JPH06321995A - ダイズ由来のグルカンエリシターレセプター - Google Patents
ダイズ由来のグルカンエリシターレセプターInfo
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- JPH06321995A JPH06321995A JP13922593A JP13922593A JPH06321995A JP H06321995 A JPH06321995 A JP H06321995A JP 13922593 A JP13922593 A JP 13922593A JP 13922593 A JP13922593 A JP 13922593A JP H06321995 A JPH06321995 A JP H06321995A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 分子量が約70Kdであって、次の部分アミノ酸
配列を含むグルカンエリシターレセプターとして機能す
るタンパク質。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp 【効果】 本発明は、ＥＲをコードするＤＮＡを用いた
植物等の育種技術の確立のための材料として極めて有用
である。また、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原
として用いることが出来、これによって得られる坑体
や、ＥＲをコードするＤＮＡの情報を基に設計されるア
ンチセンスＤＮＡは、レセプターに対するエリシターの
結合部位、結合様式やレセプターのシグナル伝達部位、
伝達様式の研究に用いられる。
配列を含むグルカンエリシターレセプターとして機能す
るタンパク質。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp 【効果】 本発明は、ＥＲをコードするＤＮＡを用いた
植物等の育種技術の確立のための材料として極めて有用
である。また、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原
として用いることが出来、これによって得られる坑体
や、ＥＲをコードするＤＮＡの情報を基に設計されるア
ンチセンスＤＮＡは、レセプターに対するエリシターの
結合部位、結合様式やレセプターのシグナル伝達部位、
伝達様式の研究に用いられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ダイズ根の原形質膜画
分に由来する、グルカンエリシターレセプター（以下
「ＥＲ」と呼ぶ）として機能するタンパク質に関する。
本発明のタンパク質は、ＥＲの生産技術の確立に、また
ＥＲをコードするＤＮＡを用いた、カビ耐性植物の育種
技術の確立のための材料として極めて有用である。ま
た、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原として用い
ることができ、得られる坑体や、ＥＲをコードするＤＮ
Ａに対するアンチセンスＤＮＡは、ＥＲのエリシター結
合部位やシグナル伝達の研究に用いられる。
分に由来する、グルカンエリシターレセプター（以下
「ＥＲ」と呼ぶ）として機能するタンパク質に関する。
本発明のタンパク質は、ＥＲの生産技術の確立に、また
ＥＲをコードするＤＮＡを用いた、カビ耐性植物の育種
技術の確立のための材料として極めて有用である。ま
た、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原として用い
ることができ、得られる坑体や、ＥＲをコードするＤＮ
Ａに対するアンチセンスＤＮＡは、ＥＲのエリシター結
合部位やシグナル伝達の研究に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】植物病原微生物の感染後、植物中にファ
イトアレキシンと呼ばれる坑菌性物質が新しく合成され
ることが知られている(M.Yoshikawa,Nature,257(1978),
546)。また、植物疫病菌から、植物に抵抗性反応（ファ
イトアレキシンの合成蓄積）を誘導する物質が見いださ
れ(N.T.Keen,Science,187(1975),74)、これらの物質は
エリシターと総称されている。ダイズの場合、エリシタ
ーはグルコースから作られている多糖で、β-1,6結合及
びβ-1,3結合したグルカンであることが報告されている
(J.K.Sharp,et al.,J.Biol.Chem.,259(1984),11321, M.
Yoshikawa,植物細胞工学,1.2(1990),695)。ダイズの抵
坑性に大切な役割を果たすファイトアレキシンはグリセ
オリンと呼ばれている(M.Yoshikawa,et al.,Physiol.Pl
ant.Pathol.,12(1978),73)。ダイズの病原糸状菌の一種
である疫病菌（Phytophthora megasperma f. sp. glyci
nea）由来のグルカンエリシターに対する特異的なレセ
プター（ＥＲ）は坑菌性物質であるグリセオリンの合
成、蓄積に重要な役割を果たしているタンパク質である
と考えられる。このエリシターに特異的なＥＲに関して
は、アミノ酸配列が解明されているものは未だなく、そ
の精製法が示されているのみである（E.G.Cosio,et a
l.,FEBS,264(1990),235, E.G.Cosio,et al.,Eur.J.Bioc
hem.,204(1992),1115, T.Frey,Phytochemistry,32(199
3),543)。これらの報告で用いられたアフィニティーカ
ラムのリガンドはダイズ疫病菌の細胞壁の酸加水分解物
で、活性測定用のエリシターはヘプターβ−グルコシド
なのに対して、本発明者等がアフィニティーカラムに用
いたリガンド及び活性測定に用いたエリシターは、ダイ
ズ疫病菌の細胞壁を酵素処理（ザイモリアーゼ100Ｔ）
して得られたもので、報告されている精製法に用いられ
たエリシターに比べ、より天然に近く、そのグリセオリ
ン誘導活性は重量比で約15倍、モル比で約150倍高い。
イトアレキシンと呼ばれる坑菌性物質が新しく合成され
ることが知られている(M.Yoshikawa,Nature,257(1978),
546)。また、植物疫病菌から、植物に抵抗性反応（ファ
イトアレキシンの合成蓄積）を誘導する物質が見いださ
れ(N.T.Keen,Science,187(1975),74)、これらの物質は
エリシターと総称されている。ダイズの場合、エリシタ
ーはグルコースから作られている多糖で、β-1,6結合及
びβ-1,3結合したグルカンであることが報告されている
(J.K.Sharp,et al.,J.Biol.Chem.,259(1984),11321, M.
