JPH06319543A - 改変された最適ｐＨを有する新規グルコースイソメラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 〔構成〕代替によって、改変された至適ｐＨ、特により
低い酸性側に改変された至適ｐＨを有する金属酵素、特
にグルコースイソメラーゼを生じさせるアミノ酸残基を
選択する方法が開示される。この方法は金属に配位する
配位子のｐＫａを改変することまたは金属結合について
のＫａｓｓを改変することに基づいている。この方法は
金属イオンの解離により低いｐＨで不活性化される金属
酵素に特異的である。 〔効果〕改変された至適ｐＨ、特により低い酸性側に改
変された至適ｐＨを有する新規グルコースイソメラーゼ
がこの方法によって提供される。これらの改変された性
質はより低いｐＨ値でデンプンの分解を行うことを可能
にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は金属酵素の性質を改善す
るためのタンパク質工学技術の適用に関する。変更によ
って金属酵素のｐＨ−活性プロフィールに影響を与える
アミノ酸を選択する方法が提供される。この方法はグル
コースイソメラーゼに適用される。本発明はまた改変さ
れた最適ｐＨを有する突然変異グルコースイソメラーゼ
分子を提供する。具体的にはｐＨ−活性プロフィールの
酸性側がより低いｐＨの方へ変位している。

【０００２】本発明はさらにフラクトースシロップ、特
に高フラクトースコーンシロップの生産に有利に適用し
得る組換えグルコースイソメラーゼを提供する。

【０００３】

【発明の背景】グルコースイソメラーゼの工業的適用 工業的なデンプン分解においては酵素が重要な役割を果
たす。酵素α−アミラーゼはデンプンの重合度約７−１
０のデキストリンへの液化に用いられる。ついで酵素α
−アミログルコシダーゼを糖化のために用い、９２−９
６％のグルコースを含むシロップを得る。グルコースの
フラクトースへの可逆的異性化は酵素グルコース（もし
くはキシロース）イソメラーゼによって触媒される。こ
の酵素の正しい命名はこの酵素のキシロースに対する優
先によりＤ−キシロース−ケトールイソメラーゼ（ＥＬ
５．３．１．５）である。しかしながら、グルコース
のフラクトースへの変換におけるこの酵素の主たる適用
により、この酵素は通常グルコースイソメラーゼと称せ
られる。この異性化についての平衡定数は１に近く、従
って最適プロセス条件下で約５０％のグルコースが変換
される。グルコースとフラクトースの平衡混合物は高フ
ラクトースシロップとして知られる。

【０００４】フラクトースは人間の味覚にとってグルコ
ースやスクロースよりはるかに甘く感じられ、このこと
がフラクトースを経済的に競争する砂糖代替物としてい
る。

【０００５】グルコースイソメラーゼを生産することが
見い出された多くの微生物が工業的に適用されてきた。
グルコースイソメラーゼの工業的使用についての詳細な
総説はＷｅｎ−Ｐｉｎ Ｃｈｅｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５ Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ
（１９８０）３０−４１及びＡｕｇｕｓｔ／Ｓｅｐｔｅ
ｍｂｅｒ（１９８０）３６−４１によって与えられた。

【０００６】Ｗｅｎ−Ｐｉｎ Ｃｈｅｎ文献は該酵素の
回収及び精製方法のみならず、該微生物の培養条件をも
記載している。さらに、この文献はグルコースイソメラ
ーゼの性質、例えば、基質特異性、最適温度及び最適ｐ
Ｈ、熱安定性及び金属イオン要求性も要約している。

【０００７】グルコースイソメラーゼはその触媒活性の
ためにＭｇ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋等の二価カチオン
またはこれらのカチオンの組合せを必要とする。異なる
グルコースイソメラーゼの３Ｄ構造の決定がモノマー単
位中の２つの金属イオンの存在を明らかにした（Ｆａｒ
ｂｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１（１９８７）４
５９−４６６；Ｒｅｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ４（１９
８７）１６５−１７２；Ｈｅｎｒｉｃｋら，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｅｎｇ．１（１９８７）４６７−４７５）。

【０００８】触媒機構における役割は別として、二価カ
チオンがいくつかのグルコースイソメラーゼの熱安定性
を増加することも報告されている（Ｍ．Ｃａｌｌａｎｓ
ら，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１
９８８（１０），６９５−７００）。さらに、グルコー
スイソメラーゼの触媒活性はＡｇ^＋、Ｈｇ^２＋、Ｃｕ
^２＋、Ｚｎ^２＋及びＣａ^２＋によって重度に阻害され
る。

【０００９】グルコースイソメラーゼは通常７．０−
９．０の間に最適ｐＨを有する。グルコースイソメラー
ゼを低いｐＨ値で用いると有利であるいくつかの理由が
ある；これらの理由のうち３つ ａ） 糖分子の安定性、 ｂ） 前の及び／または後のプロセス工程に対する適
合、 ｃ） 酵素の安定性 を以下に例証的にさらに説明する。 ａ） アルカリ性条件下で高められた温度では着色した
副生物の生成及び代謝されない糖（Ｄ−プシコース）の
生産が問題となる。望ましい運転ｐＨは６．０あたりで
ある。このｐＨあたりではグルコース及びフラクトース
の分解は最少になる。 ｂ） グルコースイソメラーゼを他の酵素と組み合わせ
て、または他の酵素工程の間で、例えば高フラクトース
シロップの製造において用いる場合もより低い最適ｐＨ
が望ましい。この方法における他の酵素工程の１つであ
るα−グルコアミラーゼの糖化はｐＨ４．５で行われ
る。 ｃ） 既知のグルコースイソメラーゼの大部分はｐＨ
７．５で適用される。このｐＨ値はより高いｐＨでのよ
り高い初期活性とより低いｐＨでの固定化酵素のより良
い安定性の間の妥協点であり、選ばれたｐＨでの最適生
産性をもたらす（Ｒ．Ｖ．Ｔｉｌｂｕｒｇ、題目：″Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｓｐｅｃｔ ｏｆＢｉｏｃａ
ｔａｌｙｓｔｓ ｉｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｔａ
ｒｃｈ Ｃｏｎｕｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ″（工業的デンプン変換技術における生物触媒の工学
的側面），Ｄｅｌｆｔｓｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ：ｔａｉｎ
ｅ Ｐｅｒｓ，１９８３）。７．５より低いｐＨでのグ
ルコースイソメラーゼの適用はより長い半減期から有利
であり、改良された基質特異性と組み合わせて、結果と
してその低いｐＨでの固定化酵素の生産性を増大させ
る。上記からプロセス条件下より低いｐＨ値でより高い
活性を有するグルコースイソメラーゼに対する要望があ
ると結論できる。

【００１０】より低い至適ｐＨを有するグルコースイソ
メラーゼを求めて多くの微生物がスクリーニングされ
た。多くの努力に拘らず、このアプローチは新規な工業
的グルコースイソメラーゼをもたらさなかった。

【００１１】タンパク質工学によってグルコースイソメ
ラーゼのｐＨ−活性プロフィールをより低いｐＨの方へ
変化させることができるためには、酸性ｐＨで触媒性能
における急激な減少を生じさせる根底となる作用を認識
することが重要である。

【００１２】酵素中での金属イオンの役割 酵素中での金属イオンについては２つの異なる機能が考
えられる。

【００１３】第一は金属イオンが構造的役割を有し得る
ことである。このことはそれらが適切な３Ｄ−構造の維
持に関与し、従って酵素分子の（熱）安定性に貢献する
ことである。かかる構造的及び安定化的役割の例はセリ
ンプロテイナーゼ中のズブチリシンファミリー（ｆａｍ
ｉｌｙ）におけるＣａ^２＋である。

【００１４】第２に、メタルイオンは触媒機構において
コフアクターとして働くことができる。この場合には酵
素活性は活性部位中の金属イオンの存在に厳密に依存す
る。例えば金属イオンは酵素と基質の間の橋として役立
ち得る（例えばホスホリパーゼ中でＣａ^２＋は基質のホ
スフェート基を結合する）かまたは水を活性化して強力
な親核性ヒドロキシルイオン（Ｚｎ^２＋−ＯＨ⁻）とし
得る。

【００１５】例としてＺｎ^２＋−プロテアーゼ（例えば
サーモリシン及びカルボキシペプチダーゼ）、カルボニ
ックアンヒドラーゼ（Ｚｎ^２＋）、ホスホリパーゼ−Ａ
_２（Ｃａ^２＋）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（Ｃａ^２＋）
及びアルカリ性ホスファターゼ（Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋）
がある。水素を移送するのにカルボキシルもしくはカル
ボニル基を分極するカチオンを必要とするα／β−樽状
酵素（ｂａｒｒｅｌｅｎｚｙｍｅｓ）の例はグルコース
／キシロースイソメラーゼ（Ｍｇ^２＋）、リブロース−
１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼ／オキシダー
ゼ（ＲＵＢＩＳＣＤ）（Ｍｇ^２＋）、エノラーゼ（Ｍｇ
^２＋）、イーストアルドラーゼ（Ｍｇ^２＋，Ｋ^＋）、マ
ンドレートラセマーゼ（Ｍｇ^２＋）、ムコネートシクロ
イソメラーゼ（Ｍｎ^２＋）である。金属キレート剤（例
えばＥＤＴＡ）の存在下に、これらの酵素は活性を完全
に失う。

