JPH06321984A - 蛋白質及びペプチドの毛管等電点電気泳動法並びに後分析のための画分採集 - Google Patents
蛋白質及びペプチドの毛管等電点電気泳動法並びに後分析のための画分採集Info
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- JPH06321984A JPH06321984A JP7775694A JP7775694A JPH06321984A JP H06321984 A JPH06321984 A JP H06321984A JP 7775694 A JP7775694 A JP 7775694A JP 7775694 A JP7775694 A JP 7775694A JP H06321984 A JPH06321984 A JP H06321984A
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- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 毛管等電点電気泳動によって蛋白質及びペプ
チドを分離採集する方法を提供する。 【構成】 ａ．毛管の内部に試料と両性電解質との混合
物を充填し、ｂ．毛管の第一流入端を第一電解液中に浸
漬し、ｃ．毛管の第二流出端を多孔質基体と接触状態に
し、ｄ．多孔質基体を第二電解液で連続的に湿潤させ、
ｅ．多孔質基体を第二電解液と接触状態にし、ｆ．第一
電解液及び第二電解液を高電圧電源の出力端子に連結さ
れた電極と接触させ、ｇ．毛管の両端を横切って高電圧
電位を印加して両性電解質が毛管内でｐＨ勾配を形成す
るようにし且つ試料がそのｐＨ勾配内で泳動するように
し、ｈ．毛管内で流れを生じさせて毛管の内容物を多孔
質基体に向けて移動させ、そしてｉ．毛管の内容物中の
試料部分を多孔質基体上に採集する各工程から構成す
る。
チドを分離採集する方法を提供する。 【構成】 ａ．毛管の内部に試料と両性電解質との混合
物を充填し、ｂ．毛管の第一流入端を第一電解液中に浸
漬し、ｃ．毛管の第二流出端を多孔質基体と接触状態に
し、ｄ．多孔質基体を第二電解液で連続的に湿潤させ、
ｅ．多孔質基体を第二電解液と接触状態にし、ｆ．第一
電解液及び第二電解液を高電圧電源の出力端子に連結さ
れた電極と接触させ、ｇ．毛管の両端を横切って高電圧
電位を印加して両性電解質が毛管内でｐＨ勾配を形成す
るようにし且つ試料がそのｐＨ勾配内で泳動するように
し、ｈ．毛管内で流れを生じさせて毛管の内容物を多孔
質基体に向けて移動させ、そしてｉ．毛管の内容物中の
試料部分を多孔質基体上に採集する各工程から構成す
る。
Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は、毛管等電点電気泳動による蛋
白質及びペプチドの分離採集法に関する。
白質及びペプチドの分離採集法に関する。
【０００２】
【発明の背景】毛管電気泳動（ＣＥ）及び毛管等電点電
気泳動（ｃＩＥＦ）は、蛋白質及びペプチドの分離及び
分析に対して極めて関心の深い技術になった周知の分離
法である。これらの技術は、高い分解能、迅速な分離、
極めて少量の試料を分析できること、並びにゲル電気泳
動や液体クロマトグラフィーのような競争分析技術と比
較したときに必要とされる装置の面から見た望ましい簡
単さという利益を提供する。
気泳動（ｃＩＥＦ）は、蛋白質及びペプチドの分離及び
分析に対して極めて関心の深い技術になった周知の分離
法である。これらの技術は、高い分解能、迅速な分離、
極めて少量の試料を分析できること、並びにゲル電気泳
動や液体クロマトグラフィーのような競争分析技術と比
較したときに必要とされる装置の面から見た望ましい簡
単さという利益を提供する。
【０００３】上記の利益は、狭い直径の毛管の使用から
ほとんどもたらされる。かかる毛管は、分離プロセスで
発生した熱の効率的な除去を可能にし、しかも分離力を
低下させるような対流混合を防止する。また、この狭い
直径の管は、毛管において電流の流れそれ故に熱の発生
を制限しながら電場を発生させるのに高い電圧を使用す
るのを可能にする。毛管に電解液を充填することによっ
てＣＥ分離が開始する。次に、毛管の一端に少量の試料
が注入される。典型的な試料注入量は、１〜２０ナノリ
ットルの範囲内である。試料の注入後に、毛管に高い電
圧が印加され、そして試料中の成分がその充填量／質量
比を基にして分離される。加えて、電気浸透流れと称さ
れるバルク流体流れによって、すべての成分は、充填量
に関係なく、毛管を経てそして一般的にはそれらをＵＶ
検出器のような適当な検出器を越して移動させる方向で
移動させられる。
ほとんどもたらされる。かかる毛管は、分離プロセスで
発生した熱の効率的な除去を可能にし、しかも分離力を
低下させるような対流混合を防止する。また、この狭い
直径の管は、毛管において電流の流れそれ故に熱の発生
を制限しながら電場を発生させるのに高い電圧を使用す
るのを可能にする。毛管に電解液を充填することによっ
てＣＥ分離が開始する。次に、毛管の一端に少量の試料
が注入される。典型的な試料注入量は、１〜２０ナノリ
ットルの範囲内である。試料の注入後に、毛管に高い電
圧が印加され、そして試料中の成分がその充填量／質量
比を基にして分離される。加えて、電気浸透流れと称さ
れるバルク流体流れによって、すべての成分は、充填量
に関係なく、毛管を経てそして一般的にはそれらをＵＶ
検出器のような適当な検出器を越して移動させる方向で
移動させられる。
【０００４】等電点電気泳動は、ゲル電気泳動分離にお
いて生じた蛋白質及びペプチドの高い分解能の分離を生
ぜしめるための周知の技術である。過去数年間にわたっ
て、いくらかの研究者は、ＣＥ分離に使用されるものと
同じハードウエア（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ４，ｐｐ１
〜８，１９９２）を使用した蛋白質分離方式として等電
点電気泳動法を使用することもできることを示してお
り、そしてこの分離方式を記載するのに頭字語ｃＩＥＦ
が採用されている。蛋白質の分離では、分析技術として
ｃＩＥＦがその高い分解能及び迅速な分析時間の故に選
