JPH06308109A - 親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックス、それらの製造およびバイオアフィニティー分離への使用 - Google Patents

親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックス、それらの製造およびバイオアフィニティー分離への使用

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JPH06308109A
JPH06308109A JP5333932A JP33393293A JPH06308109A JP H06308109 A JPH06308109 A JP H06308109A JP 5333932 A JP5333932 A JP 5333932A JP 33393293 A JP33393293 A JP 33393293A JP H06308109 A JPH06308109 A JP H06308109A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ポリビニルアルコールなどの架橋親水性ポリ
マーのコーティングを有するパーフルオロカーボンポリ
マーベースのマトリックスおよびかかる親水性ポリマー
被覆パーフルオロカーボンポリマーベースの支持体を用
いて製造される固体アフィニティー支持体およびそれら
のアフィニティー分離への使用方法。 【効果】 このアフィニティー支持体はアフィニティー
分離のために好ましく用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明は低い非特異的結合を示す不活性
固体支持体に関し、より詳細には、ポリビニルアルコー
ルなどの架橋親水性ポリマーのコーティングを有するパ
ーフルオロカーボンポリマーベースのマトリックスに関
する。かかる親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボン
ポリマーベースの支持体を用いて製造された固体アフィ
ニティー支持体、およびそれらのアフィニティー分離へ
の使用も提供される。
【０００２】
【背景技術】バイオテクノロジーにおける実験室および
プロセス操作例えば膜およびクロマトグラフィー分離は
しばしば宿主生物の自然環境に類似する条件下に行われ
なければならない。イオン強度、pHおよび温度はしばし
ば生体内（in-vivo）領域に類似するように選択され
る。生体分子の安定性を確実に最大のものとするため
に、プロセスおよび実験室の装置の露出表面は極めて極
性または親水性にして核酸および酵素を含むタンパク質
などの生体分子の不活性化および／または吸着を回避す
るようにすべきである。露出表面への吸着は、そのプロ
セスが不可逆性であり得るおよび／または生物学的活性
のロスを招き得ることから極めて望ましくない。
【０００３】湿潤剤例えば界面活性剤および水と混和し
得る有機溶媒は典型的には吸着を低下させるが、その効
果は一般的に一時的であり、特にその表面が空気に晒さ
れている場合にはそうである。さらに、溶液中にこれら
の剤が存在すると、発泡を招いたり、またタンパク質の
三次構造を乱すことにより生物学的活性にマイナスの影
響を与えることがある。
【０００４】疎水性吸着を避けるために、多くの実務家
は膜またはクロマトグラフィープロセスのための支持体
として親水性材料を選択する。この理由から、セルロー
ス、アクリルアミド、ポリエチレンイミンおよびアガロ
ースなどの材料が広く用いられている。これらの天然に
親水性である物質は望ましい低レベルの疎水性特性を有
しているものの他の面で欠陥がある。例えばこれらの親
水性物質の多くは水性溶液中に低いが有限の溶解度を示
す。このことは一般的に大量の水性液を利用する大抵の
生物学的プロセス操作における懸念である。かかる可溶
化は支持体マトリックスの物理的分解を招き、さらに支
持体マトリックスから遊離した異物により目的生成物を
汚染する可能性を生じる。治療剤中に汚染物質が存在す
ることは、発熱の原因になり得たりあるいは患者に予期
せざる免疫応答をひき起こすことがあることから、商業
的バイオテクノロジーにおける大きな懸念である。
【０００５】さらに、多くの親水性材料は限られた熱お
よび化学安定性も示すため、滅菌および内毒素除去のた
めの手順へのそれらの使用を妨げる。これに対し、最良
の熱的、生物学的および化学的抵抗性を有するマトリッ
クスは疎水性となる傾向がある。疎水性材料の典型例に
はポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、耐火ア
ルミナおよびガラスが含まれる。これらの材料は一般に
良好な熱および化学安定性を有するが、それらの表面へ
の生体分子の望ましくない吸着および非特異的結合が起
きるためにバイオテクノロジー操作への有用性は限られ
たものとなる。
【０００６】アフィニティー分離は一般に、リガンドま
たはバインダーで誘導体化された固体担体の使用を必要
とすると考えられている。アフィニティークロマトグラ
フィーは周知であり、そして例えば C. R. Lowe 著「An
Introduction to AffinityChromatography」, North h
olland Publishing Company, アムステルダム, ニュー
ヨーク, 1978，に総括されている。アフィニティークロ
マトグラフィーに適した支持体材料のリストは長大であ
り、ここで総括することはしない（リストの一部につい
ては Lowe，1978を参照されたい）。
【０００７】フルオロカーボンボリマーは吸着によりリ
ガンドが結合した担体として用いられている〔１９７４
年１０月２２日に Fishman に付与された米国特許第３,
８４３,４４３号；Rijsk Univ. (Groningen）により出
願されたＷＯ ８６０３ ８４０ Ａ；および Siergiej,
Dissertation Abstracts, It. B., 44巻, 153(198
3)〕。Sskagani ら〔１９８３年７月２０日に公開され
たＥＰ ０,０１１,５０４〕は、電着を用いてリガンド
をフルオロポリマーイオン交換膜に結合させることを開
示している。
【０００８】１９８９年１２月５日に Eveleigh に付与
された米国特許第４,８８５,２５０号は、パーフルオロ
カーボン−置換リガンドまたはバインダーをその表面に
結合させた不活性パーフルオロカーボンポリマー担体に
基づく固体支持体を開示している。１９９０年９月４日
に Eveleigh に付与された米国特許第４,９５４,４４４
号は、リガンドまたはリガンドのためのバインダーを高