【００１６】タンパク質分子における金属イオンの結合
は通常４または６の配位子による配位を含む。金属イオ
ンのタイプによって、異なる配位子が見い出されてい
る。例えばマグネシウム及びカルシウムはタンパク質生
鎖のカルボニル基、グルタミンもしくはアスパラギン側
鎖からのカルボニル基、またはアスパラギン酸もしくは
グルタミン酸側鎖からのカルボキシレート、からの酸素
原子によって通常配位される。亜鉛及び銅イオンはヒス
チジン側鎖からの窒素原子またはシステイン及びメチオ
ニンからのイオウ原子によって通常配位される。

【００１７】酵素のｐＨ依存性を決定する要素 酵素の活性は水性媒体のｐＨ値に依存する。この依存性
は一方で酵素の活性部位内のイオン化し得る基の（脱）
プロトン化、及び他方で基質または（存在する場合の）
生産物のイオン化し得る基の（脱）プロトン化によって
引き起こされる。タンパク質中のイオン化し得る基は塩
基性アミノ酸であるリジン、アルギニン及びヒスチジン
の側鎖（プロトン化された形態で正の電荷を帯びる）、
及び酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸
またはシステイン及びチロシンの側鎖（これらはすべて
脱プロトン化により負の電荷を帯びる）を包含する。さ
らに、Ｎ末端のアミノ基及びＣ末端のカルボキシル基は
それぞれ正の電荷及び負の電荷を帯びる。いくつかのア
ミノ酸のｐＫａ値を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】これらのｐＫａ値はモデル化合物に対して
あてはまるものであり、かつ、イオン化し得る基の特定
の環境により、異なるタンパク質内及び間で大きな変動
が生じることを十分に理解すべきである。酵素の機能と
構造において静電作用が基本的役割を演じることが知ら
れている（Ｊ．Ａ．Ｍａｔｔｒｅｗ；，ＣＲＣ Ｃｒｉ
ｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，１８（１９８５）９１−１９７）。イオン化
し得る基の近くの正の電荷の存在はそのｐＫａを低下さ
せ、他方、負の電荷はｐＫａの上昇を引き起こす。効果
の大きさはイオン化し得る基と電荷の間の距離に従って
減少する。さらに、この減少の大きさは媒体の誘電率に
依存する。特に触媒性残基はこれらの平均値から外れた
ｐＫａ値を示し得る（例えばＦｅｒｓｈｔ，Ｅｎｚｙｍ
ｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍ
（酵素の構造と機構），１９８５，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍ
ａｎ，ニューヨーク）。

【００２０】酵素で触媒される反応のｐＨ依存性はミカ
エリス定数ＫｍのｐＨ依存性と回転率定数Ｋｃａｔ（Ｖ
ｍａｘに等しい）のｐＨ依存性に分けることができる。
これらのパラメーターはそれぞれ基底状態及び転移状態
における基質の結合を表す。両方の基質形態の結合に影
響を与えるか、またはさもなくば触媒的出来事（ｃａｔ
ａｌｙｔｉｃ ｅｖｅｎｔ）（例えば一般的な塩基触媒
におけるが如きプロトンの取込みと放出）に関与するア
ミノ酸側鎖のｐＨ依存性（脱）プロトン化は、従って、
酵素のｐＨ−活性プロフィールを決定する。

【００２１】例えば、セリンプロテアーゼ（トリプシン
ファミリーとズブチリシンファミリーの双方）の触媒作
用性三回回転軸（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）中
のヒスチジンのプロトン化は低いｐＨ値（＜７）での活
性の喪失の原因となる。この場合、酵素活性のｐＫａは
このヒスチジン残基のｐＫａと直接関連している。

【００２２】２番目の例として、ペプシン、キモシン等
のアスパルチルプロテアーゼ中の２つのアスパラギン酸
残基を挙げることができる。これらの基はこれらのプロ
テアーゼの至適ｐＨを決定する。アスパラギン酸の代表
的構造配置は鐘形の（ｂｅｌｌ−ｓｈａｐｅｄ）ｐＨ−
活性プロフィールを生ぜしめる異なったｐＫａ値を該ア
スパラギン酸にもたしめる。

【００２３】広範囲の（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）化学的修
飾による表面電荷の改変によって触媒作用のｐＨ依存性
におけるかなりの変化をもたらすことができることが知
られている。しかしながら、多くの場合このアプローチ
は酵素の不活性化及び／または望ましくない構造変化を
生じさせる。なぜならこれらの方法はかなり非特異的だ
からである。チトクロームＣにおけるリジンの選択的化
学修飾が酸化還元電位に影響を与えることが示された
（Ｄ．Ｃ．Ｒｅｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７３，
３２３−３２６（１９８０））。しかしながら、これら
の結果は、修飾に用いたかさばった化学試薬がタンパク
質の構造を不安定にし得るという理由で、批判された。

【００２４】構造の不安定さの可能性を予想するために
タンパク質の３Ｄ（三次元）−構造を用い、及び部位特
異的突然変異誘発を用いて、タンパク質中の電荷分布を
非常に選択的に修飾することが可能である。

【００２５】Ｆｅｒｓｈｔ及び共同研究者は部位特異的
突然変異誘発によってズブチリシンのｐＨ−活性プロフ
ィールを操作できることを示した（Ｔｈｏｍａｓ；，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３１８，３７５−３７６（１９８５）；Ｒ
ｕｓｓｏｌｌ；，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９３，８
０３−８１３（１９８７）；Ｒｕｓｓｅｌ及びＦｅｒｓ
ｈｔ，Ｎａｔｕｒｅ３２８，４９６−５００（１９８
７））。タンパク質表面で活性部位から１０−１５Åの
ところに負に荷電した基を導入することによって活性部
位ヒスチジンのｐＫａ値が上昇する。逆に表面をより正
に荷電させると酸性基のｐＫａが低下する。活性部位か
ら１３ÅのところにあるＡｓｐ９９または１５Åのとこ
ろのＧｌｕ１５６をリジンに変化させると活性部位ヒス
チジンのｐＫａが０．６ｐＨ単位低下する。両方の残基
を同時に変化させて４つの電荷単位の変化を有する二重
突然変異体にするとｐＫａが１．０ｐＨ単位低下する。
クーロン相互作用における変化は累積的であり得ると思
われる。

【００２６】グルコースイソメラーゼ突然変異体 ＷＯ ８９／０１５２０（Ｌｅｔｕｓ）はストレプトマ
イセス・ルビギノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）から得られ、増加した安定性
を示すキシロースイソメラーゼのいくつかのミユーテイ
ン（ｍｕｔｅｉｎｓ）をリストしている。突然変異され
得る部位の選択は本発明で用いられるのとは異なる基準
に基づいている。３００以上の突然変異体がリストされ
ているが、突然変異酵素分子の性格付け及び改変につい
てのデータはそこには提示されていない。

【００２７】改良された性質を有する酵素を得るための方法論 改良された性質を有する酵素はいくつかの方法で、例え
ば古典的なスクリーニング法で、存在するタンパク質の
化学修飾によって、または近代的な遺伝子及びタンパク
質工学技術を用いて開発しまたは見つけ出すことができ
る。

【００２８】部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）は修飾
された酵素を得るもっとも特異的方法であって、１以上
のアミノ酸をいずれかの他の目的とするアミノ酸で特異
的に代替し得る。

【００２９】

【発明の概要】本発明は対応する野性型金属酵素と少な
くとも１つのアミノ酸において異なるアミノ酸配列を有
する新規突然変異金属酵素をコード化する遺伝子の発現
によって得られ、改変された触媒的性質を示す該変異金
属酵素を提供する。具体的には、活性部位の周囲の全体
的電荷分布を変化させることによってｐＨ−活性プロフ
ィールを改変している。

【００３０】本発明の好ましい態様の１つにおいてはグ
ルコースイソメラーゼが突然変異される。

【００３１】ｐＨ−活性プロフィールを変化調節するた
めに部位特異的突然変異誘発によって探査できる、野性
型酵素中の、部位を選択する方法を提供することが本発
明の別の一面である。