択されている。この方法を一般的に実施するときには、
試料に対して、等電点の不均一な範囲を有する小さい分
子の混合物である両性電解質が２〜５％の濃度で混合さ
れる。次いで、高い電圧の印加に先立ってその混合物が
分離毛管に充填される。これは、ＣＥ分析において典型
的なナノリットルの試料充填量と比較して１〜２ミクロ
リットルの試料が毛管に充填されることを意味してい
る。かくして、ｃＩＥＦを使用して充填することができ
る試料の典型的な量はＣＥの量よりも１００〜１０００
倍多く、これは、ｃＩＥＦ法を実施する方法（即ち、毛
管全体に両性電解質混合物を充填することによって）の
直接的な結果である。しかしながら、これまでは、蛋白
質及びペプチドの分析分野に精通した人々によって評価
されていたｃＩＥＦ技術の主な（論証上、唯一の）利益
は、分離のユニークな選択性にあった。
いて生じた蛋白質及びペプチドの高い分解能の分離を生
ぜしめるための周知の技術である。過去数年間にわたっ
て、いくらかの研究者は、ＣＥ分離に使用されるものと
同じハードウエア（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ４，ｐｐ１
〜８，１９９２）を使用した蛋白質分離方式として等電
点電気泳動法を使用することもできることを示してお
り、そしてこの分離方式を記載するのに頭字語ｃＩＥＦ
が採用されている。蛋白質の分離では、分析技術として
ｃＩＥＦがその高い分解能及び迅速な分析時間の故に選
択されている。この方法を一般的に実施するときには、
試料に対して、等電点の不均一な範囲を有する小さい分
子の混合物である両性電解質が２〜５％の濃度で混合さ
れる。次いで、高い電圧の印加に先立ってその混合物が
分離毛管に充填される。これは、ＣＥ分析において典型
的なナノリットルの試料充填量と比較して１〜２ミクロ
リットルの試料が毛管に充填されることを意味してい
る。かくして、ｃＩＥＦを使用して充填することができ
る試料の典型的な量はＣＥの量よりも１００〜１０００
倍多く、これは、ｃＩＥＦ法を実施する方法（即ち、毛
管全体に両性電解質混合物を充填することによって）の
直接的な結果である。しかしながら、これまでは、蛋白
質及びペプチドの分析分野に精通した人々によって評価
されていたｃＩＥＦ技術の主な（論証上、唯一の）利益
は、分離のユニークな選択性にあった。
【０００５】ｃＩＥＦ法の説明を続けると、毛管の両端
は緩衝電解液中に浸漬される。陰極液と称される陰極側
にある電解液は、一般には塩基性溶液である。いくつか
の公知の方法では、２０ｍＭ ＮａＯＨが使用される。
陽極が浸漬されるところの電解液即ち陽極液は、一般に
は酸性溶液である。いくつかの公知の方法では、２０ｍ
Ｍ燐酸が使用される。高電圧を印加すると、毛管の長さ
に沿ってｐＨの勾配が急速に形成され、そして両性電解
質はそれらの等電点に移行する。それよりもゆっくり
と、蛋白質分析物もｐＨ勾配内でそれらの等電点に移行
する。最後に、ある実施例では、電気浸透流れは、その
勾配を蛋白質泳動帯域と共に検出器を越えて毛管内を移
動させる。他の実施例では、その泳動帯域は、圧力の適
用によって又は毛管の端部にある溜めのうちの１つの電
解液の組成の変化の結果として毛管内を移行させられ
る。
は緩衝電解液中に浸漬される。陰極液と称される陰極側
にある電解液は、一般には塩基性溶液である。いくつか
の公知の方法では、２０ｍＭ ＮａＯＨが使用される。
陽極が浸漬されるところの電解液即ち陽極液は、一般に
は酸性溶液である。いくつかの公知の方法では、２０ｍ
Ｍ燐酸が使用される。高電圧を印加すると、毛管の長さ
に沿ってｐＨの勾配が急速に形成され、そして両性電解
質はそれらの等電点に移行する。それよりもゆっくり
と、蛋白質分析物もｐＨ勾配内でそれらの等電点に移行
する。最後に、ある実施例では、電気浸透流れは、その
勾配を蛋白質泳動帯域と共に検出器を越えて毛管内を移
動させる。他の実施例では、その泳動帯域は、圧力の適
用によって又は毛管の端部にある溜めのうちの１つの電
解液の組成の変化の結果として毛管内を移行させられ
る。
【０００６】分析物のＣＥ又はｃＩＥＦ分離における最
も大きい問題の１つは、分離されたピークの同定であ
る。従来のゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーの
ような他の分析技術では、分離からの画分は、容易に採
集されそして更なる分析を受けることができる。液体ク
ロマトグラフィーでは、これは、一般には、カラムから
の溶離後の離散画分を乾燥している容器に集めることに
よって達成され、これに対してゲル電気泳動ではこれは
ゲルから分離試料を溶離するか又はゲルから分離物を多
孔質基体に直接移動させることによって達成することが
できる。この移動はブロッテング（blotting）と称さ
れ、そしてそのブロットの直接分析を行うこともでき
る。しかしながら、ＣＥ分析から離散液体画分を採集す
ることは、電気的な連続性を維持するには電解液を収容
するビンで採集を行わなければならないという事実によ
って困難である。これは、試料の希釈（しばしば１００
倍以上まで）、及び分画採集容器の壁に付着する可能性
がある希釈剤の頻繁な損失をもたらす。加えて、ＣＥは
ごく数ナノリットルの試料の注入を可能にするので、分
画採集の問題は、低い試料濃度を例えば僅か約１ｍｇ／
ｍｌまでを取り扱うときには悪化される。この場合に
は、分離された試料の典型的な量は、一般には１ｎｇ以
下である（これは１ｐモル以下の１，０００ダルトンペ
プチドに等しい）。これは、蛋白質配列決定のような後
分析にはしばしば不適当な量のＣＥ分離分析物を提供す
る。
も大きい問題の１つは、分離されたピークの同定であ
る。従来のゲル電気泳動又は液体クロマトグラフィーの
ような他の分析技術では、分離からの画分は、容易に採
集されそして更なる分析を受けることができる。液体ク
ロマトグラフィーでは、これは、一般には、カラムから
の溶離後の離散画分を乾燥している容器に集めることに
よって達成され、これに対してゲル電気泳動ではこれは
ゲルから分離試料を溶離するか又はゲルから分離物を多
孔質基体に直接移動させることによって達成することが