Yoshikawa,植物細胞工学,1.2(1990),695)。ダイズの抵
坑性に大切な役割を果たすファイトアレキシンはグリセ
オリンと呼ばれている(M.Yoshikawa,et al.,Physiol.Pl
ant.Pathol.,12(1978),73)。ダイズの病原糸状菌の一種
である疫病菌（Phytophthora megasperma f. sp. glyci
nea）由来のグルカンエリシターに対する特異的なレセ
プター（ＥＲ）は坑菌性物質であるグリセオリンの合
成、蓄積に重要な役割を果たしているタンパク質である
と考えられる。このエリシターに特異的なＥＲに関して
は、アミノ酸配列が解明されているものは未だなく、そ
の精製法が示されているのみである（E.G.Cosio,et a
l.,FEBS,264(1990),235, E.G.Cosio,et al.,Eur.J.Bioc
hem.,204(1992),1115, T.Frey,Phytochemistry,32(199
3),543)。これらの報告で用いられたアフィニティーカ
ラムのリガンドはダイズ疫病菌の細胞壁の酸加水分解物
で、活性測定用のエリシターはヘプターβ−グルコシド
なのに対して、本発明者等がアフィニティーカラムに用
いたリガンド及び活性測定に用いたエリシターは、ダイ
ズ疫病菌の細胞壁を酵素処理（ザイモリアーゼ100Ｔ）
して得られたもので、報告されている精製法に用いられ
たエリシターに比べ、より天然に近く、そのグリセオリ
ン誘導活性は重量比で約15倍、モル比で約150倍高い。
【０００３】
【発明の解決しようとする課題】本発明の目的は、カビ
耐性植物の育種技術確立のために有用なグルカンエリシ
ターレセプターを提供することにある。
耐性植物の育種技術確立のために有用なグルカンエリシ
ターレセプターを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、分子量が約70
Kdであって、次の部分アミノ酸配列を含むグルカンエリ
シターレセプターとして機能するタンパク質である。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp 本発明のタンパク質は、Phytophthora由来のグルカンエ
リシターのレセプターとしての機能を持つものである。
即ち、このタンパク質はPhytophthora属の微生物が細胞
内に侵入した際に生じるグルカンエリシターと結合し、
細胞中のファイトアレキシン含量を増大させることをミ
クロソーム及び核に指示する機能を持つものである。
Kdであって、次の部分アミノ酸配列を含むグルカンエリ
シターレセプターとして機能するタンパク質である。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp 本発明のタンパク質は、Phytophthora由来のグルカンエ
リシターのレセプターとしての機能を持つものである。
即ち、このタンパク質はPhytophthora属の微生物が細胞
内に侵入した際に生じるグルカンエリシターと結合し、
細胞中のファイトアレキシン含量を増大させることをミ
クロソーム及び核に指示する機能を持つものである。
【０００５】本発明のタンパク質は、図１に示すように
ポリクアクリルアミド電気泳動上の分子量約70KDを示す
位置に存在する。また、以下のようなアミノ酸配列をそ
の一部として有する。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp これらのアミノ酸配列は、精製したＥＲをＰＶＤＦ膜
（ミリポア社製）にエレクトロブロッティングにて転写
し、これを、リジルエンドペプチダーゼ（AP-I）にて消
化後、断片化ペプチドをＰＶＤＦ膜上から回収し、次い
で、これらを逆相ＨＰＬＣ（μ-Bondasphere 5μC8）に
て分画後、それぞれのピーク成分について、気相プロテ
インシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社
製）で分析することにより決定した。
ポリクアクリルアミド電気泳動上の分子量約70KDを示す
位置に存在する。また、以下のようなアミノ酸配列をそ
の一部として有する。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp これらのアミノ酸配列は、精製したＥＲをＰＶＤＦ膜
（ミリポア社製）にエレクトロブロッティングにて転写