【００３２】さらに別の一面において本発明は野性型グ
ルコースイソメラーゼと比較してより酸性の至適ｐＨを
有するグルコースイソメラーゼを提供する。

【００３３】

【本発明の詳しい記述】本発明は酵素の工業的適用性を
改良する修飾を記述する。本発明は組換えＤＮＡ技術を
使用する。かかる技術はえり抜きのタンパク質における
目的とするアミノ酸の置き代えを得るのに強力な手段と
なる。実質上無制限量の可能なアミノ酸代替があるの
で、選択的アプローチを用いるのが好ましい。このアプ
ローチはタンパク質結晶学、分子模型化及びコンピュー
タ使用方法、酵素学及び動力学、分子生物学及びタンパ
ク質化学技術のよく調和させた適用に依存する。標的突
然変異の同定のための入念な方策は点突然変異が局地的
動揺（ｌｏｃａｌ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）のみを
引き起こすことがめったにないことが認識されるという
意味で革新的である。突然変異は一般にタンパク質のい
くつかの異なる性質に一度に影響を与える。従って、記
述された方策はよく確立された構造−機能相関関係を利
用するけれども、それらはまた二次的性質の望ましくな
い改変を避けるかまたは訂正する合理的方法を提供す
る。

【００３４】目的とする突然変異体の広範囲の調査研究
が改良された性質を有する突然変異体の同定をもたら
す。

【００３５】ここにおいて本グルコースイソメラーゼと
の関係で用いられる「改良された性質」によって、ｐＨ
−活性プロフィールの酸性側が対応する野性型酵素に比
べより酸性の至適ｐＨの方へ変位している酵素が意味さ
れる。

【００３６】野性型グルコースイソメラーゼのｐＨ−活
性プロフィールは７．０より下の酸性ｐＨ及び８．０よ
り上のアルカリ性ｐＨの両方で活性が減少することが確
認された（実施例１−図３）。前述のごとくグルコース
イソメラーゼをより低いｐＨで用いることができれば好
ましい。

【００３７】驚くべきことに、グルコースイソメラーゼ
の触媒性金属イオンの配位に直接関与する１以上のアミ
ノ酸のプロトン化によって、ｐＨ−活性プロフィールの
酸性側の活性低下が引き起こされることが見い出され
た。このことは定常状能の動力学によって決定される、
金属の結合についての見掛けの会合定数（ａｐｐａｒｅ
ｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）が
同様なｐＨ依存性を示したことから導かれた（実施例１
−図５）。これは以下のモデルによって表すことができ
る：

【００３８】

【化１】

【００３９】上式中、「部位」は異なる（イオン化し得
る）配位子よりなる幾何学的結合部位を表す。酵素はこ
の部位がＭｇ^２＋イオンによって占拠されている場合の
み活性であり、一方Ｍｇ^２＋イオンは非プロトン化金属
結合部位（「部位」）にのみ結合でき、プロトン化され
た部位（「部位：Ｈ^＋」）には結合できない。金属結合
部位のｐＨ依存性プロトン化はｐＫａによって特徴づけ
られ、非プロトン化部位に結合する金属は会合定数Ｋａ
ｓｓによって特徴づけられる。金属結合についての見掛
けの会合定数は真のＫａｓｓの関数であり、ｐＫａ及び
ｐＨは以下のごとく表される：

【００４０】

【化２】

【００４１】反応速度（ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）はＭｇ^２＋と複合化する酵素分
子の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）に比例する。この分画は
より高い［Ｍｇ^２＋］＊Ｋａｓｓ ａｐｐａｒｅｎｔで
増加する。

【００４２】提出されたモデルはグルコースイソメラー
ゼで観察された結果に基づくものであるが、より低いｐ
Ｈでの不活性化が金属イオンの解離による限り、このモ
デル、及びそれから導かれる方法、を金属酵素一般に用
い得ることは明らかである。

【００４３】アルカリ性ｐＨで観察された活性低下は最
大速度（Ｖｍａｘ）の減少により、触媒機構に必須のア
ミノ酸残基の脱プロトン化を反映している。

【００４４】ｐＨ−活性プロフィールの酸性側での活性
の減少を説明するのに用いることができる上記のモデル
から、より低いｐＨ値でのグルコースイソメラーゼの活
性を増大させるためにはＫａｓｓを増大させ及び／また
はｐＫａを減少させねばならないことが導かれる。

【００４５】従って、本発明の一態様においては、グル
コースイソメラーゼ等の金属酵素をコード化するＤＮＡ
配列を、突然変異体タンパク質が金属結合における配位
子として作用するアミノ酸側鎖のｐＫａにおける変化の
結果としてのｐＨ−活性プロフィールにおける変化を示
すように、突然変異させる。

【００４６】アミノ酸側鎖のｐＫａの改変による、金属
酵素のｐＨ−活性プロフィールのより低いｐＨへの変位 金属に配位する配位子のｐＫａをより酸性側のｐＨに変
位させるために、金属酵素の金属結合部位の周囲の全体
的正電荷を増加させる残基を導入しなければならない。
結果として、それについて最適ｐＨの酸性側での活性が
金属結合のｐＫａによって引き起こされる、金属酵素の
活性のｐＨ依存性はそれによって変化する。この電荷変
化は金属結合のｐＨ依存性の原因となるイオン化し得る
基の負の電荷を長い範囲の静電作用（ｌｏｎｇ ｒａｎ
ｇｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ）
により安定化する。

【００４７】好ましい態様によるとグルコースイソメラ
ーゼのｐＨ−活性プロフィールのより酸性側のｐＨへの
変位はグルコースイソメラーゼの活性部位の周りの全体
的な正の電荷を増大せしめることによって達成される。

【００４８】中性付近のｐＨでは正の電荷の正味の増加
は − 負に荷電した残基（ＡｓｐもしくはＧｌｎ）の中性
の残基への代替、 − 中性の残基の正に荷電した残基（ＡｒｇもしくはＬ
ｙｓ）への代替、 − 負に荷電した残基の正に荷電した残基への代替 によって得られる。

【００４９】突然変異させるのが適当な残基の選択につ
いては以下の基準を挙げることができる： Ｉ その位置での代替が正の電荷における正味の増加を
生じさせる位置を標的残基の周囲１５オングストローム
半径以内で選択する。標的残基はそのカチオンの配位に
関与するイオン化し得る基である。 −正の電荷をすでに含有しているすべての位置：アルギ
ニンまたはリジン。 −タンパク質の背骨原子と許容されないファンデルクー
ルス重なりを生じるのでアルギニンまたはリジンを停泊
させ得ないすべての位置。 −ファンデルクールス重なりをさけるために直接の環境
における別の位置の広範囲の（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）適
合をアルギニンまたはリジンが必要とするすべての位
置。 −アルギニンまたはリジンへの代替が疏水性クラスター
において包埋された補償されない電荷を生じさせるすべ
ての位置。 −代表的な構造配置、例えば塩橋（ｓａｌｔ ｂｒｉｄ
ｇｅｓ）、ヘリックスの詰込み（ｐａｃｋｉｎｇ ｏｆ
ｈｅｌｉｃｃｓ）、ヘリックスの出発点での負の電荷
を維持することによるヘリックスの安定化、ヘリックス
の開始（例えばヘリックスの出発点のプロリン）、挿入
されようとしている残基について許容された領域の外に
あるフアイ−プサイ（ｐｈｉ−ｐｓｉ）角に関与するの
で残基を代替すべきでないすべての位置。

【００５０】ＩＩ 好ましい態様においては以下のアミ
ノ酸も収集から外される： −触媒作用、コファクター結合（金属イオンやヌクレチ
ド）に関与するすべての残基 −（利用し得る場合の）相同酵素間で厳格に保存されて
いると思われるすべての位置。

【００５１】ＩＩＩ ついで優先を各々の可能な突然変
異部位について帰属させることができる。これは残基の
構造環境、「標的」残基への距離、該部位での残基が関
与する水素結合パターン、及び溶媒の接近可能性（ａｃ
ｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）の検査によってなされる。対
イオンによる静電相互作用のマスキングをさけるために
標的残基から溶媒によって遮蔽され得ない部位での電荷
の導入が好ましい。従って一般に、タンパク質と溶媒と
の間の誘電作用の差により、タンパク質の内部に包埋さ
れているかまたはタンパク質表面上の割れ目に部分的に
包埋されているという事実により完全に溶媒和され得な
い電荷が完全に溶媒和されている電荷より作用を起こし
易い。さらに、グルコースイソメラーゼの場合、グルコ
ースのフラクトースへの変換は低いイオン強度で行わ
れ、従って対イオンによる遮蔽が、本発明の態様内の新
規グルコースイソメラーゼ内での新たに設計された電荷
−電荷相互作用とより少ない重大性においてしか干渉し
ないことが予想される。正の電荷へ代替する場合、上記
の選ばれた部位に対する低い優先（ｐｒｉｏｒｉｔｙ）
の割当てについての基準は −正の電荷の導入及び／または負の電荷の除去は４級構
造の保持（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に影響を与えるであろ
う。 −標的残基から溶媒によって遮蔽されることが予想され
るように、従って溶媒が標的残基のｐＫａに対する作用
を減少させるように、該部位は完全に溶媒が接近し得
る。

