JPH06308122A - ヘモグロビン付加物の測定法 - Google Patents
ヘモグロビン付加物の測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血液試料中の特定のヘモグロビン付加物の正
確な濃度を得る測定方法を見出すこと。 【構成】 血液試料中の特定のヘモグロビン付加物の測
定方法であって、（ａ）血液試料を、その中に存在する
総ヘモグロビン量について、検定する工程、（ｂ）血液
試料中のヘモグロビンの総量に基づく偏差を生じ易く、
かつその濃度を測定しようとしているヘモグロビン付加
物に特異的である検定手法を用いて、該血液試料を検定
する工程、（ｃ）該ヘモグロビン付加物の測定値を該試
料中の総ヘモグロビン量に対して、正規化する工程、お
よび（ｄ）該ヘモグロビン付加物の正規化された濃度を
該総ヘモグロビン濃度で除して、ヘモグロビン付加物の
補正された濃度を得る工程、を含む方法、およびその測
定装置。
確な濃度を得る測定方法を見出すこと。 【構成】 血液試料中の特定のヘモグロビン付加物の測
定方法であって、（ａ）血液試料を、その中に存在する
総ヘモグロビン量について、検定する工程、（ｂ）血液
試料中のヘモグロビンの総量に基づく偏差を生じ易く、
かつその濃度を測定しようとしているヘモグロビン付加
物に特異的である検定手法を用いて、該血液試料を検定
する工程、（ｃ）該ヘモグロビン付加物の測定値を該試
料中の総ヘモグロビン量に対して、正規化する工程、お
よび（ｄ）該ヘモグロビン付加物の正規化された濃度を
該総ヘモグロビン濃度で除して、ヘモグロビン付加物の
補正された濃度を得る工程、を含む方法、およびその測
定装置。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血液試料中のヘモグロ
ビン付加物を測定するための方法および装置に関する。
ビン付加物を測定するための方法および装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】平均血中グルコースを監視するために、
ある種の循環蛋白質、例えばヘモグロビンのグリケーシ
ョン化の度合いを利用することができる。何故ならグリ
ケーション化は、ヘモグロビンが循環系でその滞留時間
の間にさらされる周囲のグルコース濃度に専ら依存す
る、非酵素的で、緩慢かつ連続的な反応であるからであ
る。これらの二つの要因、すなわちグルコース濃度およ
び滞留時間は、生体内では、増加した血中グルコース濃
度の程度および持続時間に置き換えられる（高血糖
症）。したがって、糖尿病が充分に制御されない糖尿病
の人々のように、血中グルコースレベルが上昇したとき
は、増加した量のグリケーション化ヘモグロビンが形成
される。ある個人の血液中のグリケーション化ヘモグロ
ビンの量は、ヘモグロビンが循環系でのその寿命の間に
さらされていた血中グルコースの平均濃度を反映してい
る。この期間は約１００日であるので、グリケーション
化ヘモグロビンの濃度の測定は、その人の血中グルコー
スの様相の来歴を提供できる。
ある種の循環蛋白質、例えばヘモグロビンのグリケーシ
ョン化の度合いを利用することができる。何故ならグリ
ケーション化は、ヘモグロビンが循環系でその滞留時間
の間にさらされる周囲のグルコース濃度に専ら依存す
る、非酵素的で、緩慢かつ連続的な反応であるからであ
る。これらの二つの要因、すなわちグルコース濃度およ
び滞留時間は、生体内では、増加した血中グルコース濃
度の程度および持続時間に置き換えられる（高血糖
症）。したがって、糖尿病が充分に制御されない糖尿病
の人々のように、血中グルコースレベルが上昇したとき
は、増加した量のグリケーション化ヘモグロビンが形成
される。ある個人の血液中のグリケーション化ヘモグロ
ビンの量は、ヘモグロビンが循環系でのその寿命の間に
さらされていた血中グルコースの平均濃度を反映してい
る。この期間は約１００日であるので、グリケーション
化ヘモグロビンの濃度の測定は、その人の血中グルコー
スの様相の来歴を提供できる。
【０００３】グリケーション化ヘモグロビンの定量のた
めの記載された方法としては、イオン交換カラムまたは
ホウ酸アフィニティーカラムでのクロマトグラフィー、
HPLCおよびアガロースゲル電気泳動などがある。これら
の手法はそれぞれ、複雑性、高価な装置、正確度または
変動度に関する短所を有する。
めの記載された方法としては、イオン交換カラムまたは
ホウ酸アフィニティーカラムでのクロマトグラフィー、
HPLCおよびアガロースゲル電気泳動などがある。これら
の手法はそれぞれ、複雑性、高価な装置、正確度または
変動度に関する短所を有する。
【０００４】グリケーション化ヘモグロビン、すなわち
グルコースとヘモグロビン蛋白質の反応性アミンの基と
の非酵素反応によって形成されるヘモグロビン誘導体の
エピトープ（抗原決定基）と反応させるためのモノクロ
ーナル抗体を開発するのに用いられた免疫手法が利用可
能であり、それがELISA またはラテックス凝集検定法な
どの標準的な免疫化学の手法によるグリケーション化ヘ
モグロビンの濃度の測定を容易にしている。そのような
凝集検定法は米国特許第4,970,171 号明細書に開示され
ていて、それには血液試料中のグリケーション化ヘモグ
ロビン、例えばβサブユニットでグリケーション化ヘモ
グロビンの一変種であるヘモグロビンAlc （HbAlc ）の
免疫検定法が記載されている。この方法は、（ａ）血液
試料を、それに含まれるヘモグロビンを変性させること
が可能なチオシアン酸塩での処理、そして処理された血
液試料中のヘモグロビンをメトヘモグロビン形態へと転
換することが可能な酸化剤で処理する工程、（ｂ）該試
料中の総ヘモグロビン量を意味するメトヘモグロビンに
ついて処理された試料を検定する工程、（ｃ）求めよう
とする変性された形態の特定のヘモグロビン誘導体の変
性形態の量について、免疫検定法を用いて、変性され、
酸化された血液試料を検定する工程、および（ｄ）試験
試料中の総ヘモグロビン量と比較して、求めようとする
ヘモグロビン誘導体の形態で存在するヘモグロビンの相
対量を算出する工程、を含む。
グルコースとヘモグロビン蛋白質の反応性アミンの基と
の非酵素反応によって形成されるヘモグロビン誘導体の
エピトープ（抗原決定基）と反応させるためのモノクロ
ーナル抗体を開発するのに用いられた免疫手法が利用可
能であり、それがELISA またはラテックス凝集検定法な
どの標準的な免疫化学の手法によるグリケーション化ヘ
モグロビンの濃度の測定を容易にしている。そのような
凝集検定法は米国特許第4,970,171 号明細書に開示され
ていて、それには血液試料中のグリケーション化ヘモグ
ロビン、例えばβサブユニットでグリケーション化ヘモ
グロビンの一変種であるヘモグロビンAlc （HbAlc ）の
免疫検定法が記載されている。この方法は、（ａ）血液
試料を、それに含まれるヘモグロビンを変性させること
が可能なチオシアン酸塩での処理、そして処理された血
液試料中のヘモグロビンをメトヘモグロビン形態へと転
換することが可能な酸化剤で処理する工程、（ｂ）該試
料中の総ヘモグロビン量を意味するメトヘモグロビンに
ついて処理された試料を検定する工程、（ｃ）求めよう
とする変性された形態の特定のヘモグロビン誘導体の変
性形態の量について、免疫検定法を用いて、変性され、
酸化された血液試料を検定する工程、および（ｄ）試験
試料中の総ヘモグロビン量と比較して、求めようとする
ヘモグロビン誘導体の形態で存在するヘモグロビンの相
対量を算出する工程、を含む。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このグリケーション化
蛋白質の免疫検定法は、その正確度に影響する潜在的な
欠陥を有することが見いだされていて、その欠陥は、与
えられた濃度のグリケーション化ヘモグロビンの応答は
その濃度だけでなく総ヘモグロビン濃度にも依存すると
いう発見に基いている。グリケーション化ヘモグロビン
の見かけの濃度と総ヘモグロビン濃度との間には反比例
の関係が存在すること、すなわち総ヘモグロビン濃度が
高いときには、グリケーション化ヘモグロビンの見かけ
の濃度は予測されるより低く、総ヘモグロビン濃度が低
いときには、グリケーション化ヘモグロビンの見かけの
濃度は予測されるより高いことが発見されている。ヘモ
グロビン分子の二量体形態と四量体形態との平衡が化学
的に乱されない平衡分析法を用いて他のヘモグロビン付