し、これを、リジルエンドペプチダーゼ（AP-I）にて消
化後、断片化ペプチドをＰＶＤＦ膜上から回収し、次い
で、これらを逆相ＨＰＬＣ（μ-Bondasphere 5μC8）に
て分画後、それぞれのピーク成分について、気相プロテ
インシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社
製）で分析することにより決定した。
【０００６】本発明のタンパク質は、例えば、Cosio ら
(E.J.B.,204(1992),1115)の方法を一部変更した方法に
より得られる。即ち、ダイズの根、葉、茎等をホモゲナ
イズし、得られたスラリーから膜画分を回収し、これを
イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、更にエリ
シターをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィ
ーによる精製することにより得られる。この際用いるエ
リシターとしては、Phytophthora属微生物由来のもので
あれば、特に限定されないが、Phytophthora megasperm
a f. sp. glycinea レース１(ATCC34566)由来のものが
好ましい。
(E.J.B.,204(1992),1115)の方法を一部変更した方法に
より得られる。即ち、ダイズの根、葉、茎等をホモゲナ
イズし、得られたスラリーから膜画分を回収し、これを
イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、更にエリ
シターをリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィ
ーによる精製することにより得られる。この際用いるエ
リシターとしては、Phytophthora属微生物由来のもので
あれば、特に限定されないが、Phytophthora megasperm
a f. sp. glycinea レース１(ATCC34566)由来のものが
好ましい。
【０００７】次に実施例によって本発明を詳細に説明す
る。但し、この実施例は本発明の技術的範囲を限定する
ものではない。
る。但し、この実施例は本発明の技術的範囲を限定する
ものではない。
【０００８】
１）ダイズ根由来のＥＲの精製 ダイズ（品種：グリーンホーマー）種子（タカヤマシー
ド社製）を１週間バーミキュライトで栽培した後、15日
間水耕栽培を行ない、根を湿重約40kg収穫した。収穫し
た根を−80℃で凍結後、湿重２kgの根に対して1.25Lの
氷冷緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.0, 30mM MgCl2, 2mM D
ithiothreitol, 2.5mMメタ重亜硫酸カリウム, 1mM PMS
F）を加え、ワーリングブレンダーで2分間ホモゲナイズ
した。
ド社製）を１週間バーミキュライトで栽培した後、15日
間水耕栽培を行ない、根を湿重約40kg収穫した。収穫し
た根を−80℃で凍結後、湿重２kgの根に対して1.25Lの
氷冷緩衝液（25mM Tris-HCl pH7.0, 30mM MgCl2, 2mM D
ithiothreitol, 2.5mMメタ重亜硫酸カリウム, 1mM PMS
F）を加え、ワーリングブレンダーで2分間ホモゲナイズ
した。
【０００９】得られたスラリーをミラクロス（カルビオ
ケム社製）で濾過し、濾液を10,000xg, ４℃, 15分間遠
心した。上清を100,000xg,４℃，20分間超遠心し、沈殿
を氷冷緩衝液, 160ml （25mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1Mシ
ュークロース, 5mM MgCl2,１mM PMSF, 5mM EDTA ）に懸
濁した。ＥＲを膜画分より可溶化するため、終濃度0.25
％となるよう両性界面活性剤ZW3-12（ベーリンガー社
製）を加え、８℃，30分間攪拌した。可溶化されたＥＲ
を回収するため、100,000xg,４℃，20分間超遠心を行な
い、上清を回収した。上清165ml を緩衝液（50mM, Tris
-HCl pH 8.0, 0.2%ZW3-12, 4℃）2Lで４回透析した後、
サンプル中よりプロテアーゼを除きＥＲを安定化するた
め、プロトラップ（宝酒造）５mlを加え、８℃で、30分
間ゆっくり攪拌した後、遠心（1,000xg, ４℃, ２分