【００５２】同様に、金属結合部位の周囲の全体的負電
荷の増加によってｐＫａはより塩基性ｐＨ値に変位す
る。

【００５３】金属結合についてのＫａｓｓの増加によ
る、金属酵素のｐＨ−活性プロフィールのより低いｐＨ
への変位 本発明の別の好ましい態様においては、ｐＨ−活性プロ
フィールのより低いｐＨへの変位はＫａｓｓの増加によ
って達成される。

【００５４】金属酵素のｐＨ−活性プロフィールのより
酸性のｐＨへの変位は金属結合についての会合定数を増
加することによって達成し得る。金属結合（ｍｅｔａｌ
ｂｉｎｄｉｎｇ）についての会合定数は金属の配位子
による配位の最適化によって増加させることができる。
これはより良い配位子の導入またはより多くの配位子の
導入によって実現させ得る。静電相互作用ははるかに長
い距離に亘って金属結合についての会合定数に貢献し得
る。

【００５５】別の好ましい態様においては、金属結合に
ついての会合定数を増加させることによって、グルコー
スイソメラーゼのｐＨ−活性プロフィールの酸性側をよ
り低いｐＨに変位させる。

【００５６】グルコースイソメラーゼは１つのサブユニ
ットあたり２つのマグネシウムを結合し、テトラマーあ
たりでは８つのカチオンを結合し、それによって全電荷
を＋１６ほど増加させる（図１参照）。両結合部位とも
β−樽状部（β−ｂａｒｒｅｌ）のＣ末端に位置してい
る。「下方の」結合部位は樽状部のかなり深くに位置し
ており、キシリトール複合体では阻害剤からの２つの酸
素を直接結合する。第２の結合部位（「上方の」）はβ
−樽状部の末端近くであって、活性部位割れ目及びサブ
ユット界面の近くに位置している。

【００５７】一般に、正に荷電したイオンが第二の粒子
に結合する場合、総括平衡親和性定数（ｏｖｅｒａｌｌ
ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎ
ｓｔａｎｔ）のみならず会合及び解離速度定数（ａｓｓ
ｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）は第２の粒子の電荷に
依存する。粒子も正に荷電している場合反力が起こり、
反対の電荷の場合には引力が起こる。小さなイオン、及
びある場合にはタンパク質について、この効果（ｅｆｆ
ｅｃｔ）を、反応速度のイオン強度依存性を研究するこ
とによって、定量できる。反対に荷電したイオンの会合
速度はイオン強度の増加に伴って減少し、同じ電荷の会
合速度はイオン強度の増加に伴って増加し、粒子の一方
（ｏｎｅ）が荷電していない場合、イオン強度の影響は
ない。

【００５８】グルコースイソメラーゼのマグネシウムに
対する親和性は、グルコースイソメラーゼ結合部位の全
体としての負の電荷と首尾一貫している（ｃｏｎｓｉｓ
ｔａｎｔ ｗｉｔｈ）イオン強度を増加するに従って減
少する。カチオンの結合性は荷電したアミノ酸を、カチ
オンの軌道（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）に沿ったタンパク
質表面で活性部位の入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）上に、導
入することによって改変し得る。より具体的には、本発
明はカチオンの会合速度定数を改変するための静電力の
使用に関する。グルコースイソメラーゼは活性部位溝
（ｃｈａｎｎｅｌ）近くへの負の電荷の付加（または正
の電荷の除去）によってカチオンについての会合定数を
増大するよう、または活性部位溝近くへの正の電荷の付
加（または負の電荷の除去）によってカチオンについて
の会合定数を減少する工作することができる。オフ速度
（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は実質上影響されないと予想され
るので、改変されたオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）がカチ
オンの改変された全体としての会合定数をもたらす。β
樽状部のＣ末端に位置するループ領域が活性部位入口
（ｅｎｔｒｙ）を形づくるので、可能な突然変異部位は
これらの領域で捜索される。樽状部の安定性を妨害する
可能性をさけるために、β−鎖またはα−ヘリックス内
での代替は考慮されない。以下の合理的な考え（ｒａｔ
ｉｏｎａｌ）を用いることができる：

【００５９】− β−鎖のＣ末端とα−ヘリックスのＮ
末端の間の領域におけるすべての残基を選択する − 金属配位子（ｍｅｔａｌ ｌｉｇａｎｄｓ）の周囲
１５Å半径の球内の正味の正の電荷が置換によって減少
するすべての残基をさらなる考慮から除外する。金属結
合側（ｍｅｔａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｄｅ）にあま
りに近接した負の電向の導入は金属配位子のｐＫａをよ
り高いｐＨへ変位させ、これによって低いｐＨで増加し
たＫａｓｓの効果が打ち消される。 − 残りの残基の各々についてその利用し得る（ａｃｃ
ｅｓｓｉｂｌｅ）表面積をタンパク質の関連において及
び半径１．４Åのプローブを用いて計算する。１０Å^２
より小さな利用し得る表面積しか有さない意味で包埋さ
れている残基を除外する。

【００６０】構造的情報 酵素（または酵素：基質または酵素：阻害剤複合体）の
３次元（３Ｄ）構造の情報は導入することができる突然
変異について予想する上で重要である。

【００６１】構造データがストレプトマイセス・ルビギ
ノーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｕｂｉｇｉｎ
ｏｓｕｓ（Ｃａｒｒｅｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５９（１９８４）３２３０−３２３６；Ｃａｒｒ
ｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６，（１９８９）４４０−４４４４）、ストレプ
トマイセス・オリボクロモゲヌス（Ｓ．ｏｌｉｖｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｕｓ）（Ｆａｒｂｅｒら，Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｅｎｇ．１，（１９８７）４６７−４７５；Ｆａｒ
ｂｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８（１９８
７）７２８９−７２９７）、アースロバクター（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ）（Ｈａｎｄｒｉｃｋら，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．２０８（１９８９）１２７−１５７）及
びストレプトマイセス・アルバス（Ｓ．ａｌｂｕｓ）
（Ｄａｕｔｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４７，１−
８）のグルコースイソメラーゼについて報告されてい
る。

【００６２】これらの酵素についてのすべてアミノ酸配
列データがある訳ではないが、アクチノプラネス・ミソ
ウリエンシス（Ａｃｔｉｒｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏ
ｕｒｉｅｎｓｉｃ）のグルコースイソメラーゼとの３Ｄ
−構造の相同性は顕著である（Ｆ．Ｒｅｙら，Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ４（１９８８）１６５−１７２参照）。本明
細書に記述された方法の一般的適用可能性を示すため、
種々の種に起源するグルコースイソメラーゼの遺伝子を
クローン化し配列決定した。ストレプトマイセス・ヴィ
オラセオルーバー（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅ
ｒ）、ストレプトマイセス・ムリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎ
ｕｓ）、アースロバクター・スピーシーズ及びストレプ
トマイセス・サーモバルガリス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｖｕ
ｌｇａｒｉｓ）の遺伝子から導かれたグルコースイソメ
ラーゼのアミノ酸配列は相同であることが示されてい
る。それぞれの遺伝子のヌクレオチド配列から導き出さ
れた、アンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）
・スピーシーズ（Ｓａａｒｉ，同書）及びストレプトマ
イセス・ヴィオラセオニガー（Ｓ．ｖｉｏｌａｃｅｏｎ
ｉｇｅｒ）（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１
９８８）９３３７）のグルコースイソメラーゼの発表さ
れたアミノ酸配列はアクチノプラネス・ミソウリエンシ
スのグルコースイソメラーゼに密接な相同性を示してい
る。さらに、ＷＯ８９／０１５２０はストレプトマイセ
ス・ルビギノーサス（Ｓ．ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）の
グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列がアンプラリー
ラ・スピーシーズのグルコースイソメラーゼに相同であ
ることを開示している。

【００６３】大部分のグルコースイソメラーゼについて
３Ｄ構造データがないけれども、放線菌目からのすべて
のグルコースイソメラーゼは類似の４量体構成を有する
と結論できる。

【００６４】一般に、全体的相同性が６５％より大、好
ましくは７４％（Ａｍｏｒｅ及びＨｏｌｌｅｎｂｅｒ
ｇ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，７５１５
（１９８９）によると、アクチノプラネス・ミソウリエ
ンシスとストレプトマイセスのグルコースイソメラーゼ
の間の最低相同性）、及びより好ましくは８５％より大
であって、かつ３Ｄ構造が類似している場合には、アミ
ノ酸代替は至適ｐＨにおける同様な変化をもたらすと考
えられる。具体的には、放線菌目に属する種からのグル
コースイソメラーゼが、選択された部位でのアミノ酸代
替による至適ｐＨの変化が類似するほど高い程度の類似
性を有すると予想される。アクチノプラネス・ミソウリ
エンシスはグルコースイソメラーゼを突然変異させるの
に好ましいソースとなる。