加物の濃度を測定する際にも、同じ現象が認められる。
免疫分析法、酵素分析法および化学的分析法は平衡法と
見做されるのに対し、クロマトグラフィー法およびペプ
シン消化法はそうではない。本発明は、この効果の根底
に存在する理由の発見、およびそれを克服するための方
法の開発に基いている。
蛋白質の免疫検定法は、その正確度に影響する潜在的な
欠陥を有することが見いだされていて、その欠陥は、与
えられた濃度のグリケーション化ヘモグロビンの応答は
その濃度だけでなく総ヘモグロビン濃度にも依存すると
いう発見に基いている。グリケーション化ヘモグロビン
の見かけの濃度と総ヘモグロビン濃度との間には反比例
の関係が存在すること、すなわち総ヘモグロビン濃度が
高いときには、グリケーション化ヘモグロビンの見かけ
の濃度は予測されるより低く、総ヘモグロビン濃度が低
いときには、グリケーション化ヘモグロビンの見かけの
濃度は予測されるより高いことが発見されている。ヘモ
グロビン分子の二量体形態と四量体形態との平衡が化学
的に乱されない平衡分析法を用いて他のヘモグロビン付
加物の濃度を測定する際にも、同じ現象が認められる。
免疫分析法、酵素分析法および化学的分析法は平衡法と
見做されるのに対し、クロマトグラフィー法およびペプ
シン消化法はそうではない。本発明は、この効果の根底
に存在する理由の発見、およびそれを克服するための方
法の開発に基いている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、血液試料中
の、ヘモグロビン付加物、例えばヘモグロビン−アセト
アルデヒド、ヘモグロビン−尿素、ヘモグロビン−アス
ピリン、ヘモグロビン−グルコース−６−リン酸、ヘモ
グロビン−グルコース−１，６−二リン酸、ヘモグロビ
ン−グルタチオンおよびヘモグロビン−グリケーション
化目的生成物の改良測定方法であって、（ａ）血液試料
を、その中に存在する総ヘモグロビン量について、検定
する工程、（ｂ）血液試料中のヘモグロビンの総量に基
づく偏差を生じ易く、かつその濃度を測定しようとして
いるヘモグロビン付加物に特異的である検定手法を用い
て、血液試料を検定する工程、（ｃ）該試料中の総ヘモ
グロビン量に対して、ヘモグロビン付加物の検定から得
られた測定値を正規化する工程、および（ｄ）ヘモグロ
ビン付加物の正規化された濃度を総ヘモグロビン濃度で
除して、ヘモグロビン付加物の補正された濃度を得る工
程、を含むことを特徴とする方法である。
の、ヘモグロビン付加物、例えばヘモグロビン−アセト
アルデヒド、ヘモグロビン−尿素、ヘモグロビン−アス
ピリン、ヘモグロビン−グルコース−６−リン酸、ヘモ
グロビン−グルコース−１，６−二リン酸、ヘモグロビ
ン−グルタチオンおよびヘモグロビン−グリケーション
化目的生成物の改良測定方法であって、（ａ）血液試料
を、その中に存在する総ヘモグロビン量について、検定
する工程、（ｂ）血液試料中のヘモグロビンの総量に基
づく偏差を生じ易く、かつその濃度を測定しようとして
いるヘモグロビン付加物に特異的である検定手法を用い
て、血液試料を検定する工程、（ｃ）該試料中の総ヘモ
グロビン量に対して、ヘモグロビン付加物の検定から得
られた測定値を正規化する工程、および（ｄ）ヘモグロ
ビン付加物の正規化された濃度を総ヘモグロビン濃度で
除して、ヘモグロビン付加物の補正された濃度を得る工
程、を含むことを特徴とする方法である。
【０００７】正規化の手順は、ヘモグロビン分子を、ク
ロマトグラフィーとは異なり、完全には解離させないい
かなる定量法にも適用することができるが、本発明は、
免疫検定法の手法によるグリケーション化ヘモグロビ
ン、例えばHbAlc の測定には特に有用である。用いてよ
いその他の前−平衡検定法としては、例えば付加物中の
グルコース、グルコース−６−リン酸またはグルコース
−１，６−二リン酸と相互作用することができる酸化酵
素、還元酵素またはホスファターゼの利用を含む酵素的
検定法、および例えば付加物を酸化、還元または加水分
解することができる化学反応を含む化学的検定法を含
む。より詳しくは、ヘモグロビン−グルコースという付
加物のグルコース部分は、酸処理によって５−ヒドロキ
シメチルフルフラールとして遊離させることができる。
そうして５−ヒドロキシメチルフルフラールをチオバル
ビツル酸と反応させて、着色錯体を形成させる。この錯
体の色の強さは、試料中に存在するヘモグロビン−グル
コース付加物の濃度に比例する。化学的測定のもう一つ
の例は、アセトアルデヒドとヘモグロビンによって形成
される付加物の分析である。アセトアルデヒドは、エタ
ノールの最初の代謝生成物であって、ヘモグロビンとの
付加物を形成することが公知であり、ヘモグロビンと会
合したアセトアルデヒドの測定値は、飲酒した人と飲酒
していない人とを区別することが報告されている。付加
物中のアセトアルデヒドは、加水分解することができ、
次いで１，３−シクロヘキサンジオンと反応させて発蛍
光団を形成させ、これを定量的に分析する。発蛍光団の
濃度は、試料中に存在するヘモグロビン−アセトアルデ
ヒド付加物の濃度に比例する。典型的には、ヘモグロビ
ン付加物の測定のためのこれらの方法は、ヘモグロビン
の変性を必要としない。る。
ロマトグラフィーとは異なり、完全には解離させないい
かなる定量法にも適用することができるが、本発明は、
免疫検定法の手法によるグリケーション化ヘモグロビ
ン、例えばHbAlc の測定には特に有用である。用いてよ
いその他の前−平衡検定法としては、例えば付加物中の
グルコース、グルコース−６−リン酸またはグルコース
−１，６−二リン酸と相互作用することができる酸化酵
素、還元酵素またはホスファターゼの利用を含む酵素的
検定法、および例えば付加物を酸化、還元または加水分
解することができる化学反応を含む化学的検定法を含
む。より詳しくは、ヘモグロビン−グルコースという付
加物のグルコース部分は、酸処理によって５−ヒドロキ
シメチルフルフラールとして遊離させることができる。
そうして５−ヒドロキシメチルフルフラールをチオバル
ビツル酸と反応させて、着色錯体を形成させる。この錯
体の色の強さは、試料中に存在するヘモグロビン−グル
コース付加物の濃度に比例する。化学的測定のもう一つ
の例は、アセトアルデヒドとヘモグロビンによって形成
される付加物の分析である。アセトアルデヒドは、エタ
ノールの最初の代謝生成物であって、ヘモグロビンとの
付加物を形成することが公知であり、ヘモグロビンと会
合したアセトアルデヒドの測定値は、飲酒した人と飲酒
していない人とを区別することが報告されている。付加
物中のアセトアルデヒドは、加水分解することができ、
次いで１，３−シクロヘキサンジオンと反応させて発蛍
光団を形成させ、これを定量的に分析する。発蛍光団の
濃度は、試料中に存在するヘモグロビン−アセトアルデ
ヒド付加物の濃度に比例する。典型的には、ヘモグロビ
ン付加物の測定のためのこれらの方法は、ヘモグロビン
の変性を必要としない。る。
【０００８】本発明は、非変性ヘモグロビンが四量体で
あるαおよびβ鎖（α２β２）と二量体形態（αβ）と
の平衡として存在するという事実に基いている。これら
のαおよびβ鎖は、それぞれアミノ酸約１４３個の長さ
である。βサブユニットの末端には、Alc のエピトープ
の一部であってグルコースと反応することができるバリ
ン単位が存在する。非変性ヘモグロビンとヘモグロビン
付加物との混合物中には（血中でのように）、グリケー
ション化ヘモグロビンを例にとれば、非グリケーション
化四量体、非グリケーション化二量体、モノグリケーシ
ョン化四量体およびモノグリケーション化二量体の混合
物が存在する。グリケーション化された成分はすべて、
異なる免疫的、酵素的または化学的反応性を有すること
になる。すなわち、グリケーション化二量体は、それら
のグリケーション化された部位が露出していて、反応体
との相互作用を生じ得るので、最も高い反応性を有す
る。グリケーション化四量体は、四量体の配置ではグリ
ケーション化された部位が立体的に束縛されることか
ら、はるかに低い反応性を有する。試料中の総ヘモグロ
ビン濃度が上昇したときは、四量体形態のグリケーショ
ン化ヘモグロビンと二量体形態のそれとの間の平衡は、
より高い濃度では会合した四量体形態の方が熱力学的に
優先されることから、四量体形態の方に移動する。この
平衡移動と、四量体形態のグリケーション化ヘモグロビ
ンと二量体形態のそれとの間の抗体試薬に対する反応性
の差との組み合わせが、血液試料中に存在する総ヘモグ