度にフッ素化されたイソシアネート基を通してその表面
に結合した不活性パーフルオロカーボンポリマー担体に
基づく固体支持体を開示している。
【０００９】Hato ら（１９８６年１０月２３日に付与
された米国特許第４,６１９,８９７号）は、パーフルオ
ロアルキル界面活性剤を所定の深さまで浸透させること
により片側を親水性にしたフッ素樹脂膜への酵素固定を
開示している。このようにして得られた非対称官能性膜
を次いで酵素およびグルタルアルデヒドなどの架橋剤で
処理して酵素固定を完成させる。
【００１０】Zhujun et al., Analyt. Chem. vol 61, p
p. 202〜205 (1989）はグルタルアルデヒドを用いた光
ファイバー上の固定化ポリビニルアルコールの架橋を開
示している。Murakami (１９８９年２月８日に公開され
た特開昭６４−３８,４４８号）は、フルオロプラスチ
ックポリマーの細孔を親水性ポリマーで含浸させ次にそ
の親水性ポリマーを紫外線照射により架橋する方法を開
示している。
【００１１】Mcreath et al., J. of Chromatography,
597, pp. 189〜196, (1992）はトリアジン系色素である
カラーインデックスリアクティブブルー４で予め誘導体
化されたポリビニルアルコールに基づくポリマーフルオ
ロ界面活性剤と共に飽和パーフルオロカーボン油を均質
化することにより生成させた液状パーフルオロカーボン
乳濁液を開示している。非特異的結合が低く、そして膜
およびクロマトグラフィー分離など様々なバイオテクノ
ロジー操作に用いることができる湿潤性、親水性、不活
性固体パーフルオロカーボンポリマーベースの支持体が
必要とされている。
【００１２】
【発明の概要】従来技術の問題点の多くは本発明の支持
体マトリックスにより解決される。湿潤性親水性ポリマ
ー被覆パーフルオロカーボンをベースとするポリマーマ
トリックスを用いることの最大の長所は、そのパーフル
オロカーボン担体が不活性さおよび剛性を有しながら同
時に、リガンドやリガンドのためのバインダーなど生物
学的に興味ある物質の吸着および非特異的結合を最小に
抑える親水性表面を与えることに関係している。すなわ
ち、本発明の支持体マトリックスは、様々なバイオテク
ノロジー操作および装置例えば支持体または分離膜、ア
フィニティークロマトグラフィー支持体、イオン交換分
離および酵素または細胞性支持体などに用いるのに適し
ている。さらにまた、本発明の架橋親水性ポリマー被覆
パーフルオロカーボンポリマーをベースとするマトリッ
クスは生物学的分子の非特異的結合を最小に抑えるべく
単独使用することができ、あるいは生物学的に活性な分
子または他の生物学的に興味ある分子、例えばリガンド
またはリガンドのためのバインダーなどに共有結合的に
結合するように活性化させることができる。
【００１３】本発明は、（ａ） 化学的に不活性な固体
パーフルオロカーボンポリマー担体；および（ｂ） 前
記担体上の架橋親水性ポリマーコーティングより成る固
体親水性パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリ
ックスに関する。
【００１４】本発明のもう一つの観点は、 （ａ） 化学的に不活性な固体パーフルオロカーボンポ
リマー担体； （ｂ） 前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティン
グ；および （ｃ） 前記親水性ポリマーの表面に結合したリガンド
またはリガンドのためのバインダー より成るリガンドまたはリガンドのためのバインダーを
結合した固体アフィニティー支持体に関する。
【００１５】本発明のもう一つの観点は、（ａ） 親水
性ポリマーをパーフルオロカーボン担体の表面に吸着さ
せ；そして（ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋
剤を用いて架橋する段階より成る親水性パーフルオロカ
ーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法。
【００１６】さらにまた本発明は、 （ａ） 親水性ポリマーをパーフルオロカーボン担体の
表面に吸着させ； （ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて
架橋し； （ｃ） 架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボン
ベースのポリマーの表面を活性化してその表面へのリガ
ンドまたはリガンドのためのバインダーの結合が可能と
なるようにし；そして （ｄ） リガンドまたはリガンドのためのバインダーを
その活性化された親水性ポリマーの表面に結合させる段
階より成る結合したリガンドまたはリガンドのためのバ
インダーを含有する固体支持体の製造方法に関する。
【００１７】本発明のもう一つの観点は、 (Ａ)(ａ) 親水性ポリマーをパーフルオロカーボン担体
の表面に吸着させ； （ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて
架橋し； （ｃ） その架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカー
ボンベースのポリマーの表面を活性化してその表面への
リガンドまたはリガンドのためのバインダーの結合が可
能となるようにし；そして （ｄ） リガンドまたはリガンドのためのバインダーを
その活性化された親水性ポリマーの表面に結合させるこ
とにより固体アフィニティー支持体を形成し；そして （Ｂ） 前記固体アフィニティー支持体を用いて混合物
から前記担体に結合したリガンドまたはバインダーに対
し相補的なバインダーまたはバインダーのためのリガン
ドを捕獲する段階より成るバイオアフィニティー分離方
法に関する。
【００１８】さらに本発明は、 （ａ） 化学的に不活性な固体パーフルオロカーボンポ
リマー担体； （ｂ） 前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティン
グ；および （ｃ） その親水性ポリマーの表面に結合した酵素より
成る固定化酵素系に関する。
【００１９】
【発明の詳述】本発明は、親水性ポリマー例えばポリビ
ニルアルコールをパーフルオロカーボンポリマーベース
の担体上に被覆または吸着し、次いで二官能性架橋剤を
用いて架橋した場合、生成親水性コーティングは、様々
なバイオテクノロジー応用例、例えば膜使用バイオアフ
ィニティー分離およびアフィニティークロマトグラフィ
ー分離などに典型的に用いられる様々な洗浄段階および
その他の操作に耐え得る安定マトリックスを提供するの