【００６５】図１はアクチノプラネス・ミソウリエンシ
スからのグルコースイソメラーゼの活性部位の図式的表
示である。

【００６６】図２は種々のグルコースイソメラーゼの一
列整列したアミノ酸配列を示す。

【００６７】本発明ではアミノ酸について三文字コード
及び一文字コードの両方を用いる（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐ．１３，第２版，Ｗ．
Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ及び（ｏｍｐ．，ＮＹ，１９８
１）。

【００６８】実験例Ｄ−グルコースイソメラーゼ遺伝子のクローニング及び
発現 Ｄ−グルコースイソメラーゼ（ＧＩ）はＤ−キシロース
をＤ−キシルロースに変換する酵素であるＤ−キシロー
スイソメラーゼ（Ｄ−キシロース）ケトール−イソメラ
ーゼ（ＥＣ ５．３．１．５）について同義的に用いら
れる。巧みに工作されたＥ．コリ菌株によって生産され
るアクチノプラネス・ミソウリエンシスからのグルコー
スイソメラーゼはＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）ＧＩと命名さ
れる。ＧＩをコード化するアクチノプラネス・ミソウリ
エンシスの遺伝子を類似のＥ．コリ_ｘｙ１Ａ遺伝子から
区別するため、前者をＧＩと称する。

【００６９】ＤＮＡ分子の操作方法はＭａｎｉａｔｉｓ
ら（１９８２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９
８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学におけ
る最近のプロトコル），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏ
ｎｓ社、ニューヨーク）に記載されている。アクチノプ
ラネス・ミソウリエンシスＤＳＭ４３０４６からのグル
コースイソメラーゼのクローニング及びＤＮＡ配列決定
はＥＰ−Ａ−０３５１０２９に記載されている。導かれ
たＧＩのアミノ酸配列は番号を付され、図２で他のグル
コースイソメラーゼと比較されている。以下、アミノ酸
の番号付けは図２を参照する。

【００７０】ＥＰ−Ａ−０３５１０２９に記述されたよ
うにして野性型及び突然変異ＧＩ酵素をＥ．コリ菌株Ｋ
５１４で生産した。

【００７１】発現産物の酵素活性のアッセイ グルコースイソメラーゼの酵素活性を以下に示すように
してアッセイした（酵素活性１単位は１分当り１．０μ
ｍｏｌの生産物−Ｄ−キシルロースまたはＤ−フラクト
ース−を生産する；従って、比活性−ｓｐａ−はＧＩ酵
素１ｍｇあたりの単位として表される）。

【００７２】グルコースイソメラーゼによるキシロース
の異性化によって３５°Ｃで生産されたキシルロースの
２７８ｎｍでの吸収の増大を測定することによってＧＩ
活性を直接アッセイできる。このアッセイは１０ｍＭ
ＭｇＳＯ_４を含有する５０ｍＭトリエタノールアミン緩
衝液、ｐＨ７．５中で０．１Ｍキシロースの存在下に行
った。アッセイにおけるグルコースイソメラーゼの最終
濃度は±０．０１ｍｇ／ｍｌであった。この濃度は、酵
素アッセイ混合物での希釈に先立ち、１．０ｍｇ／ｍｌ
の酵素溶液について２７８ｎｍで１．０８の吸光係数を
用いる吸収分光分析法によって正確に測定した。

【００７３】比活性はＤ−ソルビトールデヒドロゲナー
ゼとカップルさせたアッセイによって測定し、Ｄ−キシ
ルロースの酵素測定は、インキュベーション緩衝液が１
ｍＭエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）テトラ酢
酸（ＥＧＴＡ）をも含有することを除いて前述の如く
（Ｋｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｏｎら，Ｅｎｚｙ
ｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９８７）
１４５）、５０ｍＭトリスエタノールアミン、ｐＨ７．
５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４及び０．１Ｍキシロース中、
±２×１０^−８ＭのＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ
（Ｌ−イディトール（ｉｄｉｔｏｌ）：ＮＡＤオキシド
リダクターゼ、ＥＣｌ．１．１４）及び０．１５ｎＭ
ＮＡＤＨの存在下に３５℃でＤ−キシルロースの酵素測
定を行った。このアッセイにおけるグルコールイソメラ
ーゼの最終濃度は±２．５×１０^−３ｍｇ／ｍｌであ
り、この濃度は上述のようにして正確に測定した。

【００７４】ケト糖を酸中のカルバゾールとの反応によ
る紫色の生産物の生成に基づくシステイン−カルバゾー
ル法（ＣＣＭ）（Ｄｉｓｃｈｅ及びＢｏｒｅｎｆｒｅｕ
ｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９２（１９５１）５
８３）を用いて、異性化反応中に生産されたＤ−フラク
トースを測定することによって、基質としてグルコース
を用いるＧＩ活性をアッセイすることができる。

【００７５】

【実施例】実施例１：グルコースイソメラーゼ活性のｐＨ依存性 野性型及び突然変異グルコースイソメラーゼのｐＨ−活
性プロフィールを求めるため、１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４及
び２００ｍＭキシロースの存在下ｐＨ（５．２−８．
０）の関数として活性を測定した（直接アッセイ法を用
いた）。非常に低い活性を有する変異体についてはカッ
プルさせたソルビトールデヒドロゲナーゼアッセイ系を
ｐＨ５．８と８．４の間で用いた。極端なｐＨ値でソル
ビトールデヒドロゲナーゼ反応が速度制限的にならない
よう注意した。

【００７６】２００ｍＭのキシロース及び異なる活性化
カチオンの存在下でのグルコースイソメラーゼ（すなわ
ちアクチノプラネス・ミソウリエンシスからの組換え野
性型酵素）のｐＨ−活性プロフィールを図３に示す。図
３は７．０より下の酸性ｐＨ及び８．０より上のアルカ
リ性ｐＨの両方での活性減少を示している。

【００７７】グルコースイソメラーゼについての適切な
定常状態での動力学機構は速度制限工程において生産物
に変換される酵素−糖複合体の急速な生成（いわゆる急
速平衡、ランダム順序機構（ｒａｎｄｏｍ ｏｒｄｅｒ
ｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）−図４参照）を包含する。
平衡及び過渡動力学蛍光測定（停止流 （ｓｔｏｐｐｅ
ｄ ｆｌｏｗ））は２つの金属イオン結合部位の存在を
示す。停止流実験において金属イオンは連続的に結合す
る。高親和性金属は活性な立体配座（コンホーメーショ
ン）を継持することに役割を演じ、従って「立体配座」
部位と称せられる。第２の金属結合部位は活性化するカ
チオンを収容し、従ってこの部位は通常「触媒作用」部
位と称せられる。図４に示される反応スキームは定常状
態及び停止流実験を分析し比較するのに十分であると思
われる。原則的には定常状態での結果は２つの金属結合
部位を区別しないが、主たる効果は触媒性金属結合から
生じると想定される。

【００７８】キシロース変換の初期速度（Ｖ）のキシロ
ース及びマグネシウム濃度の関数としての分析は４つの
パラメーターの測定を可能にする：最大速度、遊離酵素
へのマグネシウム結合についての平衡定数（Ｋ_１）、酵
素−糖複合体へのマグネシウム結合についての平衡定数
（Ｋ_４）、遊離酵素へのキシロース結合の平衡定数（Ｋ
_２）及び酵素−マグネシウム複合体へのキシロース結合
の平衡定数（Ｋ_３）。

【００７９】

【化３】

【００８０】マグネシウムイオン及びキシロース濃度の
組織的変化によって最大速度についての値及び４つの平
衡定数すべてについての値を得ることができた。図５は
これらのパラメーターのｐＨ依存性を示す。

【００８１】図３と図５の結果の比較から、ｐＨプロフ
ィールの酸性側を金属イオン結合によって完全に決定で
きることが分る。図５のデータは関与するイオン化の数
を計算するには十分正確でない。しかしながら、ｌｏｇ
Ｋ_１．４対ｐＨのプロットの傾斜（傾斜＞１）は１以上
のイオン化が関与し得ることを示している。Ｋ_１とＫ_４
のｐＨ依存性における類似性は同じイオン化する基が
（同じ部位を含む）これら両プロセスにとって重要であ
ることを示している。

