ｇ／，クエン酸アン
モニウム０．８ｇ／，デオキシコール酸ナトリウム
２．０ｇ／および精製水１０００mlからなり、黄色ブドウ状球菌用液体選択培地は、酵母エキス２．５
ｇ／，ペプトン１０．０ｇ／，ケラチン３０．０ｇ
／，乳糖２．０ｇ／，マンニット１０．０ｇ／，
塩化ナトリウム７５．０ｇ／，リン酸２カリウム５．
０ｇ／，塩化リチウム５．０ｇ／，フェノールエチ
ルアルコール２５ml／および精製水１０００mlからな
り、キャンピロバクター用液体選択培地は、プロテオーズペ
プトン１５．０ｇ／，酵母エキス５．０ｇ／，肝臓
エキス２．５ｇ／，塩化ナトリウム５．０ｇ／，ヴ
ァンコマイシン１０mg／，ポリミキシンＢ２５００単
位，トリムトブリム５mg／，セファロシン１５mg／
，アンフォテリシンＢ２mg／および精製水１０００
mlからなり、酵母菌用液体選択培地は、バクトポテトデキストロース
ブイヨン３９．０ｇ／，１０％酒石酸１４ml／およ
び精製水１０００mlからなることを特徴とする特許請求
の範囲第１項に記載の生菌数測定方法。