に十分な強度であるという驚くべきかつ予想外の知見に
基づいている。本発明のマトリックスおよび支持体は水
性環境中で安定であり、また生物学的検体中のタンパク
質、核酸およびその他の成分の表面への非特異的結合は
低い。
【００２０】パーフルオロカーボンとはフッ素原子をそ
の構造中に可能な限り最大のあるいは比較的大きな割合
で含有する分子を意味する。パーフルオロカーボンポリ
マーは不活性であることが知られている。本発明の固体
アフィニティーマトリックスおよび支持体に用いること
のできるパーフルオロカーボンポリマーとしては例えば
様々なTeflonR フルオロカーボンポリマー、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリビニルフルオライドおよびポリ
ビニリデンジフルオライドなどが挙げられる。(TeflonR
は E. I. du Pont de Nemours and Company 社の登録
商標である）。
【００２１】親水性ポリマーとは、パーフルオロカーボ
ン担体上の架橋親水性ポリマーコーティングがバイオテ
クノロジー処理段階例えばアフィニティーおよび膜分離
に用いられる様々な洗浄段階に典型的に用いられる様々
な操作および操作条件に耐えるのに十分な強度および化
学的安定性を有するようにポリマー分子を隣接類似分子
を架橋（分子間架橋）するのに十分な多重度の水酸基を
有している、荷電されていない親水性、水溶性非環式ポ
リマーを意味する。好ましくは、親水性ポリマーは、１
ポリマー単位あたり６個毎の炭素原子に対して架橋に利
用できる少なくとも一つの水酸基例えば第一級または第
二級水酸基を有する。さらに、親水性ポリマーは好まし
くは、リガンドまたはリガンドのためのバインダーへの
結合に利用できる少なくとも一つの部位例えば末端水酸
基を有する。好ましくは、親水性ポリマーは１ポリマー
単位あたり３個又はそれより少ない炭素原子に対して一
つの水酸基を有する直鎖状親水性ポリマーである。約
８,０００〜約１５,０００の分子量を有するポリビニル
アルコールが特に好ましい。親水性ポリマーとして有用
でないポリマーにはアガロース、デキストラン、ポリエ
チレングリコール、ポリエチレンイミンおよびスターチ
が含まれる。親水性ポリマーに用いることのできる分子
量範囲は１０００から水に不溶性となるところ、一般に
約２０,０００までである。
【００２２】ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）は、本発
明のマトリックスおよび支持体の製造に用いられるパー
フルオロカーボン担体に対するコーティングとして使用
できる好ましい親水性ポリマーである。ポリビニルアル
コールは −〔ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)〕n− （式中、ｎは反復ポリマー単位数である）で示される反
復ポリマー構造に基づく。
【００２３】二官能性架橋剤とは、親水性ポリマーの水
酸基と共有結合的に結合して親水性ポリマー分子の分子
間架橋を行うことができる部位を有する化合物を意味す
る。例えば、水酸基と反応できる部位には、−ＣＯＣ
ｌ、ＣＯＢｒ、−ＮＣＯおよびＣＨＯが包含される。二
官能性とは架橋剤上に親水性ポリマーの水酸基と反応で
きる二つの部位が存在することを意味する。ホモ二官能
性架橋剤の場合、架橋剤上の親水性ポリマーのヒドロキ
シル基と反応できる二つの部位は同じである。水酸基と
反応できるかかる架橋剤は周知である（例えば１９７８
年７月１８日に Rubinstein らに付与された米国特許第
４,１０１,３８０号を参照されたい。その開示を引用に
より本明細書の記載に含める）。ＰＶＡをそれ自身に架
橋するのに使用できる適切な架橋剤にはジアルデヒド例
えばグルタルアルデヒド、およびジイソシアネート例え
ばトルエンジイソシアネートなどが包含される。ホモ二
官能性架橋剤が好ましく、またジアルデヒドはＰＶＡに
対する好ましい架橋剤である。
【００２４】本発明の親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンベースのポリマーマトリックスはリガンドまた
はリガンドのためのバインダーを表面に結合した固体ア
フィニティー支持体の製造に用いることができ、またか
かる支持体はアフィニティー分離を行うのに有用であ
る。リガンドとは抗原、ハプテン、核酸、酵素基質、ビ
タミン、色素または酵素エフェクターおよびインヒビタ
ーを含む他の小有機分子を意味し、またバインダーと
は、抗体、酵素、核酸、結合性タンパク質、結合性タン
パク質の合成擬似物質例えばポリリジンおよびポリエチ
レンイミン類あるいは特異結合、酵素／基質等の相互作
用が可能なその他の生体分子を意味する。
【００２５】本発明の親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンポリマーベースのマトリックスの製造方法は、
親水性ポリマーをパーフルオロカーボン担体の表面に吸
着または被覆することより成る。好ましくは、パーフル
オロカーボン担体をまず、水と混和し得る有機溶媒例え
ばアセトンまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で湿潤
させる。これは１９９２年１０月２７日に付与された米
国特許第５,１５８,８８０号に記載されている。親水性
ポリマー例えばポリビニルアルコールを次に前記担体を
被覆するのに十分な量で担体と混合し、そして調節され
た時間、温度およびpH条件下に吸着を進行させる。次に
架橋剤を添加して親水性ポリマーを同様の分子と架橋さ
せる。好ましくは、ジアルデヒド例えばテレフタルデヒ
ドを用いて好ましい親水性ポリマーであるポリビニルア
ルコールを架橋する。一般に架橋反応は調節された時
間、温度およびpH条件下に進行させる。架橋剤の使用お
よびそれらの使用に適した反応条件は当該技術分野にお
いて周知である（例えば１９７８年７月１８日に Rubin
stein らに付与された米国特許第４,１０１,３８０号を
参照されたい。その開示を引用により本発明の記載に含
める）。
【００２６】固体アフィニティー支持体は、活性化後の
表面がリガンドまたはリガンドのためのバインダーを共
有結合的に結合できるように、マトリックスの親水性表
面を調節された時間、温度およびpH条件下に活性化する
ことによって形成することができる。かかる活性化方法
は当該技術分野において周知である。かかる活性化方法
の例が Stewart, D. J., Immobilization of Triazine
Dyes On Inert Hydrophobic Supports For Affinity Ch