【００８２】実施例２：その代替が金属結合、イオン化
し得るアミノ酸のｐＫａ値を改変する、グルコースイソ
メラーゼ中のアミノ酸残基の選択 グルコースイソメラーゼの場合において、本発明の詳し
い記述で概説した、代替について可能な位置の選択につ
いての基準を、異なるソースからの一列整列させた配列
（図２）及び阻害剤キシリトールと複合化させたアクチ
ノプラネス・ミソウリエンシスのグルコースイソメラー
ゼの高度に精密な構造（図１及び「発明の詳しい記述」
の「構造的情報」参照）を用いて適用した。２．２オン
グストロームの解像度を有する高度に精密な構造は阻害
剤及び２つの金属結合部位の位置を示している。アクチ
ノプラネス・ミソウリエンシスのグルコースイソメラー
ゼの活性部位の図式的表示を図１に示す。

【００８３】コバルト及びキシリトールと複合化させた
グルコースイソメラーゼ構造から、より正に荷電したア
ミノ酸残基への代替が標的イオン化可能基の周り１５オ
ングストローム半径内における正の電荷の正味の増加を
生じさせる残基を選択した。グルコースイソメラーゼの
場合、標的は活性に必要とされる金属イオンの配位に関
与するイオン化し得る基である。これらのイオン化可能
基はＧｌｕ１８１、Ｇｌｕ２１７、Ａｓｐ２４５、Ａｓ
ｐ２５５、Ａｓｐ２９２のカルボニル基及びＨｉｓ２２
０のＮＥを包含する。

【００８４】基準Ｉの適用後、８０の可能な突然変異部
位が残った。これらの部位を以下に示す：

【００８５】触媒作用残基及び厳密に保存された残基の
除外（基準ＩＩ）後、以下の６２の残基が残った：Ａｌ
ａ５，Ｌｅｕ１５，Ｇｌｎ２１，Ａｌａ２５，Ｐｈｅ２
６，Ａｓｐ２８，Ａｌａ２９，Ｇｌｙ４７，Ｔｙｒ４
９，

【００８６】ついでこれら６２の可能な突然変異部位の
各々について基準ＩＩＩに従って優先を帰属させた。以
下の２４の部位が突然変異誘発に対し高い優先を有する
ものとして帰属させた：Ａｌａ２５，Ｇｌｙ４７，Ｔｙ
ｒ４９，Ｔｈｒ５２，Ｐｈｅ６１，Ｉｌｅ８５，

【００８７】選ばれた８０のアミノ酸残基の１つもしく
はいくつかの正に荷電した残基への突然変異はグルコー
スイソメラーゼの金属結合のｐＫａの減少をもたらすで
あろう。これによってｐＨ−活性プロフィールのより低
いｐＨへの対応する変位が生じ得る。

【００８８】同様に、選ばれた８０のアミノ酸残基の１
つもしくはいくつかの負に荷電した残基への突然変異は
グルコースイソメラーゼの金属結合のｐＫａの増加を生
じさせるであろう。これによってｐＨ−活性プロフィー
ルのより高いｐＨへの対応する変位が生じ得る。

【００８９】実施例３：Ｌｙｓ ２９４の突然変異のｐ
Ｈ−活性プロフィールへの効果 グルコースイソメラーゼ−キシリトール複合体中でもっ
とも高く占拠された金属結合部位（図１中の３９５）か
ら約８オングストロームのところで、グルコースイソメ
ラーゼの位置２９４のところに正の電荷が位置してい
る。このリジンをアルギニンに代替することによってこ
の部位の突然変異を行った。この突然変異は位置２９４
での正の電荷を保存する。この突然変異体のｐＨ−活性
プロフィールが野性型のと類似しているという観察はこ
の正の電荷の保存と首尾一貫する。

【００９０】しかしながら、リジン２９４をグルタミン
で代替することにより位置２９４での正の電荷を除去し
た場合には、ｐＨ−活性プロフィールの約０．５ｐＨ単
位のアルカリ性部位への変位が観察された。Ｋ２９４Ｒ
及びＫ２９４ＱについてのｐＨ−活性プロフィールを図
６に示す。

【００９１】この実施例は活性部位の周りのグルコース
イソメラーゼの正味電荷を変化させることによって、該
タンパク質の活性部位において、１以上の官能基のｐＫ
ａを操作することが可能であることを例示している。

【００９２】実施例４：Ｇｌｕ１８６の突然変異及びマ
グネシウムイオンのマンガンイオンによる代替のｐＨ−
活性プロフィールへの影響 突然変異体Ｅ１８６Ｑにおいて負の電荷を中性の電荷に
代替して、金属配位子の周り１５オングストローム半径
内の正の電荷の正味の増加を生じさせる。マグネシウム
の存在下でのＥ１８６ＱのｐＨ−活性プロフィールを図
７に示す。ｐＨプロフィールのアルカリ性側はより低い
ｐＨの方へかなり変位している。マグネシウムの代りに
マンガンの存在下ではＥ１８６ＱのｐＨ−活性プロフィ
ールはより低いｐＨに変位し、その至適ｐＨでその活性
は野性型についてよりより高い（図８）。

【００９３】マグネシウム以外の金属イオンを用い得る
適用については、低いｐＨでのＥ１８６Ｑとマンガンの
組合せは興味ある選択である。

【００９４】電荷に関して保存的である突然変異Ｅ１８
６Ｄも行われた。この突然変異体のｐＨ−活性プロフィ
ールを図７及び８に示す。Ｅ１８６Ｄ突然変異体につい
ては活性のｐＨ依存性は野性型酵素のそれとあまり異な
っていない。位置１８６での負電荷の除去はｐＨ−活性
プロフィールをより酸性のｐＨへ変位させた。この実施
例は突然変異Ｅ１８６Ｑの根本的原理（ｎａｔｉｏｎａ
ｌｅ）が当てはまることを強調する。

【００９５】実施例５：Ａｓｐ２５５の代替のｐＨ−活
性プロフィールへの影響 グルコースイソメラーゼ中の実際の金属結合配位子であ
る、位置２５５の負に荷電したアスパラギン酸の中性ア
スパラギンによる代替はマンガンの存在下にｐＨ−活性
プロフィールのより低いｐＨへの変位を生じさせる。至
適ｐＨは約２ｐＨ単位より酸性ｐＨに変位する。

【００９６】ｐＨ−活性プロフィールを図９に示す。

【００９７】実施例６：改変されたｐＨ−活性プロフィ
ールを有するグルコースイソメラーゼ 発明の詳しい記述で概観した方法に従って作出したグル
コースイソメラーゼ突然変異体のｐＨ−活性相関を図
（１０−２０）に示す条件下に調べた。ある変異体のｐ
Ｈ−活性プロフィールは一方で突然変異のｐＫａに対す
る影響及び他方でＫａｓｓに対する影響の結果である。

【００９８】以下の突然変異体についての結果をそれら
の図に示す：Ｆ２５４Ｋ（図１０）、Ｆ９４Ｒ（図１
１）、Ｆ６１Ｋ（図１２）、Ａ２５Ｋ（図１３）、Ｄ５
７Ｎ（図１４）、Ｌ２５８Ｋ（図１５）、Ｑ２０４Ｋ
（図１６）、Ｒ２３Ｑ（図１７）、Ｈ５４Ｎ（図１
８）、Ｈ２９０Ｎ（図１９）、Ｔ９５Ｄ（図２０）。

【００９９】正の電荷が導入されたか（Ｆ９４Ｒ、Ｆ６
１Ｋ、Ａ２５Ｋ、Ｌ２５８Ｋ、Ｑ２０４Ｋ）または負の
電荷が中和された（Ｄ５７Ｎ）突然変異体については、
ｐＨ−活性プロフィールの酸性側がより低いｐＨに変位
している。

【０１００】負の電荷が導入された（Ｔ９５Ｄ）かまた
は正の電荷が中和された（Ｒ２３Ｑ、Ｈ５４Ｎ、Ｈ２９
０Ｎ）突然変異体については、ｐＨ−活性プロフィール
がより高いｐＨに変位していることが分る。

【０１０１】これらの観察は共に発明の詳しい記述に提
示したモデルと一致している。

【０１０２】しかしながら、保存アミノ酸が代替された
突然変異体（Ｆ９４Ｒ、Ｄ５７Ｎ、Ｈ５４Ｎ）はキシロ
ースに対する特異的活性の劇的な減少を与えることが注
意されるべきである。配列−列整列（図２）における位
置２５４では疎水性アミノ酸のみが見い出される。この
位置での荷電したアミノ酸の導入（Ｆ２５４Ｋ）も特異
的活性における劇的減少を与える。かくして、（半）保
存アミノ酸位置はｐＨ−活性プロフィールを修飾する上
で電荷を改変するのに用いることができるけれども、こ
れらの位置は好ましい部位でないと結論できる。