ロビン量により検定が影響されるようにさせる。臨床的
設定においては、グリケーション化ヘモグロビン付加物
を測定しようとするときに、この「ヘモグロビン依存効
果」、それは試料中に存在するヘモグロビンの総量に基
いた偏差である、を斟酌しなければならない。
あるαおよびβ鎖（α２β２）と二量体形態（αβ）と
の平衡として存在するという事実に基いている。これら
のαおよびβ鎖は、それぞれアミノ酸約１４３個の長さ
である。βサブユニットの末端には、Alc のエピトープ
の一部であってグルコースと反応することができるバリ
ン単位が存在する。非変性ヘモグロビンとヘモグロビン
付加物との混合物中には（血中でのように）、グリケー
ション化ヘモグロビンを例にとれば、非グリケーション
化四量体、非グリケーション化二量体、モノグリケーシ
ョン化四量体およびモノグリケーション化二量体の混合
物が存在する。グリケーション化された成分はすべて、
異なる免疫的、酵素的または化学的反応性を有すること
になる。すなわち、グリケーション化二量体は、それら
のグリケーション化された部位が露出していて、反応体
との相互作用を生じ得るので、最も高い反応性を有す
る。グリケーション化四量体は、四量体の配置ではグリ
ケーション化された部位が立体的に束縛されることか
ら、はるかに低い反応性を有する。試料中の総ヘモグロ
ビン濃度が上昇したときは、四量体形態のグリケーショ
ン化ヘモグロビンと二量体形態のそれとの間の平衡は、
より高い濃度では会合した四量体形態の方が熱力学的に
優先されることから、四量体形態の方に移動する。この
平衡移動と、四量体形態のグリケーション化ヘモグロビ
ンと二量体形態のそれとの間の抗体試薬に対する反応性
の差との組み合わせが、血液試料中に存在する総ヘモグ
ロビン量により検定が影響されるようにさせる。臨床的
設定においては、グリケーション化ヘモグロビン付加物
を測定しようとするときに、この「ヘモグロビン依存効
果」、それは試料中に存在するヘモグロビンの総量に基
いた偏差である、を斟酌しなければならない。
【０００９】その存在または濃度を求めようとしている
ヘモグロビン付加物、およびその検定に用いられる特定
の方法によっては、ヘモグロビン付加物の反応部位を変
性によって露出させることが必要なことがある。ここで
用いられる変性という用語は、ヘモグロビンの二量体鎖
と四量体鎖との間の平衡を破ることなく用いるために選
ばれた分析試薬に反応部位を露出させるようないかなる
処理をも意味することが意図されている。適切な変性手
法としては、試料を高い塩濃度、高いpHもしくは低いp
H、カオトロピック試薬、例えばチオシアン酸塩、グア
ニジニウムもしくは尿素、または界面活性剤、例えば非
イオン、カチオンもしくはアニオン洗剤で処理すること
などがある。これらの処理はすべて、ヘモグロビン分子
の水素結合の何らかの程度の崩壊を生起させ、それによ
って反応部位を露出させる。これらの処理は、ヘモグロ
ビンの完全な解離を生起することはなく、したがって前
述の平衡を変化させない。蛋白質分解性の消化またはク
ロマトグラフィーは、この平衡を破ることから、本方法
と併用するには適さない。典型的には、グリケーション
化ヘモグロビン、例えばHbAlc の測定は、特に免疫検定
法の手法を用いようとするときには、ヘモグロビンの変
性を伴うことになる。
ヘモグロビン付加物、およびその検定に用いられる特定
の方法によっては、ヘモグロビン付加物の反応部位を変
性によって露出させることが必要なことがある。ここで
用いられる変性という用語は、ヘモグロビンの二量体鎖
と四量体鎖との間の平衡を破ることなく用いるために選
ばれた分析試薬に反応部位を露出させるようないかなる
処理をも意味することが意図されている。適切な変性手
法としては、試料を高い塩濃度、高いpHもしくは低いp
H、カオトロピック試薬、例えばチオシアン酸塩、グア
ニジニウムもしくは尿素、または界面活性剤、例えば非
イオン、カチオンもしくはアニオン洗剤で処理すること
などがある。これらの処理はすべて、ヘモグロビン分子
の水素結合の何らかの程度の崩壊を生起させ、それによ
って反応部位を露出させる。これらの処理は、ヘモグロ
ビンの完全な解離を生起することはなく、したがって前
述の平衡を変化させない。蛋白質分解性の消化またはク
ロマトグラフィーは、この平衡を破ることから、本方法
と併用するには適さない。典型的には、グリケーション
化ヘモグロビン、例えばHbAlc の測定は、特に免疫検定
法の手法を用いようとするときには、ヘモグロビンの変
性を伴うことになる。
【００１０】説明を目的として免疫検定法およびグリケ
ーション化ヘモグロビンを選んだ場合の本発明の方法
は、下記のように実施される。
ーション化ヘモグロビンを選んだ場合の本発明の方法
は、下記のように実施される。
【００１１】最初の工程では、ペプチドのグリケーショ
ン化されたＮ末端残基を抗体結合に利用できるようにす
るために、ヘモグロビンを変性させる。米国特許第4,65
8,022 号明細書には、熱、超音波、高いpHおよび低いpH
などの物理的手段による蛋白質の処理、並びにグアニジ
ン、尿素などのカオトロピック薬剤、またはドデシル硫
酸ナトリウムなどの洗剤を用いた消化もしくはそれらと
の相互作用による化学的変性をはじめとする、蛋白質変
性のための多数の手法が記載されている。好適な手法で
は、引用によって本発明に組み込まれた米国特許第4,97
0,171 号明細書に開示されているように、血液試料をチ
オシアン酸塩および酸化剤で処理することによって蛋白
質を変性させて、ペプチドのエピトープを抗体結合のた
めに露出させる。この特許で開示された手法は、ヘモグ
ロビンをメトヘモグロビンへと酸化し、これを安定的な
着色成分としてのチオシアン−メトヘモグロビンへと転
換する。すなわち色の強さをヘモグロビンの濃度と相関
させている。得られたチオシアン−メトヘモグロビン
は、この操作の免疫検定法の部分での被分析物として働
く特定のヘモグロビン誘導体の変性された形態の総試料
ヘモグロビンを測定するための基礎として働く。チオシ
アン酸塩は、イオン化するとチオシアン酸アニオン（Ｓ
ＣＮ- ）を与えて、免疫検定法での検出に適切なヘモグ
ロビンにするそれらの塩から選ぶ。アンモニウム、ナト
リウムおよびカリウムが適切な対カチオンである。チオ
シアン酸リチウムは、より速やかな変性ばかりでなく、
試験しようとする血液試料中の赤血球の溶解を促進させ
る。酸化剤は、基本的にはいかなる無機酸化剤であるこ
ともでき、非変性ヘモグロビンの第一鉄イオンをその第
二鉄のメトヘモグロビン形態に転換する。適切な酸化剤
としては、フェリシアン化物、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、
臭素酸塩、クロム酸塩、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩お
よび過酸化物などがある。
ン化されたＮ末端残基を抗体結合に利用できるようにす
るために、ヘモグロビンを変性させる。米国特許第4,65
8,022 号明細書には、熱、超音波、高いpHおよび低いpH
などの物理的手段による蛋白質の処理、並びにグアニジ
ン、尿素などのカオトロピック薬剤、またはドデシル硫
酸ナトリウムなどの洗剤を用いた消化もしくはそれらと
の相互作用による化学的変性をはじめとする、蛋白質変
性のための多数の手法が記載されている。好適な手法で
は、引用によって本発明に組み込まれた米国特許第4,97
0,171 号明細書に開示されているように、血液試料をチ
オシアン酸塩および酸化剤で処理することによって蛋白
質を変性させて、ペプチドのエピトープを抗体結合のた
めに露出させる。この特許で開示された手法は、ヘモグ
ロビンをメトヘモグロビンへと酸化し、これを安定的な
着色成分としてのチオシアン−メトヘモグロビンへと転
換する。すなわち色の強さをヘモグロビンの濃度と相関
させている。得られたチオシアン−メトヘモグロビン
は、この操作の免疫検定法の部分での被分析物として働
く特定のヘモグロビン誘導体の変性された形態の総試料
ヘモグロビンを測定するための基礎として働く。チオシ
アン酸塩は、イオン化するとチオシアン酸アニオン（Ｓ
ＣＮ- ）を与えて、免疫検定法での検出に適切なヘモグ
ロビンにするそれらの塩から選ぶ。アンモニウム、ナト
リウムおよびカリウムが適切な対カチオンである。チオ
シアン酸リチウムは、より速やかな変性ばかりでなく、
試験しようとする血液試料中の赤血球の溶解を促進させ