間）し、上清を回収した。得られた上清160mlを、限外
濾過膜YM-10（アミコン社製）を用いて、約50mlに濃縮
した後、Ａ緩衝液（50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1Mシュー
クロース, ５mM MgCl2, １mM PMSF, 5mM EDTA, 0.2%ZW3
-12,４℃）に透析した。
ケム社製）で濾過し、濾液を10,000xg, ４℃, 15分間遠
心した。上清を100,000xg,４℃，20分間超遠心し、沈殿
を氷冷緩衝液, 160ml （25mM Tris-HCl pH 7.4, 0.1Mシ
ュークロース, 5mM MgCl2,１mM PMSF, 5mM EDTA ）に懸
濁した。ＥＲを膜画分より可溶化するため、終濃度0.25
％となるよう両性界面活性剤ZW3-12（ベーリンガー社
製）を加え、８℃，30分間攪拌した。可溶化されたＥＲ
を回収するため、100,000xg,４℃，20分間超遠心を行な
い、上清を回収した。上清165ml を緩衝液（50mM, Tris
-HCl pH 8.0, 0.2%ZW3-12, 4℃）2Lで４回透析した後、
サンプル中よりプロテアーゼを除きＥＲを安定化するた
め、プロトラップ（宝酒造）５mlを加え、８℃で、30分
間ゆっくり攪拌した後、遠心（1,000xg, ４℃, ２分
間）し、上清を回収した。得られた上清160mlを、限外
濾過膜YM-10（アミコン社製）を用いて、約50mlに濃縮
した後、Ａ緩衝液（50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1Mシュー
クロース, ５mM MgCl2, １mM PMSF, 5mM EDTA, 0.2%ZW3
-12,４℃）に透析した。
【００１０】次いで、Q-セファロースHP 26／10（ファ
ルマシア社製）にアプライし、０から1M NaClのリニア
グラジエントを行ない、ＥＲを溶出した。ＥＲは、NaCl
濃度0.45M付近に溶出された。活性画分をＡ緩衝液で３
倍に希釈した後、MonoQ10／10（ファルマシア社製）に
アプライし、０から1M NaClリニアグラジエントを行な
い、ＥＲ８mlを溶出した。ＥＲはNaCl濃度0.25M付近に
溶出された。
ルマシア社製）にアプライし、０から1M NaClのリニア
グラジエントを行ない、ＥＲを溶出した。ＥＲは、NaCl
濃度0.45M付近に溶出された。活性画分をＡ緩衝液で３
倍に希釈した後、MonoQ10／10（ファルマシア社製）に
アプライし、０から1M NaClリニアグラジエントを行な
い、ＥＲ８mlを溶出した。ＥＲはNaCl濃度0.25M付近に
溶出された。
【００１１】最後に、エリシターをリガンドとしたアフ
ィニティーゲルによりＥＲを精製すべく以下の操作を行
った。ゲル担体に対する非特異的吸着を除くため、活性
画分を集め、約33mgのマルトース結合ガラスゲル（ベッ
ド体積約100μl）と８℃で１時間攪拌し、ゲルを遠心
（1,000rpm, ４℃, ２分間）で沈殿し、上清を回収し
た。上清８mlに、約17mgのエリシター結合ガラスゲル
（ベッド体積約50μl）を加え、８℃で一晩ゆっくり攪
拌した。遠心（1,000rpm, ４℃, ２分間）で、ゲルを回
収し、２ベッド体積のＡ緩衝液で２回洗浄した。４ベッ
ド体積の0.1％SDSで３回洗浄し、ゲルに結合したＥＲを
回収した。以上の各精製ステップにおけるタンパク質量
及びＥＲ量を表１に示す。
ィニティーゲルによりＥＲを精製すべく以下の操作を行
った。ゲル担体に対する非特異的吸着を除くため、活性
画分を集め、約33mgのマルトース結合ガラスゲル（ベッ
ド体積約100μl）と８℃で１時間攪拌し、ゲルを遠心
（1,000rpm, ４℃, ２分間）で沈殿し、上清を回収し
た。上清８mlに、約17mgのエリシター結合ガラスゲル
（ベッド体積約50μl）を加え、８℃で一晩ゆっくり攪
拌した。遠心（1,000rpm, ４℃, ２分間）で、ゲルを回
収し、２ベッド体積のＡ緩衝液で２回洗浄した。４ベッ
ド体積の0.1％SDSで３回洗浄し、ゲルに結合したＥＲを
回収した。以上の各精製ステップにおけるタンパク質量
及びＥＲ量を表１に示す。
【００１２】