できる。この移動はブロッテング（blotting）と称さ
れ、そしてそのブロットの直接分析を行うこともでき
る。しかしながら、ＣＥ分析から離散液体画分を採集す
ることは、電気的な連続性を維持するには電解液を収容
するビンで採集を行わなければならないという事実によ
って困難である。これは、試料の希釈（しばしば１００
倍以上まで）、及び分画採集容器の壁に付着する可能性
がある希釈剤の頻繁な損失をもたらす。加えて、ＣＥは
ごく数ナノリットルの試料の注入を可能にするので、分
画採集の問題は、低い試料濃度を例えば僅か約１ｍｇ／
ｍｌまでを取り扱うときには悪化される。この場合に
は、分離された試料の典型的な量は、一般には１ｎｇ以
下である（これは１ｐモル以下の１，０００ダルトンペ
プチドに等しい）。これは、蛋白質配列決定のような後
分析にはしばしば不適当な量のＣＥ分離分析物を提供す
る。
【０００７】それにもかかわらず、ＣＥ分離に続いて試
料中の成分の更なる分析のために画分採集（フラクショ
ンコレクション）を使用することが記載されている。Ca
milleri 氏外（Anal.Biochem. Vol 196,pp178 〜182,19
91）は、分析物の拡散を最小限にするためにＨ2 Ｏ基剤
電解質溶液の代わりにＤ2 Ｏ基剤電解質溶液を使用し、
次いで画分採集を容易にするために分離した成分を圧力
によって溶離した。Huang 及びZare両氏（Anal.Bioche
m. Vol 62,pp443〜446,1992）は、毛管をその流出口の
前で接地するのを可能にするオンカラム焼結ガラス構造
体を使用した。毛管における電気浸透流れは、分離した
種を毛管の流出口まで移動させ、かくして毛管の出口端
において試料の採集を可能にする。フジモト氏外（J.of
High Resol.Chromatogra.,Vol 15,pp 201〜203,1992）
は、ＣＥ画分採集を容易にするためにポリアクリルアミ
ドゲルによって包囲されたオンカラムフラクチャーを使
用した。再び、この電気回路は、毛管の流出口の前で完
結された。これらの技術の各々は、比較的少量の試料の
みの回収をもたらし、そして蛋白質配列決定及びアミノ
酸分析で使用するのに特に好適ではない。その上、毛管
の電気回路をその流出口の前で分断させることは、高電
圧の印加から生じる帯電誘発運動力を切断するという効
果を有する。その代わり、試料の運動はバルク流れ特性
に依存し、そしていくらかの適用例ではこのバルク流量
は完全分離を達成するのに困難を引き起こす程に低いも
のである。
料中の成分の更なる分析のために画分採集（フラクショ
ンコレクション）を使用することが記載されている。Ca
milleri 氏外（Anal.Biochem. Vol 196,pp178 〜182,19
91）は、分析物の拡散を最小限にするためにＨ2 Ｏ基剤
電解質溶液の代わりにＤ2 Ｏ基剤電解質溶液を使用し、
次いで画分採集を容易にするために分離した成分を圧力
によって溶離した。Huang 及びZare両氏（Anal.Bioche
m. Vol 62,pp443〜446,1992）は、毛管をその流出口の
前で接地するのを可能にするオンカラム焼結ガラス構造
体を使用した。毛管における電気浸透流れは、分離した
種を毛管の流出口まで移動させ、かくして毛管の出口端
において試料の採集を可能にする。フジモト氏外（J.of
High Resol.Chromatogra.,Vol 15,pp 201〜203,1992）
は、ＣＥ画分採集を容易にするためにポリアクリルアミ
ドゲルによって包囲されたオンカラムフラクチャーを使
用した。再び、この電気回路は、毛管の流出口の前で完
結された。これらの技術の各々は、比較的少量の試料の
みの回収をもたらし、そして蛋白質配列決定及びアミノ
酸分析で使用するのに特に好適ではない。その上、毛管
の電気回路をその流出口の前で分断させることは、高電
圧の印加から生じる帯電誘発運動力を切断するという効
果を有する。その代わり、試料の運動はバルク流れ特性
に依存し、そしていくらかの適用例ではこのバルク流量
は完全分離を達成するのに困難を引き起こす程に低いも
のである。
【０００８】ＣＥ画分採集のための他の方法は米国特許
第５１２６０２５号に記載されており、ここでは基体上
に配置された採集膜を経て毛管の流出端で電気回路を効
率的に完結させるために多孔質基体組立体が使用されて
いる。分離された成分は、回転円板又は移動ベルトによ
って連続的に採集される。移動する多孔質膜上に分析物
を直接付着させるこの技術は、分画採集における従来の
試みに優る進歩をもたらす。というのは、それは、１０
０％の付着を確実にし、希釈を最小限にし、分離の十分
な空間的分解能を維持し、且つ毛管全体の端部を通して
電気回路を連続させるからである。分析物が結合された
多孔質気体は、様々な抗体標識技術を使用して分析され
ることができる。更に、多孔質膜に結合された試料から
蛋白質配置決定を直接行うこともできる。しかしなが
ら、経験によれば、この特許に記載される装置を使用し
て単一のＣＥ分離から採集することができる試料の量で
は蛋白質配置決定がしばしば困難であることが判明し
た。例えば、１０，０００ダルトン蛋白質での典型的な
最低要件は配置決定に対して試料約１０ｐモルであり、
そして米国特許第５１２６０２５号に開示される技術を
使用する典型的なＣＥ分離は多孔質膜上にわずか約０．
１ｐモルを付着させることができるに過ぎない。
第５１２６０２５号に記載されており、ここでは基体上
に配置された採集膜を経て毛管の流出端で電気回路を効
率的に完結させるために多孔質基体組立体が使用されて
いる。分離された成分は、回転円板又は移動ベルトによ
って連続的に採集される。移動する多孔質膜上に分析物
を直接付着させるこの技術は、分画採集における従来の
試みに優る進歩をもたらす。というのは、それは、１０
０％の付着を確実にし、希釈を最小限にし、分離の十分
な空間的分解能を維持し、且つ毛管全体の端部を通して
電気回路を連続させるからである。分析物が結合された
多孔質気体は、様々な抗体標識技術を使用して分析され
ることができる。更に、多孔質膜に結合された試料から
蛋白質配置決定を直接行うこともできる。しかしなが