る。酸化剤は、基本的にはいかなる無機酸化剤であるこ
ともでき、非変性ヘモグロビンの第一鉄イオンをその第
二鉄のメトヘモグロビン形態に転換する。適切な酸化剤
としては、フェリシアン化物、ヨウ素酸塩、塩素酸塩、
臭素酸塩、クロム酸塩、次亜塩素酸塩、過ヨウ素酸塩お
よび過酸化物などがある。
【００１２】メトヘモグロビンの濃度は、好都合には、
ＨＰ ８４５０Ａ分光光度計またはその同等物などの慣
用の分光光度計を用いて、５４０nmでのその特徴的な吸
光を測定することによって決定する。これに代えて、米
国国家臨床検査室規格委員会（National Commision for
Clinical Laboratory Standards）の提唱規格ＰＳＨ−
１５項に記載されたとおりのDrabkin の手順を用いるこ
ともできる。
ＨＰ ８４５０Ａ分光光度計またはその同等物などの慣
用の分光光度計を用いて、５４０nmでのその特徴的な吸
光を測定することによって決定する。これに代えて、米
国国家臨床検査室規格委員会（National Commision for
Clinical Laboratory Standards）の提唱規格ＰＳＨ−
１５項に記載されたとおりのDrabkin の手順を用いるこ
ともできる。
【００１３】変性後は、総メトヘモグロビン、および問
題のヘモグロビン付加物について血液試料を検定する。
これは、最も好都合には、変性蛋白質中のヘモグロビン
付加物、例えばHbAlc を特徴付けるエピトープに特異的
に結合するよう開発されたモノクローナル抗体を用いた
免疫検定法によって達成される。特定の免疫検定の手法
および様式、ならびに標識方式および発生した信号検出
は臨界的でない。放射性同位元素標識法または酵素標識
法（ELISA ）を用いることができる。抗体粒子試薬およ
び凝集剤試薬の特異的な相互作用に基づく粒子凝集阻害
免疫検定法は特に有用である。抗体粒子試薬は、水に懸
濁し得る粒子、典型的にはポリスチレンまたは他のラテ
ックスに結合させたモノクローナル抗体もしくはその断
片を含む。凝集剤は抗体試薬に対する複数のエピトープ
性結合部位を含む。被分析物の不在下では、抗体粒子と
凝集剤は相互に結合して光散乱性複合体を形成し、これ
を比濁分析による測定によって定量することができる。
増加する量の被分析物の存在下では、抗体粒子が被分析
物に結合し、凝集剤（典型的には問題のヘモグロビン誘
導体を特徴付けるエピトープを規定する多数の有機部
分、例えばペプチド残基が付着している重合体骨格であ
る）に結合できなくなるにつれて、溶液の濁度が低下す
る。HbAlc を測定しようとするときは、エピトープは、
HbAlc のグリケーション化Ｎ末端残基の配列に対応する
いくつかのアミノ酸単位のグリケーション化ペプチド残
基を含む。
題のヘモグロビン付加物について血液試料を検定する。
これは、最も好都合には、変性蛋白質中のヘモグロビン
付加物、例えばHbAlc を特徴付けるエピトープに特異的
に結合するよう開発されたモノクローナル抗体を用いた
免疫検定法によって達成される。特定の免疫検定の手法
および様式、ならびに標識方式および発生した信号検出
は臨界的でない。放射性同位元素標識法または酵素標識
法（ELISA ）を用いることができる。抗体粒子試薬およ
び凝集剤試薬の特異的な相互作用に基づく粒子凝集阻害
免疫検定法は特に有用である。抗体粒子試薬は、水に懸
濁し得る粒子、典型的にはポリスチレンまたは他のラテ
ックスに結合させたモノクローナル抗体もしくはその断
片を含む。凝集剤は抗体試薬に対する複数のエピトープ
性結合部位を含む。被分析物の不在下では、抗体粒子と
凝集剤は相互に結合して光散乱性複合体を形成し、これ
を比濁分析による測定によって定量することができる。
増加する量の被分析物の存在下では、抗体粒子が被分析
物に結合し、凝集剤（典型的には問題のヘモグロビン誘
導体を特徴付けるエピトープを規定する多数の有機部
分、例えばペプチド残基が付着している重合体骨格であ
る）に結合できなくなるにつれて、溶液の濁度が低下す
る。HbAlc を測定しようとするときは、エピトープは、
HbAlc のグリケーション化Ｎ末端残基の配列に対応する
いくつかのアミノ酸単位のグリケーション化ペプチド残
基を含む。
【００１４】総ヘモグロビンおよびヘモグロビン誘導体
の濃度を測定した後は、総ヘモグロビンの一部としての
ヘモグロビン付加物の百分率を算出する。この測定は、
従来の技術に教示されるように、単にヘモグロビン誘導
体の濃度を総ヘモグロビン濃度で除してヘモグロビン付
加物の百分率の値を得るだけによって実施される。しか
し、前述のヘモグロビン依存効果に起因して、この計算
は完全に正確な数字を与えるわけではない。本発明の目
的は、ヘモグロビン誘導体の測定からヘモグロビン依存
効果を要因付けるための手順を提供し、それによって考
慮しているヘモグロビン誘導体の濃度を決定するための
より正確な手順を提供することにある。この改良された
手順は、この免疫検定法を用いて測定されたヘモグロビ
ン誘導体の濃度を正規化することを含む。これは、ヘモ
グロビン誘導体の真の濃度を、ともに検定の際に測定さ
れる値であるその反応性および総ヘモグロビン濃度から
演繹することによって達成される。この正規化の手順は
５つの工程で実施される。これらの工程とは、 Ａ．正規化された濃度のヘモグロビンおよび異なる濃度
のヘモグロビン付加物を含有する較正用血液試料を用い
ることによって、（ａ）ヘモグロビン効果を受けない参
照手順、例えばHPLCを用いて測定されたヘモグロビン付
加物の濃度を、（ｂ）免疫反応の応答に関係付ける較正
曲線を作成する工程、 Ｂ．それぞれ種々の濃度のヘモグロビンを含有するが、
同一百分率のヘモグロビン付加物を含有する一系列の血
液試料を調製して、各試料の免疫反応の応答を測定し、
そして各試料について観測されたヘモグロビン付加物の
濃度を、Ａ工程で作成した較正曲線から得る工程、 Ｃ．（ａ）Ｂ工程で測定された各系列からのヘモグロビ
ン付加物の観測濃度を（ｂ）その系列の各試料のヘモグ
ロビン濃度に関係付ける適合する（ｎ次の）多項式の一
系列の曲線を作成して、多項曲線の適合化係数（ａn 、
ａn-1 、ａn-2・・・・ａ0 ）を各曲線ごとに得、そし
て曲線の系列全体についてこの過程を反復する工程、 Ｄ．（ａ）Ｃ工程で作成された一系列の曲線に対する多
項曲線の適合化係数ａn を、（ｂ）ヘモグロビンの正規
化された濃度でのヘモグロビン付加物の百分率に関係付
ける適合する直線を得、そして適合する直線の勾配（Ｓ
n ）および切片（Ｉn ）を得る工程、 Ｅ．Ｄ工程の手順を用いて、多項曲線の適合化係数ａ
n-1 、ａn-2 ・・・・ａ1 からそれぞれＳn-1 、Ｓn-2
・・・・Ｓ1 およびＩn-1 、Ｉn-2 ・・・・Ｉ1の値を
得る工程、並びに Ｆ．方程式（Ｉ）： Hbad＝〔Hbad' −（Hbn −Nn）＊In−（Hbn-1 −Nn-1）＊In-1−（Hbn-2 −Nn -2 ）＊In-2−・・・・（Hb−N ）＊I1〕／〔（Hbn −Nn）＊Sn＋（Hbn-1 −Nn-1 ）＊Sn-1＋（Hbn-2 −Nn-2）＊Sn-2＋・・・・（Hb−N ）＊S1＋１〕 （Ｉ） 〔式中、Hbadは、その濃度を求めようとしているヘモグ
ロビン付加物の補正された濃度であり、Hbad’は、免疫
検定法を用いて測定されたヘモグロビン付加物のｇ／dl
で示される観測濃度であり、Ｉn ・・・・Ｉ1 およびＳ
n ・・・・Ｓ1 は、実験的に決定される係数であり、そ
してＮは、ｇ／dlの正規化されたヘモグロビン濃度であ
る〕を、解くことによって、（ａ）ヘモグロビン付加物
の観測濃度を、（ｂ）ヘモグロビン濃度に関係付けるこ
とによって、ヘモグロビン付加物の補正された濃度を得
る工程、である。ここで用いられている正規化されたヘ
モグロビン濃度とは、ヘモグロビンの固定された濃度を
意味する。正規化された濃度としては、いかなる濃度を
選ぶこともできるが、大多数の臨床血液標本は１４ｇ／
dlの濃度のヘモグロビンを含有することから、本手順で
はこの濃度を使用することが好適である。このことの利
点は、標本のヘモグロビン濃度が正規化された濃度に等
しいならば、この場合、補正された濃度は観測された濃
度に等しいことから、補正を全く必要としないことであ
る。
の濃度を測定した後は、総ヘモグロビンの一部としての
ヘモグロビン付加物の百分率を算出する。この測定は、
従来の技術に教示されるように、単にヘモグロビン誘導
体の濃度を総ヘモグロビン濃度で除してヘモグロビン付