【表１】 各精製ステップにおけるタンパク質量及びＥＲ量 （ダイズ根、湿重約40kgを出発材料とした） ──────────────────────────────── タンパク質（mg） ＥＲ量（pmol） ──────────────────────────────── 膜画分 17900 30 可溶性画分 2000 214 Ｑ−Sepharose 190 205 MonoＱ 49 233 マルトース素通り画分 45 220 エリシター溶出画分 0.004 45 ──────────────────────────────── 上記のエリシター結合ガラスゲル溶出画分(10μl)及びM
onoＱ活性画分、マルトース結合ガラスゲル素通り画分
を電気泳動用グラジエントゲル、SDS-PAGEプレート10／
20（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動し、銀染色
（第一化学薬品社製）により染色した。これを図１に示
す。図中の１がMonoＱ活性画分、２がマルトース結合ガ
ラスゲル素通り画分、３がエリシター結合ガラスゲル溶
出画分を示す。図に示すようにＥＲの示すバンドは、分
子量約70,000付近に検出された。
onoＱ活性画分、マルトース結合ガラスゲル素通り画分
を電気泳動用グラジエントゲル、SDS-PAGEプレート10／
20（第一化学薬品社製）を用いて電気泳動し、銀染色
（第一化学薬品社製）により染色した。これを図１に示
す。図中の１がMonoＱ活性画分、２がマルトース結合ガ
ラスゲル素通り画分、３がエリシター結合ガラスゲル溶
出画分を示す。図に示すようにＥＲの示すバンドは、分
子量約70,000付近に検出された。
【００１３】分子量約70,000のタンパク質がエリシター
結合活性を持つことは、フォトアフィニティー試薬、SA
SD（ピアス社製）とエリシターの複合体をヨードラベル
化したものを用いて、分子量約70,000のタンパク質がヨ
ードラベル化されたこと及び、膜画分のSDS-PAGEをＰＶ
ＤＦ膜へウエスタンブロッティングし、ＰＶＤＦ膜をヨ
ードラベル化エリシターとインキュベートして、分子量
約70,000のタンパク質がヨードラベル化されたことより
示された。
結合活性を持つことは、フォトアフィニティー試薬、SA
SD（ピアス社製）とエリシターの複合体をヨードラベル
化したものを用いて、分子量約70,000のタンパク質がヨ
ードラベル化されたこと及び、膜画分のSDS-PAGEをＰＶ
ＤＦ膜へウエスタンブロッティングし、ＰＶＤＦ膜をヨ
ードラベル化エリシターとインキュベートして、分子量
約70,000のタンパク質がヨードラベル化されたことより
示された。
【００１４】上述の方法に従い湿重約40kgの根からＥＲ
約３μg を精製した。次に、ＥＲの精製に用いた、エリ
シター、マルトース結合ガラスゲル、エリシター結合ガ
ラスゲルの作り方、及び、ＥＲの結合活性測定法につい
て説明する。 Ｉ エリシターの作り方 エリシターはN.T.Keen(Plant Physiol.,71(1983),460,
Plant Physiol.,71(1983),466)らの方法を一部変更し調
製した。疫病菌（Phytophthora megasperma f.sp. glyc
inea）レース１（ATCC34566）の細胞壁をザイモリアー
ゼ100T（キリンビール社製）で処理しエリシターを遊離
させた後、CM−セルロースにザイモリアーゼ100Tを吸着
させ、得られた素通り画分を、ゲル濾過G-75（ファルマ
シア社製）にて精製し平均分子量１万の画分を回収し
た。回収画分のグリセオリンを誘導するエリシター活性
の測定は、M. Yoshikawa(Nature,257(1978),546)の方法
に従って行なった。８μgのエリシターをダイズの子葉
に与えると、24時間後に約550μgのグリセオリンが誘導
された。II マルトース結合ガラスゲルの作り方 A.M.Jeffrey,et al.,(Biochem.Biophys.Res.Commun.,62
(1975),608)らの方法に従って合成を行なった。マルト
ース120mgとGlss, Aminopropyl（シグマ社製）6gを36ml
のH2O に懸濁し、室温で一晩攪拌した。エタノール36ml
を加え、その直後、72mlのエタノールに864mgSodium bo
rohydrideを溶解したものを加え、２分間ソニケート
し、５時間室温で攪拌した。288mlのH2O を加え、氷冷
し、酢酸でpH5.6に調製した。結合しなかったマルトー
スを除くため、ゲルを約1.8LのH2O で洗浄した。洗浄液
中に含まれるマルトースをアンスロン試薬を用い、J.H.