ら、経験によれば、この特許に記載される装置を使用し
て単一のＣＥ分離から採集することができる試料の量で
は蛋白質配置決定がしばしば困難であることが判明し
た。例えば、１０，０００ダルトン蛋白質での典型的な
最低要件は配置決定に対して試料約１０ｐモルであり、
そして米国特許第５１２６０２５号に開示される技術を
使用する典型的なＣＥ分離は多孔質膜上にわずか約０．
１ｐモルを付着させることができるに過ぎない。
【０００９】かくして、蛋白質配置決定又はアミノ酸分
析のような後分離分析のために十分な量で毛管電気泳動
法の使用を含めて蛋白質含有分析物を分離採集する技術
に対する要求がなお存在している。毛管を通して試料を
推進させる運動力の最低の希釈で且つ最小の中断で多孔
質基体上にかかる分析物を採集するのが望ましいだろ
う。
析のような後分離分析のために十分な量で毛管電気泳動
法の使用を含めて蛋白質含有分析物を分離採集する技術
に対する要求がなお存在している。毛管を通して試料を
推進させる運動力の最低の希釈で且つ最小の中断で多孔
質基体上にかかる分析物を採集するのが望ましいだろ
う。
【００１０】
【発明の概要】本発明は、アミノ酸分析及び蛋白質配列
決定のような後分離分析のために毛管等電点電気泳動
（ｃＩＥＦ）及び分画採集を使用する蛋白質又はペプチ
ドの分離採集法及び装置を提供するものである。本発明
は、ｃＩＥＦにおける空間的な分解能を保存しながら更
なる分析のために、多量の分離した試料分析物を効率的
に採集するための簡単で効率的で高速度且つ高処理量の
方法を提供する。
決定のような後分離分析のために毛管等電点電気泳動
（ｃＩＥＦ）及び分画採集を使用する蛋白質又はペプチ
ドの分離採集法及び装置を提供するものである。本発明
は、ｃＩＥＦにおける空間的な分解能を保存しながら更
なる分析のために、多量の分離した試料分析物を効率的
に採集するための簡単で効率的で高速度且つ高処理量の
方法を提供する。
【００１１】本発明の好ましい具体例に従えば、ｃＩＥ
Ｆ分離を行うのにＣＥ系が使用され、そして分離された
分析物は分画採集のために多孔質膜上に付着される。使
用される毛管は、ヒューズドシリカから作られそして１
〜５００μｍの内径、１００〜１０００μｍの外径及び
５〜２００ｃｍの長さを有する。毛管が蛋白質含有試料
と両性電解質との混合物を充填された後に、陽極液側の
端部は１０ｍＭ燐酸の電解液中に浸漬される。陰極液側
の端部は、第二電解液である２０ｍＭ水酸化ナトリウム
で湿った多孔質基体と直接接触状態にされる。毛管に高
い電圧を印加して試料を多孔質膜に向けて移動させる。
試料中の成分は多孔質膜上に吸着され、そして両性電解
質及び等電点電気泳動に使用された他の緩衝剤成分は、
後に行われる分析に対していかなる干渉もしないことを
確実にするために基体から容易に洗い落とすことができ
る。
Ｆ分離を行うのにＣＥ系が使用され、そして分離された
分析物は分画採集のために多孔質膜上に付着される。使
用される毛管は、ヒューズドシリカから作られそして１
〜５００μｍの内径、１００〜１０００μｍの外径及び
５〜２００ｃｍの長さを有する。毛管が蛋白質含有試料
と両性電解質との混合物を充填された後に、陽極液側の
端部は１０ｍＭ燐酸の電解液中に浸漬される。陰極液側
の端部は、第二電解液である２０ｍＭ水酸化ナトリウム
で湿った多孔質基体と直接接触状態にされる。毛管に高
い電圧を印加して試料を多孔質膜に向けて移動させる。
試料中の成分は多孔質膜上に吸着され、そして両性電解
質及び等電点電気泳動に使用された他の緩衝剤成分は、
後に行われる分析に対していかなる干渉もしないことを
確実にするために基体から容易に洗い落とすことができ
る。
【００１２】本発明の他の面、利益及び目的は、添付図
面と関連させて行う以下の詳細な説明から明らかになる
であろう。
面と関連させて行う以下の詳細な説明から明らかになる
であろう。
【００１３】
【発明の具体的な説明】図１は、多孔質基体１２上に配
置された多孔質膜１８を出口溜め２３に収容された電解
液で湿潤状態に保つために多孔質基体１２を使用した分
画採集器（フラクションコレクター）１１に連結された
ＣＥ系１０のブロック図を示す。かかる系は、約５〜５
００μｍの範囲内の内径、約１００〜１０００μｍの範
囲内の外径及び約５〜２００ｃｍの範囲内の長さを有す
るフューズドシリカ毛管１４を含む。この毛管は、電解
液を収容する入口溜め１６に浸漬された流入端１５、及
び多孔質膜１８と直接接触状態にある流出端１７を含
む。毛管の内部は、周知の方式でキャリヤー両性電解質
を含有する混合物中に浸漬された蛋白質又はペプチドを
充填されるが、この詳細については以下で更に説明する
ことにする。溜め１６、２３は、高電圧電源２０の出力
端子に連結された別個の電極２１Ａ、２１Ｂと接触して
いる。この電気回路は、入口電極２１Ａから充填毛管を
経て毛管の出口端１７、次いで多孔質膜１８から基体１
２を経て出口溜め２３中に浸漬された高電圧電極２１Ｂ
までで完結される。高電圧電源の出力は、制御器１３に
よって固定される。分離は、オンラインＵＶ検出器２２
を使用して監視される。
置された多孔質膜１８を出口溜め２３に収容された電解
液で湿潤状態に保つために多孔質基体１２を使用した分
画採集器（フラクションコレクター）１１に連結された
ＣＥ系１０のブロック図を示す。かかる系は、約５〜５
００μｍの範囲内の内径、約１００〜１０００μｍの範
囲内の外径及び約５〜２００ｃｍの範囲内の長さを有す
るフューズドシリカ毛管１４を含む。この毛管は、電解
液を収容する入口溜め１６に浸漬された流入端１５、及
び多孔質膜１８と直接接触状態にある流出端１７を含
む。毛管の内部は、周知の方式でキャリヤー両性電解質
を含有する混合物中に浸漬された蛋白質又はペプチドを
充填されるが、この詳細については以下で更に説明する
ことにする。溜め１６、２３は、高電圧電源２０の出力
端子に連結された別個の電極２１Ａ、２１Ｂと接触して
いる。この電気回路は、入口電極２１Ａから充填毛管を
経て毛管の出口端１７、次いで多孔質膜１８から基体１
２を経て出口溜め２３中に浸漬された高電圧電極２１Ｂ
までで完結される。高電圧電源の出力は、制御器１３に
よって固定される。分離は、オンラインＵＶ検出器２２