加物の百分率の値を得るだけによって実施される。しか
し、前述のヘモグロビン依存効果に起因して、この計算
は完全に正確な数字を与えるわけではない。本発明の目
的は、ヘモグロビン誘導体の測定からヘモグロビン依存
効果を要因付けるための手順を提供し、それによって考
慮しているヘモグロビン誘導体の濃度を決定するための
より正確な手順を提供することにある。この改良された
手順は、この免疫検定法を用いて測定されたヘモグロビ
ン誘導体の濃度を正規化することを含む。これは、ヘモ
グロビン誘導体の真の濃度を、ともに検定の際に測定さ
れる値であるその反応性および総ヘモグロビン濃度から
演繹することによって達成される。この正規化の手順は
５つの工程で実施される。これらの工程とは、 Ａ．正規化された濃度のヘモグロビンおよび異なる濃度
のヘモグロビン付加物を含有する較正用血液試料を用い
ることによって、（ａ）ヘモグロビン効果を受けない参
照手順、例えばHPLCを用いて測定されたヘモグロビン付
加物の濃度を、（ｂ）免疫反応の応答に関係付ける較正
曲線を作成する工程、 Ｂ．それぞれ種々の濃度のヘモグロビンを含有するが、
同一百分率のヘモグロビン付加物を含有する一系列の血
液試料を調製して、各試料の免疫反応の応答を測定し、
そして各試料について観測されたヘモグロビン付加物の
濃度を、Ａ工程で作成した較正曲線から得る工程、 Ｃ．（ａ）Ｂ工程で測定された各系列からのヘモグロビ
ン付加物の観測濃度を（ｂ）その系列の各試料のヘモグ
ロビン濃度に関係付ける適合する（ｎ次の）多項式の一
系列の曲線を作成して、多項曲線の適合化係数（ａn 、
ａn-1 、ａn-2・・・・ａ0 ）を各曲線ごとに得、そし
て曲線の系列全体についてこの過程を反復する工程、 Ｄ．（ａ）Ｃ工程で作成された一系列の曲線に対する多
項曲線の適合化係数ａn を、（ｂ）ヘモグロビンの正規
化された濃度でのヘモグロビン付加物の百分率に関係付
ける適合する直線を得、そして適合する直線の勾配（Ｓ
n ）および切片（Ｉn ）を得る工程、 Ｅ．Ｄ工程の手順を用いて、多項曲線の適合化係数ａ
n-1 、ａn-2 ・・・・ａ1 からそれぞれＳn-1 、Ｓn-2
・・・・Ｓ1 およびＩn-1 、Ｉn-2 ・・・・Ｉ1の値を
得る工程、並びに Ｆ．方程式（Ｉ）： Hbad＝〔Hbad' −（Hbn −Nn）＊In−（Hbn-1 −Nn-1）＊In-1−（Hbn-2 −Nn -2 ）＊In-2−・・・・（Hb−N ）＊I1〕／〔（Hbn −Nn）＊Sn＋（Hbn-1 −Nn-1 ）＊Sn-1＋（Hbn-2 −Nn-2）＊Sn-2＋・・・・（Hb−N ）＊S1＋１〕 （Ｉ） 〔式中、Hbadは、その濃度を求めようとしているヘモグ
ロビン付加物の補正された濃度であり、Hbad’は、免疫
検定法を用いて測定されたヘモグロビン付加物のｇ／dl
で示される観測濃度であり、Ｉn ・・・・Ｉ1 およびＳ
n ・・・・Ｓ1 は、実験的に決定される係数であり、そ
してＮは、ｇ／dlの正規化されたヘモグロビン濃度であ
る〕を、解くことによって、（ａ）ヘモグロビン付加物
の観測濃度を、（ｂ）ヘモグロビン濃度に関係付けるこ
とによって、ヘモグロビン付加物の補正された濃度を得
る工程、である。ここで用いられている正規化されたヘ
モグロビン濃度とは、ヘモグロビンの固定された濃度を
意味する。正規化された濃度としては、いかなる濃度を
選ぶこともできるが、大多数の臨床血液標本は１４ｇ／
dlの濃度のヘモグロビンを含有することから、本手順で
はこの濃度を使用することが好適である。このことの利
点は、標本のヘモグロビン濃度が正規化された濃度に等
しいならば、この場合、補正された濃度は観測された濃
度に等しいことから、補正を全く必要としないことであ
る。
【００１５】HbAlc が問題のヘモグロビン付加物である
下記の実施例を用いて、本発明を実施する方法を更に説
明する。この実施例では、例示の目的のために２次多項
式が選ばれている。この手順に適合する、直線、２次、
またはより高次多項曲線を用いることができる。しか
し、適合する直線は結果の曲がり具合を補正せず、より
高次の多項式に対するアルゴリズムはより複雑であっ
て、より多くの係数を有することになる。すなわち、適
合する直線は係数Ｉ1 およびＳ1 を必要とし、２次多項
式は係数Ｉ1 、Ｉ2 、Ｓ1 およびＳ2 を必要とするが、
３次多項式は係数Ｉ1 、Ｉ2 、Ｉ3 、Ｓ1 、Ｓ2 および
Ｓ3 を必要とすることになる。
下記の実施例を用いて、本発明を実施する方法を更に説
明する。この実施例では、例示の目的のために２次多項
式が選ばれている。この手順に適合する、直線、２次、
またはより高次多項曲線を用いることができる。しか
し、適合する直線は結果の曲がり具合を補正せず、より
高次の多項式に対するアルゴリズムはより複雑であっ
て、より多くの係数を有することになる。すなわち、適
合する直線は係数Ｉ1 およびＳ1 を必要とし、２次多項
式は係数Ｉ1 、Ｉ2 、Ｓ1 およびＳ2 を必要とするが、
３次多項式は係数Ｉ1 、Ｉ2 、Ｉ3 、Ｓ1 、Ｓ2 および
Ｓ3 を必要とすることになる。
【００１６】
実施例 Ａ．HPLCにより決定された、それぞれ２．５％、５．９
％、７．９％、８．９３％、１０．９７％および１２．
５４％のHbAlc を含有する６つの較正点用サンプルを調
製した。それぞれの較正点の血液試料中の総ヘモグロビ
ン濃度は１４ｇ／dlであった。前述のラテックス凝集手
法を用いてそれぞれの較正点の免疫反応の応答を測定し
て、第１表に示した結果を得た。
％、７．９％、８．９３％、１０．９７％および１２．
５４％のHbAlc を含有する６つの較正点用サンプルを調
製した。それぞれの較正点の血液試料中の総ヘモグロビ
ン濃度は１４ｇ／dlであった。前述のラテックス凝集手
法を用いてそれぞれの較正点の免疫反応の応答を測定し
て、第１表に示した結果を得た。
【００１７】
【表１】
【００１８】Ｙの値として、用いられた免疫反応応答、
およびＸの値として、用いられたAlc の参照濃度である
図１の較正曲線を作成した。この実施例では、免疫反応
の応答をmA（５４０nm、１６８〜２８）で表したが、こ
れは反応開始後の２８秒と１６８秒との間の５４０nmの
波長で読んだミリ吸光度の差である。
およびＸの値として、用いられたAlc の参照濃度である
図１の較正曲線を作成した。この実施例では、免疫反応
の応答をmA（５４０nm、１６８〜２８）で表したが、こ
れは反応開始後の２８秒と１６８秒との間の５４０nmの
波長で読んだミリ吸光度の差である。
【００１９】Ｂ．次の工程は、２．５％、５．９３％、
７．９７％、８．９３％、１０．９７％および１２．５
４％のAlc （Ａ工程での参照方法を用いて見出されたHb
Alcのレベルに対応する）を含有し、それぞれ９ｇ／dl
と２０ｇ／dlとの間の５種類またはそれ以上のレベルの
ヘモグロビン濃度を有する６群の試料を調製することで
あった。これらの試料は、ヒト充填赤血球およびヒト血
漿から調製した。それらの免疫反応の応答を、前述のラ
テックス凝集法を用いて測定し、この免疫反応の応答か
ら、Ａ工程で作成した較正曲線を用いて、これらの試料
のAlc 濃度を算出した。試料の濃度をAlc の観測値とし
て第２表に示した。HbAlc を測定するための手順は、Hb
Alc のμM 濃度をHbAlc の百分率に関係付ける方法とと
もに米国特許第4,847,209 号明細書に詳述されている。
この特許の手法は引用によって本発明に組み込まれてい
る。
７．９７％、８．９３％、１０．９７％および１２．５
４％のAlc （Ａ工程での参照方法を用いて見出されたHb
Alcのレベルに対応する）を含有し、それぞれ９ｇ／dl
と２０ｇ／dlとの間の５種類またはそれ以上のレベルの
ヘモグロビン濃度を有する６群の試料を調製することで
あった。これらの試料は、ヒト充填赤血球およびヒト血
漿から調製した。それらの免疫反応の応答を、前述のラ
テックス凝集法を用いて測定し、この免疫反応の応答か
ら、Ａ工程で作成した較正曲線を用いて、これらの試料
のAlc 濃度を算出した。試料の濃度をAlc の観測値とし
て第２表に示した。HbAlc を測定するための手順は、Hb
Alc のμM 濃度をHbAlc の百分率に関係付ける方法とと
もに米国特許第4,847,209 号明細書に詳述されている。
この特許の手法は引用によって本発明に組み込まれてい
る。
【００２０】Ｃ．Ｂの工程の各群の試料について、Alc
％観測値をヘモグロビン濃度に対してプロットした（図