romatography, Thesis for the degree of Doctor of P
hilosophy, University of Cambridge, Kings College
(1989）（その開示を引用により本明細書の記載に含め
る）に記載されている。活性化により、リガンドまたは
リガンドのためのバインダー上のいずれかの部位例えば
タンパク質の−ＮＨ2または−ＣＯＯＨを親水性ポリマ
ーコーティングの水酸基、好ましくは末端水酸基を介し
て共有結合的に結合させることができる。好ましい親水
性ポリマーであるＰＶＡを用いる場合、ＰＶＡはシアヌ
ル酸クロライドの添加により活性化させることができ
る。
【００２７】活性化の後、リガンドまたはリガンドのた
めのバインダーを固体親水性ポリマー被覆パーフルオロ
カーボンベースのポリマーマトリックスに結合して、共
有結合的結合により固体アフィニティー支持体を形成す
る。リガンドまたはリガンドのためのバインダーを適切
に活性化された支持体に共有結合的に結合させるための
手段、およびかかる共有結合的結合を至適化するための
手段は当該技術分野において知られている。例えばリガ
ンドを共有結合的に結合させるための様々な方法が Ste
wart, D. J., Immobilization of Triazine Dyes On In
ert Hydrophobic Supports For Affinity Chromatograp
hy, thesis for the degree of Doctorof Philosophy,
University of Cambridge, Kings College (1989）（そ
の開示を引用により本明細書の記載に含める）記載され
ている。
【００２８】本発明の固体親水性被覆パーフルオロカー
ボンポリマーベースのマトリックスは広範な様々な応用
分野に用いることができる。例えばマトリックスは、パ
ーフルオロカーボンベースポリマー電子回路ボード用の
基体として用いることができる。パーフルオロカーボン
ベースのポリマーは親水性ポリマー例えばＰＶＡで被覆
することができ、そして様々な伝導性材料例えば金属を
その表面に沈着させるように処理することができる。一
応用例においては、ホトレジストで予め処理されそして
紫外光に晒されたパーフルオロカーボンポリマーベース
の支持体上にＰＶＡを吸着させることができ、それによ
って所望の電気系路を規定する。そのＰＶＡ被覆パーフ
ルオロカーボンマトリックスは溶解硝酸銀の溶液（硝酸
銀は希アンモニアの添加により溶解させることができ
る）に浸漬し、そして銀が支持体に沈着するまで数滴の
還元剤例えばホルムアルデヒドを添加することができ
る。さらに、本発明のマトリックスは、湿潤性ポリマー
フィルムまたは粉末として様々な応用に用いることがで
きる。さらに本発明のマトリックスは有色色素適用のた
めの基体としてあるいは上にプリントできる基体として
用いることもできる。
【００２９】本発明の支持体はイムノアッセイにも用い
ることができる。そのようなアッセイの一つは定性的酵
素連結免疫収着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、その
場合色は濾紙表面またはその他の表面上で視覚的に検出
することができる。色以外の検出可能なシグナルも用い
ることができる。
【００３０】もう一つの応用例は、親水性ポリマー被覆
固体パーフルオロカーボンベースのポリマーマトリック
ス上に酵素を固定することによる固定化酵素系例えば酵
素電極などの構築と用途である。この応用例において酵
素は、電気化学的ガスセンサーのパーフルオロカーボン
膜に結合させることができる。酵素は、電気化学的にモ
ニターすることができる生成物を生産しまたは同時反応
成分を消費する反応を触媒するように選択される。電気
化学的シグナルは被検体濃度の尺度となる。この応用例
では、酵素はバインダーとして働き、そして標的被検体
はリガンドとして働く。
【００３１】
【実施例】
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）のフルオロポリマー粒
子への吸着 １００ｇのパーフルオロカーボンポリマー粒子（６〜８
ｍ2／ｇ、平均粒度７０ミクロン、デラウエア州ウイル
ミントンの E. I. du Pont de Nemours and Company 社
より入手）を５００mlのテトラヒドロフラン中で一夜撹
拌し、次いで焼結ガラス（等級２）フィルター上、５０
０mlのアセトン中で洗浄した。残留アセトンを、粒子が
依然としてアセトンで湿潤しかつ空気には晒されないよ
うにして、重力下に排液した。得られた半透明材料を
０.７mMポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（分子量１４,
０００、１００％加水分解）（Aldrich Co., Gillingha
m,Dorset, 英国）の水性撹拌溶液に添加し、そしてその
ＰＶＡを２０℃で５時間吸着させた後５０mlの７０mM水
性テレフタルデヒド(Aldrich, Gillingham, Dorset，英
国）を添加した。その混合物を２０mlの５Ｍ ＨＣｌの
添加により酸性化し、そして４時間の架橋処理後、その
材料を沈殿させそして上清を傾瀉除去した。得られた架
橋ポリビニルアルコール被覆パーフルオロカーボンポリ
マーマトリックスを焼結ガラスフィルター上で、２リッ
トルの水、２リットルの６０℃の熱水、および２リット
ルの蒸留水で順次洗浄した。
【００３２】支持体に吸着したＰＶＡ量は Zwick, M.
M., J. Appl. Polm. Sci., 9, p. 2393 (1965)（その開
示を引用により本明細書の開示に含める）に記載された
特異的ＰＶＡアッセイを用いた上清の差分析により測定
した。それは１ｇのパーフルオロカーボン担体あたり約
２０mgのＰＶＡであることがわかった。
【００３３】架橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリ
マーベースのマトリックスの活性化と活性化方法の至適
化 パーフルオロカーボン担体１ｇあたり２０mgのＰＶＡを
有し、そして前述の如く製造された０.５ｇの架橋ＰＶ
Ａ被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリッ
クスの試料を０.０、０.１、０.５、１.０、２.０、３.
０、４.０および５.０Ｍの一連の水性水酸化ナトリウム
（ＮａＯＨ）溶液に１時間インキュベートした。得られ
た材料を次に焼結ガラスフィルターを用いて濾過しそし
てアセトン中の２０mMシアヌル酸クロライド（Aldrich