を使用して監視される。
【００１４】画分採集器１１は、適当な電解液を満たし
た出口溜め２３、多孔質基体１２及び多孔質膜１８を含
む。電極２１Ｂは出口溜め中に浸漬され、そしてその中
に収容される電解液は基体及び膜を連続的に湿潤させて
導電性を維持し、その間に試料は流出端１７から溶離し
そして膜上に採集される。この具体例では、画分採集器
は図１で矢印によって示されるように回転運動を行うよ
うな形成され、しかして膜の表面上に分離した試料のパ
ターンが形成される。しかしながら、採集器を一方向に
運動させて同じ効果を達成することも可能である。その
上、ある場合には、離散試料を個々に採集することがで
きるように分画採集器を固定状態に保つことが望ましい
こともある。
た出口溜め２３、多孔質基体１２及び多孔質膜１８を含
む。電極２１Ｂは出口溜め中に浸漬され、そしてその中
に収容される電解液は基体及び膜を連続的に湿潤させて
導電性を維持し、その間に試料は流出端１７から溶離し
そして膜上に採集される。この具体例では、画分採集器
は図１で矢印によって示されるように回転運動を行うよ
うな形成され、しかして膜の表面上に分離した試料のパ
ターンが形成される。しかしながら、採集器を一方向に
運動させて同じ効果を達成することも可能である。その
上、ある場合には、離散試料を個々に採集することがで
きるように分画採集器を固定状態に保つことが望ましい
こともある。
【００１５】かくして記載される装置は、米国特許第５
１２６０２５号に記載されるものと多くの点において類
似しているので、必要ならばその記載を参照された。
１２６０２５号に記載されるものと多くの点において類
似しているので、必要ならばその記載を参照された。
【００１６】１つの具体例では、多孔質膜１８でｃＩＥ
Ｆ分離及び画分採集を行うために、毛管１４は、両性電
解質溶液を２〜５％の濃度で混合した蛋白質試料で充填
される。毛管１５の流入端は、陽極緩衝液として１０ｍ
Ｍ燐酸のような酸性溶液を収容する溜め１６中に浸漬さ
れ、そして毛管の流出端１７は多孔質膜１８と直接接触
状態にされる。この膜は溜め２３に入れられた陰極緩衝
液（これは一般には２０ｍＭ ＮａＯＨのような塩基性
溶液である）で湿潤状態に保たれる。膜１８は緩衝液溜
め２３中に配置された基体１２と直接接触状態にあり、
そして毛管１４はこの緩衝液溜め２３を経て接地され
る。溜め１６、２３にそれぞれ配置された高電圧電極２
１Ａ、２１Ｂは、高電圧電源２０に連結される。
Ｆ分離及び画分採集を行うために、毛管１４は、両性電
解質溶液を２〜５％の濃度で混合した蛋白質試料で充填
される。毛管１５の流入端は、陽極緩衝液として１０ｍ
Ｍ燐酸のような酸性溶液を収容する溜め１６中に浸漬さ
れ、そして毛管の流出端１７は多孔質膜１８と直接接触
状態にされる。この膜は溜め２３に入れられた陰極緩衝
液（これは一般には２０ｍＭ ＮａＯＨのような塩基性
溶液である）で湿潤状態に保たれる。膜１８は緩衝液溜
め２３中に配置された基体１２と直接接触状態にあり、
そして毛管１４はこの緩衝液溜め２３を経て接地され
る。溜め１６、２３にそれぞれ配置された高電圧電極２
１Ａ、２１Ｂは、高電圧電源２０に連結される。
【００１７】高電圧電源２０が作働されると、両性電解
質によってｐＨ勾配が急速に形成される。それよりもゆ
っくりと、このｐＨ勾配内で蛋白質が泳動される。蛋白
質が泳動する間に、毛管内で緩やかなバルク流体流れが
生じる。１つの具体例では、この力は、毛管１４の全内
容物を多孔質膜１８に向けて移動させる電気浸透流れの
結果である。別法として、その力は、圧力の適用の結
果、又は陰極及び陽極緩衝液の処方を変える結果である
場合がある。分離が行われている間に、多孔質膜１８
は、毛管の流出端１７との直接接触を維持しながら徐々
に移動する。これは、膜上に毛管流出液の連続的付着を
もたらし、しかしてｃＩＥＦ分離の空間的な分解能を維
持する。高電圧の連続した印加は、最終的には、移動す
る多孔質膜１８の表面上に泳動した蛋白質のすべての付
着をもたらす。分析物が毛管を出ると、それらは多孔質
膜に密着結合される。
質によってｐＨ勾配が急速に形成される。それよりもゆ
っくりと、このｐＨ勾配内で蛋白質が泳動される。蛋白
質が泳動する間に、毛管内で緩やかなバルク流体流れが
生じる。１つの具体例では、この力は、毛管１４の全内
容物を多孔質膜１８に向けて移動させる電気浸透流れの
結果である。別法として、その力は、圧力の適用の結
果、又は陰極及び陽極緩衝液の処方を変える結果である
場合がある。分離が行われている間に、多孔質膜１８
は、毛管の流出端１７との直接接触を維持しながら徐々
に移動する。これは、膜上に毛管流出液の連続的付着を
もたらし、しかしてｃＩＥＦ分離の空間的な分解能を維
持する。高電圧の連続した印加は、最終的には、移動す
る多孔質膜１８の表面上に泳動した蛋白質のすべての付
着をもたらす。分析物が毛管を出ると、それらは多孔質
膜に密着結合される。
【００１８】多孔質膜１８は、親水性若しくは疎水性の
どちらかの微孔質若しくは限外ろ過膜であってよく、又
は水性ゲル若しくはポリアクリルアミド膜のようなゲル
からなるものであってもよい。電気回路を完結させるた
めに乾燥時に疎水性で湿潤時に親水性である膜を使用す
るのが有益である場合がある。溶液から蛋白質を結合す
ることができる代表的な膜は当業者には周知である。し
かしながら、現時点で好ましい膜としては、ポリ二弗化
ビニリデン又はナイロンから作られたものが挙げられ
る。
どちらかの微孔質若しくは限外ろ過膜であってよく、又
は水性ゲル若しくはポリアクリルアミド膜のようなゲル
からなるものであってもよい。電気回路を完結させるた
めに乾燥時に疎水性で湿潤時に親水性である膜を使用す
るのが有益である場合がある。溶液から蛋白質を結合す
ることができる代表的な膜は当業者には周知である。し
かしながら、現時点で好ましい膜としては、ポリ二弗化
ビニリデン又はナイロンから作られたものが挙げられ
る。
【００１９】
【実施例】次の実施例は、本発明を例示するものであっ
て、本発明を限定するものではない。
て、本発明を限定するものではない。
【００２０】この実験では、ポリ二弗化ビニリデン（Ｐ
ＶＤＦ）膜（米国マサチューセッツ州ベッドフォードー