【０１０３】実施例７：適用条件下でより良い性能を与
える改変された至適ｐＨを有する突然変異体の安定化 実施例６に示した如く、突然変異体Ｈ２９０Ｎ及びＦ６
１ＫはｐＨ−活性プロフィールにおいて予想された変位
を与える。これらの変異体中Ｈ２９０ＮをＥＰ−Ａ−３
５１０２９（実施例７）に記述されたようにして固定化
した。野性型及びこの突然変異グルコースイソメラーゼ
の適用テストは同出願（実施例８）に記載されたように
して行った。安定性は１次崩壊定数（Ｋｄ、、この崩壊
定数が小さいほど酵素はより安定である）によって示
す。表２は野性型及び突然変異グルコースイソメラーゼ
についてのＫｄ値を与える。

【０１０４】

【表２】

【０１０５】表２に見られる如く、Ｈ２９０Ｎは野性型
グルコースイソメラーゼと比較して不安定化されてい
る。Ｋ２５３Ｒは３より大なる比率で野性型グルコース
イソメラーゼを安定化することが見い出された。Ｋ２５
３Ｒ変異体のｐＨ−活性プロフィールは野性型酵素のそ
れと同じである。ｐＨ変異体Ｈ２９０Ｎと安定化変異体
Ｈ２５３Ｒの組合せは野性型酵素を安定化することが示
された突然変異を導入することによってｐＨ変異体を安
定化できることを示す。

【０１０６】さらに、表２はｐＨ変異体Ｆ６１ＫがＫ２
５３Ｒの導入によって野性型酵素に関し安定化されるこ
とを示している。

【０１０７】Ｆ６１ＫのｐＨ−活性プロフィールの酸性
変位は二重変異体で維持されている（図２１）。このこ
とは酵素の異なる性質を改良する突然変異は組み合わせ
て個々の突然変異の改良された性質（この場合改良され
た至適ｐＨ及び改良された安定性）を収容した新しい突
然変異体とすることができることを示している。

【０１０８】上述の実施例は本発明の概念を実証するた
めのものであり、その範囲を限定するためのものでない
ことが理解されるべきである。この観点から上述の突然
変異と改変された特性、例えば熱安定性、金属結合性も
しくは基質特異性を生じさせる他の突然変異との組合せ
も本発明の範囲内であることが明らかである。

【０１０９】

【発明の効果】本発明によって改変されたｐＨ−活性プ
ロフィール：特に該プロフィールの酸性側がより酸性ｐ
Ｈに変位したプロフィールを有する突然変異金属酵素、
特にグルコースイソメラーゼ、及びその取得方法が提供
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はグルコースイソメラーゼ−キシリトール
複合体の三次元構造から導かれた、アクチノプラネス・
ミソウリエンシスからのグルコースイソメラーゼの活性
部位の図式的表示を表す。阻害剤が図面の中央に十分に
詳しく示されている。アミノ酸残基については水素結合
に関与する原子のみが描かれている。アミノ酸残基名は
実線で描かれた箱に記載され、溶媒分子は点線で描かれ
た箱に記載されている。金属結合部位は３９５及び５８
０と番号付けされた卵形のものによって表される。点線
は静電的相互作用を示す：細い点線は水素結合を表し、
太い点線は金属の提案された連結を表す。厳格に保存さ
れている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基は星印（ａｓｔｅ
ｒｉｘ）で印されている。保存されていない残基につい
ては見い出された代替が示されている。

【図２】図２Ａ及び図２Ｂは異なる微生物から得られた
グルコースイソメラーゼのアミノ酸配例のアラインメン
ト（一列整列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエ
ンシスのグルコースイソメラーゼの完全配列が与えられ
ている。アンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌ
ａ）のグルコースイソメラーゼのアミノ配列は発表され
た配列（Ｓａａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６
９（１９８７）６１２）と１つの残基が異なっている：
発表された配列のプロリン１７７はアルギニンであるこ
とが判明した。ストレプトマイセス・サーモバルガリス
配列はアミノ酸３４６までしか確立されていない。未決
定の残基はブランクのままあけてある。点は他の配列の
いずれかと比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。
異なる種は以下の記号で示される： 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
状部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。

【図３】図３は２００ｍＭのキシロース、１０ｍＭのマ
グネシウム（正方形）及び１ｍＭのマンガン（円）の存
在下におけるグルコースイソメラーゼのｐＨ−活性プロ
フィールを示す。

【図４】図４は金属イオンの存在下にグルコースイソメ
ラーゼによって触媒された異性化についての反応スキー
ムを示す。 Ｅ＝酵素、Ｓ＝基質、Ｍ＝金属イオン、Ｐ＝生産物

【図５】図５は定常状態の実験で観察されたグルコース
イソメラーゼとキシロース及びＭｇ^２＋の反応のｐＨ依
存性を示す。Ｋ_１、Ｋ_２、Ｋ_３及びＫ_４は明細書中及び
図４で与えられた反応スキーム中で説明された平衡定数
である。

【図６】図６は２００ｍＭのキシロース及び１０ｍＭの
マグネシウムの存在下での突然変異体Ｋ２９４ＲとＫ２
９４ＱについてのｐＨ−活性プロフィールを示す。

【図７】図７は２００ｍＭのキシロース及び１０ｍＭの
Ｍｇ^２＋の存在下でのＥ１８６ＱとＥ１８６Ｄについて
のｐＨ−活性プロフィールを示す。

【図８】図８は２００ｍＭのキシロースと１ｍＭのＭｎ
^２＋の存在下でのＥ１８６ＤとＥ１８６Ｑについてのｐ
Ｈ−活性プロフィールを示す。

【図９】図９は２００ｍＭのキシロースと１ｍＭのマン
ガンの存在下での突然変異体Ｄ２５５ＮのｐＨ−活性プ
ロフィールを示す。

【図１０−２０】図１０−２０は以下の突然変異体につ
いての標準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性
プロフィールを示す：Ｆ２５４Ｋ（図１０）、Ｆ９４Ｒ
（図１１）、Ｆ６１Ｋ（図１２）、Ａ２５Ｋ（図１
３）、Ｄ５７Ｎ（図１４）、Ｌ２５８Ｋ（図１５）、Ｑ
２０４Ｋ（図１６）、Ｒ２３Ｑ（図１７）、Ｈ５４Ｎ
（図１８）、Ｈ２９０Ｎ（図１９）、Ｔ９５Ｄ（図２
０）。条件は各図中に示す。

【図２１】図２１は突然変異体Ｆ６１ＫＫ２５３Ｒにつ
いての標準化されたｐＨ−活性プロフィールを示す。条
件は該図中に示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月１日

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はグルコースイソメラーゼ−キシリトール
複合体の三次元構造から導かれた、アクチノプラネス・
ミソウリエンシスからのグルコースイソメラーゼの活性
部位の図式的表示を表す。阻害剤が図面の中央に十分に
詳しく示されている。アミノ酸残基については水素結合
に関与する原子のみが描かれている。アミノ酸残基名は
実線で描かれた箱に記載され、溶媒分子は点線で描かれ
た箱に記載されている。金属結合部位は３９５及び５８
０と番号付けされた卵形のものによって表される。点線
は静電的相互作用を示す：細い点線は水素結合を表し、
太い点線は金属の提案された連結を表す。厳格に保存さ
れている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基は星印（ａｓｔｅ
ｒｉｘ）で印されている。保存されていない残基につい
ては見い出された代替が示されている。

【図２】図２は異なる微生物から得られたグルコースイ
ソメラーゼのアミノ酸配列のアラインメント（一列整
列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエンシスのグ
ルコースイソメラーゼの完全配列が与えられている。ア
ンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）のグルコ
ースイソメラーゼのアミノ配列は発表された配列（ｓａ
ａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１９８
７）６１２）と１つの残基が異なっている：発表された
配列のプロリン１７７はアルギニンであることが判明し
た。ストレプトマイセス・サーモバルガリス配列はアミ
ノ酸３４６までしか確立されていない。未決定の残基は
ブランクのままあけてある。点は他の配列のいずれかと
比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。異なる種は
以下の記号で示される： Ａｍｉ． ： Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉｅｎｓｉｓＤＳＭ ４６４３ Ａｍｐ． ： Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ｓｐｅ
ｃｉｅｓ ＡＴＣＣ３１３５１ Ｓｖｉ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌ
ａｃｅｏｒｕｂｅｒＬＭＧ ７１８３ Ｓｍｕ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉ
ｎｕｓ Ｓｔｈ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｖｕｌｇａｒｉｓＤＳＭ ４０４４４ Ａｒｔ． ： Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃ
ｉｅｓ Ｂｓｕ． ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｅｃｏ． ： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｌｘｙ． ： Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌ
ｏｓｕｓ 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
状部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。