社, Gillingham, Dorset, 英国）５mlに２０℃で１０分
間添加した。得られた活性化された材料を空気への曝露
を避けながらアセトン、アセトン／水（５０：５０ ｖ
／ｖ）および水で順次洗浄した後、カップリングされた
反応性基を評価した。活性化度（μｍＣｌ-／ｇ（活性
化材料））は、０.１ｇの反応性材料を３mlの０.１Ｍ
ＮａＯＨ中、２０℃で１時間加水分解しそして遊離クロ
ライドイオンを Vogel, A. I., Textbookof Quantitati
ve Inorganic Analysis, 1978, Longman Inc., N.Y., p
p. 754（その開示を引用により本明細書の記載に含め
る）に記載された方法を用いてアッセイすることにより
測定した。活性化の結果、ＰＶＡの一部の第二級水酸基
がシアヌル酸クロライドと結合した。
【００３４】図１は、予備洗浄におけるＮａＯＨ濃度を
１Ｍとすることが反応性シアヌル酸クロライド基をマト
リックスに導入するのに至適であることを示すグラフで
ある。アルカリ濃度がそれより高いと、より強力な塩基
がカップリングしたシアヌル酸クロライドを加水分解し
てしまうかまたはＰＶＡコーティングの架橋をさらに進
めてしまうために、活性化材料の反応性が低下した。逆
に、より低い濃度のＮａＯＨを用いると、吸着剤上のシ
アヌル酸クロライドの加水分解が低下し、そのために可
能性としての非特異的吸着部位の導入が最小に抑えられ
た。
【００３５】２０mg（ＰＶＡ）／ｇ（パーフルオロカー
ボン担体）を有しそして前述の如く製造された５ｇの架
橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマ
トリックスを５０mlの１Ｍ水性水酸化ナトリウム（Ｎａ
ＯＨ）中で１時間インキュベートした。次に、得られた
材料を焼結ガラスフィルターを用いて濾過しそしてその
材料の０.５ｇ試料をアセトン中に０.０〜０.１シアヌ
ル酸クロライドを含有する一連の５mlの水性溶液に２０
℃で１０分間添加した。シアヌル酸の使用濃度は図２で
グラフにより示す。得られる活性化された材料を、空気
への曝露を避けながら、アセトン、アセトン／水（５
０：５０ ｖ／ｖ）および水で順次洗浄した後カップリ
ングした反応性基数を評価した。活性化度（μｍＣｌ-
／ｇ（活性化材料））は前述の如く測定した。
【００３６】図２は、１Ｍ ＮａＯＨを至適予備洗浄条
件として用いながらシアヌル酸クロライド濃度を高める
ことの材料の反応性に及ぼす効果を示すグラフである。
活性化度は、約７０μｍＣｌ-／ｇで準プラトーになる
まで直線的に増加したところ、このことは支持体の反応
性レベルを容易に調節し得ることを実証している。１０
mM濃度のシアヌル酸クロライドは、２０μｍＣｌ-／ｇ
（材料）を含有する支持体を生成した。前述の条件下で
は、活性化反応は極めて速やかで、アルカリ性支持体を
シアヌル酸クロライドに添加してから数分内に活性化は
最大となる。
【００３７】図３は、様々な条件下における活性化材料
の安定性を示すグラフである。前述の如く製造された２
０μｍＣｌ-／ｇ（活性化材料）の反応性材料１ｇを三
つの異なる条件、すなわち０.１Ｍ ＮａＯＨ中、０.１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７.０）中、および０.１
Ｍ酢酸中に２０℃で貯蔵した。カップリングされた反応
性基は０.１Ｍ ＮａＯＨ中でただちに加水分解されたが
０.１Ｍ酢酸および０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH
７.０）中では１週間までそれらの反応性の少なくとも
半分を保持した。前述の如く製造された活性化材料の試
料を１０％（ｖ／ｖ）酢酸中で凍結乾燥した後４℃で保
存したところ、３ケ月間保存後も反応性の明白なロスは
みられなかった（前述の手順を用いて測定）。
【００３８】ＨＳＡ、ＩｇＧおよびコンカナバリンＡを
表面に結合したアフィニティー支持体の製造 タンパク質測定アッセイ 前述の如く製造されそして２０μmolＣｌ-／ｇ（活性化
材料）を含有する活性化材料または０.２ｇの加水分解
された材料を０.１Ｍホスフェート緩衝液（pH７.０）中
のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Cohn Fraction V, S
igma Co. 社，Poole, Dorset）（４mg／２ml）に添加し
た。１時間後にカップリング反応を止め、そして固定化
されたＨＳＡの量を分光光度測定的に差により測定し
た。
【００３９】タンパク質の量は、タンパク質溶液の適切
な連続希釈液(２０μｌ）に PierceCoomassie タンパク
質アッセイ試薬（１.０ml）（Pierce社, Luton, Beds,
英国）を添加して測定した。混合しそして室温で１０分
間放置した後、５９５nmでの吸光度を測定した。ヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）（ＰＭＬＳ（Porton Down, Wiltshire, 英国）より
寄贈）およびコンカナバリンＡ（ConＡ）についての標
準曲線を作成した。原液中のタンパク質濃度は、Ａ２８
０nm １％（ｗ／ｖ）をＨＳＡ、ＩｇＧおよびConＡにつ
いてそれぞれ５.８、１４.７（Nakamura, K., Hashimot
o, T., Kato, Y., Shimuran, K. および Kasai, K. -
I., J. Chromatogr., 510 (1990) 101.）および１.１
（Borchert, A., Larsson, P.-O. および Mosbach, K.,
J. Chromatogr., vol. 244, 1982,p. 49.）と推定して
２８０nmでの吸光度によりまず測定した。またＡ２７５
nm１％（ｗ／ｖ）はプロティンＡについては１.６５で
あった（Langone, J. J., Adv. Immunol., vol. 32, 19
82, 157）。
【００４０】図４は、様々なpH値におけるヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）の活性化支持体へのカップリングを示
すグラフである。ＨＳＡの固定化はpH５で最大（８mg／
ｇ）となる一方、それより高いpH値では、多分、ＨＳＡ
の溶解度が高くなるために、あるいは反応性シアヌル酸
クロライド基が加溶媒分解されるために、固定化される
タンパク質は減少する。前述の如く製造されたが０.１
Ｍエタノールアミンを用いてpH９.０、２０℃で一夜加
水分解されたシアヌル酸クロライド活性化材料である対
照材料に対しては固定化されるタンパク質は顕著に減少