Roe,(J. Biol.Chem.,212(1955),335) の方法に従い定量
し、洗浄液中に含まれるマルトースの量から、ゲルに結
合したマルトース量を推定した。その結果、6gのGlass,
Aminopropylに対して60mgのマルトースが結合した。III エリシター結合ガラスゲルの作り方 A.M.Jeffrey,et al.,(Biochem.Biophys.Res.Commun.,62
(1975),608) らの方法に従って合成を行なった。エリシ
ター37mgとGlass, Aminopropyl 490mgを6mlのH2Oに懸濁
し、室温で一晩攪拌した。エタノールを6ml加え、その
直後、12mlのエタノールに144mgのSodium borohydride
を溶解したものを加え、２分間ソニケートし、５時間室
温で攪拌した。48mlのH2Oを加え、氷冷し、酢酸でpH5.6
に調製した。結合しなかったエリシターをアンスロン試
薬を用いて定量し、洗浄液中に含まれるマルトースの量
から、ゲルに結合したエリシター量を推定した。その結
果、490mgのGlass, Aminopropylに対して、34mgのエリ
シターが結合した。IV ＥＲの結合活性測定法 エリシターとチラミン（東京化成工業製）の複合体をJo
ng-Joo Cheong(The Plant Cell,3(1991),127) らの方法
に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体
をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。ＥＲの結合
活性測定は、以下のような反応液で行なった。 50mM Tris-HCl pH7.4 0.1M Saccharose 5mM MgCl2 1mM PMSF 5mM EDTA アッセイ用緩衝液（500μl）中にサンプル（タンパク量
500μg以下）を懸濁し、０℃、２時間インキュベートし
た後、7.0nM ヨードラベル化エリシターチラミン複合体
（70Ci／mmol）を加え、４℃、２時間インキュベートし
た。ワットマンGF／B(0.3％ポリエチレンイミン水溶液
で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、５ml
の氷冷緩衝液（10mM Tris-HCl pH7.0, 1M NaCl, 10mM M
gCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマー
カウンターで測定した。非特異的結合による影響を除く
ため、同じサンプルに17μM のエリシターを加えアッセ
イ用緩衝液に懸濁した後、０℃、２時間インキュベート
し、以下同様の操作を行ない、得られたカウントを差し
引きすることのより、特異的結合によるカウントを求め
た。 ２）エリシターレセプターの断片化ペプチドの分析 エリシターレセプターをプロテアーゼ消化によってペプ
チド断片化して、岩松の方法（岩松明彦、生化学、63
（1991）、139；A. Iwamatsu, Electorophoresis, 13
（1992）、142）によって断片化ペプチドのアミノ酸配
列を決定した。上述の方法で湿重約40kgの根を用いてエ
リシターレセプターを精製し、得られた試料をセントリ
コン-30（アミコン社製）で約100μlに濃縮し、10-20％
アクリルアミドSDS電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリ
ポア社製）へエレクトロブロッティング（Sartrius社
製）した。試料を転写し、膜を0.1％Ponceau S／1％酢
酸で染色し、分子量約70,000のメインバンドを切り取
り、0.5mM NaOHで脱色した。これを還元S-カルボキシメ
チル化を行い、リジルエンドペプチダーゼ（AP-I）を酵
素：基質（mol:mol）比で1：100になるよう加え、30
℃、16時間反応させた。生成した断片化ペプチドは、μ
-Bondasphere 5μC8-300Å（2.1x150mm, Waters ）カラ
ムを使用し、2-50％のSolventBのリニアグラジエントで
30分間、流速0.25ml／分で溶出した（SolventA：0.05％
TFA in Water, SolventB：0.02％TFA in 2-propanol:ac
etonitrile=7:3(v／v)）。溶出されたペプチドは、214n
mにおける吸収で検出しマニュアルでそれぞれのピーク
を集めた。集めたそれぞれのピークは、気相プロテイン
シークエンサー（Applied Biosystems Model 470A）に
て分析した。それぞれのピークから分析された断片化ペ
プチドのアミノ酸配列は、以下のように決定された。
約３μg を精製した。次に、ＥＲの精製に用いた、エリ
シター、マルトース結合ガラスゲル、エリシター結合ガ
ラスゲルの作り方、及び、ＥＲの結合活性測定法につい
て説明する。 Ｉ エリシターの作り方 エリシターはN.T.Keen(Plant Physiol.,71(1983),460,
Plant Physiol.,71(1983),466)らの方法を一部変更し調
製した。疫病菌（Phytophthora megasperma f.sp. glyc
inea）レース１（ATCC34566）の細胞壁をザイモリアー
ゼ100T（キリンビール社製）で処理しエリシターを遊離
させた後、CM−セルロースにザイモリアーゼ100Tを吸着
させ、得られた素通り画分を、ゲル濾過G-75（ファルマ
シア社製）にて精製し平均分子量１万の画分を回収し
た。回収画分のグリセオリンを誘導するエリシター活性
の測定は、M. Yoshikawa(Nature,257(1978),546)の方法
に従って行なった。８μgのエリシターをダイズの子葉
に与えると、24時間後に約550μgのグリセオリンが誘導