２）。Alc ％観測の値をＹの値として、またヘモグロビ
ン濃度をＸの値として（第２表）、Advance Graphic So
ftware社のSlideWrite（商標）、またはJandel Scienti
fic 社のSigmaplot （商標）などの商業的な曲線適合化
プログラムを用いて、データを適合する多項曲線に適合
させることができる。データはいかなる次数の多項式に
も適合させることができる。
％観測値をヘモグロビン濃度に対してプロットした（図
２）。Alc ％観測の値をＹの値として、またヘモグロビ
ン濃度をＸの値として（第２表）、Advance Graphic So
ftware社のSlideWrite（商標）、またはJandel Scienti
fic 社のSigmaplot （商標）などの商業的な曲線適合化
プログラムを用いて、データを適合する多項曲線に適合
させることができる。データはいかなる次数の多項式に
も適合させることができる。
【００２１】２．５％の試料の群については、２．２
８、２．４３、２．５７、２．４３、２．７５および
２．５のAlc ％観測値をＹの値として用い、２１．９、
１７．５、１４、１４、１２．１および１０．４のヘモ
グロビン濃度をＸの値として用いた。これらのデータを
２次多項曲線に適合させた後、試料のその群について、
方程式Ｙ＝−0.0011617 ＊Ｘ2 ＋0.02542 ＊Ｘ＋2.490
を作成した。
８、２．４３、２．５７、２．４３、２．７５および
２．５のAlc ％観測値をＹの値として用い、２１．９、
１７．５、１４、１４、１２．１および１０．４のヘモ
グロビン濃度をＸの値として用いた。これらのデータを
２次多項曲線に適合させた後、試料のその群について、
方程式Ｙ＝−0.0011617 ＊Ｘ2 ＋0.02542 ＊Ｘ＋2.490
を作成した。
【００２２】５．９３％の試料の群については、５．１
７、５．５８、５．７９、６．０６、６．３５および
６．４５のAlc ％観測値をＹの値として用い、１９．
９、１６．３、１４、１３．２、１１．７および１０．
３のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.004478＊Ｘ2 −0.2747＊Ｘ＋8.85
9 を作成した。
７、５．５８、５．７９、６．０６、６．３５および
６．４５のAlc ％観測値をＹの値として用い、１９．
９、１６．３、１４、１３．２、１１．７および１０．
３のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.004478＊Ｘ2 −0.2747＊Ｘ＋8.85
9 を作成した。
【００２３】７．９７％の試料の群については、７．０
５、７．８８、８．０５、８．２６、８．８７および
９．０８のAlc ％観測値をＹの値として用い、２０．
４、１６．８、１４、１３．４、１１．６および１０．
４のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.006158＊Ｘ2 −0.3860＊Ｘ＋12.4
19を作成した。
５、７．８８、８．０５、８．２６、８．８７および
９．０８のAlc ％観測値をＹの値として用い、２０．
４、１６．８、１４、１３．４、１１．６および１０．
４のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.006158＊Ｘ2 −0.3860＊Ｘ＋12.4
19を作成した。
【００２４】８．９３％の試料の群については、７．９
２、８．６０、９．３３、９．２６、９．９２および１
０．５８のAlc ％観測値をＹの値として用い、２１．
９、１７．１、１４．２、１４、１２．３および１０．
８のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.017231＊Ｘ2 −0.7985＊Ｘ＋17.1
58を作成した。
２、８．６０、９．３３、９．２６、９．９２および１
０．５８のAlc ％観測値をＹの値として用い、２１．
９、１７．１、１４．２、１４、１２．３および１０．
８のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これらの
データを２次多項曲線に適合させた後、試料のその群に
ついて、方程式Ｙ＝0.017231＊Ｘ2 −0.7985＊Ｘ＋17.1
58を作成した。
【００２５】１０．９７％の試料の群については、９．
７２、１０．９４、１１．０２、１２．１４、１２．９
６および１４．１３のAlc ％観測値をＹの値として用
い、１９．７、１５．２、１４、１２、１０．４および
８．７のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これ
らのデータを２次多項曲線に適合させた後、試料のその
群について、方程式Ｙ＝0.01644 ＊Ｘ2 −1.14462 ＊Ｘ
＋11.064を作成した。
７２、１０．９４、１１．０２、１２．１４、１２．９
６および１４．１３のAlc ％観測値をＹの値として用
い、１９．７、１５．２、１４、１２、１０．４および
８．７のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これ
らのデータを２次多項曲線に適合させた後、試料のその
群について、方程式Ｙ＝0.01644 ＊Ｘ2 −1.14462 ＊Ｘ
＋11.064を作成した。
【００２６】１２．５４％の試料の群については、１
０．１３、１１．９７、１２．４４、１３．０８、１
４．４６および１６．０１のAlc ％観測値をＹの値とし
て用い、２０．９、１６．２、１４、１３、１１および
９．２のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これ
らのデータを２次多項曲線に適合させた後、試料のその
群について、方程式Ｙ＝0.02734 ＊Ｘ2 −1.3086＊Ｘ＋
25.608を作成した。
０．１３、１１．９７、１２．４４、１３．０８、１
４．４６および１６．０１のAlc ％観測値をＹの値とし
て用い、２０．９、１６．２、１４、１３、１１および
９．２のヘモグロビン濃度をＸの値として用いた。これ
らのデータを２次多項曲線に適合させた後、試料のその
群について、方程式Ｙ＝0.02734 ＊Ｘ2 −1.3086＊Ｘ＋
25.608を作成した。
【００２７】これらの２次方程式で、−0.001617、0.00
4478、0.006158、0.017231、0.02644 、および0.02734
が、曲線適合化の工程で形成された係数ａ2 であり、0.
02542 、−0.2747、−0.386 、−0.7985、−1.1462およ
び−1.3086が係数ａ1 である。ＤおよびＥの工程の手順
は、これらの係数ａ1 およびａ2 を用いて更に計算する
ことを必要とする。
4478、0.006158、0.017231、0.02644 、および0.02734
が、曲線適合化の工程で形成された係数ａ2 であり、0.
02542 、−0.2747、−0.386 、−0.7985、−1.1462およ
び−1.3086が係数ａ1 である。ＤおよびＥの工程の手順
は、これらの係数ａ1 およびａ2 を用いて更に計算する
ことを必要とする。
【００２８】Ｄ．0.02542 、−0.2747、−0.3860、−0.
7985、−1.1462および−1.3086というａ1 の値をＹの値
に用い、Ｘの値としての２．５、５．９３、７．９７、
８．９３、１０．９７および１２．５４というAlc の％
の値に対してプロットして図３を作成した。データを、
SlideWrite（商標）の曲線適合化プログラムを用いて、
適合する直線に適合させた。この直線の適合化から Ｙ＝−0.141 ＊Ｘ＋0.505 〔式中、−0.141 が係数Ｓ1 であり、0.505 が係数Ｉ1
である〕という結果が得られる。
7985、−1.1462および−1.3086というａ1 の値をＹの値
に用い、Ｘの値としての２．５、５．９３、７．９７、
８．９３、１０．９７および１２．５４というAlc の％
の値に対してプロットして図３を作成した。データを、
SlideWrite（商標）の曲線適合化プログラムを用いて、
適合する直線に適合させた。この直線の適合化から Ｙ＝−0.141 ＊Ｘ＋0.505 〔式中、−0.141 が係数Ｓ1 であり、0.505 が係数Ｉ1
である〕という結果が得られる。
【００２９】Ｅ．−0.001617、0.004478、0.006158、0.