し、また本明細書中にすでに記載した如く製造された架
橋ＰＶＡ被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマ
トリックスに対しては一段と低下した。
【００４１】図５は、ＩｇＧを４〜１１のpH値でカップ
リングした場合の同様の試験の結果を示すグラフであ
る。ＨＳＡのカップリングについて既述したのと同じカ
ップリング条件を用いた。５〜８のpH範囲において１０
mg（ＩｇＧ）／ｇ（材料）という広い至適容量が得られ
た。しかしながらより高いpH値におけるＩｇＧの固定化
には、特にＨＳＡと比較すると、多分、加溶媒分解に先
立ち反応性支持体との相互作用を促進するタンパク質溶
解度の減少が関係した。ＨＳＡについて前述したのと同
じ条件下にエタノールアミンを用いて加水分解するとカ
ップリングされるＩｇＧ量は減少したが、本明細書中に
既述された如く製造されたＰＶＡ被覆パーフルオロカー
ボンポリマーベースのマトリックスに対するタンパク質
吸着についてみられる極めて低いレベルまでの減少では
なかった。
【００４２】図６は、pH５.０および２０℃では添加ア
ルブミンの約６０％が５〜１０分内に活性化支持体にカ
ップリングされ２時間後に固定化が最大となることを示
すグラフである。０.２ｇ量の活性化材料を０.１Ｍアセ
テート緩衝液（pH５.０）中のＨＳＡ（４mg／２ml）試
料に別々に添加した。時間間隔をおいてカップリングを
止め、そして固定化または結合ＨＳＡ量を上清のアッセ
イにより測定した。シアヌル酸クロライド基の高い反応
性は、水性媒質中および生理学的pHでの支持体に対する
生化学物質の速かな固定化を助長する。
【００４３】図７は、ＨＳＡ、ＩｇＧおよびコンカナバ
リンＡはすべて類似した等温線（isotherm）を示し（濃
度が漸増する２ml溶液を０.１Ｍアセテート緩衝液（pH
５.０）中で２時間シアヌル酸活性化材料（０.２ｇ、２
０μmolＣｌ-／ｇ）と共にインキュベートした）、約８
〜１０mg／ｇ（活性材料）の至適カップリング、および
比較的低いタンパク質濃度でさえ約８０％のカップリン
グ収率を与えることを示すグラフである。それらタンパ
ク質のすべてを、タンパク質吸着に特徴的な数値である
約１.４mg／ｍ2の表面被覆率で固定化した（例えば And
rade,J. D. および Hlady, V., Adv. Polym. Sci., vo
l. 79, 1986, 12参照）。この観察は、カップリングさ
れたタンパク質が表面に密に充填された単層を形成する
ことを示唆しているが、一般に、アフィニティー分子を
結合する際に伴う可能性としての立体障害を緩和するた
めに高密度充填は避けるべきである。この、最大量のタ
ンパク質固定の達成は効率的アフィニティー吸着剤の生
産にはつながらないこともあり、その場合、至適タンパ
ク質表面密度を実験的に決定する必要があり得る。
【００４４】コンカナバリンＡ固体アフィニティー支持
体での西洋ワサビペルオキシダーゼのクロマトグラフィ
ー分離 下記の如く製造された固体アフィニティー支持体を適切
な緩和液中で平衡させ、５ml／分の流速で Pharmacia
ＨＲ ５／１０カラムに充填し、そしてＰ５００ポン
プ、ＬＣＣ ５００プラスコントローラー、ＵＶ−Ｉシ
ングルパス（path）モニターおよびＬＫＢ ２２１２ He
lirac フラクションコレクターより成る Pharmacia Ｆ
ＰＬＣ系と共に用いた。
【００４５】コンカナバリンＡ（レクチン）を活性化材
料にカップリングし、そしてそれらの西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）精製能をテストした。コンカナバ
リンＡアフィニティー支持体は、０.５Ｍアセテート、
０.５Ｍ ＮａＣｌ、１mM ＣａＣｌ2、１mM ＭｎＣｌ2、
pH５.１（カップリング緩衝液）中で、α−メチル−Ｄ
−グルコピラノシド（Sigma社，Poole, Dorset, 英国）
の存在下にレクチンを２時間カップリングすることによ
り製造した。使用する前にその材料をカップリング緩衝
液で洗浄し、そして０.１Ｍエタノールアミン、pH９.０
中、４℃で４８時間撹拌した。
【００４６】コンカナバリンＡアフィニティー支持体
は、０.０５Ｍアセテート、０.５ＭＮａＣｌ、１mM Ｃ
ａＣｌ2、１mM ＭｎＣｌ2、pH５.１中でα−メチル−Ｄ
−グルコピラノシドの存在下にレクチンを２時間カップ
リングすることにより合成した。使用する前にその材料
をカップリング緩衝液で洗浄し、そして０.１Ｍエタノ
ールアミン、pH９.０中で４℃で４８時間撹拌した。
【００４７】粗製西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）（Sigma社，Poole，Dorset，英国）調製物をコンカ
ナバリンＡアフィニティー支持体に適用し（図８Ａ）、
そして未結合タンパク質を洗浄除去した後、吸着ＨＲＰ
を競合グリコピラノシドを用いて特異的に溶出された。
２.２の溶出フラクションのＲＺ比（４０５nmでの吸光
度／２８０nmでの吸光度）は、８０％総括回収率をもっ
て、粗製材料の純度の５.６倍に相当した。
【００４８】図８に関し、使用されたカラムは、０.５
×１０cmであって、３.６mg（コンカナバリンＡ）／ｇ
（支持体）および７０μｍパーフルオロカーボン担体を
含有した。カラム条件は次のとおりであった：移動相
０.０５Ｍアセテート、０.５ＭＮａＣｌ、 １mM ＣａＣ
ｌ2、（ＦＳＡ、Loughborough, Leics, 英国）、１mM
ＭｎＣｌ2、pH５.１；流速：１ml／分；試料は１分時点
で１mlの粗製ＨＲＰ（５mg／ml）を注入した；溶出緩衝
液：移動相（３ml）中の２５mMアルファ−メチル−Ｄ−
グルコピラノシドは５分時点で注入した；フラクション
（１ml）を２８０nmおよび４０５nmでアッセイした。
【００４９】プロティンＡ固体アフィニティー支持体で
のヒトＩｇＧのクロマトグラフィー分離 前述のカップリング法を用いてプロティンＡ（黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus）コワン（Cowan）株の
細胞壁から精製、Sigma Co. 社, Poole, Dorset，英
国）を４.６μmolＣｌ-／ｇ（活性化マトリックス）を
有するシアヌル酸クロライド活性化パーフルオロカーボ
ンポリマーベースの活性化マトリックスにカップリング
した。過剰の反応性基をエタノールアミンで不活性化し
た後、（theNational Blood Transfusion Center (英国
Nottingham）において既知の供血者から入手した）血
漿をゲルに適用してＩｇＧを精製した（図９Ａ）。０.