【図３】図３は異なる微生物から得られたグルコースイ
ソメラーゼのアミノ酸配列のアラインメント（一列整
列）を示す。アクチノプラネス・ミソウリエンシスのグ
ルコースイソメラーゼの完全配列が与えられている。ア
ンプラリーラ（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ）のグルコ
ースイソメラーゼのアミノ配列は発表された配列（ｓａ
ａｒｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１９８
７）６１２）と１つの残基が異なっている：発表された
配列のプロリン１７７はアルギニンであることが判明し
た。ストレプトマイセス・サーモバルガリス配列はアミ
ノ酸３４６までしか確立されていない。未決定の残基は
ブランクのままあけてある。点は他の配列のいずれかと
比較してこの位置のアミノ酸の欠如を示す。異なる種は
以下の記号で示される： Ａｍｉ． ： Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉｅｎｓｉｓＤＳＭ ４６４３ Ａｍｐ． ： Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ｓｐｅ
ｃｉｅｓ ＡＴＣＣ３１３５１ Ｓｖｉ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌ
ａｃｅｏｒｕｂｅｒＬＭＧ ７１８３ Ｓｍｕ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉ
ｎｕｓ Ｓｔｈ． ： Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｖｕｌｇａｒｉｓＤＳＭ ４０４４４ Ａｒｔ． ： Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃ
ｉｅｓ Ｂｓｕ． ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｅｃｏ． ： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｌｘｙ． ： Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｘｙｌ
ｏｓｕｓ 二次構造の割当て（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）はアクチノ
プラネス・ミソウリエンシスの構造において行った。樽
状部におけるヘリックスは実線で囲まれている。陰を付
した箱はβ−鎖を示す。

【図４】図４は２００ｍＭのキシロース、１０ｍＭのマ
グネシウム（正方形）及び１ｍＭのマンガン（円）の存
在下におけるグルコースイソメラーゼのｐＨ−活性プロ
フィールを示す。

【図５】図５は金属イオンの存在下にグルコースイソメ
ラーゼによって触媒された異性化についての反応スキー
ムを示す。 Ｅ＝酵素、Ｓ＝基質、Ｍ＝金属イオン、Ｐ＝生産物

【図６】図６は定常状態の実験で観察されたグルコース
イソメラーゼとキシロース及びＭｇ^２＋の反応のｐＨ依
存性を示す。Ｋ_１、Ｋ_２、Ｋ_３及びＫ_４は明細書中及び
図４で与えられた反応スキーム中で説明された平衡定数
である。

【図７】図７は２００ｍＭのキシロース及び１０ｍＭの
マグネシウムの存在下での突然変異体Ｋ２９４ＲとＫ２
９４ＱについてのｐＨ−活性プロフィールを示す。

【図８】図８は２００ｍＭのキシロース及び１０ｍＭの
Ｍｇ^２＋の存在下でのＥ１８６ＱとＥ１８６Ｄについて
のｐＨ−活性プロフィールを示す。

【図９】図９は２００ｍＭのキシロースと１ｍＭのＭｎ
^２＋の存在下でのＥ１８６ＤとＥ１８６Ｑについてのｐ
Ｈ−活性プロフィールを示す。

【図１０】図１０は２００ｍＭのキシロース及び１ｍＭ
のマンガンの存在下での突然変異体Ｄ２５５ＮのｐＨ−
活性プロフィールを示す。

【図１１】図１１はＦ２５４Ｋ突然変異体についての標
準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィ
ールを示す：条件は図中に示す。

【図１２】図１２はＦ９４Ｒ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図１３】図１３はＦ６１Ｋ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図１４】図１４はＡ２５Ｋ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図１５】図１５はＤ５７Ｎ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図１６】図１６はＬ２５８Ｋ突然変異体についての標
準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィ
ールを示す：条件は図中に示す。

【図１７】図１７はＱ２０４Ｋ突然変異体についての標
準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィ
ールを示す：条件は図中に示す。

【図１８】図１８はＲ２３Ｑ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図１９】図１９はＨ５４Ｎ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図２０】図２０はＨ２９０Ｎ突然変異体についての標
準化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィ
ールを示す：条件は図中に示す。

【図２１】図２１はＴ９５Ｄ突然変異体についての標準
化した（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ｐＨ−活性プロフィー
ルを示す：条件は図中に示す。

【図２２】図２２は突然変異体Ｆ６１ＫＫ２５３Ｒにつ
いての標準化されたｐＨ−活性プロフィールを示す。条
件は該図中に示す。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図１０】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/61 Ｃ１２Ｒ 1:045） (72)発明者 アン マリー ヴィルジニーエ ルネ ラ ンベール ベルギー国 3030 エーヴェルレエ ビュ ス 43 スパーランドレーフ 30 (72)発明者 イニャース ラステル ベルギー国 3081 ペルク リュートガル ディスストラート 24 (72)発明者 ナディール ムラベ ベルギー国 1080 ケーケルベルグ アヴ ェニュー ド ラ バゼリーク 380 ５ ア (72)発明者 ウィルヘルムス ヨハネス クワックス オランダ国 2253ヴェーベー フォールシ ョッテン ヤン ファン ガレンラーン ８ (72)発明者 ヤン メツク ファン デル ラーン オランダ国 9718ペーエー クローニンイ ェンコルテ ストラート 13 (72)発明者 オンノ ミセット オランダ国 2623セーカー デルフト オ ッテルラーン ２

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 その金属酵素をコード化する遺伝子の発
   現によって得られ、野性型酵素と少なくとも１つのアミ
   ノ酸が異なり、及び改変されたｐＨ−活性プロフィール
   を示す突然変異金属酵素。
2. 【請求項２】 改変されたｐＨ−活性プロフィールまた
   はその少なくとも酸性部分がより低いｐＨ値の方へ変位
   している請求項１の突然変異金属酵素。
3. 【請求項３】 代替されたアミノ酸残基がより正に荷電
   した残基によって代替されている請求項１または２の突
   然変異金属酵素。
4. 【請求項４】 金属酵素がグルコースイソメラーゼであ
   る請求項１−３のいずれか１つの突然変異金属酵素。
5. 【請求項５】 グルコースイソメラーゼが放線菌目の微
   生物から得られる請求項４の突然変異グルコースイソメ
   ラーゼ。
6. 【請求項６】 グルコースイソメラーゼがアクチノプラ
   ネス・ミソウリエンシスから得られる請求項５の突然変
   異グルコースイソメラーゼ。
7. 【請求項７】 ｐＨ−活性プロフィールまたはその少な
   くとも酸性部分がより低いｐＨ値の方へ変位している請
   求項４−６のいずれかの突然変異グルコースイソメラー
   ゼ。
8. 【請求項８】 標的残基の周囲１５Åの球内にアミノ酸
   置換を有する請求項４−７のいずれかの突然変異グルコ
   ースイソメラーゼ。
9. 【請求項９】 代替されたアミノ酸残基がより正に荷電
   した残基によって代替されている請求項４−８のいずれ
   か１つの突然変異グルコースイソメラーゼ。
10. 【請求項１０】 以下のアミノ酸の少なくとも１つ、ま
    たは相同グルコースイソメラーゼの対応位置のアミノ酸
    が野性型では見られないアミノ酸によって代替されてい
    る請求項４−９のいずれか１つの突然変異グルコースイ
    ソメラーゼ：
11. 【請求項１１】 以下のアミノ酸の少なくとも１つ、ま
    たは相同グルコースイソメラーゼの対応位置のアミノ酸
    が野性型では見られないアミノ酸によって代替されてい
    る請求項４−９のいずれ１つの突然変異グルコースイソ
    メラーゼ：
12. 【請求項１２】 以下のアミノ酸の少なくとも１つ、ま
    たは相同グルコースイソメラーゼの対応位置のアミノ酸
    が野性型では見られないアミノ酸によって代替されてい
    る請求項４−９のいずれか１つの突然変異グルコースイ
    ソメラーゼ：
13. 【請求項１３】 以下のアミノ酸代替の少なくとも１つ
    を含有する請求項６の突然変異グルコースイソメラー
    ゼ：
14. 【請求項１４】 少なくとも１つのアミノ酸を異なった
    風に荷電した側鎖を有するアミノ酸で代替することを特
    徴とするグルコースイソメラーゼのｐＨ−活性プロフィ
    ールを改変する方法。
15. 【請求項１５】 標的残基の周囲１５Åの球内のアミノ
    酸をより正に荷電したアミノ酸で代替する請求項１４の
    方法。
16. 【請求項１６】 以下の工程よりなる請求項１−１３の
    いずれか１つの突然変異グルコースイソメラーゼを取得
    する方法： ａ） グルコースイソメラーゼをコード化するＤＮＡ配
    列を得、 ｂ） この配列を選ばれたヌクレオチド位置で突然変異
    させ、 ｃ） 突然変異させた配列を発現ベクター中にＤＮＡ配
    列が発現されるようにクローン化、 ｄ） 宿生生物または細胞を該ベクターで形質転換し、 ｅ） 宿生生物を培養し、 ｆ） グルコースイソメラーゼを単離する。
17. 【請求項１７】 先行請求項のいずれか１つの突然変異
    グルコースイソメラーゼの糖分子の変換における使用。