所在のミリポア・コーポレーションから市場で入手でき
る商品名「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ」）を採集媒体とし
て基体上に配置した連続回転式採集用多孔質膜基体円板
を使用して、蛋白質含有分析物のｃＩＥＦ／画分採集を
行った。毛管は、７５μｍの内径、３６５μｍの外径及
び６０ｃｍの長さを有していた。２８０ｎｍの波長にお
いてオンラインＵＶ検出器を使用した。検出領域は、毛
管の流出端から８．８ｃｍであった。画分採集組立体
は、３１．２４分／回転で回転された。毛管を横切って
１８ＫＶの電圧を印加した。陽極液は１０ｍＭ燐酸であ
り、そして陰極液は２０ｍＭ水酸化ナトリウムであっ
た。
ＶＤＦ）膜（米国マサチューセッツ州ベッドフォードー
所在のミリポア・コーポレーションから市場で入手でき
る商品名「Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ」）を採集媒体とし
て基体上に配置した連続回転式採集用多孔質膜基体円板
を使用して、蛋白質含有分析物のｃＩＥＦ／画分採集を
行った。毛管は、７５μｍの内径、３６５μｍの外径及
び６０ｃｍの長さを有していた。２８０ｎｍの波長にお
いてオンラインＵＶ検出器を使用した。検出領域は、毛
管の流出端から８．８ｃｍであった。画分採集組立体
は、３１．２４分／回転で回転された。毛管を横切って
１８ＫＶの電圧を印加した。陽極液は１０ｍＭ燐酸であ
り、そして陰極液は２０ｍＭ水酸化ナトリウムであっ
た。
【００２１】使用した蛋白質試料は、チトクロムＣの
２．９ｍｇ／ｍｌ溶液（シグマ・ケミカル・カンパニー
によってＰａｒｔ Ｎｏ．Ｃ７７５２として販売され
る）であった。この溶液に、ミリポア・コーポレーショ
ンから市場で入手できそして２Ｄ−電気泳動用に最適化
した両性電解質、５％のｐＨ３−１０／２Ｄ（Ｃａｔａ
ｌｏｇｕｅ Ｎｏ．ＥＬＣＲＩＤＣ１０として確認され
た）、０．１％のメチルセルロース（２％において４，
０００ｃｐ粘度）及び１％のＴＥＭＥＤを混合した。
２．９ｍｇ／ｍｌ溶液（シグマ・ケミカル・カンパニー
によってＰａｒｔ Ｎｏ．Ｃ７７５２として販売され
る）であった。この溶液に、ミリポア・コーポレーショ
ンから市場で入手できそして２Ｄ−電気泳動用に最適化
した両性電解質、５％のｐＨ３−１０／２Ｄ（Ｃａｔａ
ｌｏｇｕｅ Ｎｏ．ＥＬＣＲＩＤＣ１０として確認され
た）、０．１％のメチルセルロース（２％において４，
０００ｃｐ粘度）及び１％のＴＥＭＥＤを混合した。
【００２２】図２に示されるチトクロムＣの分離のＵＶ
検出器出力は、分析時間の最初のおおよそ３０分間の間
には毛管から溶離するピークが全くないこと、しかし１
つのピークが観察されそして移行時間は３４．４分であ
ることを示している。このピークは、ＣＥ系によって混
合物から分離されたチトクロムＣ試料の量に相当する。
実際には、この試料は、膜上に離散帯域又はバンドで採
集される。図３はチトクロムＣを膜上に採集したときの
典型的な分離を示す。ＣＥ画分採集後の膜上の位置は、
中央孔の右側で膜の周辺近くに縦バンドとして現れてい
る。示されるように、唯１個の細長いスポットが目で明
確に見える。
検出器出力は、分析時間の最初のおおよそ３０分間の間
には毛管から溶離するピークが全くないこと、しかし１
つのピークが観察されそして移行時間は３４．４分であ
ることを示している。このピークは、ＣＥ系によって混
合物から分離されたチトクロムＣ試料の量に相当する。
実際には、この試料は、膜上に離散帯域又はバンドで採
集される。図３はチトクロムＣを膜上に採集したときの
典型的な分離を示す。ＣＥ画分採集後の膜上の位置は、
中央孔の右側で膜の周辺近くに縦バンドとして現れてい
る。示されるように、唯１個の細長いスポットが目で明
確に見える。
【００２３】次いで、このスポット又はバンドをＰＶＤ
Ｆ膜から切り取りそして酸加水分解次いでＡＱＣ−誘導
体化操作を施した。この詳細については、１９９１年９
月９日付け出願の米国特許願第０７／７６２，５７９号
から見い出すことができる。高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を使用して標識アミノ酸を分離し同定
した。アミノ酸の分析値を表１に示す。加えて、製造業
者のビンからのチトクロムＣをピペットでＰＶＤＦ膜上
に落とした。膜に酸加水分解、上記と同じＡＱＣ−誘導
体化操作を施し、そしてＨＰＬＣを使用して標識アミノ
酸を同定した。アミノ酸の分析値を表２に示す。この分
析を正の対照例（コントロール）として使用した。最後
に、同じ態様でブランク膜を処理しそして負の対照例と
して使用した。得られたアミノ酸の分析値を表３に示
す。
Ｆ膜から切り取りそして酸加水分解次いでＡＱＣ−誘導
体化操作を施した。この詳細については、１９９１年９
月９日付け出願の米国特許願第０７／７６２，５７９号
から見い出すことができる。高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）を使用して標識アミノ酸を分離し同定
した。アミノ酸の分析値を表１に示す。加えて、製造業
者のビンからのチトクロムＣをピペットでＰＶＤＦ膜上
に落とした。膜に酸加水分解、上記と同じＡＱＣ−誘導
体化操作を施し、そしてＨＰＬＣを使用して標識アミノ
酸を同定した。アミノ酸の分析値を表２に示す。この分
析を正の対照例（コントロール）として使用した。最後
に、同じ態様でブランク膜を処理しそして負の対照例と
して使用した。得られたアミノ酸の分析値を表３に示
す。
【００２４】本発明の方法に従ってｃＩＥＦ分離から誘
導された表１に示されるアミノ酸分析値は、チトクロム
Ｃの公知の組成及び表２に見られる正の対照例の両方に
ついて極めて類似している。表１における分析値では１
２．２％の平均誤差が生じたが、これは、表２における
正の対照例で生じた９．０％の平均誤差よりもごく僅か
だけ悪い。膜から分析される蛋白質では２０％までの平
均誤差は普通であるので、この分析値は、有意義なアミ
ノ酸データを生じるのに十分な試料を単一のｃＩＥＦ分
析で膜上に付着させることができることを例証してい