された。II マルトース結合ガラスゲルの作り方 A.M.Jeffrey,et al.,(Biochem.Biophys.Res.Commun.,62
(1975),608)らの方法に従って合成を行なった。マルト
ース120mgとGlss, Aminopropyl（シグマ社製）6gを36ml
のH2O に懸濁し、室温で一晩攪拌した。エタノール36ml
を加え、その直後、72mlのエタノールに864mgSodium bo
rohydrideを溶解したものを加え、２分間ソニケート
し、５時間室温で攪拌した。288mlのH2O を加え、氷冷
し、酢酸でpH5.6に調製した。結合しなかったマルトー
スを除くため、ゲルを約1.8LのH2O で洗浄した。洗浄液
中に含まれるマルトースをアンスロン試薬を用い、J.H.
Roe,(J. Biol.Chem.,212(1955),335) の方法に従い定量
し、洗浄液中に含まれるマルトースの量から、ゲルに結
合したマルトース量を推定した。その結果、6gのGlass,
Aminopropylに対して60mgのマルトースが結合した。III エリシター結合ガラスゲルの作り方 A.M.Jeffrey,et al.,(Biochem.Biophys.Res.Commun.,62
(1975),608) らの方法に従って合成を行なった。エリシ
ター37mgとGlass, Aminopropyl 490mgを6mlのH2Oに懸濁
し、室温で一晩攪拌した。エタノールを6ml加え、その
直後、12mlのエタノールに144mgのSodium borohydride
を溶解したものを加え、２分間ソニケートし、５時間室
温で攪拌した。48mlのH2Oを加え、氷冷し、酢酸でpH5.6
に調製した。結合しなかったエリシターをアンスロン試
薬を用いて定量し、洗浄液中に含まれるマルトースの量
から、ゲルに結合したエリシター量を推定した。その結
果、490mgのGlass, Aminopropylに対して、34mgのエリ
シターが結合した。IV ＥＲの結合活性測定法 エリシターとチラミン（東京化成工業製）の複合体をJo
ng-Joo Cheong(The Plant Cell,3(1991),127) らの方法
に従い合成した。次に、エリシターとチラミンの複合体
をクロラミンＴを用いてヨードラベルした。ＥＲの結合
活性測定は、以下のような反応液で行なった。 50mM Tris-HCl pH7.4 0.1M Saccharose 5mM MgCl2 1mM PMSF 5mM EDTA アッセイ用緩衝液（500μl）中にサンプル（タンパク量
500μg以下）を懸濁し、０℃、２時間インキュベートし
た後、7.0nM ヨードラベル化エリシターチラミン複合体
（70Ci／mmol）を加え、４℃、２時間インキュベートし
た。ワットマンGF／B(0.3％ポリエチレンイミン水溶液
で１時間以上処理した）で反応溶液を濾過した後、５ml
の氷冷緩衝液（10mM Tris-HCl pH7.0, 1M NaCl, 10mM M
gCl2）で３回洗浄し、膜上に残った放射活性をガンマー
カウンターで測定した。非特異的結合による影響を除く
ため、同じサンプルに17μM のエリシターを加えアッセ
イ用緩衝液に懸濁した後、０℃、２時間インキュベート
し、以下同様の操作を行ない、得られたカウントを差し
引きすることのより、特異的結合によるカウントを求め
た。 ２）エリシターレセプターの断片化ペプチドの分析 エリシターレセプターをプロテアーゼ消化によってペプ
チド断片化して、岩松の方法（岩松明彦、生化学、63
（1991）、139；A. Iwamatsu, Electorophoresis, 13
（1992）、142）によって断片化ペプチドのアミノ酸配
列を決定した。上述の方法で湿重約40kgの根を用いてエ
リシターレセプターを精製し、得られた試料をセントリ
コン-30（アミコン社製）で約100μlに濃縮し、10-20％
アクリルアミドSDS電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜（ミリ
ポア社製）へエレクトロブロッティング（Sartrius社
製）した。試料を転写し、膜を0.1％Ponceau S／1％酢
酸で染色し、分子量約70,000のメインバンドを切り取
り、0.5mM NaOHで脱色した。これを還元S-カルボキシメ
チル化を行い、リジルエンドペプチダーゼ（AP-I）を酵
素：基質（mol:mol）比で1：100になるよう加え、30
℃、16時間反応させた。生成した断片化ペプチドは、μ
-Bondasphere 5μC8-300Å（2.1x150mm, Waters ）カラ
ムを使用し、2-50％のSolventBのリニアグラジエントで
30分間、流速0.25ml／分で溶出した（SolventA：0.05％
TFA in Water, SolventB：0.02％TFA in 2-propanol:ac
etonitrile=7:3(v／v)）。溶出されたペプチドは、214n
mにおける吸収で検出しマニュアルでそれぞれのピーク
を集めた。集めたそれぞれのピークは、気相プロテイン
シークエンサー（Applied Biosystems Model 470A）に
て分析した。それぞれのピークから分析された断片化ペ
プチドのアミノ酸配列は、以下のように決定された。
【００１５】１．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Il
e His Pro Tyr Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp
e His Pro Tyr Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp
【００１６】
【発明の効果】本発明では、ダイズ根膜画分よりＥＲを
精製し、それをプロテアーゼ消化し、得られた断片化ペ