017231、0.02644 および0.02734 というａ2 の値をＹの
値に用い、Ｘの値としての２．５、５．９３、７．９
７、８．９３、１０．９７および１２．５４のAlc ％値
に対してプロットして図４を作成した。データを、適合
する直線に適合させて、 Ｙ＝0.0032＊Ｘ−0.0129 〔式中、0.0032が係数Ｓ2 であり、−0.0129が係数Ｉ2
である〕という結果を得た。
017231、0.02644 および0.02734 というａ2 の値をＹの
値に用い、Ｘの値としての２．５、５．９３、７．９
７、８．９３、１０．９７および１２．５４のAlc ％値
に対してプロットして図４を作成した。データを、適合
する直線に適合させて、 Ｙ＝0.0032＊Ｘ−0.0129 〔式中、0.0032が係数Ｓ2 であり、−0.0129が係数Ｉ2
である〕という結果を得た。
【００３０】Ｆ．方程式（II）： Alc ＝〔Alc'−（Hb2 −142 ）＊I2−（Hb−14）＊I1〕／〔（Hb2 −142 ） ＊S2＋（Hb−14）＊S1＋１〕 （II） 〔式中、Alc'は免疫検定法を用いて測定されたHbAlc ％
観測値であり、Hbは、ｇ／dlで示した総ヘモグロビン濃
度であり、Ｉ2 、Ｉ1 、Ｓ2 およびＳ1 は、実験的に決
定された係数であり、１４は、正規化された濃度として
選ばれた１４ｇ／dlのヘモグロビンである〕を解くこと
によってAlc の補正された濃度を得た。
観測値であり、Hbは、ｇ／dlで示した総ヘモグロビン濃
度であり、Ｉ2 、Ｉ1 、Ｓ2 およびＳ1 は、実験的に決
定された係数であり、１４は、正規化された濃度として
選ばれた１４ｇ／dlのヘモグロビンである〕を解くこと
によってAlc の補正された濃度を得た。
【００３１】ヘモグロビンの濃度が正規化された濃度か
ら更に隔たっているときは、参照値（例えばHPLCの値）
からのHbAlc の一層の偏差が観測される。したがって、
正規化された濃度を、最小限の偏差を有する試験となる
ように、検査しようとしている血液試料において最も普
遍的に認められるヘモグロビン濃度に設定するのが好都
合である。この補正法は、様々な正規化された濃度、例
えば１３ｇ／dl、１４ｇ／dl、１５ｇ／dlなどで用いる
ことができる。しかしながら、大多数の血液標本は１４
ｇ／dlというヘモグロビン濃度を有することから、この
レベルを正規化された濃度として選ぶことが好都合であ
る。
ら更に隔たっているときは、参照値（例えばHPLCの値）
からのHbAlc の一層の偏差が観測される。したがって、
正規化された濃度を、最小限の偏差を有する試験となる
ように、検査しようとしている血液試料において最も普
遍的に認められるヘモグロビン濃度に設定するのが好都
合である。この補正法は、様々な正規化された濃度、例
えば１３ｇ／dl、１４ｇ／dl、１５ｇ／dlなどで用いる
ことができる。しかしながら、大多数の血液標本は１４
ｇ／dlというヘモグロビン濃度を有することから、この
レベルを正規化された濃度として選ぶことが好都合であ
る。
【００３２】上記の実施例では、HbAlc というエピトー
プの測定を説明しているが、本発明の手法は、他のヘモ
グロビン誘導体、例えば他のグリケーション化アミンと
いうエピトープをαおよびβサブユニットとともに有す
るものにも等しく適用可能である。同様に、本方法は、
ヘモグロビンを完全には解離することのない免疫検定法
以外の検定方法にも適用可能である。これらの方法とし
ては、化学的検定法および酵素による検定法などがあ
る。
プの測定を説明しているが、本発明の手法は、他のヘモ
グロビン誘導体、例えば他のグリケーション化アミンと
いうエピトープをαおよびβサブユニットとともに有す
るものにも等しく適用可能である。同様に、本方法は、
ヘモグロビンを完全には解離することのない免疫検定法
以外の検定方法にも適用可能である。これらの方法とし
ては、化学的検定法および酵素による検定法などがあ
る。
【００３３】
【表２】
【００３４】この実験の結果を報告する第２表を参照す
ると、補正されていない結果の偏差（観測された値と参
照値との間の差の百分率）は２８．７％〜−１８．６％
にわたる。アルゴリズム〔式（II）〕および上記の係数
による補正後は、偏差は７．０〜−５．６％に減少し
た。
ると、補正されていない結果の偏差（観測された値と参
照値との間の差の百分率）は２８．７％〜−１８．６％
にわたる。アルゴリズム〔式（II）〕および上記の係数
による補正後は、偏差は７．０〜−５．６％に減少し
た。
【００３５】本発明のヘモグロビン濃度に関する正規化
の工程は、マイクロチップの形態であってもよい予めプ
ログラムされたコンピュータ記憶機構を用いて実施する
ことができる。予め選ばれたヘモグロビン付加物の測定
のための公知の装置、例えばD.G. Marreroら：Diabetes
Care,15/8, 1,045 〜1,049 (1992)に記載されたそれに
マイクロチップを組み込むことによって、（ａ）血液試
料中の総ヘモグロビン量を測定するための手段、（ｂ）
ヘモグロビン付加物の検定を実施するための手段、
（ｃ）該試料中の総ヘモグロビン量に対して，ヘモグロ
ビン付加物の測定値を正規化するための手段、および
（ｄ）ヘモグロビン付加物の正規化された濃度を総ヘモ
グロビン量で除して、ヘモグロビン付加物の補正された
濃度を得るための手段、を含む装置が提供される。
の工程は、マイクロチップの形態であってもよい予めプ
ログラムされたコンピュータ記憶機構を用いて実施する
ことができる。予め選ばれたヘモグロビン付加物の測定
のための公知の装置、例えばD.G. Marreroら：Diabetes
Care,15/8, 1,045 〜1,049 (1992)に記載されたそれに
マイクロチップを組み込むことによって、（ａ）血液試
料中の総ヘモグロビン量を測定するための手段、（ｂ）
ヘモグロビン付加物の検定を実施するための手段、
（ｃ）該試料中の総ヘモグロビン量に対して，ヘモグロ
ビン付加物の測定値を正規化するための手段、および
（ｄ）ヘモグロビン付加物の正規化された濃度を総ヘモ
グロビン量で除して、ヘモグロビン付加物の補正された
濃度を得るための手段、を含む装置が提供される。
【００３６】これに関わるヘモグロビン付加物および／
または検定方法が、ヘモグロビンの変性を必要とするよ
うなものであるときには、装置も、またヘモグロビンを
変性させるための手段を有することになる。
または検定方法が、ヘモグロビンの変性を必要とするよ
うなものであるときには、装置も、またヘモグロビンを
変性させるための手段を有することになる。
【００３７】この計器は、ヘモグロビン付加物の測定さ
れた濃度を血液試料中の総ヘモグロビン量に対して正規
化するのに必要な計算のすべてを実行するように予めプ
ログラムされた記憶機構を有する。
れた濃度を血液試料中の総ヘモグロビン量に対して正規
化するのに必要な計算のすべてを実行するように予めプ
ログラムされた記憶機構を有する。
【００３８】数学的方程式、例えば式（II）、並びに係
数ＩおよびＳは、計算機、コンピュータ、または総ヘモ
グロビン濃度および総ヘモグロビン付加物濃度を測定す
ることが可能な臨床分析装置とのインタフェースを備え
たコンピュータなどの計算装置の記憶機構内にプログラ
ムされ、記憶させることができる。臨床的試料のそれぞ
れについて、検定を実施することによってヘモグロビン
付加物の観測濃度および総ヘモグロビン濃度が測定され
る。そうして、計算機を用いた手動によるか、または予
めプログラムされたコンピュータによるかのいずれかに
よって、ヘモグロビン付加物の補正された濃度が決定さ
れる。これに代えて、臨床分析装置とのインタフェース
を備えたコンピュータから直接的に結果を得ることもで
きる。
数ＩおよびＳは、計算機、コンピュータ、または総ヘモ
グロビン濃度および総ヘモグロビン付加物濃度を測定す
ることが可能な臨床分析装置とのインタフェースを備え
たコンピュータなどの計算装置の記憶機構内にプログラ
ムされ、記憶させることができる。臨床的試料のそれぞ
れについて、検定を実施することによってヘモグロビン
付加物の観測濃度および総ヘモグロビン濃度が測定され
る。そうして、計算機を用いた手動によるか、または予
めプログラムされたコンピュータによるかのいずれかに
よって、ヘモグロビン付加物の補正された濃度が決定さ
れる。これに代えて、臨床分析装置とのインタフェース
を備えたコンピュータから直接的に結果を得ることもで
きる。
【図１】HbAlc についての免疫検定の標準曲線である。
【図２】免疫検定法を用いて測定された総ヘモグロビン
濃度で表されたHbAlc の観測された百分率の依存性を示
す図である。
濃度で表されたHbAlc の観測された百分率の依存性を示
す図である。
【図３】HbAlc の異なるレベルでの係数ａ1 を示す図で
ある。
ある。
【図４】HbAlc の異なるレベルでの係数ａ2 を示す図で
ある。
ある。
Claims (22)
- 【請求項１】 血液試料中の特定のヘモグロビン付加物
の測定方法であって、（ａ）血液試料を、その中に存在
する総ヘモグロビン量について、検定する工程、（ｂ）
血液試料中のヘモグロビンの総量に基づく偏差を生じ易
く、かつその濃度を測定しようとしているヘモグロビン
付加物に特異的である検定手法を用いて、血液試料を検
定する工程、（ｃ）該ヘモグロビン付加物の測定値を該
試料中の総ヘモグロビン量に対して、正規化する工程、
および（ｄ）該ヘモグロビン付加物の正規化された濃度
を該総ヘモグロビン濃度で除して、ヘモグロビン付加物
の補正された濃度を得る工程、を含むことを特徴とする
方法。 - 【請求項２】 正規化工程が、 Ａ．血液試料中の総ヘモグロビン量に基づく偏差を生じ
易い方法を用いて、（ａ）血液試料中の総ヘモグロビン
量に基づく偏差を生じない参照手順を用いて測定された
ヘモグロビン付加物の濃度を、（ｂ）該ヘモグロビン付
加物について、較正用血液試料を分析することにより得
られた応答に関係付ける較正曲線を作成する工程、 Ｂ．各試料中に、種々の濃度のヘモグロビンを同一濃度
のヘモグロビン付加物とともに含有する一系列の血液試
料を用意し、偏差を生じ易い該方法を用いて該付加物の
濃度を測定し、そしてＡ工程で作成した較正曲線から、
各試料のヘモグロビン付加物の観測濃度を得る工程、 Ｃ．（ａ）Ｂ工程で測定された各系列からのヘモグロビ
ン付加物の観測濃度を、（ｂ）その系列の各試料のヘモ
グロビン濃度に関係付ける適合する（ｎ次の）多項式の
一系列の曲線を作成して、多項曲線の適合化係数（ａ
n 、ａn-1 、ａn-2・・・・ａ0 ）を各曲線ごとに得、
そして曲線の系列全体についてこの過程を反復する工
程、 Ｄ．（ａ）Ｃ工程で作成した一系列の曲線に対する多項
曲線の適合化係数ａn を、（ｂ）正規化されたヘモグロ
ビン濃度でのヘモグロビンの百分率に関係付ける適合す
る直線を得、そして適合する直線の勾配（Ｓn ）および
切片（Ｉn ）を得る工程、 Ｅ．該多項曲線の適合化係数ａn-1 、ａn-2 ・・・・ａ
1 からそれぞれＳn-1 、Ｓn-2 ・・・・Ｓ1 およびＩ
n-1 、Ｉn-2 ・・・・Ｉ1 の値を得る工程、並びに Ｆ．方程式（Ｉ）： Hbad＝〔Hbad' −（Hbn −Nn）＊In−（Hbn-1 −Nn-1）＊In-1−（Hbn-2 −Nn -2 ）＊In-2−・・・・（Hb−N ）＊I1〕／〔（Hbn −Nn）＊Sn＋（Hbn-1 −Nn-1 ）＊Sn-1＋（Hbn-2 −Nn-2）＊Sn-2＋・・・・（Hb−N ）＊S1＋１〕 （Ｉ） 〔式中、Hbadは、その濃度を求めようとしているヘモグ