る。表３に示されるブランク対照例膜のアミノ酸分析値
は、かかる技術の低いバックグランドを示し、しかして
この方法の有用性を更に立証している。
導された表１に示されるアミノ酸分析値は、チトクロム
Ｃの公知の組成及び表２に見られる正の対照例の両方に
ついて極めて類似している。表１における分析値では１
２．２％の平均誤差が生じたが、これは、表２における
正の対照例で生じた９．０％の平均誤差よりもごく僅か
だけ悪い。膜から分析される蛋白質では２０％までの平
均誤差は普通であるので、この分析値は、有意義なアミ
ノ酸データを生じるのに十分な試料を単一のｃＩＥＦ分
析で膜上に付着させることができることを例証してい
る。表３に示されるブランク対照例膜のアミノ酸分析値
は、かかる技術の低いバックグランドを示し、しかして
この方法の有用性を更に立証している。
【００２５】アミノ酸分析に対するｃＩＥＦ及び膜画分
採集の結合が例示されているけれども、この方法は、他
の後分離分析技術及び画分採集装置に対する適用性を有
することが明らかである。当業者には本発明の他の変形
例が明らかになるであろう。
採集の結合が例示されているけれども、この方法は、他
の後分離分析技術及び画分採集装置に対する適用性を有
することが明らかである。当業者には本発明の他の変形
例が明らかになるであろう。
【００２６】例えば、本発明は、採集した蛋白質及びペ
ピチドのアミノ酸分析に使用する場合について記述され
る。しかしながら、例示される原理は、蛋白質の配列決
定、質量スペルトル分析でのレーザによる脱着又は蛋白
質若しくはペプチドの抗体結合染色に同等に有用であ
る。
ピチドのアミノ酸分析に使用する場合について記述され
る。しかしながら、例示される原理は、蛋白質の配列決
定、質量スペルトル分析でのレーザによる脱着又は蛋白
質若しくはペプチドの抗体結合染色に同等に有用であ
る。
【００２７】加えて、ここに記載する毛管等電点電気泳
動技術は、様々な細管、両性電解質及び緩衝液を使用し
て実施することができる。上記の例は、未被覆フューズ
ドシリカ毛管を使用するものであり、そして毛管を通し
て試料を移動又は流動させるのに電気浸透流れに依存し
ている。また、被覆毛管の使用と関連させて塩移動技術
を使用することもできる。どちらの緩衝液への塩の添加
も、抑制された電気浸透流れで被覆毛管における勾配の
移動を引き起こす。また、真空移動と共に同様の被覆毛
管を使用することも可能である。移動は、被覆毛管を使
用して二工程法の一部分として実施することができる。
第一工程では、等電点電気泳動が行われ、しかる後に緩
衝状態が逆にされ、しかして勾配の移動がもたらされ
る。
動技術は、様々な細管、両性電解質及び緩衝液を使用し
て実施することができる。上記の例は、未被覆フューズ
ドシリカ毛管を使用するものであり、そして毛管を通し
て試料を移動又は流動させるのに電気浸透流れに依存し
ている。また、被覆毛管の使用と関連させて塩移動技術
を使用することもできる。どちらの緩衝液への塩の添加
も、抑制された電気浸透流れで被覆毛管における勾配の
移動を引き起こす。また、真空移動と共に同様の被覆毛
管を使用することも可能である。移動は、被覆毛管を使
用して二工程法の一部分として実施することができる。
第一工程では、等電点電気泳動が行われ、しかる後に緩
衝状態が逆にされ、しかして勾配の移動がもたらされ
る。
【００２８】
【表１】
【００２９】
【表２】
【００３０】
【表３】
【図１】本発明のＣＥ系画分収集装置のブロック図を示
す。
す。
【図２】等電点電気泳動を使用して多孔質膜基体の上に
採集されたチトクロムＣの分離の電気泳動図を示す。
採集されたチトクロムＣの分離の電気泳動図を示す。
【図３】本発明の方法を使用して分離したチトクロムＣ
の典型的な図であって、ＣＥ画分採集後の多孔質膜基体
におけるチトクロムＣバンドの位置を示す。
の典型的な図であって、ＣＥ画分採集後の多孔質膜基体
におけるチトクロムＣバンドの位置を示す。
１０ 毛管電気泳動系 １１ 画分採集器 １２ 多孔質基体 １４ フューズドシリカ毛管 １５ 流入端 １６ 入口溜め １７ 流出端 １８ 多孔質膜 ２０ 高電圧電源の出力端子 ２１ 電極 ２２ 検出器 ２３ 出口溜め
Claims (16)
- 【請求項１】 試料蛋白質又はペプチド種の分離採集法
において、 ａ．毛管の内部に試料と両性電解質との混合物を充填
し、 ｂ．毛管の第一流入端を第一電解液中に浸漬し、 ｃ．毛管の第二流出端を多孔質基体と接触状態にし、 ｄ．多孔質基体を第二電解液で連続的に湿潤させ、 ｅ．多孔質基体を第二電解液と接触状態にし、 ｆ．第一電解液及び第二電解液を高電圧電源の出力端子
に連結された電極と接触させ、 ｇ．毛管の両端を横切って高電圧電位を印加して両性電
解質が毛管内でｐＨ勾配を形成するようにし且つ試料が
そのｐＨ勾配内で泳動するようにし、 ｈ．毛管内で流れを生じさせて毛管の内容物を多孔質基
体に向けて移動させ、そして ｉ．毛管の内容物中の試料部分を多孔質基体上に採集す
る、 各工程を含む分離採集法。 - 【請求項２】 多孔質基体が固定型である請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 多孔質基体が毛管の流出端に対して可動
式である請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 多孔質基体が毛管の流出端に対して回転
する請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 多孔質基体が微孔質膜を含む請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】 多孔質基体が限外ろ過膜を含む請求項１
記載の方法。 - 【請求項７】 膜がナイロン膜である請求項５記載の方
法。 - 【請求項８】 膜がポリ弗化ビニリデン膜である請求項
５記載の方法。 - 【請求項９】 膜がナイロン膜である請求項６記載の方
法。 - 【請求項１０】 膜がポリ弗化ビニリデン膜である請求
項６記載の方法。 - 【請求項１１】 採集した試料が、採集した蛋白質及び
ペプチドのアミノ酸分析のために使用される請求項１記