プチドのアミノ酸配列を決定した。このようにＥＲに由
来するペプチドのアミノ酸配列の決定は、世界で初めて
であり、本発明は、ＥＲをコードするＤＮＡを用いた植
物等の育種技術の確立のための材料として極めて有用で
ある。 また、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原
として用いることが出来、これによってえられる坑体
や、ＥＲをコードするＤＮＡの情報を基に設計されるア
ンチセンスＤＮＡは、レセプターに対するエリシターの
結合部位やレセプターのシグナル伝達の研究に用いられ
る。従って、本発明は産業上極めて有用なものである。
精製し、それをプロテアーゼ消化し、得られた断片化ペ
プチドのアミノ酸配列を決定した。このようにＥＲに由
来するペプチドのアミノ酸配列の決定は、世界で初めて
であり、本発明は、ＥＲをコードするＤＮＡを用いた植
物等の育種技術の確立のための材料として極めて有用で
ある。 また、ＥＲに対する坑体を調製するための坑原
として用いることが出来、これによってえられる坑体
や、ＥＲをコードするＤＮＡの情報を基に設計されるア
ンチセンスＤＮＡは、レセプターに対するエリシターの
結合部位やレセプターのシグナル伝達の研究に用いられ
る。従って、本発明は産業上極めて有用なものである。
【図１】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンを
示す。
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 吉川 正明 北海道札幌市北区北24条西12丁目１−７− Ａ−901
Claims (1)
- 【請求項１】 分子量が約70Kdであって、次の部分アミ
ノ酸配列を含むグルカンエリシターレセプターとして機
能するタンパク質。 １．Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr Ile His Pro Ty
r Leu Glu Gly ２．Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Se
r ３．Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13922593A JPH06321995A (ja) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | ダイズ由来のグルカンエリシターレセプター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13922593A JPH06321995A (ja) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | ダイズ由来のグルカンエリシターレセプター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06321995A true JPH06321995A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=15240414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13922593A Pending JPH06321995A (ja) | 1993-05-19 | 1993-05-19 | ダイズ由来のグルカンエリシターレセプター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06321995A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995035371A1 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Glucan elicitor receptor and dna coding for the same |
| WO1997022242A1 (fr) * | 1995-12-15 | 1997-06-26 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Vegetaux resistant a la moisissure et leur procede d'obtention |
| JP2013540422A (ja) * | 2010-07-12 | 2013-11-07 | フルタローム スウィッツァーランド リミテッド | 真菌誘発型大豆苗から得られる栄養組成物 |
-
1993
- 1993-05-19 JP JP13922593A patent/JPH06321995A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995035371A1 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Glucan elicitor receptor and dna coding for the same |
| WO1997022242A1 (fr) * | 1995-12-15 | 1997-06-26 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Vegetaux resistant a la moisissure et leur procede d'obtention |
| JP2013540422A (ja) * | 2010-07-12 | 2013-11-07 | フルタローム スウィッツァーランド リミテッド | 真菌誘発型大豆苗から得られる栄養組成物 |
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