１Ｍクエン酸塩（pH３.０）で溶出されたフラクション
は０.９mgのＩｇＧを含有し、他の支持体と等価なキャ
パシティーを示した（例えば Fuglistaller, J. Immuno
l.Meth., vol. 124, 1989, p. 171参照）。ＩｇＧの純
製試料を適用した場合も、アフィニティー８０％のアフ
ィニティー吸着タンパク質回収率で同様のキャパシティ
ーを示した。
【００５０】図９に関し、使用したカラムは０.５×１
０cmであり、０.７mg（プロティンＡ）／ｇ（支持体）
および７０μｍパーフルオロカーボン担体を含有した。
カラム条件は次のとおりであった：移動相０.１Ｍ Ｎａ
2ＨＰＯ4緩衝液pH８.０；流速：２ml／分；試料は１分
時点で１mlのヒト血漿を注入した；溶出緩衝液：０.１
Ｍクエン酸塩（pH３.０）（３ml）を６分時点で注入し
た；（２ml）フラクションを２８０nmでアッセイした。
【００５１】本発明の新しい特徴および本発明それ自体
は、その構成および操作方法の両方に関し、発明の詳細
な説明を添付図面と伴せ読むとき最良に理解されよう。
添付図面中同じ符号は同じ部分を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】シアヌル酸クロライドを架橋ポリビニルアルコ
ール被覆パーフルオロカーボンポリマーベースのマトリ
ックスに導入する際の予備洗浄におけるＮａＯＨの効果
を示すグラフである。
【図２】架橋ポリビニルアルコール被覆パーフルオロカ
ーボンポリマーベースのマトリックスの活性化に対する
シアヌル酸クロライド濃度の効果を示すグラフである。
【図３】三つの異なる条件すなわち０.１Ｍ ＮａＯＨ
（丸）、０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７.０）
（三角）および０.１Ｍ酢酸（四角）中の活性化架橋ポ
リビニルアルコール被覆パーフルオロカーボンポリマー
ベースの材料の保存効果を示すグラフである。
【図４】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのヒト血清
アルブミン（ＨＳＡ）の結合に対するpHの効果を示すグ
ラフである。図示されているのは次のとおりである：活
性化支持体（円）、０.１Ｍエタノールアミンで加水分
解された活性化支持体（三角）、および架橋ポリビニル
アルコール被覆パーフルオロカーボンポリマーベースの
マトリックス（ダイヤ）。
【図５】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのヒトＩｇ
Ｇの結合に対するpHの効果を示すグラフである。図示さ
れているのは次のとおりである：活性化支持体（円）、
０.１Ｍエタノールアミンで加水分解された活性化支持
体（三角）、および架橋ポリビニルアルコール被覆パー
フルオロカーボンポリマーベースのマトリックス（ダイ
ヤ）。
【図６】活性化架橋ポリビニルアルコール被覆パーフル
オロカーボンポリマーベースの材料の表面へのＨＳＡの
結合についての経時変化を示すグラフである。
【図７】ＨＳＡ（丸）、ＩｇＧ（三角）およびコンカナ
バリンＡ（四角）を活性化架橋ポリビニルアルコール被
覆パーフルオロカーボンポリマーベースの材料にカップ
リングするための等温線を示すグラフである。
【図８】コンカナバリンＡ固体アフィニティー支持体を
用いた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の精製を
示すグラフである。
【図９】プロティンＡ固体アフィニティー支持体を用い
たヒト血漿からのＩｇＧの精製を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリストフアー・ロビン・ロウ イギリス国シー・ビー10 ２ピー・ダブリ ユー．サフランウオールデン．ヘンプステ ツド．ザライムズ（番地なし) (72)発明者 イーアン・ピツトフイールド イギリス国ドーセツト．フオレストロード 18 (72)発明者 ダンカン・ロス・パービス イギリス国ケンブリツジシヤー州フロービ シヤークロウス22

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ） 化学的に不活性な固体パーフル
    オロカーボンポリマー担体；および （ｂ） 前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティング
    より成る固体親水性パーフルオロカーボンポリマーベー
    スのマトリックス。
  2. 【請求項２】 担体がポリテトラフルオロエチレン、ポ
    リビニルフルオライドおよびポリビニリデンジフルオラ
    イドより成る群より選択される請求項１記載のマトリッ
    クス。
  3. 【請求項３】 親水性ポリマーがポリビニルアルコール
    である請求項１記載のマトリックス。
  4. 【請求項４】 （ａ） 化学的に不活性な固体パーフル
    オロカーボンポリマー担体； （ｂ） 前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティン
    グ；および （ｃ） 前記親水性ポリマーの表面に結合したリガンド
    またはリガンドのためのバインダーより成るリガンドま
    たはリガンドのためのバインダーを結合した固体アフィ
    ニティー支持体。
  5. 【請求項５】 前記リガンドが核酸、ビタミンおよび色
    素より成る群より選択される請求項４記載の支持体。
  6. 【請求項６】 親水性ポリマーがポリビニルアルコール
    である請求項４記載の支持体。
  7. 【請求項７】 前記リガンドのためのバインダーが担
    体、酵素および核酸より成る群より選択される請求項４
    記載の支持体。
  8. 【請求項８】 担体がポリテトラフルオロエチレン、ポ
    リビニルフルオライドおよびポリビニリデンジフルオラ
    イドより成る群より選択される請求項４記載の支持体。
  9. 【請求項９】 （ａ） 親水性ポリマーをパーフルオロ
    カーボン担体の表面に吸着させ；そして （ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて
    架橋する段階より成る親水性パーフルオロカーボンポリ
    マーベースのマトリックスの製造方法。
  10. 【請求項１０】 架橋剤がジアルデヒドおよびジイソシ
    アネートより成る群より選択される請求項９記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 （ａ） 親水性ポリマーをパーフルオ
    ロカーボン担体の表面に吸着させ； （ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて
    架橋し； （ｃ） 架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカーボン
    ベースのポリマーの表面を活性化してその表面へのリガ
    ンドまたはリガンドのためのバインダーの結合が可能と
    なるようにし；そして （ｄ） リガンドまたはリガンドのためのバインダーを
    その活性化された親水性ポリマーの表面に結合させる段
    階より成る結合したリガンドまたはリガンドのためのバ
    インダーを含有する固体支持体の製造方法。
  12. 【請求項１２】 親水性ポリマーがポリビニルアルコー
    ルである請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 (Ａ)(ａ) 親水性ポリマーをパーフル
    オロカーボン担体の表面に吸着させ； （ｂ） 前記親水性ポリマーを二官能性架橋剤を用いて
    架橋し； （ｃ） その架橋親水性ポリマー被覆パーフルオロカー
    ボンベースのポリマーの表面を活性化してその表面への
    リガンドまたはリガンドのためのバインダーの結合が可
    能となるようにし；そして （ｄ） リガンドまたはリガンドのためのバインダーを
    その活性化された親水性ポリマーの表面に結合させるこ
    とにより固体アフィニティー支持体を形成し；そして （Ｂ） 前記固体アフィニティー支持体を用いて混合物
    から前記担体に結合したリガンドまたはバインダーに対
    し相補的なバインダーまたはバインダーのためのリガン
    ドを捕獲する段階より成るバイオアフィニティー分離方
    法。
  14. 【請求項１４】 前記リガンドが核酸、ビタミンおよび
    色素より成る群より選択される請求項１１または１３記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記リガンドのためのバインダーが抗
    体、酵素および核酸より成る群より選択される請求項１
    １または１３記載の方法。
  16. 【請求項１６】 （ａ） 化学的に不活性な固体パーフ
    ルオロカーボンポリマー担体； （ｂ） 前記担体上の架橋親水性ポリマーコーティン
    グ；および （ｃ） その親水性ポリマーの表面に結合した酵素より
    成る固定化酵素系。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009523239A (ja) * 2006-01-13 2009-06-18 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド ウイルス粒子／ウイルス抗原の濃度を測定する方法
JP2018524167A (ja) * 2015-07-20 2018-08-30 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティドＷ．Ｌ． Ｇｏｒｅ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ アフィニティークロマトグラフィー装置

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5874165A (en) * 1996-06-03 1999-02-23 Gore Enterprise Holdings, Inc. Materials and method for the immobilization of bioactive species onto polymeric subtrates
US5914182A (en) * 1996-06-03 1999-06-22 Gore Hybrid Technologies, Inc. Materials and methods for the immobilization of bioactive species onto polymeric substrates