載の方法。 - 【請求項１２】 採集した試料が、採集した蛋白質及び
ペプチドの蛋白質配列決定のために使用される請求項１
記載の方法。 - 【請求項１３】 採集した試料が、質量スペクトル分析
のためにレーザによる脱着に対して使用される請求項１
記載の方法。 - 【請求項１４】 採集した試料が、蛋白質又はペプチド
の抗体結合染色のために使用される請求項１記載の方
法。 - 【請求項１５】 第一電解液が燐酸を含む陽極液であ
り、そして第二電解液が水酸化ナトリウムを含む陰極液
である請求項１記載の方法。 - 【請求項１６】 試料と両性電解質との混合物が電気浸
透流れによって毛管内を流動される請求項１記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3794593A | 1993-03-26 | 1993-03-26 | |
| US037945 | 1993-03-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06321984A true JPH06321984A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=21897207
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7775694A Pending JPH06321984A (ja) | 1993-03-26 | 1994-03-25 | 蛋白質及びペプチドの毛管等電点電気泳動法並びに後分析のための画分採集 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0617048A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06321984A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5580434A (en) * | 1996-02-29 | 1996-12-03 | Hewlett-Packard Company | Interface apparatus for capillary electrophoresis to a matrix-assisted-laser-desorption-ionization mass spectrometer |
| DE19724266A1 (de) * | 1996-09-28 | 1998-04-09 | Fuhr Guenter Prof Dr | Verfahren und Vorrichtung zur isoelektrischen Teilchentrennung |
| WO1998013689A1 (de) | 1996-09-28 | 1998-04-02 | Fuhr Guenter | Verfahren und vorrichtung zur isoelektrischen teilchentrennung |
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| US6764817B1 (en) | 1999-04-20 | 2004-07-20 | Target Discovery, Inc. | Methods for conducting metabolic analyses |
| US7069151B2 (en) | 2000-02-08 | 2006-06-27 | Regents Of The University Of Michigan | Mapping of differential display of proteins |
| WO2001058925A2 (en) * | 2000-02-08 | 2001-08-16 | The Regents Of The University Of Michigan | Protein separation and display |
| JP4555820B2 (ja) | 2003-02-10 | 2010-10-06 | ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン | シリコン上の脱離／イオン化質量分析（ｄｉｏｓ−ｍｓ）を使用した周囲空気の成分の吸着、検出、および同定 |
| CN101556260B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 固定化pH梯度毛细管等电聚焦测定微生物等电点的方法 |
| CN101556261B (zh) * | 2009-05-25 | 2012-01-11 | 北京理工大学 | 微管内等电聚焦和剪断吹出培养测定微生物等电点的方法 |
| CN101915696B (zh) * | 2010-07-07 | 2014-08-13 | 邯郸开发区奥泰克生物科技有限公司 | 一种毛细管内壁涂层的制备方法 |
| CN102023666B (zh) * | 2010-11-24 | 2012-07-11 | 福州展旭电子有限公司 | 一种蛋白质等电聚焦的电压控制装置及其电压控制方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69032400T2 (de) * | 1989-10-10 | 1999-02-18 | Unisys Corp., Blue Bell, Pa. | Bilddatenverarbeitungssystem und methode |
-
1994
- 1994-03-23 EP EP94104627A patent/EP0617048A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-25 JP JP7775694A patent/JPH06321984A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0617048A1 (en) | 1994-09-28 |
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