ロビン付加物の補正された濃度であり、Hbad’は、ｇ／
dlで示される観測濃度であり、Ｉn ・・・・Ｉ1および
Ｓn ・・・・Ｓ1 は、実験的に決定される係数であり、
そしてＮは、ｇ／dlの正規化されたヘモグロビン濃度で
ある〕を解くことによって、（ａ）ヘモグロビン付加物
の観測濃度を、（ｂ）総ヘモグロビンの観測濃度に関係
付けることによって、該ヘモグロビン付加物の補正され
た濃度を得る工程、によって達成される請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 正規化されたヘモグロビン濃度が、１４
である請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 ヘモグロビン付加物が、ヘモグロビン−
アセトアルデヒド、ヘモグロビン−尿素、ヘモグロビン
−アスピリン、ヘモグロビン−グルコース−６−リン
酸、ヘモグロビン−グルコース−１，６−二リン酸また
はヘモグロビン−グルタチオンである請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】 ヘモグロビン付加物が、グリケーション
化ヘモグロビンである請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 グリケーション化ヘモグロビンが、HbAl
c である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 付加物の観測濃度を、免疫検定法、化学
的手法または酵素的手法を用いて測定する請求項１記載
の方法。 - 【請求項８】 酵素が酸化酵素、還元酵素またはホスフ
ァターゼである酵素的手法を用いる請求項７記載の方
法。 - 【請求項９】 ヘモグロビン付加物を５−ヒドロキシメ
チルフルフリルおよびチオバルビツル酸で処理して着色
錯体を形成することを含む化学的検定法を用いる請求項
７記載の方法。 - 【請求項１０】 付加物の観測濃度をラテックス／凝集
免疫検定法を用いて測定する請求項７記載の方法。 - 【請求項１１】 ヘモグロビンを検定前に変性する請求
項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１２】 血液試料を高い塩濃度、低いpHもしく
は高いpH、カオトロピック試薬、または界面活性剤で処
理することによって変性を達成する請求項１１記載の方
法。 - 【請求項１３】 変性用試薬が、界面活性剤である請求
項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 界面活性剤が、ノニオン、カチオンま
たはアニオン系洗剤である請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 多項曲線が２次曲線である請求項１記
載の方法。 - 【請求項１６】 血液試料中のHbAlc の測定方法であっ
て、 （ａ）血液試料中のヘモグロビンの実質的な全量を変性
できる変性剤で該試料を処理する工程、 （ｂ）その中に存在する総ヘモグロビン量について変性
させた血液試料を検定する工程、 （ｃ）HbAlc について特異的である免疫検定法の手法を
用いて、変性させた血液試料を検定する工程、 （ｄ）該試料中の総ヘモグロビン量に対して、該免疫検
定法から得たHbAlc の測定値を正規化する工程、および （ｅ）正規化されたHbAlc の濃度を総ヘモグロビン濃度
で除して、HbAlc の補正された濃度を得る工程、を含む
ことを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 HbAlc の濃度が、 Ａ．（ａ）血液試料中の総ヘモグロビン量に基づく偏差
を生じない参照手順を用いて測定されたHbAlc の濃度
を、（ｂ）HbAlc について、較正用血液試料を免疫検定
法を用いて分析することにより得られた応答に関係付け
る較正曲線を作成する工程、 Ｂ．各試料中に種々の濃度のヘモグロビンを同一濃度の
HbAlc とともに含有する一系列の血液試料を用意し、免
疫検定法を用いて該HbAlc の濃度を測定し、そしてＡ工
程で作成した較正曲線から、各試料のHbAlc の観測濃度
を得る工程、 Ｃ．（ａ）Ｂ工程で測定された各系列のHbAlc の観測濃
度を、（ｂ）その系列の各試料のヘモグロビン濃度に関
係付ける適合する２次多項式の一系列の曲線を作成し
て、多項曲線の適合化係数（ａn 、ａn-1 、ａn-2 ・・
・・ａ0 ）を各曲線ごとに得、そして一系列の曲線全体
についてこの過程を反復する工程、 Ｄ．（ａ）Ｃ工程で作成した一系列の曲線に対する多項
曲線の適合化係数ａ1 を（ｂ）ヘモグロビンの１４ｇ／
dlという正規化された濃度でのヘモグロビンの百分率に
関係付ける適合する直線を得、そして適合する直線の勾
配（Ｓ1 ）および切片（Ｉ1 ）を得る工程、 Ｅ．該多項曲線の適合化係数ａ1 からＳ2 およびＩ2 の
値を得る工程、並びに Ｆ．方程式（II）： Alc ＝〔Alc ’−（Hb2 −142 ）＊I2−（Hb−14）＊I1〕／〔（Hb2 −142 ） ＊S2＋（Hb−14）＊S1＋１〕 （II） 〔式中、Alc は、HbAlc の補正された濃度であり、Alc
’は、免疫検定法で測定されたHbAlc の観測濃度であ
り、Hbは、ｇ／dlで示される総ヘモグロビン濃度であ
り、Ｉ2 、Ｉ1 、Ｓ2 およびＳ1 は、実験的に決定され
る係数であり、そして１４は、正規化されたヘモグロビ
ン濃度として選ばれた１４ｇ／dlのヘモグロビンであ
る〕を解くことによって、（ａ）HbAlc の観測濃度を、
（ｂ）総ヘモグロビンの観測濃度に関係付けることによ
って、該HbAlc の補正された濃度を得る工程、によって
正規化される請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 血液試料中のヘモグロビン付加物の濃
度を測定する装置であって、（ａ）該血液試料中の総ヘ
モグロビン量を測定するための手段、（ｂ）ヘモグロビ
ン付加物の濃度を測定するための手段、（ｃ）該試料中
のヘモグロビンの測定値を正規化するための手段、およ
び（ｄ）ヘモグロビン付加物の正規化された濃度を総ヘ
モグロビン濃度で除して、ヘモグロビン付加物の補正さ
れた濃度を得るための手段、を含むことを特徴とする装
置。 - 【請求項１９】 ヘモグロビン付加物の測定値を正規化
するための手段が、請求項２記載の方程式（Ｉ）： Hbad＝〔Hbad’−（Hbn −Nn）＊In−（Hbn-1 −Nn-1）＊In-1−（Hbn-2 −Nn -2 ）＊In-2−・・・・（Hb−N ）＊I1〕／〔（Hbn −Nn）＊Sn＋（Hbn-1 −Nn-1 ）＊Sn-1＋（Hbn-2 −Nn-2）＊Sn-2＋・・・・（Hb−N ）＊S1＋１ （Ｉ） 並びに係数ＩおよびＳが予めプログラムされている記憶
機構を有する計算装置である請求項１８記載の装置。 - 【請求項２０】 ２次多項式が用いられる請求項１９の
装置。 - 【請求項２１】 血液試料中のヘモグロビンをさらに界
面活性剤に接触させるための手段を含む請求項１８記載
の方法。 - 【請求項２２】 界面活性剤がノニオン、カチオンまた
はアニオン系洗剤である請求項２１記載の装置。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4147193A | 1993-04-02 | 1993-04-02 | |
| US041471 | 1993-06-18 | ||
| US08/077,546 US6043043A (en) | 1993-04-02 | 1993-06-18 | Method for the determination of hemoglobin adducts |
| US077546 | 1993-06-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06308122A true JPH06308122A (ja) | 1994-11-04 |
| JP3331251B2 JP3331251B2 (ja) | 2002-10-07 |
Family
ID=26718171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06280394A Expired - Lifetime JP3331251B2 (ja) | 1993-04-02 | 1994-03-31 | ヘモグロビン付加物の測定法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6043043A (ja) |
| EP (1) | EP0618449B1 (ja) |
| JP (1) | JP3331251B2 (ja) |
| AT (1) | ATE181599T1 (ja) |
| DE (1) | DE69419192T2 (ja) |
| DK (1) | DK0618449T3 (ja) |
| ES (1) | ES2132272T3 (ja) |
| FI (1) | FI109557B (ja) |
| NZ (1) | NZ260084A (ja) |
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| WO2004023143A2 (de) * | 2002-09-03 | 2004-03-18 | Zeptosens Ag | Analytische plattform und nachweisverfahren |
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1994
- 1994-03-14 NZ NZ260084A patent/NZ260084A/en unknown
- 1994-03-21 DE DE69419192T patent/DE69419192T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-21 DK DK94104399T patent/DK0618449T3/da active
- 1994-03-21 ES ES94104399T patent/ES2132272T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-21 EP EP94104399A patent/EP0618449B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-21 AT AT94104399T patent/ATE181599T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-03-31 FI FI941522A patent/FI109557B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-03-31 JP JP06280394A patent/JP3331251B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|
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