GB0028879D0 (en) * 2000-11-27 2001-01-10 Prometic Biosciences Ltd Adsorbents and their use
ES2545526T3 (es) 2001-02-01 2015-09-11 Sigma-Aldrich Co. Llc Matrices de afinidad mejorada con visibilidad mejorada para aplicaciones de arrastre molecular e inmunoprecipitación
US6551643B2 (en) 2001-05-22 2003-04-22 Wm. Wrigley Jr. Company Process and apparatus for producing miniature gum ball centers using an underwater pelletizer
US7179506B2 (en) * 2001-08-24 2007-02-20 Mount Holyoke College Surface modification of solid phase objects by poly(vinyl alcohol)
AU2002343100A1 (en) * 2001-11-27 2003-06-10 Prometic Biosciences Ltd. The use of metal-chelating adsorbents
GB0211805D0 (en) * 2002-05-22 2002-07-03 Prometic Biosciences Ltd Endotoxin-binding ligands and their use
US7629016B2 (en) * 2002-06-10 2009-12-08 Council of Industrial and Scientific Research Process for photochemical activation of polymer surface and immobilization of biomolecules onto the activated surface
WO2004041428A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Nexttec Gmbh Sorbent material having a covalently attached perfluorinated surface with functional groups
JP4637533B2 (ja) * 2004-08-31 2011-02-23 信和化工株式会社 固相抽出用分離剤
US7494511B2 (en) * 2006-05-08 2009-02-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company Hydrophilic stain release agents
US20090151241A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-18 Dressler Lawrence V Method for producing algae in photobioreactor
EP2090361A1 (en) * 2008-02-14 2009-08-19 RESQ Lab B.V. Improved chromatography resin, and methods and devices related thereto.
US8197857B2 (en) * 2008-06-06 2012-06-12 Dressler Lawrence V Method for eliminating carbon dioxide from waste gases
AU2014226126B2 (en) 2013-03-08 2019-02-14 Genzyme Corporation Continuous purification of therapeutic proteins
TWI709570B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析法及製法
TWI709569B (zh) 2014-01-17 2020-11-11 美商健臻公司 無菌層析樹脂及其用於製造方法的用途
JP7699537B2 (ja) 2018-08-31 2025-06-27 ジェンザイム・コーポレーション 無菌クロマトグラフィー樹脂および製造方法におけるその使用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3843443A (en) * 1973-03-30 1974-10-22 J Fishman Polypeptide materials bound to fluorocarbon polymers
GB1538810A (en) * 1976-08-10 1979-01-24 Sumitomo Electric Industries Hydrophilic porous fluorocarbon structures and process for their production
US4229537A (en) * 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
JPS5569298A (en) * 1978-11-17 1980-05-24 Kureha Chem Ind Co Ltd Electrodeposition method of protein
JPS56115727A (en) * 1980-02-19 1981-09-11 Kuraray Co Ltd Carrier for immobilizing physiologically active substance
JPS5968344A (ja) * 1982-10-12 1984-04-18 Agency Of Ind Science & Technol 非対称機能膜及びその製法
US4693985A (en) * 1984-08-21 1987-09-15 Pall Corporation Methods of concentrating ligands and active membranes used therefor
US4778767A (en) * 1984-12-17 1988-10-18 Akzo N.V. Solid phase immunoassay using immunoreagents immobilized on inert synthetic resin surfaces
US5144013A (en) * 1986-09-24 1992-09-01 Ube Industries, Ltd. Body fluid purifying material and method for purifying body fluid by use thereof
US4885250A (en) * 1987-03-02 1989-12-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
US4954444A (en) * 1987-03-02 1990-09-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Enzyme immobilization and bioaffinity separations with perfluorocarbon polymer-based supports
CA1320718C (en) * 1987-06-08 1993-07-27 Richard Frederick Hammen Chromatographic material
GB8915974D0 (en) * 1989-07-12 1989-08-31 Gore W L & Ass Uk Hydrophilic semi-permeable ptfe membranes and their manufacture
US5270193A (en) * 1989-10-27 1993-12-14 E. I. Dupont De Nemours And Company Immobilization of biomolecules on perfluorocarbon surfaces
US5030352A (en) * 1990-01-25 1991-07-09 Purdue Research Foundation Coated media for chromatography
US5243037A (en) * 1990-09-21 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Poly(fluoroalkyl) sugar reagents for surface modification of supports

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009523239A (ja) * 2006-01-13 2009-06-18 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド ウイルス粒子／ウイルス抗原の濃度を測定する方法
JP2018524167A (ja) * 2015-07-20 2018-08-30 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティドＷ．Ｌ． Ｇｏｒｅ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ アフィニティークロマトグラフィー装置
JP2020073257A (ja) * 2015-07-20 2020-05-14 ダブリュ．エル．ゴア アンド アソシエイツ，インコーポレイティドＷ．Ｌ． Ｇｏｒｅ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ アフィニティークロマトグラフィー装置
US10974169B2 (en) 2015-07-20 2021-04-13 W. L. Gore & Associates, Inc. Affinity chromatography devices
US10974170B2 (en) 2015-07-20 2021-04-13 W. L. Gore & Associates, Inc. Affinity chromatography devices

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